We are searching data for your request:
Upon completion, a link will appear to access the found materials.
أثناء تخليق الريبوسوم قبل 40S وما قبل 60S ، تشير العديد من المصادر إلى أهمية UAF أو UBF في مجمع البدء لنسخ DNA الريبوسوم. لم يذكر أي من المصادر التي رأيتها الآخر عند ذكر UAF أو UBF ، لذلك أريد أن أعرف ما إذا كانا في الواقع نفس الشيء.
مصدر آخر للارتباك هو أن ويكيبيديا لديها مقال لكليهما: https://en.wikipedia.org/wiki/Upstream_activating_factor
https://en.wikipedia.org/wiki/UBTF
شكرا لك مقدما.
الأدوار التفاضلية للفسفرة في تكوين بوليميريز الحمض النووي الريبي النشط النسخي I
يعتمد تنظيم نسخ rDNA على تكوين وتفكك معقد وظيفي بين RNA polymerase I (pol I) وعامل بدء النسخ Rrn3p. قمنا بتحليل ما إذا كانت الفسفرة متورطة في هذا التبديل الجزيئي. Rrn3p هو بروتين فسفوري في الغالب مُفسفر في الجسم الحي عندما لا تكون ملزمة بـ pol I. في المختبر، Rrn3p قادر على الارتباط بـ pol I والدخول في دورة النسخ في شكله غير الفسفوري. على النقيض من ذلك ، فإن فسفرة pol I مطلوبة لتكوين مجمع pol I-Rrn3p مستقر لبدء النسخ الفعال. علاوة على ذلك ، يرتبط ارتباط pol I مع Rrn3p بتغير في حالة الفسفرة في pol I. في الجسم الحي. نقترح أن الفسفرة في مواقع محددة من pol I هو شرط أساسي لبدء النسخ السليم وأن الفسفرة / نزع الفسفرة من pol I هو أحد الاحتمالات لتعديل نشاط نسخ الحمض النووي الريبي الخلوي.
يلعب التنظيم الدقيق لتخليق الرنا الريباسي وفقًا للظروف البيئية دورًا رئيسيًا في التخليق الحيوي للريبوسوم ، والذي يتم التحكم فيه بإحكام من خلال جميع الكائنات بدائية النواة وحقيقية النواة (1 ، 2). يرتبط مستوى إنتاج الرنا الريباسي مع نشاط RNA polymerase I (pol I) - التي تحتوي على آلات النسخ التي تولد نسخة السلائف من الرنا الريباسي 18S و 25S و 5.8S الناضج. تعتمد كفاءة النسخ على تكوين مجمعات بدء نشطة على مروج rDNA ، الأمر الذي يتطلب العديد من عوامل بدء النسخ وتجنيد المختص ببدء العمل الأول. في الخميرة خميرة الخميرة، كان عامل البدء الأول المعتمد على pol I الذي تم تحديده هو بروتين ربط TATA TBP (3 ، 4) ، والذي يمكن عزله داخل مجمع ثابت يبلغ 240 كيلو دالتون (5). تلامس TBP بولي ببتيدات من مجمعين متعددي البروتينات ، والعامل الأساسي (CF المراجع 6 و 7) وعامل التنشيط المنبع (المرجعان UAF. 6 و 8). يتمثل أحد الأدوار الحاسمة لـ TBP في نسخ pol I في تجنيد آلية pol I إلى المروج بطريقة تعتمد كليًا على UAF (6 ، 8 ، 9). يتكون CF من ثلاثة بروتينات مرتبطة بشكل ثابت مشفرة بواسطة الجينات RRN6 و RRN7 و RRN11 (7 ، 10 ، 11) بينما UAF عبارة عن مجمع متعدد الوحدات يتكون من خمسة بروتينات مختلفة على الأقل: Rrn5p ، Rrn7p ، Rrn10p (12) ، و هيستونات H3 و H4 (13). لقد تم اقتراح أن ربط UAF المنبع إلى المروج ضروري لتوظيف CF بكفاءة ، وأخيراً ، بدء الشكل النشط لـ pol I إلى موقع بدء تخليق الرنا الريباسي (8). يرتبط poli المختص بالبدء ارتباطًا ثابتًا بعامل البدء الخاص بـ pol I الخاص Rrn3p (14 ، 15). من خلال ربط الجزء C-terminal من Rrn6p والوحدة الفرعية A43 الخاصة بـ pol I ، يربط Rrn3p CF بـ pol I ، مما يؤدي إلى توظيف pol I إلى المروج وتشكيل مجمع بدء نشط (16). في الآونة الأخيرة ، تم اقتراح أن pol I-Rrn3p ، مع CF ، دورات داخل وخارج المروج ، بينما يظل UAF مقيدًا (17). أحد الاحتمالات لتنظيم بدء النسخ هو تكوين وتفكك مجمع pol I-Rrn3p ، والذي يمثل مفتاحًا جزيئيًا لتنظيم تخليق الرنا الريباسي. تم دعم هذه الفكرة من خلال البيانات التالية المنشورة مسبقًا (15). أولاً ، يعد الارتباط المستقر لـ pol I مع Rrn3p في المحلول شرطًا أساسيًا ضروريًا لبدء النسخ ثانيًا ، تم العثور على نسبة صغيرة فقط من كل من Rrn3p و pol I في مجمع مستقر مع بعضهما البعض في مستخلصات الخلية الكاملة ، في حين أن معظم pol I و Rrn3p غير معقد ووجد أنهما غير نشط في بدء النسخ الثالث ، تم فصل مجمع pol I-Rrn3p خلال جولة واحدة من النسخ في المختبر وفقدت قدرتها على إعادة التهيئة اللاحقة والخلايا الرابعة الثابتة ، والتي تكون صامتة في نسخ rDNA ، تُظهر انخفاضًا قويًا في مجمعات pol I-Rrn3p ، ومع ذلك ، فهي تحتوي على مستويات كبيرة من كل من Rrn3p و pol I (15). نظرًا لأن كلا من pol I و Rrn3p موجودان بالتوازي على أنهما غير معقدان وكجزيئات مرتبطة بشكل ثابت ، فمن المتصور أن التعديلات المختلفة اللاحقة للترجمة يجب أن توجد في أحد المكونات أو كلاهما لتحفيز نشاط البدء.
في الآونة الأخيرة ، تم تحديد التماثل البشري لـ yRrn3p. إنه قادر على استبدال الخميرة Rrn3p في الجسم الحي (18) وتبين أنه متطابق مع TIF-IA ، العامل الذي يتوسط في التحكم المعتمد على النمو في تخليق الحمض النووي الريبي للثدييات (19). وفقًا لنظيره من الخميرة ، وجد أن Rrn3p البشري ضروري لتوظيف القطب المختص بالبدء في المروج ، وبالتالي ربط الإنسان الأول بعامل انتقائية المروج SL1 (20). على غرار الوضع في الخميرة ، تم العثور على نسبة صغيرة فقط من مجمعات الإنسان pol I في ارتباط مستقر مع hRrn3p لتؤدي إلى إنزيم مختص بالبدء (20). تشير هذه النتائج إلى أن التفاعل القابل للانعكاس بين Rrn3p و pol I من خلال تعديلات ما بعد الترجمة قد يعكس آلية قاعدية محفوظة لتنظيم نسخ الحمض النووي الريبي في حقيقيات النوى.
الفسفرة هي تعديل شائع بعد الترجمة يشارك في العديد من المسارات التنظيمية. لأن النتائج السابقة أوضحت أن الوحدات الفرعية للقطب الأول A190 و A43 و A34.5 و A23 و A19 هي فسفرة في الجسم الحي (21 ، 22) ، سألنا عما إذا كانت فسفرة pol I هدفًا محتملًا يمكنه تعديل التفاعل بين pol I و Rrn3p. في الواقع ، يوازي ارتباط pol I مع Rrn3p تغيير في نمط الفسفرة pol I ، مما يشير إلى انتقال في حالة الفسفرة في pol I للوصول إلى كفاءة البدء. نزع الفسفرة للبول الأول في المختبر انخفاض نشاط بدء الخميرة pol I ، أدى إلى زعزعة استقرار مجمع pol I-Rrn3p المشكل مسبقًا ، وتثبيط التكوين المعقد باستخدام Rrn3p المعبر عنه بكتيريًا. على النقيض من ذلك ، فإن كفاءة بدء Rrn3p لا تتطلب الفسفرة الخاصة بها. من هذه النتائج ، نقترح أن فسفرة pol I هو أحد الاحتمالات لتعديل تفاعل pol I-Rrn3p ، وبالتالي للتحكم في نشاط عملية النسخ.
التنظيم الهيكلي لوحدة نسخ الرنا الريباسي
في الفقاريات العليا ، تقوم وحدة نسخ rDNA القياسية بترميز السلائف إلى 18S و 28S و 5.8S rRNAs. تحتوي كل وحدة أيضًا على عناصر تسلسل مهمة تنظم النسخ المسبق للرنا الريباسي ، مثل محفز rDNA ، والمعززات ، ومحفزات المباعدة ، وأصل النسخ المتماثل ، ومحطات إنهاء النسخ ، وحاجز شوكة النسخ الذي يمنع شوكات النسخ المتماثل من الاصطدام بنسخ بوليميراز RNA أثناء النسخ. المرحلة S. قد يكون الترتيب الترادفي لجينات rDNA المتعددة مفيدًا لزيادة جرعة الجينات والحفاظ على تماثل تسلسل الرنا الريباسي المعروف جيدًا. باستثناء الأنواع وثيقة الصلة ، تباعدت تسلسل محفز الحمض النووي الريبي حقيقية النواة بشكل كبير. تمشيا مع هذا التباين في التسلسل ، يكون نسخ rDNA خاصًا بشكل عام بالأوامر التصنيفية ، حيث لا يتم التعرف على مروج مجموعة واحدة بواسطة آلية النسخ للآخرين (للمراجعة ، انظر Heix and Grummt 1995). مع استثناءات قليلة ، يشترك مروجو rDNA في تنظيم معياري مشترك ، يتكون من مروج أساسي قريب لموقع البداية (CP) وعنصر تحكم في المنبع (UCE). تعد المحاذاة الفراغية لكلا عنصري التسلسل أمرًا بالغ الأهمية لبدء النسخ الفعال. كشف تحليل المعلمات الهيكلية لمحفزات الجينات الريبوزومية من الإنسان إلى النباتات الدنيا عن الحفاظ على سمات هيكلية محددة ، بدلاً من التسلسل الأساسي ، والتي تعتبر أساسية لوظيفة المروج (Marilley and Pasero 1996 Marilley et al.2002). على ما يبدو ، فإن الكود الهيكلي ، بالإضافة إلى التسلسل الأولي ، يوجه تفاعلات بروتينية محددة بين DNA في محفز rDNA وقد يلعب وظيفة مهمة في التحكم في النسخ.
الموقع
من المعروف منذ فترة طويلة أن نسخ pol I يتم ترجمته إلى مواقع منفصلة تسمى nucleoli ، ويمكن تشبيهها بمصانع الريبوسوم ، حيث يتم تصنيع الرنا الريباسي بواسطة pol I في المراكز الليفية ثم معالجتها وتجميعها في ريبوسومات في المناطق الحبيبية المحيطة (3) ). لطالما كان يُنظر إلى هذا على أنه خصوصية لنظام pol I ، ولكن أظهرت دراسة حديثة أن كلا من pol II و pol III يقومان أيضًا بالنسخ في مواقع منفصلة (4). كشف الفحص المجهري متحد البؤر والإلكترون لخلايا هيلا أن نسخ pol III يحدث في
2000 موقع داخل النواة (4). كل موقع له نصف قطر من
20 نانومتر ويحتوي ، في المتوسط ، على خمسة جزيئات من القطب النشط الثالث (4). لم يتم العثور على Pol II في هذه المواقع ، ولكنها تعمل في مواقعها المكانية المنفصلة ، والتي قد تكون موجودة
على الرغم من أنه يُعتقد أن النسخ التي تم إجراؤها بواسطة pol I و pol II تتم معالجتها بالقرب من موقع تركيبها ، فقد يحدث جزء على الأقل من مسار معالجة tRNA في النواة (5). وهكذا ، الفلورسنت فى الموقع يكشف التهجين عن الحمض النووي الريبي غير المعالج داخل نوى خميرة الخميرة (5). علاوة على ذلك ، يمكن العثور على الوحدة الفرعية للحمض النووي الريبي لـ RNase P ، وهو منتج pol III الذي يساعد على تشقق ما قبل الحمض النووي الريبي ، في كل من النواة والنيوكليوبلازم في الخميرة والثدييات (5 ، 6). قد توفر معالجة الحمض الريبي النووي النقال داخل نفس الحجرة مثل تخليق الريبوسوم فرصًا لتنسيق إنتاج المكونات المتميزة للجهاز متعدية.
النتائج
مستويات مرتفعة من 35S RNA في موت 1 الخلايا.
تعطيل MOT1 يؤدي إلى إلغاء استجابة الإجهاد ، ونوع التزاوج ، وجينات التحول diauxic (13). تساءلنا عما إذا كان موت 1 تمتلك الخلايا ميزات أخرى للخلايا التي تدخل مرحلة ثابتة. نظرًا لأن نشاط مروج Pol I حساس لمرحلة النمو الخلوي (62) ، فقد فحصنا من خلال النشاف الشمالي لمستويات نسخة الرنا الريباسي الأولية ، 35S RNA ، في النوع البري و موت 1 الخلايا. كما هو مبين في الشكل. & # x200B الشكل 1 ، 1 ، تم رفع مستويات 35S RNA حوالي ضعفين في موت 1 مقارنة بالمستويات الموجودة في الخلايا البرية. لوحظ هذا التأثير في كل من اثنين مختلفين حساسين لدرجة الحرارة موت 1 سلالات بعد تحول لمدة 45 دقيقة إلى 35 & # x000b0C. كما لوحظ ارتفاع مستويات 35S RNA في موت1-14 نمت الخلايا عند 30 & # x000b0C ، وهي درجة حرارة تنمو فيها هذه الخلايا ببطء (12). منذ أن لوحظت الزيادة في 35S RNA في موت 1-14 الخلايا عند 30 & # x000b0C ، هذا التأثير ليس نتيجة استجابة آلية Pol I للإجهاد الحراري (43). بالإضافة إلى ذلك ، فإن بروتين Mot1 يكاد يكون غير قابل للكشف في مقتطفات من موت 1-14 الخلايا (12) ، مما يشير إلى أن هذه التأثيرات على مستويات النسخ من غير المرجح أن تكون تقليلًا من التقدير الناتج عن الخمول الجزئي لـ Mot1.
