معلومة

حركة الخلايا التائية: هل تتطلب الحركة بلمرة أكتين محددة الاتجاه؟

حركة الخلايا التائية: هل تتطلب الحركة بلمرة أكتين محددة الاتجاه؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد ثبت أن الخلايا التائية تهاجر داخل تدرجات التركيز - سواء في اتجاه المصدر أو بعيدًا. حتى في ظل التدرجات الضحلة ، تتحرك الخلايا التائية. أنا أزعم أنه لكي تكون الخلية قادرة على التحرك بطريقة موجهة ، يجب أن تكون قادرة على الحصول على استجابة تفاضلية من بلمرة الأكتين و Philipodia. لكني أجد صعوبة في تصديق أنها استجابة تفاضلية ما لم يكن دقة المستشعر متصلاً مركزيًا فحسب ، بل يكون أيضًا حساسًا للغاية. كيف يعمل هذا؟


من المفهوم على الأقل أن حركة الكريات البيض تعتمد على إعادة تشكيل الهيكل الخلوي وديناميات الأكتين. في الدم ، عندما تتعثر الخلايا التائية متجاوزة البطانة النشطة للموقع المصاب ، يتم التقاطها بواسطة سيليكتينز وإنتغرينات معبر عنها على السطح البطاني. غالبًا ما يتم توضيحها على أنها مراحل الالتصاق والدوران لهجرة الخلايا التائية.

تحفز المواد الكيميائية ، التي تشكل عادةً تدرجًا للانحدار الكيميائي للخلايا التائية ، تغييرات في التشكل الخلوي التي تعزز الهجرة إلى الأنسجة المحيطة. تستقطب الخلايا إلى صفيحة مولدة للقوة مع حافة رائدة في المقدمة ، و uropod في الخلف. يبدو كما لو أن الأكتين يتبلمر في lamellopodium ويخرج الخلية نحو اتجاه الإشارة ، ويتقلص uropod بطريقة تعتمد على الميوسين ، ويطلق الجزيئات المرتبطة هناك ، مما يسمح للخلية بالسحب في اتجاه lamellopodia ( 1 ، 2).

وقد تميزت الآلية في الواقع بإعادة توزيع رائدة لمستقبلات الكيموكين مثل CCR5 و CXCR4 ، والتي قد تكون لها علاقة بديناميات الأكتين / الميوسين وطوافات الدهون. هذا يجعل توزيع المستقبلات غير متماثل أيضًا ، وبالتالي استجابة أضعف للجاذب الكيميائي في النهاية الخلفية للخلية. أفضل طريقة يمكنني وصفها هي استخدام تشكيل cSMAC في بيولوجيا مستقبلات الخلايا التائية (الشكل 1) (3). SMAC هو في الأساس عبارة عن مشابك تم تشكيلها أثناء تنشيط الخلايا التائية حيث تتركز المستقبلات في منطقة معينة حيث تلتقي الخلية التائية بـ APC.

الشكل 1. إعادة تشكيل الهيكل الخلوي بوساطة TCR

الطريقة التي يصفها المؤلفون هي إشارات المصب من TCR التي تحدد جزيئات مسار الأكتين إلى موقع الإشارة ، وتسبب إعادة تشكيل الهيكل الخلوي في هذا الموقع المحدد.

أظهرت الدراسات التي أجريت على العدلات أن الاستقطاب يؤدي إلى واجهة وخلفية للخلية ، تنظمها بروتينات مختلفة ويمنع تكوين بعضها البعض. هذه ورقة جيدة للقراءة حول هذا الموضوع ، على الرغم من صعوبة قراءتها في رأيي: https://www.researchgate.net/publication/8957894_Cytoskeletal_remodeling_in_leukocyte_function


يتم تعديل الحركة الأميبية للخلايا التائية ثلاثية الأبعاد المحسّنة للحبس عبر التصاقات منظمة الميوسين IIA