ارتفاع 35S RNA في موت 1 الخلايا. من النوع البري (WT) و موت 1 نمت الخلايا في وسط غني عند 30 & # x000b0C إلى OD600 من & # x0223c1.0. ثم تم حصاد الخلايا أو صدمتها بالحرارة لمدة 45 دقيقة عند 35 & # x000b0 درجة مئوية قبل الحصاد. تم حل عشرين ميكروغرامًا من إجمالي الحمض النووي الريبي من كل سلالة عن طريق الرحلان الكهربائي ، وتم نقلها إلى غشاء نايلون ، وتم فحصها باستخدام مسبار خاص بعلامة إشعاعية 35S. لتطبيع شدة نطاق 35S RNA ، تم تجريد وصمة عار من أجل قانون 1 رسالة. يوضح الرسم البياني مستوى RNA المعدل النسبي 35S المحدد من ثلاث تجارب مستقلة & # x000b1 الانحراف المعياري.
يتضاءل معدل تخليق الرنا الريباسي في خلايا mot1.
المستوى المرتفع لـ 35S RNA في موت 1 تشير الخلايا إلى أن Mot1 يمنع نسخ الرنا الريباسي في الخلايا الطبيعية. بدلاً من ذلك ، يمكن أن يكون تراكم الأنواع 35S ناتجًا عن وظيفة لـ Mot1 في معالجة RNA 35S أو تأثيرات Mot1 على كل من النسخ والمعالجة. لتقييم المعدلات النسبية لتخليق الرنا الريباسي ومعالجته مباشرة في النوع البري و موت 1 الخلايا ، أجريت تجارب مطاردة النبض. نمت الخلايا في وسط خالٍ من الميثيونين ثم حضنت بميثيونين [methyl- 3 H] لمدة دقيقتين ، متبوعًا بإضافة فائض من الميثيونين غير المسمى (انظر المواد والطرق). تم حصاد الخلايا في نقاط زمنية مختلفة بعد وضع العلامات ، وتم تحليل أنواع الرنا الريباسي بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام والتصوير الفلوري. كما هو مبين في الشكل. & # x200B الشكل 2 ، 2 ، بالكاد يمكن اكتشاف الحمض النووي الريبي 35S غير المعالج في الخلايا من النوع البري ، ولكن تم اكتشاف العديد من أشكال الرنا الريباسي التي تمت معالجتها ومعالجتها جزئيًا ، كما هو معتاد في سلالات خميرة التحكم (على سبيل المثال ، انظر المرجع 59). بعد 10 دقائق من المطاردة ، تمت معالجة جميع أنواع الحمض النووي الريبي المسمى تقريبًا لتنضج 18S و 25 S. في تناقض صارخ ، & # x0223c5 أضعاف أقل من الرنا الريباسي تم تصنيعه بواسطة موت 1-14 خلال فترة وضع العلامات التي تبلغ دقيقتين ، وكانت أنواع الرنا الريباسي السائدة التي يمكن اكتشافها في الوقت صفر هي الحمض النووي الريبي 35S غير المعالج بالكامل. على الرغم من عيب المعالجة الواضح بعد وضع العلامات على النبض ، تمت معالجة 35S RNA من الناحية الكمية تقريبًا إلى أشكال 18S و 25 S الناضجة بحلول 10 دقائق. حيث موت 1-14 تنمو الخلايا ببطء ، ويحدث تخليق الرنا الريباسي بما يتناسب مع معدل النمو ، وليس من الواضح إلى أي مدى تقل تخليق الرنا الريباسي في موت 1-14 الخلايا هي نتيجة لانخفاض معدل النمو مقابل عيب في نسخ Pol I الناجم مباشرة عن خلل في Mot1. ومع ذلك ، تشير هذه النتائج إلى أن كلا من تخليق ومعالجة الرنا الريباسي معيب في موت 1 الخلايا.
انخفاض تخليق الرنا الريباسي ومعالجته في موت 1 الخلايا. البرية من نوع و موت1-14 نمت الخلايا عند 30 & # x000b0C في وسط صناعي يفتقر إلى الميثيونين إلى OD600 من & # x0223c0.3 إلى 0.4. تم بعد ذلك وضع علامات على الخلايا باستخدام [methyl- 3 H] ميثيونين لمدة دقيقتين (وقت صفر) ثم تم تحضينها باستخدام ميثيونين غير مرمز للأوقات الموضحة فوق الممرات قبل الحصاد. تم تجزئة إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) على هلام الفورمالديهايد agarose ، وتم الكشف عن أنواع rRNA ذات العلامات الإشعاعية بواسطة التصوير الشعاعي الذاتي كما هو موضح في المواد والطرق.
انخفاض كثافة البوليميراز والمعالجة المعيبة في موت 1 الخلايا.
لتحديد كيفية تأثير خلل في Mot1 على تخليق الرنا الريباسي بشكل أفضل ، تم استخدام طريقة ميلر لنشر الكروماتين لتصور الجينات النووية الفردية من زوجين من موت 1 سلالات من النوع البري متحولة ومتجانسة. سلالات التحكم من النوع البري لها توزيعات كثافة البلمرة مماثلة لتلك التي شوهدت في سلالات من النوع البري الأخرى ، والتي تعرض عادةً نطاقًا واسعًا من كثافات البوليميراز بمتوسط & # x0223c50 نسخة / جين (19 ، 48). سلالة من النوع البري AY51 (13) لها كثافة بوليميراز 56 (ن & # x0003d 55) ، على غرار كثافة السلالة البرية JD194 (16) ، والتي كانت كثافة البوليميراز فيها 50 (ن & # x0003d 27). متوسط عدد البوليميراز / الجين لـ موت1-14 (سلالة AY86) (13) كان 48 (ن & # x0003d 75) ، في حين أن ذلك لـ موت 1-1 (سلالة دينار 215 ب) (16) كان 30 (ن & # x0003d 130). كثافة البوليميراز للجينات من موت 1-14 كانت الخلايا أقل بكثير من كثافة خلايا التحكم من النوع البري ، مع ارتباط ص قيمة أقل بقليل من 0.05. انخفاض كثافة البوليميراز على الجينات من موت 1-1 الخلايا مقابل تلك الموجودة في خلايا التحكم الجينية لها ارتباط ص قيمة أقل بكثير من 0.05 ، مما يشير إلى أن هذا الاختلاف مهم للغاية. كما يتضح من الرسم في الشكل رقم & # x200B الشكل 3 أ ، 3 أ ، فإن جميع السلالات التي تم تحليلها لها توزيع واسع في كثافة البوليميراز ، ولكن قيم كثافة البوليميراز النمطية ، أو الأكثر شيوعًا ، كانت متشابهة لكليهما. موت 1 سلالات (من 20 إلى 25 بولس / جين) وكانت أقل من القيمة المشروطة للسلالة من النوع البري (& # x0223c50 بوليميراز / جين).
جينات الرنا الريباسي من موت 1 تعرض الخلايا عددًا أقل من النسخ لكل جين في المتوسط وتبطئ معالجة الرنا الريباسي على تلك النصوص. (أ) توزيع كثافة البوليميراز على الجينات من موت 1-14 و موت 1-1 سلالات مقارنة بسلالة التحكم من النوع البري. تم تحديد عدد البوليميرات لكل جين لـ 55 جينًا من الرنا الريباسي من خلايا من النوع البري ، و 75 جينًا من موت 1-14 الخلايا ، و 130 جينًا لـ موت 1-1 الخلايا. (B و C) صورة مجهرية إلكترونية لجينات الرنا الريباسي التمثيلية من النوع البري (B) أو موت 1-14 (ج) سلالة ، مع 55 و 37 نسخة ، على التوالي. يوجد أسفل كل جين تتبع توضيحي لـ rDNA (الخط المنقط) ونصوص الحمض النووي الريبي (الخطوط الصلبة). يعرض الجين من النوع البري (B) أحداث معالجة الرنا الريباسي النموذجية التي تظهر على جينات الخميرة الرنا الريباسي (43) ، بما في ذلك تكوين جسيمات كبيرة 5 & # x02032- الطرفية ، والتي تشمل الحمض النووي الريبي قبل الوحدة الفرعية الصغيرة ، متبوعًا بانقسام SSU. المعالجات من النصوص الوليدة (الأسهم). ال موت1-14 يعرض الجين الرنا الريباسي (C) النصوص التي لا تكتسب مكونات معالجات SSU ولا يتم قطعها أثناء ظهورها (الأسهم) ، وهي سمة من سمات معالجة الرنا الريباسي البطيئة أو المتأخرة.
تتوافق ملاحظة كثافة البوليميراز المنخفضة مع نتائج وضع العلامات على النبض في الشكل. & # x200B الشكل 2 ، 2 ، مما يشير إلى ضعف نسخ الرنا الريباسي في موت 1 الخلايا. تبدأ معالجة الرنا الريباسي في نسخ الرنا الريباسي الوليدة ويمكن تصورها بواسطة EM (43). أظهر تحليل EM أنه بالإضافة إلى عيب في النسخ ، تأخرت معالجة الرنا الريباسي باستمرار أو تباطأت موت 1 سلالات نسبة إلى ذلك في النوع البري. يمكن ملاحظة ذلك على جينات الرنا الريباسي التمثيلية في الشكل 3 ب و ج. على وجه التحديد ، شوهدت أحداث معالجة الرنا الريباسي العادية ، بما في ذلك ضغط الرنا الريباسي قبل 18S في سيروم الوحدة الفرعية الريبوزومية الصغيرة (SSU) وانقسامها اللاحق من النسخة الوليدة ، على طول جين الرنا الريباسي من النوع البري كما هو متوقع (الشكل 1 ب).& # x200B (الشكل 3 ب) 3 ب) ولكن ليس في جينات الرنا الريباسي من موت1-14 الخلايا (الشكل & # x200 ب (الشكل 3 ج) 3 ج) أو موت 1-1 الخلايا (الموضحة أدناه). بدلاً من ذلك ، وصلت نسخ الرنا الريباسي في الخلايا الأخيرة إلى نهاية الجين قبل التعبئة الكبيرة وبدون انقسام الحمض النووي الريبي. قد يمثل هذا عيبًا حركيًا محددًا في معالجة الرنا الريباسي أو فك ارتباط النسخ ومعالجة الرنا الريباسي كنتيجة لتقليل نسخ Pol I (انظر المناقشة). الأهم من ذلك ، لوحظت هذه الاختلافات في كثافة Pol I ومعالجة الرنا الريباسي في كل من اثنين مختلفين موت 1 سلالات ، مما يشير إلى أن هذه التأثيرات لا تعتمد على موت 1 أليل أو سلالة الخلفية. أظهر تحليل الارتباط المتقاطع بسورالين (الشكل & # x200B (الشكل 4) 4) أن نسبة جينات الرنا الريباسي النشطة كانت هي نفسها في النوع البري و موت 1 الخلايا. تمشيا مع تحليل EM ، تشير هذه الملاحظة إلى أن Mot1 يؤثر على استخدام جينات الرنا الريباسي الفردية المختصة بالنسخ بدلاً من عدد القوالب النشطة.
عدد تكرارات rDNA النشط هو نفسه في wild-type و موت 1 الخلايا. يؤدي ربط السورالين المتقاطع للحمض النووي الريبوزومي إلى إبطاء هجرة التكرارات المنسوخة بنشاط. من النوع البري (WT) ، موت1-14، و موت 1-42 تم حصاد الخلايا في طور السجل ثم تعامل السورالين والأشعة فوق البنفسجية كما هو موصوف في المواد والطرق. تم بعد ذلك هضم محضرات الحمض النووي الجينومي باستخدام EcoRI ، وحلها على جل 1.3 & # x00025 agarose-Tris-borate-EDTA ، ونقلها إلى غشاء ، والتحقيق فيها باستخدام جزء 35S rDNA. يُشار إلى التكرارات المكتوبة بنشاط (مفتوح) والتكرارات غير النشطة (المغلقة) على البقعة ، ويُشار إلى النسب المئوية للتكرارات المفتوحة في الرسم البياني الشريطي.
توطين Mot1 إلى rDNA ودوره في تجميع عمليات الموافقة المسبقة عن علم و SSU.
تأثير موت 1 على نسخ Pol I يمكن أن ينتج بشكل غير مباشر من تأثير Mot1 على نسخ عامل (عوامل) Pol I ، أو وظيفة مباشرة لـ Mot1 في نسخ Pol I ، أو مزيج من الاحتمالين. كما هو مبين في الشكل 5A و B ، بواسطة ChIP ، تم اكتشاف Mot1 بسهولة في كل منطقة من المناطق الثلاث من rDNA ، بما في ذلك مروج Pol I (NTS2). حدثت نقطة المنتصف لنطاق الاستجابة الخطية لـ Mot1 ChIP إلى rDNA بعد 22 دورة من PCR ، أي أقل بمقدار 5 من عدد الدورات المطلوبة للوصول إلى نقطة منتصف النطاق الخطي لـ Mot1 ChIP إلى INO1، جين Mot1 المكبوت جيدًا (14). نظرًا لوجود rDNA في نسخ متعددة ، لم يكن من الممكن إجراء مقارنة مباشرة بمستوى Mot1 الموجود في نسخة واحدة من مروجي Pol II. ومع ذلك ، فإن الارتباط الوثيق بين توطين Mot1 ومواقع عملها في مروجين Pol II (1 ، 13 ، 23) يشير إلى أن إشارة Mot1 ChIP القوية التي تم الحصول عليها في rDNA ترجع إلى دور وظيفي مباشر لـ Mot1 في تخليق الرنا الريباسي. كما هو متوقع ، تم ترجمة TBP أيضًا إلى NTS2 ، لكن إشارة TBP ChIP لم تتأثر بطفرة Mot1 (الشكل & # x200B (الشكل 5C). 5C). تشير هذه النتائج إلى أن دور Mot1 في نسخ Pol I لا يمكن أن يعزى إلى إزاحة TBP المحفزة Mot1 من NTS2.