أثناء الاتجار عبر الأنسجة ، تضبط الخلايا التائية حركتها بشكل دقيق لموازنة مدى ومدة ملامسات سطح الخلية مقابل الحاجة إلى اجتياز العضو بأكمله. هنا نظهر ذلك في الجسم الحي، فإن الخلايا التائية الناقصة في الميوسين IIA لديها ثالوث من العيوب ، بما في ذلك الترابط المفرط للأوردة البطانية العالية ، والهجرة الخلالية الأقل ، وعدم كفاءة إعادة الدوران من خلال العقد الليمفاوية. أظهر التحليل الزماني المكاني للحركة ثلاثية الأبعاد في القنوات الدقيقة أن درجة الحبس ووظيفة الميوسين IIA ، بدلاً من التصاق إنتغرين (على النحو الذي اقترحه نموذج الحركية الحركية) ، هو معدل الحركة الأمثل. حدثت هذه الحركة من خلال وضع "المشي" السريع المعتمد على الميوسين IIA مع عدة التصاقات صغيرة ومتزامنة بالركيزة ، مما منع التصاقات الزائفة والمطولة. وبالتالي فإن تمييز الالتصاق الذي يوفره الميوسين IIA ضروري لتحسين الحركة من خلال الأنسجة المعقدة.


مراجعة المادة

أليسون جايلو & # x02020 ، ديلون سي شروك & # x02020 ، نينوشكا آر جيه فرنانديز و ديبورا ج. فويل *
  • قسم الأحياء الدقيقة والمناعة ، مركز ديفيد إتش سميث لبيولوجيا اللقاح والمناعة ، معهد Aab للعلوم الطبية الحيوية ، جامعة روتشستر ، روتشستر ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية

تخرج الخلايا التائية المستجيبة من الأوعية الدموية الملتهبة في بيئة شكلتها التكوينات الهيكلية الخاصة بالأنسجة والتعديلات الخارجية التي يسببها الالتهاب. بمجرد دخول المساحات الخلالية للأنسجة غير اللمفاوية ، تهاجر الخلايا التائية بطريقة عشوائية واضحة غير اتجاهية. يعد المسح الفعال للخلايا التائية لبيئة الأنسجة أمرًا ضروريًا لتحقيق الموقع الناجح للخلايا المستهدفة المصابة أو مواجهة الخلايا العارضة للمستضد التي تنشط وظائف المستجيب المضاد للميكروبات للخلايا التائية. إن آليات حركة الخلايا التائية الخلالية والإشارات البيئية التي قد تعزز أو تعيق مسح الأنسجة الفعال غير مفهومة جيدًا. يبدو أن المصفوفة خارج الخلية (ECM) تلعب دورًا هامًا في السقالات في توجيه انتقال الخلايا التائية ومن المحتمل أن توفر منصة لعرض العوامل الكيميائية التي قد تساعد في توجيه موضع الخلايا التائية. هنا ، نناقش كيف قدم التصوير داخل الحجاج نظرة ثاقبة لأنماط الحركة والآلات الخلوية التي تسهل الانتقال الخلالي للخلايا التائية والعوامل البيئية الحرجة التي قد تحسن كفاءة مسح الخلايا التائية المستجيب للأنسجة الملتهبة. على وجه التحديد ، نسلط الضوء على إشارات تحديد المواقع الدقيقة المحلية التي تواجهها الخلايا التائية أثناء انتقالها داخل الأنسجة الملتهبة ، من جزيئات ECM المحيطة وجزيئات الإشارة ، بالإضافة إلى مطلب لتحديد المواقع الكلية المناسبة بعيدة المدى داخل حجرات الأنسجة المتميزة أو في بؤر منفصلة للعدوى أو تلف الأنسجة. يستجيب الجهاز العصبي المركزي (CNS) للإصابة والعدوى عن طريق إعادة تشكيل ECM على نطاق واسع ومع من جديد توليد شبكة شبكية ليفية من المحتمل أن تؤثر على حركة الخلايا التائية. ندرس كيف أن التغييرات التي يسببها الالتهاب في منظر الجهاز العصبي المركزي قد تنظم استكشاف أنسجة الخلايا التائية وتعديل الوظيفة.