شغل TBP الذي لا يمكن تمييزه لـ NTS2 في البرية من النوع و موت 1 يبدو أن الخلايا تتعارض مع الاختلافات في معدل نسخ الرنا الريباسي في هذه السلالات. نظرًا لأن Mot1 له دور في التحكم في بدء نسخ Pol II واختيار موقع البدء (44) ، كان أحد الاحتمالات أن مجمعات نسخ Pol II تتجمع بشكل زائف على rDNA في موت 1 الخلايا. لفحص هذا الاحتمال ، تم تحليل rDNA بواسطة ChIP للإشغال بواسطة Pol II ، بالإضافة إلى عامل النسخ العام الخاص بـ Pol II TFIIB. كما هو مبين في الشكل 5D و E ، كانت مستويات TFIIB و Pol II على rDNA أقل بشكل ملحوظ من مستويات هذه العوامل الموجودة في قانون 1 المروجين. في حين أنه من غير الممكن الحصول على مقياس مطلق للشغل في rDNA مقابل قانون 1 بسبب الاختلافات في رقم نسخة الجينات ، في ظل هذه الظروف ، كانت إشارة NTS2 TBP ChIP مشابهة لـ TBP ChIP إلى قانون 1 (الشكل & # x200B (الشكل 5C) ، 5C) ، في حين أن مدى TFIIB و Pol II ChIP إلى rDNA كان جزءًا صغيرًا فقط من ذلك في قانون 1 (الشكل 5 د و هـ). نظرًا لأن نسب TFIIB إلى TBP و Pol II إلى TBP في rDNA كانت أقل بشكل ملحوظ من هذه النسب عند قانون 1، نستنتج أن تكوين Pol II PICs كان غير مفضل على rDNA في كل من النوع البري و موت 1 الخلايا مقارنة بالحالة مع قانون 1. بشكل جماعي ، تشير هذه النتائج إلى أن Mot1 قد يكون لها وظيفة مباشرة في نسخ Pol I تختلف عن دورها في نسخ Pol II.
لمزيد من استكشاف الآلية المحتملة لعمل Mot1 في rDNA ، قمنا بعد ذلك بقياس شغل NTS2 بثلاثة عوامل نسخ عامة Pol I (الوحدات الفرعية UAF Rrn5 و Rrn9 و CF الوحدة Rrn7) ، بالإضافة إلى الوحدة الفرعية Pol I Rpa135. نمت سلالات Rrn5 و -7 و -9 و Rpa135 التي تحمل علامات FLAG بشكل يتعذر تمييزها عن الخلايا البرية (الشكل & # x200B (الشكل 6A) ، 6A) ، مما يشير إلى أن البروتينات الموسومة تعمل بكامل طاقتها. باستثناء انخفاض طفيف في معدل نمو FLAG-Rrn5 موت 1-42 مقارنة بخلايا غير المميزة موت 1-42 سلالة ، لم تكن هناك عيوب نمو اصطناعي لوحظت في موت 1-42 الخلايا التي تؤوي هذه البروتينات الموسومة بعلامة FLAG (الشكل & # x200B (الشكل 6 أ). 6 أ). لكن المثير للدهشة أن تحليل اللطخة الغربية لمستخلصات الخلية الكاملة للخميرة أظهر أن مستويات كل هذه العوامل قد انخفضت في موت 1-42 الخلايا مقارنة بالخلايا من النوع البري (الشكل & # x200 ب (الشكل 6 ب). 6 ب). ومع ذلك ، كان ارتباط Rrn5 و Rrn7 و Rrn9 و Rpa135 مع NTS2 أكبر إلى حد ما في موت 1-42 مقارنة بالخلايا من النوع البري (الشكل & # x200 ب (الشكل 6 ج) ، 6 ج) ، مما يشير إلى أنه في الخلايا البرية ، يفرض Mot1 حدًا لمدى ارتباط هذه العوامل بـ rDNA.
تم تعزيز تجنيد UAFs ومجمع CF في موت 1 الخلايا. (أ) فحوصات بقعة التخفيف التسلسلي للسلالات التي تعبر عن البروتينات المشار إليها بعلامة FLAG في WT و موت 1-42 الخلايا. تم تحضين لوحات YPD (الوسط الغني) في درجات الحرارة المحددة لمدة يومين قبل التصوير. (ب) لطخة غربية تظهر مستويات البروتين في WT أو موت 1-42 الخلايا. تنخفض مستويات البروتين (باستثناء Rrn7 ، الذي لا يتأثر) في موت 1 الخلايا. (ج) التحديد الكمي للرقاقة إلى NTS2 (منطقة تضخيم الحمض النووي الموضحة في الشكل. & # x200B الشكل 5). 5). يتم زيادة تجنيد كل من UAFs ومجمع CF بشكل طفيف في موت 1 الخلايا. لاحظ أن الانخفاض الكبير في مستويات البروتين لا يؤثر على قدرة هذه البروتينات في النسخ.
تشير النتائج في الشكل. & # x200B الشكل 2 2 و & # x200B و 3 3 إلى عدم الكفاءة والتأخير في تجميع آلية معالجة RNA 35S في موضع rDNA. لمزيد من التحقيق في هذا العيب الظاهر ، تم إنشاء سلالات يتم فيها تمييز مكون معالجة SSU Utp8 أو Utp9 أو Utp10 (17) باستخدام حاتمة HA إما في النوع البري أو موت 1-42 معرفتي. ترتبط بروتينات Up بكل من المنطقة القريبة من المروج لـ rDNA والنهاية 5 & # x02032 لـ 35S pre-rRNA وتشارك في اقتران نسخ الرنا الريباسي ومعالجته (20). نمت سلالات HA-Utp8 و HA-Utp9 بشكل مشابه إلى النوع البري غير المميز و موت 1-42 سلالات ، مما يشير إلى أن بروتينات Utp8 و Utp9 المعلمة كانت تعمل بكامل طاقتها (الشكل & # x200B (الشكل 7A). 7A). في المقابل ، نمت سلالة HA-Utp10 إلى حد ما بشكل أبطأ من الخلايا البرية متساوية المنشأ وعرضت نمطًا ظاهريًا مريضًا اصطناعيًا عندما تم دمج الجين الموسوم مع موت 1-42 أليل (الشكل & # x200B (الشكل 7 أ). 7 أ). أظهر تحليل اللطخة الغربية لمستخلصات الخلية الكاملة للخميرة أن مستويات Utp8 و Utp9 و Utp10 قد انخفضت في موت 1-42 مقارنة بالخلايا الموجودة في الخلايا البرية (الشكل & # x200 ب (الشكل 7 ب). 7 ب). على الرغم من انخفاض مستوياتها ، إلا أن ارتباط الحمض النووي الريبي لـ Utp8 و Utp9 لم يتأثر بشكل ملحوظ بطفرة MOT1 (الشكل & # x200B (الشكل 7C) ، 7C) ، مما يشير إلى أن عيب المعالجة في موت 1-42 الخلايا ليست مجرد نتيجة لانخفاض ارتباط الكروماتين نتيجة لانخفاض مستوى البروتين الكلي. تم الحصول على نتيجة مماثلة لـ HA-Utp10 ChIP ، على الرغم من أن نتائج ChIP كانت مرتبطة بخطأ أكبر من HA-Utp8 و HA-Utp9. عيب النمو التخليقي في HA-Utp10 موت 1-42 تتوافق الخلايا مع التفاعل الوظيفي بين Utp10 و Mot1 ، ولكن نظرًا لأن بروتين Utp10 الموسوم يبدو أنه لا يعمل بشكل كامل في الجسم الحي ، فربما يكون النشاط الضعيف لـ HA-Utp10 ومرض السلالات مسؤولاً عن التباين في نتائج ChIP لـ هذا العامل.
لا يتأثر تجنيد مكونات عملية SSU للكروماتين موت 1 الخلايا. (أ) اختبار موضعي يُظهر نمو التخفيفات التسلسلية بمقدار 10 أضعاف باستخدام HA الموسومة Utps في WT و موت 1-42 سلالات. تظهر خلايا HA-Utp10 عيبًا اصطناعيًا شديدًا مع موت 1-42. (ب) لطخة غربية تكشف عن مستويات Utp في WT و موت 1-42 سلالات. يؤثر Mot1 على مستوى التعبير لجميع Utps الثلاثة التي تم اختبارها. تشير علامة النجمة إلى موضع Utp10 ، والذي يتم التعبير عنه بمستويات منخفضة حتى في خلايا WT. (ج) القياس الكمي لنتائج Utp ChIP. يوضح الرسم البياني متوسط القيمة & # x000b1 الانحراف المعياري الذي تم الحصول عليه باستخدام دفعتين معدتين بشكل مستقل من الكروماتين. لاحظ أن مدى ارتباط Up بالكروماتين لا يعتمد على مستوى البروتين الكلي في مستخلصات الخلية الكاملة.
يتطلب تركيب ومعالجة الرنا الريباسي الفعال نشاط Mot1 ATPase.
يؤدي نشاط ATPase الخاص بـ Mot1 إلى إزاحة TBP من الحمض النووي وهو مطلوب لوظيفته الأساسية في الجسم الحي (4). بقدر ما لم تتأثر مستويات TBP ChIP عند NTS2 في موت 1 الخلايا ، كان من المهم تحديد ما إذا كان نشاط ATPase مهمًا لوظيفة Mot1 في تخليق الرنا الريباسي. لمعالجة هذا السؤال ، موت 1-1 تم تحويل الخلايا بنسخ محمولة بالبلازميد من النوع البري MOT1, موت 1 - 505، أو ناقل وحده. موت 1 - 505 يحتوي على طفرات متعددة في نموذج Walker B لجيب ربط ATP ، مما يؤدي إلى تدمير نشاط ATPase (54). الأهم ، موت 1 - 505 يتم التعبير عنها بمستويات من النوع البري في الجسم الحي (54). كما هو مبين في الشكل & # x200B الشكل 8 أ ، 8 أ ، موت 1-1 معربا عن الخلايا موت 1 - 505 كان لديها مستويات مرتفعة من الحمض النووي الريبي 35S غير المعالج مماثلة لتلك التي تحتوي على ناقلات وحدها ، في حين أن إضافة النوع البري MOT1 استعادة المستوى المنخفض الطبيعي لـ 35S RNA. أظهر تحليل EM أن rDNA loci موجودة في موت 1 - 505 تحتوي الخلايا على كثافة بوليميراز تبدو مشابهة جدًا لتلك الموجودة في موت 1-1 الخلايا ، والنصوص المنتجة في هذه الخلايا تفتقر إلى المقابض الطرفية التي تشير إلى كفاءة معالجة الحمض النووي الريبي 35S (الشكل 8 ب إلى د). وبالتالي ، فإن نشاط ATPase الخاص بـ Mot1 مطلوب لوظيفته في نسخ Pol I.
نشاط Mot1 ATPase مطلوب للنسخ الصحيح لـ 35S RNA. (أ) تظهر نتائج التحليل الشمالي مستويات الحمض النووي الريبي 35S النسبية في كل من السلالات الثلاث. موت 1-1 تم تحويل الخلايا باستخدام ناقل بلازميد أو بلازميدات تحمل النوع البري (WT) MOT1 أو موت 1 - 505 (DEAD box mutant) ، وتم إجراء التحليل الشمالي كما في الشكل. & # x200B الشكل 1. 1. تم تطبيع مستويات 35S RNA النسبية إلى قانون 1 مستويات الرسائل في كل سلالة. يوضح الرسم البياني متوسط & # x000b1 الانحراف المعياري الذي تم الحصول عليه من تجربتين مستقلتين. (ب إلى د) صورة مجهرية إلكترونية من rDNA من موت 1-1 تحولت الخلايا من النوع البري MOT1 (ب)، موت 1 - 505 (ج) ، أو ناقل (د) بلازميد. لاحظ أن العدد المنخفض للنصوص والعيوب في معالجة النسخ المتماثل التي شوهدت مع السلالة الحاملة للناقل تم استعادتها فقط عن طريق التعايش مع النوع البري MOT1 لكن لا موت 1 - 505، وهو معيب لنشاط Mot1 ATPase.
توظيف Mot1 لمروج Pol I في المختبر.
أشارت النتائج السابقة إلى أن Mot1 غير مطلوب لنسخ Pol I في المختبر (4). في ضوء العيوب في تخليق الرنا الريباسي في موت 1 الخلايا الموضحة أعلاه ، تمت إعادة فحص دور محتمل لـ Mot1 في نسخ Pol I في المختبر. كما هو مبين في الشكل. & # x200B الشكل 9 أ ، 9 أ ، بما يتفق مع النتائج السابقة ، مقتطفات من خلية كاملة من موت 1-1 دعمت الخلايا نسخ Pol I. نظرًا لأن بروتين Mot1 لا يمكن اكتشافه في مقتطفات من موت 1-1 الخلايا (غير معروضة) ، تشير هذه النتيجة إلى أن Mot1 ليس ضروريًا لنسخ Pol I في المختبر. معايرة مستخلصات الخلية الكاملة من النوع البري و موت 1-1 كشفت الخلايا ذلك موت 1-1 كانت المقتطفات ذات سعة منخفضة لنسخ Pol I مقارنة بالمقتطفات من خلايا من النوع البري (الشكل & # x200B (الشكل 9 أ) ، 9 أ) ، ولكن من المحتمل أن يكون هذا الاختلاف الكمي بسبب التأثيرات المشتركة لاستنفاد Mot1 ، أيضًا كمستويات مخفضة من إنزيم Pol I ومجموعة فرعية من عوامل النسخ العامة Pol I في المستخلص (الشكل & # x200B (الشكل 6 ب 6 ب).