المواد والأساليب

ثقافة الطفيليات

T. جوندي تمت المحافظة على tachyzoites لسلالة RH من خلال ممر تسلسلي ثنائي الأبعاد في طبقات أحادية الخلية HFF كما هو موصوف سابقًا (Morisaki وآخرون.، 1995). تم استخدام طفيليات RH التي تعبر عن β-galactosidase (2F) في الاختبارات الكيميائية الحيوية (Dobrowolski وآخرون.، 1997). تم تقديم طفيليات سلالة RH التي عبرت عن اندماج آخر 82 من بقايا الأحماض الأمينية لـ TgMyoA مع البروتين الفلوري الأخضر (GFP TgM-Atail) من قبل الدكتور دومينيك سولداتي (Hettman). وآخرون.، 2000). تم عزل الطفيليات بعد فترة وجيزة من تحلل الخلية المضيفة ، وتم تمريرها عبر مرشح 3 ميكرومتر ، وغسلها مرة واحدة بمحلول ملح متوازن من Hanks (Life Technologies ، Gaithersburg ، MD) يحتوي على 0.001 M EGTA ، 0.01 M HEPES (HHE).

YFP-ACT1 - بناء السلالة

تم تصميم البلازميد الذي يعبر عن بروتين الفلورسنت الأصفر (YFP) - أكتين كبروتين اندماج ليكون له رابط 10-ألانين بين YFP والأكتين (Doyle and Botstei ، 1996). ال قانون 1 تم تضخيم الجين من a T. جوندي البلازميد (كدنا) باستخدام البادئات PCR 5′-ACCAATGCATجكتجككجكاجكجكجكاجككجكتجكاجكا-ATGGCGGATGAAGAAGTGCAAGC-3 (تمهيدي ACT1F ، يحتوي على تسلسل ترميز لـ 10 ألانين [مائل]) و 5′-CATGCTTAATTAATTAGAAGCACTTGCGGTGGACG-3 (التمهيدي ACT1R) ويتم هضمه باستخدام Nsiانا و باكتم تضخيم YFP بواسطة PCR باستخدام البادئات 5′-ACGTCAGATCTAAAATGGTGAGCAAGGGC- GAGG AGC-3 ′ (YFPF التمهيدي) و 5′-CAGTATGCATCTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3 (YFPR التمهيدي) وهضمها باستخدام Bglالثاني و Nsi1.هذا البناء ، المشار إليه باسم pTUB / YFP-ACT1 / SAGCAT ، يحتوي على اندماج YFP-ACT1 المحاط بـ 5′-α-tubulin (Nagel and Boothroyd ، 1988) و 3′-DHFR (Roos ، 1993) متواليات تنظيمية ، تليها كاسيت مقاومة الكلورامفينيكول بما في ذلك قط الجين الذي يحيط بهSAG1 التسلسل التنظيمي (Striepen وآخرون.، 1998). تم نقل الطفيليات المعزولة حديثًا (ن = 10 7) باستخدام 75 ميكروغرام من DNA البلازميد وتم تلقيحها في الخلايا المضيفة كما هو موصوف سابقًا (Roos وآخرون.، 1994). لإنتاج الجينات المعدلة وراثيًا مستقرة ، تمت إضافة الكلورامفينيكول بعد 24 ساعة إلى تركيز نهائي قدره 6 ميكروغرام / مل ، وتم عزل الحيوانات المستنسخة المقاومة للأدوية عن طريق التخفيف المحدود بعد عدة جولات من الاختيار. تم استنساخ المحولات بشكل إضافي في وجود استنساخ الدواء YA2 وتم اختياره لمزيد من الاستخدام. الأمصال المضادة للأكتين متعددة النسيلة للأرنب (Dobrowolski وآخرون.، 1997) والأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAb) 3E6 ضد GFP (Clontech ، كامبريدج ، المملكة المتحدة) لاكتشاف بروتين YFP-actin في البقع الغربية. الماوس mAb Tg17–43 ضد GRA1 (Cesbron-Delauw وآخرون.، 1989) كعنصر تحكم في التحميل.