وبالتالي ، تم استخدام نهج أكثر مباشرة لتحديد ما إذا كان قد تم تجنيد Mot1 لمروج Pol I من خلال الارتباط مع TBP و / أو المكونات الأخرى لآلة النسخ العامة Pol I. تم تحليل ارتباط Mot1 مع مروج Pol I في المختبر باستخدام اختبار قالب ثابت (3). تم تحضين مقتطفات الخلية الكاملة باستخدام قالب Pol I المرتبط بالخرز للسماح بتكوين مجمعات النسخ. تمت إزالة العوامل غير المقيدة بعد ذلك عن طريق غسل الخرز ، وتم تحليل Mot1 المرتبط بالقالب بواسطة النشاف الغربي. كما هو مبين في الشكل & # x200B الشكل 9B 9B (الممر 1) ، باستخدام مقتطفات من الخلايا البرية ، تم اكتشاف ارتباط Mot1 مع مروج Pol I بسهولة. لتحديد ما إذا كانت عوامل النسخ العامة الخاصة بـ Pol I أو Pol I متورطة في توظيف Mot1 في مروج Pol I ، استفدنا من سلالة الخميرة التي يتم فيها دعم تخليق الرنا الريباسي بواسطة Pol II المعتمد GAL7 مروج (39). في هذه السلالة ، يتجاوز Pol II متطلبات جهاز Pol I ، مما يسمح بفقدان الجينات المشفرة لعوامل نسخ Pol I التي تكون ضرورية بخلاف ذلك. مستويات Mot1 في مقتطفات من rrn3 & # x00394, rrn7 & # x00394، و rpa190 & # x00394 كانت الخلايا قابلة للمقارنة مع المستوى في المقتطفات من الخلايا البرية (الشكل & # x200 ب (الشكل 9 ب). 9 ب). ومن المثير للاهتمام ، أن توظيف Mot1 في مروج Pol I في المختبر كان يعتمد بشدة على Rrn7 ، أحد مكونات CF ، وكذلك Pol I نفسه ، كما يتضح من فقدان ربط Mot1 بالمروج في المقتطفات التي تفتقر إلى الوحدة الفرعية الخاصة بـ Pol I Rpa190 (الشكل & # x200B (الشكل 9B ، 9B ، الممرات 4 و 5). على النقيض من ذلك ، كان ارتباط Mot1 مع مروج Pol I أقل اعتمادًا على عامل Pol I المرتبط Rrn3. تم أيضًا تقليل تجنيد Mot1 باستخدام مقتطفات استنفد من الوحدة الفرعية UAF Rrn5 ، ولكن كان هناك عدد أقل من Mot1 في rrn5 & # x00394 مقتطف ، مما يجعل تقييم دور Rrn5 في توظيف Mot1 غير واضح. بشكل عام ، تدعم هذه النتائج نموذجًا يرتبط فيه Mot1 بمروج Pol I عبر تفاعلات تعاونية بين العوامل الخاصة بـ Pol I التي تثبت تشكيل Pol I PIC.
المواد والأساليب
سلالات ووسائل الإعلام
لتوليد JS490 و JS493 و JS566 ، تم إنشاء ملف RPD3, SIN3 أو SIR2 تم حذف إطارات القراءة المفتوحة (ORFs) ، على التوالي ، من JS311 واستبدالها بامتداد كان علامة بطريقة استبدال الجينات بخطوة واحدة (سميث وآخرون، 1999). تم إجراء فروق ميلر على مشتقات S288C و JS772 و JS777. تم وصف التركيب الوراثي لكل سلالة في الجدول الثاني.
أضنى | الطراز العرقى |
JS311 سميث وآخرون. (1999) . | حصيرةα his3Δ200 leu2Δ1 met15Δ0 trp1Δ63 ura3-167 RDN1 :: Ty1-MET15، mURA3-HIS3 |
JS490 سميث وآخرون. (1999) . | صنع JS311 rpd3Δ :: kanMX4 |
شبيبة 566 | صنع JS311 sir2Δ :: kanMX4 |
JS218 b b Smith and Boeke (1997). | حصيرةα his3Δ200 leu2Δ1 ura3-167 sir2Δ :: HIS3 RDN1 :: Ty1- mURA3 |
JS772 ج ج Winzeler وآخرون. (1999) . | حصيرةأ his3Δ0 leu2Δ0 ura3Δ0 |
JS777 | صنع JS772 rpd3Δ :: kanMX4 |
عبر ربط سورالين
تم إجراء فحوصات السورالين المتقاطعة كما هو موصوف سابقًا (Dammann وآخرون. ، 1993 سميث وبويك ، 1997). تم استخدام مزارع الطور الثابت لتلقيح 250 مل من مزارع YPD الطازجة إلى أ600 من ∼0.2. تم حصاد قسامات من خلايا ∼1 × 10 8 في النقاط الزمنية المحددة. تم إعادة تعليق الخلايا المغسولة في 1.4 مل من TE المثلج وتم تقطيع 0.7 مل من هذا الخليط في لوحة زراعة الأنسجة 24 بئر 40 ميكرولتر من محلول 200 ميكروغرام / مل من 4،5 ′ ، وكان 8-trimethylpsoralen (Sigma) يضاف إلى كل بئر. تم بعد ذلك تشعيع الخلايا بالأشعة فوق البنفسجية (نموذج مصباح الأشعة فوق البنفسجية B-100A Ultraviolet Products ، Inc.) على الجليد لمدة خمس جرعات من 5 دقائق على مسافة 6 سم. تم تكوير الخلايا بالكرات مع zymolyase ، lysed ، معاملة بروتيناز K ، استخلاص الفينول - كلوروفورم وتم ترسيب الحمض النووي الناتج عن الإيثانول. تم إعادة تعليق الحبيبات في TE وتم تطبيعها إلى تركيز حمض نووي قدره 2 مجم / مل ، وتم هضم 4 ميكرولتر باستخدام سابقة بمعنى البيئةRI في تفاعل 30 ميكرولتر. تم فصل الحمض النووي المشقوق على هلام الاغاروز 1.3٪ ونقله إلى غشاء نايلون موجب الشحنة. تم الكشف عن نطاقات محددة rDNA عن طريق التهجين مع 3.6 كيلو بايت Xbaأنا-Xbaأنا جزء يحتوي على معظم منطقة 35S من الخميرة rDNA (الشكل 1A).
تحليل لطخة الحمض النووي الريبي
نمت مزارع الخميرة على النحو الموصوف أعلاه من أجل ربط السورالين المتقاطع. تم حصاد الخلايا (∼4 × 10 8) في النقاط الزمنية المحددة وتم عزل الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام طريقة حمض الفينول (Ausubel وآخرون. ، 2000). تم فصل إجمالي الحمض النووي الريبي (15 ميكروغرام) على 1.2 ٪ من الاغاروز -2 ٪ هلام الفورمالديهايد ونقلها إلى مرشح نايلون. تم تهجين المرشح لمدة 90 دقيقة باستخدام مسبار يحمل علامة P 32 JS45 (5′-TCGGGTCTCTCTGCTGCC GGAAATGCTCTGTTCA-3 ′) ، والذي يتهجين إلى 5 ETS من 35S rRNA. تم إجراء التهجين في محلول كويخيبي (ستراتاجين) عند 65 درجة مئوية. تم غسل المرشحات مرتين (5 دقائق) عند درجة حرارة الغرفة باستخدام 2 × SSC / 0.1٪ SDS ثم مرتين أكثر عند 60 درجة مئوية مع 0.1 × SSC / 0.1٪ SDS. تم تصور نطاقات 35S rRNA بواسطة التصوير الشعاعي الذاتي. ال قانون 1 كان مسبار قليل النوكليوتيد JB2351 (5′-GTC ACCGGCAAAACCGGCTTTACACATACCAGAACCGTTATCAAT AACCAAAGCAGCAAC-3). كان التهجين باستخدام هذا المسبار هو نفسه مع JS45 فيما عدا أن درجة حرارة التهجين كانت 60 درجة مئوية والغسيل بدرجة حرارة عالية كان عند 55 درجة مئوية.
فحص التشغيل النسخي
في الجسم الحي تم إجراء فحوصات التشغيل على النحو الموصوف سابقًا (Elion and Warner ، 1986 Cormack and Struhl ، 1992) ، مع العديد من التعديلات.تم حصاد الخلايا (∼8 × 10 7) من ثقافات طور السجل (OD600 = 0.5) أو الثقافات التي كانت تقترب من المرحلة الثابتة (OD600 = 5.6). تم غسل الخلايا مرتين باستخدام المخزن المؤقت TMN المثلج (10 ملي مولار تريس - حمض الهيدروكلوريك 7.4 ، 100 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي مولار MgCl2) ، معلق في 1 مل من 0.5٪ صوديوم ن-اللورويل ساركوزين وحضنت لمدة 15 دقيقة على الجليد. تم تكوير الخلايا بعد ذلك وتعليقها في خليط تفاعل 100 ميكرولتر يحتوي على 50 ملي مولار من Tris – HCl pH 7.9 ، 100 ملي مول كلوريد ، 5 ملي مول كلوريد2، 1 مم MnCl2، 2 ملي مولار DTT ، 0.5 ملي مولار ATP ، 0.25 ملي مولار CTP ، 0.25 ملي مولار GTP ، 10 ملي فوسفوكرياتين ، 10 مجم / مل كرياتين فوسفوكيناز ، 100 μCi [α- 32 P] UTP (800 Ci / mmol) و 25 ميكروغرام / مل α- أمانيتين. تم تحضين هذا التفاعل عند 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم تم إيقافه بإضافة 1 مل من TMN المثلج البارد مع 1 ملي مولار من UTP. تم عزل RNA الكلي وفصله بواسطة RNA النشاف كما هو موضح أعلاه. تم الكشف عن الحمض النووي الريبي المسمى بواسطة التصوير الشعاعي الذاتي وقياس الكميات باستخدام Molecular Dynamics Storm PhosphorImager.
المجهر الإلكتروني
نمت الخميرة في YPD بالإضافة إلى 1 M من السوربيتول حتى منتصف (أ600 = 0.4) أو بعد- (أ600 = 2.5) مرحلة التسجيل. تم تحضير فرشات ميلر كروماتين من سلالات الخميرة بعد هضم قصير لجدار خلية الخميرة مع zymolyase متبوعًا بتحلل منخفض التوتر في 0.025 ٪ Triton X-100 pH 9 (Hamkalo and Miller ، 1973 Rattner وآخرون، 1982). تم حصاد أحجام 1 و 0.2 مل ، واستخدمت تركيزات إنزيم زيمولياز من 5 و 25 مجم / مل لخلايا المرحلة المتوسطة وما بعد التسجيل ، على التوالي. تم إجراء هضم جدار الخلية عند 30 درجة مئوية مع الرج في وجود أكتينوميسين د (0.1 مجم / مل). بعد 4 دقائق ، تم عصر الهضم بأقصى سرعة في جهاز طرد مركزي دقيق من إيبندورف لمدة 6 ثوان وأعيد تعليق حبيبات الخميرة في 1 مل من محلول التحلل ، والذي تم بعد ذلك تخفيفه مرة أخرى باستخدام 3 مل إضافي من محلول التحلل. تم تحريك العينات برفق لمدة 20 دقيقة للسماح بتشتيت المحتويات الخلوية قبل تثبيتها بـ 0.4 مل من 0.1 مولار سكروز و 3.7٪ فورمالين وطردها على شبكات EM مغلفة بالكربون. تم تلطيخ الشبكات بعد ذلك بحمض الفوسفوتونجستيك وخلات اليورانيل وفحصها في مجهر JEOL 100 CX.
النشاف الغربي
تم فصل WCEs على 12٪ SDS – polyacrylamide gel ثم نقلها إلى أغشية PVDF. تم توفير الأجسام المضادة الخاصة بـ H4 الأسيتيل (بنتا H4) والأسيتيل H3 (K9 ، 14-أسيتيل) و H3 الميثيل على K4 من قبل David Allis ، وتم تحضينها مع الغشاء عند تخفيف 1: 5000 في PBS-T (1 × PBS ، 0.05٪ توين -20) تحتوي على 2٪ حليب لمدة ساعة عند درجة حرارة الغرفة. تم تحضين جميع الأجسام المضادة الأخرى عند تخفيف 1: 10000 لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة. تم غسل الأغشية باستخدام PBS-T (2٪ حليب). تم شراء الأجسام المضادة الخاصة بـ هيستون H4 الأسيتيل على ليسين 5 أو 8 أو 12 أو 16 من Serotec. كان الجسم المضاد الثانوي عبارة عن اتحاد ماعز α-rabbit-HRP يستخدم بتخفيف 1: 5000 (Amersham Biosciences). تم اكتشاف الهستونات المعدلة بعد الترجمة H3 و H4 باستخدام كواشف ECL من Amersham Biosciences.
رقائق
نمت مزارع YPD (50 مل) من JS311 و JS490 في مرحلة السجل (أ600 = 1) أو المرحلة الثابتة المبكرة (أ600 = 7) ، ثم ثبته لمدة ساعة مع 1٪ فورمالديهايد. تم إجراء استخراج الكروماتين والتغيرات المناعية كما هو موضح سابقًا (Kuo and Allis ، 1999). تم تعليق حبيبات الخلايا في 400 ميكرولتر من محلول FA-lysis (50 ملي مولار HEPES-KOH pH 7.5 ، 140 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي مولار EDTA ، 1٪ Triton X-100 ، 0.1٪ حمض deoxycholic ، 1 ملي PMSF ، 1 ميكروغرام / مل ليوببتين ، 1 ميكروغرام / مل بيبستاتين). تم تعطيل الخلايا بالخرز الزجاجي في BioSpec Products Mini Beadbeater. تم صوت المستخلص لتفتيت الكروماتين ثم طرده عند 14000 دورة في الدقيقة. لمدة 20 دقيقة لتوضيح WCE.
من أجل التهابات المناعة ، تم دمج 200 ميكرولتر من محلول FA-lysis مع 40 ميكرولتر من WCE و 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة للهيستون. تم تحضين هذا الخليط عند 4 درجات مئوية طوال الليل على محور دوار. تم ترسيب الكروماتين المربوط باستخدام خرزات البروتين A-Sepharose (Amersham Biosciences) لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية. تم غسل الحبيبات على نطاق واسع وتم التصفية من المجمعات المناعية مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من 1 ٪ SDS / 0.1 M NaHCO3 في درجة حرارة الغرفة. بعد عكس الارتباط المتبادل ، تمت معالجة المادة المستردة بـ RNase A ثم بروتيناز K. تم استخراج الحمض النووي المتبقي بالفينول وترسيب الإيثانول وإعادة تعليقه في حجم نهائي قدره 150 ميكرولتر من TE. تم استخدام كل عينة (3 ميكرولتر) في 50 ميكرولتر من PCRs الخاصة بمناطق NTS1 أو NTS2 أو 5′-ETS أو 25S من rDNA ، أو INO1, حصيرةα و كوب 1 الجينات. تم فصل منتجات PCR على 2٪ agarose – 1 × TBE gel ، ملطخة ببروميد الإيثيديوم والصور الملتقطة باستخدام نظام توثيق وتحليل AlphaImager 2000 من Alpha Innotech. كانت الأجسام المضادة هي نفسها المستخدمة في النشاف الغربي.
محتويات
تم التعرف على النواة بواسطة الفحص المجهري للمجال اللامع خلال ثلاثينيات القرن التاسع عشر. [6] لم يكن معروفًا سوى القليل عن وظيفة النواة حتى عام 1964 ، عندما أجريت دراسة [7] على النوى بواسطة جون جوردون ودونالد براون في الضفدع الأفريقي المخالب Xenopus laevis ولّد اهتمامًا متزايدًا بوظيفة النواة وبنيتها التفصيلية. ووجدوا أن 25٪ من بيض الضفادع لا يحتوي على نواة وأن مثل هذه البويضات لم تكن قادرة على الحياة. نصف البيض يحتوي على نواة واحدة و 25٪ منها نواة. وخلصوا إلى أن النواة لها وظيفة ضرورية للحياة. في عام 1966 ، أظهر ماكس ل. بيرنستيل ومعاونوه من خلال تجارب تهجين الحمض النووي أن الحمض النووي الموجود داخل النواة يحتوي على شفرة الحمض النووي الريبوزي. [8] [9]
يتم التعرف على ثلاثة مكونات رئيسية للنواة: المركز الليفي (FC) ، والمكون الليفي الكثيف (DFC) ، والمكون الحبيبي (GC). [1] يحدث نسخ rDNA في FC. [10] يحتوي DFC على البروتين الليفي ، [10] وهو أمر مهم في معالجة الرنا الريباسي. يحتوي GC على بروتين nucleophosmin ، [10] (B23 في الصورة الخارجية) والذي يشارك أيضًا في التكوين الحيوي للريبوسوم.
ومع ذلك ، فقد تم اقتراح أن هذه المنظمة المعينة يتم ملاحظتها فقط في حقيقيات النوى الأعلى وأنها تطورت من منظمة ثنائية مع الانتقال من anamniotes إلى amniotes. يعكس الزيادة الكبيرة في المنطقة الجينية للحمض النووي ، كان من الممكن أن ينفصل مكون ليفي أصلي إلى FC و DFC. [11]
تم تحديد بنية أخرى داخل العديد من النوى (خاصة في النباتات) وهي منطقة واضحة في وسط الهيكل يشار إليها بالفجوة النووية. [12] نواة من أنواع نباتية مختلفة ثبت أنها تحتوي على تركيزات عالية جدًا من الحديد [13] على عكس نوى الخلايا البشرية والحيوانية.
يمكن رؤية البنية التحتية للنواة من خلال المجهر الإلكتروني ، في حين يمكن دراسة التنظيم والديناميكيات من خلال وضع علامات على البروتين الفلوري واستعادة الفلورسنت بعد التبييض الضوئي (FRAP). يمكن أيضًا استخدام الأجسام المضادة ضد بروتين PAF49 كعلامة للنواة في تجارب التألق المناعي. [14]
على الرغم من أنه يمكن رؤية نواة واحدة أو اثنتين فقط ، إلا أن الخلية البشرية ثنائية الصبغة تحتوي على عشر مناطق منظمة للنواة (NORs) ويمكن أن تحتوي على عدد أكبر من النوى. غالبًا ما تشارك NORs متعددة في كل نواة. [15]
في التكوين الحيوي للريبوسوم ، هناك حاجة إلى اثنين من بوليمرات الحمض النووي الريبي حقيقية النواة الثلاثة (القطب الأول والثالث) ، وتعمل هذه العناصر بطريقة منسقة. في المرحلة الأولية ، يتم نسخ جينات الرنا الريباسي كوحدة واحدة داخل النواة بواسطة بوليميريز الحمض النووي الريبي I. من أجل حدوث هذا النسخ ، يلزم وجود العديد من العوامل المرتبطة بـ pol I وعوامل التحويل الخاصة بالحمض النووي. في الخميرة ، الأهم هو: UAF (عامل تنشيط المنبع) ، TBP (بروتين ربط صندوق TATA) ، وعامل الربط الأساسي (CBF)) الذي يربط عناصر المروج ويشكل معقد ما قبل البدء (PIC) ، والذي يتم التعرف عليه بدوره بواسطة RNA pol. في البشر ، يتم تجميع الموافقة المسبقة عن علم مماثلة مع SL1 ، عامل انتقائية المروج (يتكون من عوامل مرتبطة بـ TBP و TBP ، أو TAFs) ، وعوامل بدء النسخ ، و UBF (عامل ربط المنبع). يقوم RNA polymerase I بنسخ معظم نسخ الرنا الريباسي 28S و 18S و 5.8S) لكن الوحدة الفرعية 5S rRNA (مكون من الوحدة الفرعية الريبوسومية 60S) يتم نسخها بواسطة RNA polymerase III. [16]
ينتج عن نسخ الرنا الريباسي جزيء سلائف طويل (45S pre-rRNA) والذي لا يزال يحتوي على ITS و ETS. هناك حاجة إلى مزيد من المعالجة لتوليد جزيئات 18S RNA و 5.8S و 28S RNA. في حقيقيات النوى ، يتم إحضار الإنزيمات المعدلة للـ RNA إلى مواقع التعرف الخاصة بها عن طريق التفاعل مع RNAs الإرشادية ، والتي تربط هذه التسلسلات المحددة. تنتمي هذه الحمض النووي الريبي الإرشادي إلى فئة الحمض النووي الريبي الصغير (snoRNAs) والتي تكون معقدة بالبروتينات وتوجد كبروتينات ريبونوكليوبروتينات نواة صغيرة (snoRNPs). بمجرد معالجة الوحدات الفرعية للـ rRNA ، تكون جاهزة للتجميع في وحدات فرعية ريبوسومية أكبر. ومع ذلك ، فإن جزيء الرنا الريباسي الإضافي ، الرنا الريباسي 5S ، ضروري أيضًا. في الخميرة ، يتم ترجمة تسلسل 5S rDNA في المباعد الجينية ويتم نسخه في النواة بواسطة RNA pol.
في حقيقيات النوى والنباتات الأعلى ، يكون الوضع أكثر تعقيدًا ، لأن تسلسل الحمض النووي 5S يقع خارج منطقة منظمة Nucleolus (NOR) ويتم نسخه بواسطة RNA pol III في النيوكليوبلازم ، وبعد ذلك يجد طريقه إلى النواة للمشاركة في التجمع الريبوسوم. لا يقتصر هذا التجميع على الرنا الريباسي فحسب ، بل يشمل أيضًا البروتينات الريبوزومية. يتم نسخ الجينات التي ترميز هذه البروتينات بواسطة pol II في النيوكليوبلازم بواسطة مسار "تقليدي" لتخليق البروتين (النسخ ، معالجة ما قبل الرنا المرسال ، التصدير النووي للـ mRNA الناضج والترجمة على الريبوسومات السيتوبلازمية). يتم بعد ذلك استيراد بروتينات r الناضجة إلى النواة وأخيراً النواة. يؤدي ارتباط ونضج الرنا الريباسي والبروتينات إلى تكوين الوحدات الفرعية 40S (الصغيرة) و 60S (الكبيرة) من الريبوسوم الكامل. يتم تصديرها من خلال مجمعات المسام النووية إلى السيتوبلازم ، حيث تظل حرة أو ترتبط بالشبكة الإندوبلازمية ، وتشكل الشبكة الإندوبلازمية الخشنة (RER). [17] [18]
في خلايا بطانة الرحم البشرية ، تتشكل أحيانًا شبكة من القنوات النووية. لم يتم بعد تحديد أصل ووظيفة هذه الشبكة بشكل واضح. [19]
بالإضافة إلى دورها في التكوُّن الحيوي للريبوسومات ، تُعرف النواة بقدرتها على التقاط البروتينات وتثبيتها ، وهي عملية تُعرف باسم الاحتجاز النووي. البروتينات المحتجزة في النواة غير قادرة على الانتشار والتفاعل مع شركائها الملزمين. تشمل أهداف هذه الآلية التنظيمية لما بعد الترجمة VHL و PML و MDM2 و POLD1 و RelA و HAND1 و hTERT ، من بين أهداف أخرى. من المعروف الآن أن RNAs الطويلة غير المشفرة الناشئة من المناطق الجينية للنواة هي المسؤولة عن هذه الظاهرة. [20]
المواد والأساليب
زراعة الخلايا
نمت خلايا N1S1 أو خلايا NISIC3 ، والتي تشتمل بشكل ثابت على وحدة فرعية FLAG الموسومة & # x003b2 من RNA Pol I (15) ، في RPMI مع 5٪ مصل حصان و 1٪ مصل بقري جنيني. تم وصف تحضير مستخلصات S100 من خلايا N1S1 مسبقًا (6). عند الحاجة ، تم تحضير مستخلصات S100 من خلايا NISIC3 المعالجة بـ 100 & # x003bcg / مل سيكلوهيكسيميد (CHX) (سيغما ، سانت لويس ، MO) لمدة ساعة واحدة. تم غسيل مستخلصات S100 مقابل C-20 (20 ملي مولار HEPES ، درجة الحموضة 7.9 ، 20٪ جلسرين ، 100 ملي بوكل ، 5 ملي مول كلوريد2، 0.2 مم EDTA) في وحدة غسيل الكلى المصغرة Slide-A-Lyzer من بيرس (Rockford ، IL) طوال الليل عند 4 & # x000b0C قبل استخدامها لإزالة NTPs الذاتية. تم التعبير عن FLAG البشري النشط المؤتلف الموسوم Rrn3 في خلايا Sf9 وتنقيته كما هو موضح سابقًا (8).
قوالب الحمض النووي
أ تم استنساخ جزء 920-bp من مروج rDNA للفئران 45S في Bamأهلا و ايكو ارى مواقع pUC 19 وتستخدم لإنشاء قوالب rDNA لفحوصات القالب المعطلة. تم تضخيم قالب من النوع البري باستخدام واحد من اثنين من أزواج التمهيدي باستخدام برايمر مشترك 5 & # x02032 (5 & # x02032-GCTCACTCATTAGGCACC CCAGG-3 & # x02032) ، بناءً على تسلسل pUC 19 المنبع لإدخال rDNA. كانت البادئات العكسية / المصبّة إما 5 & # x02032-GGAAAACCCTTCCAGTCG-3 & # x02032 أو 5 & # x02032-GTGCAACTCGGGAGGCACACAG-3 & # x02032 ، والتي تولد منتجات من 680 أو 857 نقطة أساس ، على التوالي ، تحتوي على 90 نقطة أساس من pUC ، وشظايا من الفئران. الجين الممتد من & # x02212287 إلى +303 أو +480 على التوالي. تم استخدام pUC 19 كقالب DNA غير محدد في بعض التجارب. تم تضخيم قالب pUC باستخدام البادئات الأمامية 5 & # x02032-CAGGGGATAACGCA GG-3 & # x02032 والعكس 5 & # x02032-GACGCCGGGCAAGCA AC-3 & # x02032 ، والتي تولد منتجًا بقوة 1300 نقطة أساس. تم شراء مواد التمهيدي من Integrated DNA Technologies (كورالفيل ، آي إيه). تمت تنقية منتجات PCR باستخدام مجموعة تنقية MinElute PCR Qiagen (فالنسيا ، كاليفورنيا). بعد الشطف من أعمدة Qiagen الدورانية ، تم استخراج الحمض النووي من الفينول وترسيب الإيثانول وتعليقه في 10 ملي مولار تريس ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 1 ملي مولار EDTA (TE).
تكوين وعزل وتحليل مجمعات الموافقة المسبقة عن علم
تم تحضين خمسة ميكرولتر من S100 (5 & # x020138 & # x003bcg بروتين) بقالب 60 نانوغرام PCR (من النوع البري أو PUC كما هو محدد) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بحجم إجمالي 30 & # x003bcl. تمت إضافة الهيبارين أو الساركوزيل (Sigma) حيث تمت الإشارة إليه بحجم إجمالي قدره 20 & # x003bcl واستمرت الحضانة لمدة 15 دقيقة عند 30 & # x000b0 درجة مئوية. تم غسل حبات agarose المضادة لـ FLAG M2 (Sigma) ثلاث مرات باستخدام C-20 وتم تخزينها كملاط بنسبة 50 ٪ في نفس المخزن المؤقت. تمت إضافة عشرين ميكرولتر من الملاط بنسبة 50٪ من كريات مكافحة FLAG وتم تقليب الخليط لمدة ساعة واحدة عند 4 & # x000b0C. تم طرد الملاط عند 2000 دورة في الدقيقة (360 & # x02009 & # x000d7 & # x02009ز) لمدة 20 ثانية وإزالة المادة الطافية. تم غسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام 100 & # x003bcl من C-20. تم إعادة تعليق حبيبات الحبيبات في 50 & # x003bcl من الماء المقطر متبوعًا بإضافة 5 & # x003bcl من 1 مجم / مل بروتيناز K (فيشر). تم تحضين الخليط عند 65 & # x000b0 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تم طرد الحبيبات وإزالة المادة الطافية إلى أنبوب جديد. تمت تنقية الأحماض النووية عن طريق الاستخلاص بكمية متساوية من الفينول / الكلوروفورم / كحول الأيزو أميل (25: 24: 1) ثم تم استخلاص الطور المائي باستخدام 10 & # x003bcl من الكلوروفورم. تم تضخيم الحمض النووي من التفاعل بأكمله باستخدام 2 نانوغرام من البادئات الأمامية والخلفية الموصوفة أعلاه مع 50 & # x003bcl من مزيج Promega (Madison ، WI) PCR Master. تم إجراء PCR في GeneMate Genius (ISC BioExpress ، Kays-ville ، UT) وفقًا للشروط التالية: 94 & # x000b0C ، دقيقة واحدة (دورة واحدة) 95 & # x000b0C ، 45 ثانية ، 55 & # x000b0C ، 30 ثانية ، 72 & # x000b0C ، دقيقة واحدة (35 دورة) 72 & # x000b0C ، 7 دقائق (دورة واحدة). تم تضخيم خمسة وعشرين ميكرولترًا من هذا التفاعل في تفاعل PCR ثانٍ. احتوى التفاعل الثاني على 24 نانوغرام من كل مادة أولية واستمر لمدة 20 دورة. أظهرت تفاعلات التحكم أن هذه الشروط تضمن زيادة في التمهيدي. تم تصوير عشرة ميكرولتر من التفاعل الثاني على 1 ٪ من الحمض النووي لهلام الاغاروز عن طريق تلطيخ بروميد الإيثيديوم. تم فحص المواد الهلامية على نظام التصوير AlphaEaseFC (Alpha Innotech Corp. ، San Leandro CA). تم إجراء PCR في الوقت الحقيقي (RT-PCR) باستخدام Roche Light Cycler (Roche Molecular Biochemicals ، مانهايم ، ألمانيا). كان التمهيدي الأمامي هو 5 & # x02032-CCTGTCATGTTTATCCCTG-3 & # x02032 والعكس 5 & # x02032-GGTGCAAGCCTCTTGGAACG-3 & # x02032 ، والذي ينتج منتجًا بقوة 135 نقطة أساس. بالنسبة لتجارب RT-PCR ، تم تحضين الحمض النووي والمستخلص في الحجم النهائي 30 & # x003bcl لمدة 10 دقائق على الجليد ، تمت إضافة الهيبارين بالتركيزات المشار إليها في الحجم النهائي 50 & # x003bcl ، واستمرت الحضانة لمدة 30 إضافية دقيقة عند 30 & # x000b0 درجة مئوية. تمت إضافة عشرين ميكرولتر من الطين بنسبة 50٪ من الخرزات المضادة لـ FLAG وهبط التفاعل عند 4 & # x000b0C لمدة 45 دقيقة. تمت إزالة المادة الطافية من الملاط ، وهضمها ببروتينيز K ، وتنقية الحمض النووي كما هو موصوف أعلاه. كانت الجولة الأولى من PCR هي نفسها المستخدمة في المواد الهلامية الملطخة ببروميد الإيثيديوم. تم تضخيم 2 ميكرولتر من هذا التفاعل بشكل إضافي في تفاعل RT-PCR الثاني باستخدام مجموعة Qiagen و QuantiTect SYBR Green PCR. كانت ظروف PCR 95 & # x000b0C ، 15 دقيقة (دورة واحدة) 95 & # x000b0C ، 1 ثانية ، 55 & # x000b0C ، 10 ثوانٍ ، 72 & # x000b0C ، 27 ثانية (65 دورة).