النشاف الجنوبي

الحمض النووي الجيني من خلايا HFF أو T. جوندي(من النوع البري أو YFP-ACT1 المعدلة وراثيًا) باستخدام نوكليازات مقيدة عند 37 درجة مئوية طوال الليل ، وتم عزلها بالكهرباء في جل agarose بنسبة 0.8 ٪ ، ونقلها إلى أغشية النايلون عن طريق نقل الشعيرات الدموية القلوية (Maniatis وآخرون.، 1982). تم فحص البقع بين عشية وضحاها باستخدام مسبار يحمل علامة P 32 يشتمل على تسلسل أكتين جزئي من 241 نيوكليوتيد ناتج من البلازميد pTUB / YFP-ACT1 / SAGCAT بواسطة PCR باستخدام الاشعال 5′-GACGACATGGAGAAAATCTGGCATCACACC-3 ′ (مسبار 5′F) CATGCTTAATTAATTAGAAGCACTTGCGGTGGACG-3 ′ (مسبار التمهيدي). تم تهجين البقع عند 42 درجة مئوية بين عشية وضحاها في 4 × SSPE ، 0.8 ٪ SDS ، 40 ٪ فورماميد ، 4 × محلول Denhardt ، و 100 ميكروغرام / مل من العجل الغدة الصعترية DNA وغسلها بصرامة نهائية تبلغ 68 درجة مئوية في 0.1 × SSPE ، 0.1 ٪ SDS. تم تعريض المرشحات لفيلم Kodak XAR عند درجة حرارة -70 درجة مئوية للتصوير الشعاعي الذاتي.

وضع العلامات المناعية

أعيد تعليق الطفيليات في HHE وعولجت بـ 2 ميكرومتر من JAS (مجسات جزيئية ، يوجين ، OR) تم إذابتها في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) أو 1 ٪ DMSO وحده كعنصر تحكم لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة الغرفة ، ثم سمح لها بالالتصاق بالبولي أغطية l -lysine-coated لمدة 10 دقائق في غرفة رطبة. تم شطف الأغطية ، وتثبيتها لمدة 5 دقائق بميثانول 100٪ عند درجة حرارة -20 درجة مئوية ، وتم حظرها بنسبة 20٪ FBS (Hyclone ، Logan ، UT) في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة. بعد وضع العلامات باستخدام الأمصال المضادة لـ ACT1 الأرانب متعددة النسيلة (Dobrowolski وآخرون.، 1997) في 1: 250 في PBS ، مصل الأرانب المضاد لـ α-tubulin (Morrissette and Sibley ، 2002b) عند 1: 1000 ، جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد لـ SAG1 (DG52) (Morisaki وآخرون.، 1995) عند 1: 250 ، و / أو الفأر أحادي النسيلة المضاد لـ IMC1 (مركب الغشاء الداخلي) (45.15) عند 1: 1000 في برنامج تلفزيوني (Mann and Beckers ، 2001) ، تم تصنيف الطفيليات بمضاد الماعز أو مضاد للفأر. أرنب Alexa 488 و / أو 594 (1: 500 في PBS ، مجسات جزيئية). تم تركيب العينات في Vectashield + DAPI (تقنيات الحياة) وفحصها باستخدام مجهر Zeiss Axioskop أو مجهر متحد البؤر Zeiss 510 (Zeiss ، Oberkochen ، ألمانيا). تم جمع صور التألق ذات المجال الواسع باستخدام إصدار 2.0.5 من برنامج Zeiss Axiocam و Zeiss Axiovision ، ثم تمت معالجتها ودمجها مع Adobe Photoshop (Adobe Systems ، Mountain View ، CA). تم التقاط صور مجهرية متحد البؤر باستخدام عدسة موضوعية 63 × مخطط أحادي اللون (فتحة عددية ، 1.4 زايس) وأشعة ليزر He-Ne و Kr-Ar. تم استيراد الصور إلى برنامج Zeiss Imagebrowser ثم معالجتها في Adobe Photoshop.