النسخ المختبري: فحوصات القالب المعطلة
تم إنشاء جميع القوالب بواسطة PCR وتم تثبيتها على خرز أفيدين المغناطيسي (Dynal Corp ، أوسلو ، النرويج) من خلال البيوتين المدمج في 5 & # x02032 التمهيدي المشترك. تم تمييز القوالبين بواسطة 3 & # x02032 PCR التمهيدي مما أدى إلى نسخ نسخ 480 أو 303-nt. تم إجراء ربط القالب المعالج بالبيوتينيلات بالخرز المغناطيسي على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة. بعد احتضان 60 & # x003bcl من S100 مع 260 نانوغرام من القالب الثابت لمدة 45 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة ، تم جمع الخرزات بالمغناطيس. تم غسل الحبيبات بـ C-20 واستمرت الحضانات عند 30 & # x000b0C متبوعًا في بعض التجارب بغسل ثاني باستخدام C-20. تمت إضافة المؤتلف Rrn3 إلى بعض الحضانة (300 نانوغرام) في النقاط الزمنية المحددة. بدأ النسخ بإضافة NTPs & # x02009 & # x000b1 & # x02009 [& # x003b1- 32 P] UTP كما هو محدد. تم تحليل منتجات النسخ عن طريق تغيير طبيعة اليوريا / PAGE كما هو موضح سابقًا (44). تم إجراء تفاعلات النسخ في المختبر باستخدام القوالب في المحلول باستخدام 0.1 & # x003bcg p5.1E / X خطي باستخدام EcoRI كقالب لكل رد فعل كما هو موضح سابقًا (44). تم استكمال التفاعلات مع الهيبارين أو الساركوزيل كما هو محدد.
تحليل لطخة غربية
تم إجراء تحليل SDS-PAGE و electroblot كما هو موضح سابقًا (15). تم رفع antisera الأرانب متعددة النسيلة إلى rpa3 إلى rpa المؤتلف المعبر عنه في بكتريا قولونية (Capralogics ، Inc. ، Hardwick ، MA). تم شراء الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد لـ FLAG (M2) من شركة Sigma Chemical Co. (سانت لويس ، MO) وتم استخدامه كما هو موضح سابقًا (15).
النتائج
SHU1 الإفراط في التعبير سامة في uaf30Δ سلالات
التعرف على الجينات الجديدة التي تتفاعل معها وراثيا SHU1، تم إجراء شاشة SDL باستخدام التعبير الزائد SHU1 إدخال البلازميد في مكتبة حذف الخميرة. ال SHU1 تم استنساخ الجين تحت محفز يحفزه النحاس إلى ناقل 2 ميكرومتر. في وجود تركيزات متزايدة من النحاس ، SHU1 تم إحداث التعبير وتصوره بواسطة لطخة بروتينية باستخدام Shu1 الموسوم بعلامة FLAG (الشكل التكميلي 1A). الإفراط في التعبير عن SHU1 أو SHU1-FLAG لا يسبب أي عيوب في النمو (الشكل التكميلي 1 ب) ويكمل حساسية MMS لـ a shu1Δ سلالة (الشكل التكميلي 1C) ، مما يدل على أن SHU1 ترميز البلازميدات الأليلات الوظيفية. غير الموسومة SHU1 تم إدخال البلازميد بشكل منفصل في ∼4800 سلالات أحادية الصيغة الصبغية من مكتبة حذف الخميرة ، وفشلت تسعة اضطرابات في النمو عندما SHU1 كان مبالغا فيه. واحدة من هذه الاضطرابات ، uaf30Δ، لتفاعلات SDL بعد التحويل المباشر لـ SHU1 البلازميد في سلالة الحذف (الشكل 1A والشكل التكميلي 1A). يُرى تفاعل SDL حتى بدون إضافة النحاس ، مما يشير إلى أن المستوى الأساسي لتعبير Shu1 ، على الأرجح بسبب كميات صغيرة من النحاس في الوسط ، كافٍ لإحداث هذا النمط الظاهري. تتوافق هذه الملاحظة مع النتيجة التي توصل إليها غير المستحثة SHU1 يمنع البلازميد حساسية MMS لـ a shu1Δ سلالة (الشكل التكميلي 1C).
الشكل 1: الإفراط في التعبير عن SHU1 يتسبب في تفاعل SDL مع حذف UAF30، وهو الجين الذي يغير إعادة تركيب الحمض النووي الريبي في a FOB1-بطريقة تعتمد. (أ) تم طلاء التخفيفات التسلسلية بخمسة أضعاف على وسائط انتقائية بتركيزات متزايدة من النحاس باستخدام المتجه الفارغ (pWJ1530) أو SHU1 الإفراط في التعبير البلازميد (SHU1) إلى WT أو uaf30Δ. (ب) تم تحليل المجهري الإسفار لخلايا الخميرة التي تحتوي على Uaf30-YFP و Top1-CFP من أجل التوحيد (دمج).(ج) تواتر المؤتلفات rDNA (هل يستطيع R. , ade2) بالوزن ، uaf30Δ, fob1Δ، و uaf30Δ fob1Δ سلالات الخميرة ، وتم تآمرها مع SD. لاحظ أن ترددات إعادة تركيب الحمض النووي الريبي تختلف في uaf30Δ الخلايا ، على الأرجح بسبب زعزعة استقرار مجموعة الحمض النووي الريبي.
Uaf30 هو بروتين نووي مهم لتنظيم إعادة تركيب الحمض النووي الريبي
تم تصنيف Uaf30 في الأصل كمكون من مكونات مجمع UAF ، والذي يعزز نسخ rDNA بواسطة RNA polymerase I ويقمع RNA polymerase II (Siddiqi وآخرون.، 2001 Hontz وآخرون.، 2008). نظرًا لأن UAF يعمل في النواة في rDNA ، فقد حللنا الخلايا التي تعبر عن البروتين الفلوري الأصفر Uaf30 (YFP) والبروتين الفلوري Top1-cyan (CFP) ، وهو بروتين معروف موجود في النواة (Edwards وآخرون.، 2000 هاه وآخرون.، 2003) ، لتوطينها. يوضح الشكل 1 ب أن Uaf30-YFP يتجمع مع Top1-CFP في النواة. تؤكد هذه النتائج دراسة نشرت سابقًا على مستوى الجينوم تم فيها ترجمة Uaf30 إلى النواة (Huh وآخرون.، 2003) ويتناقض مع تقرير آخر على مستوى الجينوم وجد فيه أنه سيتوبلازمي (Huang وآخرون., 2003).
نظرًا لأن Uaf30 هو نووي وأن عدم وجود مكونات أخرى لمركب UAF يؤدي إلى توسع الحمض النووي الريبي ، فقد درسنا الدور المحتمل لـ UAF30 في إعادة تركيب الحمض النووي الريبي باستخدام مقايسة فقدان علامة. في هذا الاختبار ، فإن ADE2 و يمكن 1 تم إدخال الجينات في واحد من 100-200 rDNA مكرر ، وتم حساب ترددات إعادة التركيب عن طريق قياس الفقد المتزامن لكلا الواسمتين. يوضح الشكل 1C ذلك uaf30Δ تعرض الخلايا ترددات إعادة تركيب rDNA متزايدة مقارنة بالسلالة الأبوية من النوع البري (WT). علاوة على هذه الزيادة تعتمد على فوب 1، وهو جين مهم لمماطلة شوكة النسخ المتماثل لـ rDNA الذي يؤدي إلى تواتر منخفض من DSBs العفوية في المصفوفة (الشكل 1C) (كوباياشي وآخرون.، 1998، 2004 Burkhalter and Sogo، 2004).
يتحول Shu1 أيضًا إلى النواة ويؤثر على إعادة تركيب الحمض النووي الريبي
لأن Uaf30 يترجم إلى نواة الخلية و uaf30Δ الخلايا حساسة ل SHU1 الإفراط في التعبير ، سألنا عما إذا كان Shu1 مترجمًا أيضًا إلى النواة. لقد وجدنا سابقًا أن Shu1 بعلامة YFP المزدوجة تتمركز في النواة ، لكننا لم ننظر بعناية في توطينها النووي (Shor وآخرون.، 2005). نوضح هنا ، بعد إجراء مزيد من التحليل ، أن Shu1 موجود أيضًا في النواة لأنه يتحد مع Nop1-CFP ، وهو بروتين نووي معروف (الشكل 2 أ).
الشكل 2: يتم توطين Shu1 في النواة ويؤثر على إعادة تركيب الحمض النووي الريبي. (أ) تم تحليل الخميرة مع Shu1-YFP-YFP و Nop1-CFP بواسطة الفحص المجهري الفلوري من أجل التلوين (دمج). (ب) تواتر المؤتلف rDNA (هل يستطيع R. , ade2) بالوزن ، shu1Δ, uaf30Δ، و uaf30Δ shu1Δ سلالات الخميرة ، وتم تآمرها مع SD. (ج) كميات الحمض النووي الريبي في الوزن ، shu1Δ, uaf30Δ، و uaf30Δ shu1Δ تم قياس كمية السلالات من خلال تحليل كمية الحمض النووي الريبي الناتج عن تقييد الهضم للحمض النووي الكلي ، وكشف عن جزء يبلغ 9.1 كيلو بايت كما هو موضح في المواد والأساليب. يتم رسم SD. (D) WT و uaf30Δ تم تحويل السلالات مع المتجه الفارغ (pWJ1530) أو SHU1 إفراط في التعبير البلازميد (pWJ1530-SHU1). نمت السلالات في وجود 100 ميكرومتر من النحاس (CuSO4) ، وتواتر rDNA المؤتلف (هل يستطيع R. , ade2) تم قياسه ورسمه SE. لاحظ أن ترددات إعادة التركيب في uaf30Δ كانت الخلايا مختلفة بالنسبة إلى (B) ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى نموها في الوسط الاصطناعي الأدنى ، والذي كان ضروريًا للحفاظ على البلازميد.
لأنه تم العثور على مجمع Shu سابقًا لتعزيز إعادة التركيب من خلال الموارد البشرية (Shor وآخرون.، 2005 منقوري وآخرون.، 2007) ، افترضنا أنه في غيابه ، سيتم قمع إعادة التركيب في rDNA. في الواقع ، وجدنا ذلك shu1Δ إلى حد كبير يقمع إعادة تركيب الحمض النووي الريبي المتزايد لـ uaf30Δ الخلايا (الشكل 2 ب). في المقابل ، في حالة عدم وجود Shu1 وحده ، لا يتم زيادة أو نقص إعادة تركيب الحمض النووي الريبي (الشكل 2 ب والبيانات غير معروضة). تشير هذه النتائج إلى أن Shu1 تعمل على تعزيز معالجة الموارد البشرية لوسائط إعادة تركيب الحمض النووي الريبي التي تم إنشاؤها بواسطة uaf30Δ. علاوة على ذلك ، فإن هذه النتائج ليست محددة لتعطيل SHU1 بسبب اضطراب الآخرين شو الجينات (أي SHU2 و CSM2) يقلل أيضًا من تكرار إعادة تركيب الحمض النووي الريبي المتزايد لـ uaf30Δ الخلايا (الشكل التكميلي 2). في المقابل ، حذف PSY3 لا تنخفض بشكل ملحوظ uaf30Δ- زيادة إعادة تركيب الحمض النووي الريبي (rDNA) ومتغير بدرجة كبيرة (الشكل التكميلي 2). بالإضافة الى، CSM2Δ تزيد الخلايا وحدها من إعادة تركيب rDNA بالنسبة إلى WT (الشكل التكميلي 2). في الواقع ، يمكن أن يكون للأعضاء المختلفين في مجمع Shu وظائف مميزة في عمليات مختلفة لأنه تم الإبلاغ عن الاختلافات بين أعضاء مجمع Shu لعمليات إعادة ترتيب الكروموسوم الإجمالية (Huang وآخرون.، 2003) و Rad52 ، ومعدلات تحويل الجينات في S. بومبي (مارتن وآخرون., 2006).
تعطيل SHU1 يقلل من مستويات إعادة التركيب rDNA التي لوحظت في uaf30Δ الخلايا. لتحديد ما إذا كان SHU1 يؤدي التعطيل إلى قمع عدم استقرار الحمض النووي الريبي بشكل عام ، وقمنا بتحليل تأثير الحذف SHU1 على إعادة تركيب الحمض النووي الريبي المتزايد الذي لوحظ في أعلى 1 المسوخ (كريستمان وآخرون.، 1988 جانجلوف وآخرون.، 1996). لقد وجدنا أن هذا التردد المتزايد لإعادة التركيب لا يتغير بشكل كبير في a shu1Δ أعلى 1Δ متحولة مزدوجة ، تدعم فكرة أن التفاعل الجيني بين مجمع Shu و Uaf30 محدد (الشكل التكميلي 3).
في حالة عدم وجود UAF الجينات ، توسع الخلايا rDNA الخاصة بها (Nogi وآخرون.، 1991 كيز وآخرون.، 1996). نظرًا لأن Uaf30 هو أحد مكونات مجمع UAF ، فقد افترضنا ذلك uaf30Δ ستظهر سلالات زيادة عدد نسخ rDNA ، وهي تفعل بالفعل (الشكل 2C). لأن Shu1 يقمع إلى حد كبير تردد إعادة التركيب الذي لوحظ في uaf30Δ سلالات (الشكل 2 ب) ، افترضنا أن تعطيلها سيؤدي أيضًا إلى قمع الحجم المتزايد لمصفوفة rDNA التي لوحظت في uaf30Δ. كما كان متوقعا، shu1Δ uaf30Δ تظهر المسوخات المزدوجة عدد نسخ rDNA مخفض مقارنةً بـ uaf30Δ (الشكل 2 ج). لكن، shu1Δ يظهر زيادة طفيفة في عدد نسخة rDNA بالنسبة إلى WT (الشكل 2C).
أخيرًا ، سألنا عما إذا كان الإفراط في التعبير عن Shu1 سيزيد من إعادة تركيب الحمض النووي الريبي لأن مركب Shu متورط وراثيًا في تعزيز إعادة التركيب. باستخدام تحفيز النحاس SHU1 يتميز البلازميد في الشكل التكميلي 1 ، وجدنا أن إعادة تركيب الحمض النووي الريبي المتزايد لوحظ في uaf30Δ تتفاقم الخلايا بسبب SHU1 الإفراط في التعبير (الشكل 2 د). بشرط SHU1 الإفراط في التعبير سام في أ uaf30Δ في الخلفية ، قد تكون ترددات إعادة التركيب في الواقع أعلى من تلك التي لوحظت إذا أدت أحداث إعادة التركيب إلى موت هذه الخلايا أو توقف نموها.
يعمل Shu1 في نفس مسار Srs2
اثنان من البروتينات المعقدة Shu ، Shu1 و Psy3 ، هما Paralogues Rad51. تعمل Paralogues Rad51 ، جنبًا إلى جنب مع Rad52 ، على تعزيز تشكيل خيوط Rad51. الأهم من ذلك ، في كل من الخميرة الناشئة والانشطارية ، يتفاعل عضو آخر من مجمع Shu ، Shu2 ، جسديًا مع هليكاز Srs2 ، الذي يعطل خيوط Rad51 (Ito وآخرون.، 2001 كريجسي وآخرون.، 2003 Veaute وآخرون.، 2003 مارتن وآخرون.، 2006). تشير الدراسات الجينية والكيميائية الحيوية إلى أن Srs2 يعمل كمضاد لإعادة التركيب ينظم تبادل حبال Rad51 بوساطة (Aboussekhra وآخرون.، 1989 Krejci وآخرون.، 2003 Veaute وآخرون.، 2003). بناءً على هذه الملاحظات ، افترضنا أن مركب Shu و Srs2 قد يكونان متورطين في نفس المسار الذي يتحكم في فرط تأشيب الحمض النووي الريبي في uaf30Δ. لأنه تم إثبات أن Srs2 سابقًا غني بالنواة (Torres-Rosell وآخرون.، 2007) ، فحصنا ما إذا كان srs2Δ متحولة ، مثل shu1Δ، يمكنه أيضًا كبح زيادة إعادة تركيب الحمض النووي الريبي (rDNA) في حالة عدم وجود UAF30. تعطيل SRS2 وحده يزيد بشكل متواضع من تواتر إعادة تركيب الحمض النووي الريبي (ثلاثة أضعاف على WT) ، بما يتوافق مع النمط الظاهري للتركيب المفرط الذي لوحظ في مواقع أخرى. عندما يقترن ب uaf30Δ، ال uaf30Δ srs2Δ يظهر متحولة مزدوجة معدلات إعادة التركيب مماثلة ل uaf30Δ shu1Δ، مشيرا إلى أن كليهما srs2Δ و shu1Δ قمع uaf30Δ عيب (الشكلان 3 أ و 2 ب). نجد أيضًا أن uaf30Δ srs2Δ shu1Δ يظهر المسوخ الثلاثي نفس المستوى من الكبت ، مما يشير إلى أن Srs2 و Shu1 يعملان في نفس المسار استجابةً ل uaf30Δالناجم عن تلف الحمض النووي في rDNA. تمشيا مع هذا الرأي ، لا نلاحظ أي خلل في النمو التخليقي في srs2Δ uaf30Δ سلالات متحولة مزدوجة ، على عكس ما ورد في دراسة على مستوى الجينوم (Pan وآخرون., 2006).
الشكل 3: وظائف Shu1 في نفس المسار مثل Srs2 للقمع uaf30Δ إعادة تركيب الحمض النووي الريبي (rDNA) ويغير تشكيل تركيز Srs2. (أ) تم قياس تواتر إعادة تركيب الحمض النووي الريبي بالوزن ، shu1Δ, srs2Δ, shu1Δ srs2Δ, uaf30Δ, uaf30Δ srs2Δ، و uaf30Δ srs2Δ shu1Δ سلالات ، وتم تآمرهم مع SD. لاحظ تكرار إعادة تركيب uaf30Δ shu1Δ لم يتم إجهاد السلالة في نفس الوقت. (ب) تم تحليل سلالات YFP-Srs2 معبرة عن النسبة المئوية للبؤر النووية العفوية في WT ، shu1Δ, uaf30Δ، و shu1Δ uaf30Δ الخلايا. يتم عرض صور Srs2 مع رؤوس سهام بيضاء تشير إلى البؤر. تم إجراء كل تجربة في ثلاث نسخ بإجمالي 400-500 خلية تم تحليلها. يوضح الرسم البياني النسبة المئوية للخلايا ذات البؤر مع SE. (C) تم تحليل الخلايا التي تعبر عن CFP-Rad51 في WT و shu1Δ سلالات لنسبة البؤر النووية العفوية. تم إجراء كل تجربة في ثلاث نسخ بإجمالي 150-200 خلية تم تحليلها باستخدام مخطط SE. لاحظ أن السلالات تحتوي أيضًا على بلازميد مكمل WT Rad51 لأن CFP-Rad51 لا يعمل بشكل كامل.
يؤثر Shu1 على تشكيل التركيز Srs2 و Rad51 على حد سواء تلقائيًا وفي فواصل خاصة بالموقع
في الجسم الحي ، يشكل Srs2 بؤرًا في مواقع تكرار الحمض النووي وإعادة التركيب ، حيث يزيل خيوط البروتين النووي Rad51 (بورغيس وآخرون.، 2009). نظرًا لأن Shu1 و Srs2 يتفاعلان وراثيًا ، فمن الممكن أن يقوم Shu1 عادةً بتعزيز إعادة التركيب عن طريق تثبيط وظيفة مضاد إعادة التركيب في Srs2. لاختبار هذه الفرضية ، قمنا بتحليل ما إذا كان عدد بؤر Srs2 يتغير في shu1Δ, uaf30Δ، أو shu1Δ uaf30Δ الخلايا (الشكل 3 ب). ومن المثير للاهتمام، shu1Δ و shu1Δ uaf30Δ تظهر السلالات عددًا متزايدًا من بؤر Srs2 (ع 0.005 الشكل 3 ب). فى المقابل، uaf30Δ السلالات ، التي تظهر زيادة تردد إعادة تركيب الحمض النووي الريبي ، لديها عدد أقل من بؤر Srs2 بالنسبة إلى WT (p 0.05 الأشكال 1C و 3 B). لأن shu1Δ تزيد الخلايا من عدد بؤر Srs2 العفوية ، والتي قد تؤدي بدورها إلى زيادة نشاط Srs2 المضاد لإعادة التركيب ، قمنا بتحليل ما إذا كانت قدرة Rad51 على تكوين بؤر إعادة التركيب ضعيفة بسبب SHU1 اضطراب (الشكل 3 ج). نجد أن عدد بؤر Rad51 العفوية في shu1Δ تم تقليل الإجهاد بالنسبة إلى وزن (ع 0.05 الشكل 3 ج). تتوافق هذه النتائج معًا مع فكرة أنه في حالة عدم وجود Shu1 ، يتم زيادة نشاط Srs2.
لاختبار ما إذا كان Shu1 ينظم توظيف Srs2 في مواقع DSB بشكل مباشر ، استفدنا من نظام حيث I-Sceتم إدخال موقع قطع نوكلياز داخلي في تكرار rDNA واحد (Torres-Rosell وآخرون.، 2007) أو خارج rDNA في URA3 موضع على الكروموسوم الخامس (Lisby وآخرون.، 2004) (الشكل 4). بالإضافة إلى ذلك ، هناك مجموعة ترادفية من مواقع ربط Tet repressor (224xtetO أو 336xtetO، على التوالي) بجوار كل موقع قطع. تم الكشف عن توطين موقع القطع من خلال التعبير عن TetI المصهور لبروتين فلورسنت أحمر أحادي (mRFP) ، والذي يرتبط بـ TetO. باستخدام هذا النظام ، قمنا بتحليل توطين Srs2 أو Rad52 ذي العلامات الفلورية فيما يتعلق بموقع قطع الحمض النووي بعد إحداث DSB في كل من WT و shu1Δ الخلايا (الشكل 4 ، A و B). تم استخدام Rad52 ، وهو بروتين مركزي لإصلاح الحمض النووي ، لمراقبة كفاءة قطع DSBs (Lisby وآخرون.، 2004 توريس روسيل وآخرون.، 2007). نجد أن Rad52 يتم تجنيده إما لكسر rDNA أو كسر في الكروموسوم V ، حتى في حالة عدم وجود SHU1 (ص 0.01). في المقابل ، يزيد تعيين Srs2 لأي من DSB بشكل ملحوظ في a SHU1 الاضطراب (الشكل 4 ، A و B ، p 0.025 و p 0.05 ، على التوالي). تظهر هذه النتائج أن Shu1 يعمل بشكل طبيعي لمنع تجنيد Srs2 في DSBs.
الشكل 4: يمنع Shu1 تجنيد Srs2 لفواصل الحمض النووي. (أ) أنا-Sceتم دمج موقع القطع في rDNA المجاور لمصفوفة ترادفية من مواقع ربط Tet repressor (224x)tetO). تم الكشف عن موقع فاصل rDNA بالتعبير عن TetI المدمج في mRFP. تمت مراقبة Rad52-CFP و YFP-Srs2 لتجنيدهم في فواصل rDNA في WT و shu1Δ الخلايا التي تعبر عن GAL-I-Sceأنا بلازميد. تم قياس النتائج في الرسم البياني مع رسم SE. (ب) أنا-Sceقطعت موقع متكامل في URA3 موضع على الكروموسوم V المجاور لمصفوفة ترادفية لمواقع ربط Tet repressor (336xtetO). تمت مراقبة Rad52-CFP و YFP-Srs2 في WT و shu1Δ خلايا للتجنيد في موقع القطع في سلالات تعبر عن GAL-I-Sceأنا بلازميد. تم قياس النتائج في الرسم البياني مع رسم SE.
أبسط فرضية لشرح هذه الملاحظات هي أن مركب Shu يثبط عادةً Srs2 ، وفي غيابه ، يؤدي زيادة نشاط Srs2 إلى تغيير التوازن لإزالة خيوط Rad51. التفسير البديل هو أن مركب Shu متورط بشكل مباشر في تشكيل خيوط Rad51 (يتصرف مثل الوسيط) ، وفي غيابه ، يتم تشكيل عدد أقل من الخيوط. إذا كان التفسير الأخير صحيحًا ، فسيتم تقليل تشكيل تركيز Rad51 في ملف shu1Δ، كما نلاحظ في الشكل 3C ، ولكن سيتم أيضًا تقليله أ shu1Δ srs2Δ متحولة مزدوجة لأن وجود أو عدم وجود Srs2 يجب ألا يغير تشكيل خيوط Rad51. في الواقع ، عندما نعطل وسيط خيوط Rad51 ، RAD55، يتم رؤية عدد أقل من بؤر Rad51 في حالة عدم وجود ملفات SRS2 (الشكل التكميلي 4 ص 0.025). بدلاً من ذلك ، إذا كان Shu1 يثبط Srs2 مباشرةً ، فإن تشكيل تركيز Rad51 سيزداد في a shu1Δ srs2Δ متحولة مزدوجة بالنسبة إلى WT ، وهو بالضبط ما وجدناه. نجد أن shu1Δ srs2Δ يعرض متحولة مزدوجة أكبر عدد من بؤر Rad51 مثل srs2Δ سلالة (الشكل 5 ص 0.05). على الرغم من أننا لم نستبعد تمامًا أن مركب Shu يلعب دورًا ما في تكوين خيوط Rad51 ، فإن نتائجنا تشير بقوة إلى أن الدور الرئيسي لمركب Shu هو منع Srs2.
الشكل 5: لا يتم منع تكوين خيوط Rad51 في shu1Δ srs2Δ الخلايا. WT ، shu1Δ, srs2Δ، و shu1Δ srs2Δ تم تحليل الخلايا بالنسبة المئوية لبؤر CFP-Rad51 العفوية. تم إجراء كل تجربة في ثلاث نسخ بإجمالي 200 خلية تم تحليلها باستخدام SE. لاحظ أن السلالات تحتوي أيضًا على بلازميد مكمل WT Rad51 لأن CFP-Rad51 لا يعمل بشكل كامل. من المحتمل أن ينتج عن هذا التكوين عدد أقل من بؤر Rad51 التي تمت ملاحظتها في srs2Δ من الخلايا التي أبلغنا عنها سابقًا (Burgess وآخرون., 2009).
المواد والأساليب
البلازميدات والسلالات والوسائط
تم سرد البلازميدات وسلالات الخميرة المستخدمة في هذه الدراسة في الجدولين الأول والثاني على التوالي. تم استخدام التقنيات والوسائط الوراثية للخميرة القياسية (شيرمان وآخرون., 1979 ).
بلازميد | وصف | المتجه | المرجع / المتبرع |
---|---|---|---|
بلازميدات الخميرة | |||
pGP5 | CEN ، TRP1, RPA43 | pRS314 | هذه الدراسة |
pGP5-4 | CEN ، TRP1, rpa43–4 | pRS314 | هذه الدراسة |
pGP5-6 | CEN ، TRP1, rpa43–6 | pRS314 | هذه الدراسة |
pGP5-14 | CEN ، TRP1, rpa43–14 | pRS314 | هذه الدراسة |
pGP5-18 | CEN ، TRP1, rpa43–18 | pRS314 | هذه الدراسة |
pGP5-24 | CEN ، TRP1, rpa43 - 24 | pRS314 | هذه الدراسة |
pGP32 | 2 μ ، LEU2, GAL4 [768–881] -RRN6 [865–894] | باكت 2 | هذه الدراسة |
pGP40 | 2 μ ، LEU2, GAL4 [768-881] RRN6 [772–8894] | باكت 2 | هذه الدراسة |
pGP44 | 2 μ ، LEU2, GAL4 [768-88] RRN6 | باكت 2 | هذه الدراسة |
باس-RRN3 | 2 μ ، TPR1, GAL4 [1-147] -RRN3 | pASΔ | جيه ستيفان |
yCPA43 | CEN ، URA3, RPA43 | yCP | ثوريوكس وآخرون. (1995) |
بسيسيس 2 | 2 μ ، URA3, RRN3 | pSYC | كادويل وآخرون. (1997) |
pL1 | 2 μ ، URA3, SPT15 | pFL44 | كافاليني وآخرون. (1989) |
pNOY102 | 2 μ ، URA3, RDN تحت سيطرة GAL7 المروجين | pC1 / 1 | نوغي وآخرون. (1991) |
إرسال بريد إلكتروني | 26S ميني | Ye30-Δ6 | التجمعات وآخرون. (1989) |
البلازميدات للتعبير في بكتريا قولونية | |||
pGP4 | HA-HIS-RPA43 تحت سيطرة المروج T7 | pRSET5d | هذه الدراسة |
pGP34 | HA-HIS-RRN3 تحت سيطرة المروج T7 | pRSET5d | هذه الدراسة |
pGP37 | RRN6 [772–894] تحت سيطرة المروج T7 | pRSET5d | هذه الدراسة |
pGP45 | أ 43 تحت سيطرة المروج T7 | pACYC184-11b | هذه الدراسة |
pGP47 | GST-RRN6 [772–894] تحت سيطرة المروج T7 | pGEX3X | هذه الدراسة |
أضنى | وصف | المرجعي |
---|---|---|
GPy9 | حصيرةأ rpa43::LEU2 ade2-101 ura3-52 lys2-801 trp1-Δ63 his3Δ200 leu2-1/ pGP5 | هذه الدراسة |
GPy11-4 | حصيرةأ rpa43::LEU2 ade2-101 ura3-52 lys2-801 trp1-Δ63 his3Δ200 leu2-1/ pGP5-4 | هذه الدراسة |
GPy11-6 | حصيرةأ rpa43::LEU2 ade2-101 ura3-52 lys2-801 trp1-Δ63 his3Δ200 leu2-1/ pGP5-6 | هذه الدراسة |
GPy11-14 | حصيرةأ rpa43::LEU2 ade2-101 ura3-52 lys2-801 trp1-Δ63 his3Δ200 leu2-1/ pGP5-14 | هذه الدراسة |
GPy11-18 | حصيرةأ rpa43::LEU2 ade2-101 ura3-52 lys2-801 trp1-Δ63 his3Δ200 leu2-1/ pGP5-18 | دراسته |
GPy11-24 | حصيرةأ rpa43::LEU2 ade2-101 ura3-52 lys2-801 trp1-Δ63 his3Δ200 leu2-1/ pGP5-24 | هذه الدراسة |
GPy21 | ماتا rpa43::LEU2 rrn3-8 ura3-52 trp1 leu2 his3Δ200 his7Δ2 ade/ yCPA43 | هذه الدراسة |
GPy43 | ماتا rpa43::LEU2 rrn3-8 ura3-52 trp1 leu2 his3Δ200 his7Δ2 ade/ pNOY200 | هذه الدراسة |
GPy44 | ماتا rpa43::LEU2 rrn3-8 ura3-52 trp1 leu2 his3Δ200 his7Δ2 ade/ pNOY102 | هذه الدراسة |
GPy52 | حصيرةأ ade2-101 ura3-52 lys2-801 trp1-Δ63 his3Δ200 leu2-Δ1 rrn6-Δ1 | هذه الدراسة |
ماتا ade2-101 ura3-52 lys2-801 trp1-Δ63 his3Δ200 leu2-Δ1 RRN6 | ||
D101-I2 | حصيرةأ rpa43::LEU2 ade2-101 ura3-52 lys2-801 trp1-Δ63 his3Δ200 leu2-1/ yCPA43 | ثوريوكس وآخرون. (1995) |
D128 | ماتا rpa43::LEU2 ade2-101 ura3-52 lys2-801 trp1-Δ63 his3Δ200 leu2-1/ pNOY102 | ثوريوكس وآخرون. (1995) |
yCC95 | ماتا rrn3-8 ade5 ura3-52 trp1-289 his7-2 leu2-112 | كادويل وآخرون. (1997) |
Y190 | حصيرةأ ade2-101 trp1-901 his3 leu2-3،112 gal4 gal80 ura3-52 :: GAL1-lacZ :: URA3 lys2 :: GAL1-HIS3 cyh ص | هاربر وآخرون. (1993) |
الطفرات العشوائية
rpa43 تم الحصول على الأليلات الطافرة بواسطة PCR المطفر (200 ميكرومتر MnCl2) وإصلاح الثغرات كما هو موصوف (Muhlrad وآخرون., 1992 ).
تنقية كسور B600 و B2000
تم إجراء تنقية كسور B600 و B2000 والمجمعات المحتوية على Pol I-Rrn3 و TBP كما هو موصوف سابقًا (Milkereit وآخرون., 1997 ).
فحوصات النسخ في المختبر
تم تقييم النشاط غير المحدد لـ RNA Pol I كما هو موصوف (Buhler وآخرون. ، 1974). تم إجراء فحوصات النسخ المحددة كما هو موصوف (Milkereit وآخرون. ، 1997) مع 40 نانوغرام من pSIRT البلازميد (Musters وآخرون. ، 1989). تم فصل النصوص عن طريق الرحلان الكهربي على هلام بولي أكريلاميد بنسبة 6٪ يحتوي على 7 م يوريا في TBE وعرضها على التصوير الشعاعي الذاتي.
تحضير البروتينات المؤتلفة A43 و Rrn3 و Rrn6
يتم التعبير عن البروتينات المؤتلفة Rrn3 و Rrn6 في الإشريكية القولونية. نمت خلايا BL21 (DE3) المحولة عند 24 درجة مئوية في وسط LB مكمل بالأمبيسيلين (500 ميكروغرام / مل) والكلورامفينيكول (34 ميكروغرام / مل) والسوربيتول (1 م). تم إحداث التعبير عن البروتين المؤتلف عند 0.4 OD600 مع 250 ميكرومتر من الأيزوبروبيل- β- D- ثيوجالاكتوبيرانوسيد (IPTG). تم اهتزاز الخلايا لمدة 4 ساعات عند 24 درجة مئوية ، وتم جمعها وتعليقها في المخزن المؤقت للكسر [100 ملي مولار تريس - حمض الهيدروكلوريك pH 8 ، 20 ٪ جلسرين ، 400 ملي KOAc ، 1 ملي مولار EDTA ، 5 ملي ميكروغرام (OAc)2، 5 ملي β-mercaptoethanol و 0.1٪ Tween 20] مكمل بمثبطات الأنزيم البروتيني (Complete Boehringer). تم فصل الخلايا عن طريق دورتين من التجميد والذوبان في النيتروجين السائل. تمت إضافة ليسوزيم (20 ميكروغرام / مل) وبنزوناز (100 وحدة / مل) وتم تحضين المعلق لمدة ساعة عند 4 درجات مئوية. تم الطرد المركزي للمستخلص الخام في دوار Beckman 45-Ti لمدة ساعة واحدة عند 40000 دورة في الدقيقة.
المؤتلف A43 و Rrn3 معبراً عنه بشكل مشترك في الإشريكية القولونية. تم إجراء ثقافة الخلية والحث كما هو موضح أعلاه. تم إعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت للكسر [50 ملي تريس - حمض الهيدروكلوريك pH 8 ، 20 ٪ جلسرين ، 100 ملي KOAc ، 5 ملي ملغ (OAc)2 و 0.1٪ توين 20] مكمل بمثبطات الأنزيم البروتيني وتم تحللها بمكبس إيتون وتم طرد المستخلص الخام بالطرد المركزي على النحو الوارد أعلاه.
تنقية جزئية لـ rRrn3. تم تحميل جزء S100 من مزرعة سعة 12 لترًا على عمود Q-Sepharose عالي التحميل 20 مل متوازن مع محلول Q (20 ملي مولار تريس - حمض الهيدروكلوريك pH 8 ، 20٪ جلسرين ، 5 ملي مولار (OAc)2 و 0.1٪ توين 20] يحتوي على 400 ملي مولار KOAc. بعد الغسل ، تمت التصفية من البروتينات بتدرج خطي من 400 ملي مولار إلى 2 م KOAc في محلول Q. تم تجميع الكسور المحتوية على Rrn3 ، وفقًا لتحليل اللطخة الغربية باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة لـ HA (16B12 Babco) ، واستكمالها بـ 5 ملي إيميدازول. تم تحميل حوض السباحة على عمود نيكل Hi-Trap سعة 1 مل متوازن مع محلول Ni [20 ملي مولار تريس - حمض الهيدروكلوريك pH 8 ، 20 ٪ جلسرين ، 500 ملي KOAc ، 5 ملي مولار (OAc)2 و 0.1٪ توين 20] يحتوي على 5 ملي إيميدازول. تم تطوير العمود بتدرج خطي من 5 إلى 200 ملي إيميدازول في محلول Ni تم تجميع الكسور المحتوية على Rrn3 وغسلها مقابل 20 ملي مولار تريس - حمض الهيدروكلوريك pH 8 ، 20 ٪ جلسرين ، 50 ملي KOAc ، 5 ملي مولار (OAc)2، 5 ملي β-mercaptoethanol و 0.1٪ توين 20.
[35 S] Rrn6 [C1] توليف. [35 S] Rrn6 [C1] تم تصنيعه في مستخلص جرثومة القمح (Promega) مكملًا بـ T7 RNA polymerase (Promega) ، [35 S] ميثيونين (0.8 mCi / ml) و 1 ميكروغرام من البلازميد المنقى pGP37.
اللوني تقارب
كان الكروماتوغرافيا لـ [35 S] Rrn6 [772-894] على عمود من Rrn3 مثبتًا في خرز G-Sepharose (Pharmacia) مغلف بـ 45 ميكروغرام من الأجسام المضادة المنقاة 12CA5 ، متوازنة في كسر العازلة بنسبة 1٪ (وزن / حجم) منخفضة حليب دسم. تم بعد ذلك تمرير S100 المحتوي على HA الموسوم Rrn3 (1 مل) خمس مرات من خلال الخرزات. تم غسل الحبيبات على نطاق واسع باستخدام محلول تكسير مكمل بحليب قليل الدسم بنسبة 1٪ (وزن / حجم) ثم مع محلول ملزمة [20 ملي مولار تريس - حمض الهيدروكلوريك pH 8 ، 20 ٪ جلسرين ، 50 ملي KOAc ، 5 ملي مولار (OAc)2، 5 ملي β-mercaptoethanol و 0.1٪ توين 20]. تم بعد ذلك تحميل قسامة مقدارها 50 ميكرولتر من خليط [35 S] Rrn6 [772-894] ، المخفف في 300 ميكرولتر من محلول الربط المؤقت ، خمس مرات على نفس العمود. بعد الغسيل المكثف باستخدام محلول الربط المؤقت ، تمت تصفية البروتينات عند 37 درجة مئوية مع 1 مل من محلول الربط الذي يحتوي على 1 ميكروغرام / ميكرولتر من ببتيد HA المنقى. تم إخضاع البروتينات لـ SDS-PAGE وتحليلها بواسطة التصوير الشعاعي الذاتي على أفلام BiomaxMS (أمرشام).
كان اللوني لـ rRrn3 على عمود من GST – Rrn6 الثابت [772-894]. تم تحضير حبات الجلوتاثيون- سيفاروس على النحو الوارد أعلاه و 150 ميكرولتر من HA-His المنقى جزئيًا6تم تحميل -Rrn3 على العمود. تمت التصفية من البروتينات باستخدام 1 مل من محلول الربط المضاف إليه 30 ملي مولار من الجلوتاثيون وتحليلها بالنشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة لـ HA (16B12 Babco).
تفاعل ثنائي الهجين بين Rrn3 و Rrn6
تم إجراء الفحص الهجين بشكل أساسي كما هو موصوف (Flores وآخرون، 1999). تم تحويل السلالة Y190 التي تم تحويلها باستخدام pAS-Rrn3 باستخدام مكتبة الجينوم DNA (Fromont-Racine وآخرون. ، 1997). تم اختيار المحولات على وسط يحتوي على 50 و 75 ملي مولار 3AT واختبارها لتنشيط لاكز الجين المراسل.
تحضير العينة للفحص المجهري الإلكتروني ومعالجة الصور
تم إجراء تكوين المجمعات المناعية وتحليل الصور للبيانات كما وصفها Klinger وآخرون. (1996) .