فحص الحركة الانزلاقية

تم طلاء Coverslips في 50 ٪ FBS في PBS لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية وشطفها في برنامج تلفزيوني. تم تعليق tachyzoites التي تم حصادها حديثًا في HHE ، وعولجت بتركيزات متفاوتة من JAS أو 1 ٪ DMSO لمدة 10 دقائق ، وأضيفت إلى الأغطية الجاهزة ، وحضنت عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تم إصلاح الشرائح في -20 درجة مئوية من الميثانول وتم حظرها بنسبة 20 ٪ FBS في برنامج تلفزيوني. تم الكشف عن وجود بروتين الغشاء السطحي SAG1 في المسارات باستخدام mAb DG52 (1: 250) المترافق مباشرة مع أوريغون الأخضر (المجسات الجزيئية). تم شطف الأغطية وتركيبها في Vectashield (Vector Laboratories ، Burlingame ، CA) بالإضافة إلى DAPI ، وفحصها باستخدام مجهر مضان واسع المجال. تم تحديد متوسط ​​طول المسار في أطوال أجسام الطفيليات (7 ميكرومتر) من خمسة حقول تم اختيارها عشوائيًا 63 × تحتوي على 50 طفيليًا لكل حقل في كل من التجارب الثلاثة المنفصلة (يعني ± SEM).

فحص الغزو

تم طلاء خلايا HFF على أغطية 24 ساعة قبل التجارب. تم تعليق tachyzoites التي تم حصادها حديثًا في وسائط الغزو (DMEM ، تقنيات الحياة) ، 3 ٪ FBS ، 10 ملي مولار HEPES) واستخدمت لتحدي الطبقات الأحادية HFF لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تم شطف الطبقات الأحادية في HHE ، وتثبيتها في 3 ٪ فورمالدهايد في PBS لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، وتم حظرها بنسبة 20 ٪ FBS في PBS ، وملطخة بـ mAb DG52 (1: 250) مترافق مع Texas Red (مجسات جزيئية). تم بعد ذلك شطف العينات وتجفيفها باستخدام 0.1٪ سابونين لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة ، وتلطيخها بـ DG52 مترافق مع أخضر أوريغون (1: 250). تم شطف الأغطية وتركيبها في Vectashield وفحصها باستخدام مجهر مضان واسع المجال. تم تحديد النسبة المئوية للطفيليات داخل الخلايا (الملطخة باللون الأخضر ولكن غير الملطخة باللون الأحمر) من خمسة حقول تم اختيارها عشوائيًا 63 × تحتوي على طفيليات 50 لكل حقل في كل من التجارب الثلاثة المنفصلة (يعني ± SEM).

القياس الكمي للأكتين الخيطي بواسطة النشاف الغربي

تم وضع طفيليات سلالة 2F التي تم حصادها حديثًا (RH المنقولة باستخدام β-galactosidase) في محلول تثبيت الأكتين (60 ملي أنابيب ، 25 ملي مولار HEPES ، 10 ملي مولار EDTA ، 2 ملي MgCl2، 125 ملي بوكل) ومعالجتها بتركيزات متفاوتة من JAS أو 1 ٪ DMSO لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. تمت إضافة الجلسرين إلى تركيز نهائي بنسبة 10٪ ، 100 × كوكتيل مثبط البروتياز (1 مجم / مل E64 ، 10 مجم / مل من فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد ، 10 مجم / مل TLCK (Nα-p-Tosyl-L- ليسين- كلورو ميثيل كيتون هيدروكلوريد) ، و 1 مجم / مل من leupeptin) إلى تركيز نهائي قدره 1 × ، وتمت إضافة Triton X-100 إلى تركيز نهائي قدره 1٪. تم تحضين العينات عند 0 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، ثم غزلها عند 16000 × ز في جهاز طرد مركزي إيبندورف 1415 درجة مئوية عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة لتكوير خيوط الأكتين. تم خلط المادة الطافية مع حجم متساوٍ من الأسيتون (Fisher Scientific ، Houston ، TX) وتم تكويرها عند 16000 ×ز عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. تم إعادة تعليق هذه العينات والطفيليات المحللة (Dobrowolski and Sibley ، 1996) في محلول عينة هلام البروتين. تم تحميل المواد الطافية على مواد هلامية بروتينية بتركيز 25٪ من عينات الحبيبات. تم اكتشاف الأكتين باستخدام جسم مضاد متعدد الأضلاع مضاد لـ ACT1 للأرنب عند 1: 10000 (Dobrowolski وآخرون.، 1997). كعنصر تحكم في التحلل ، تم مسح العينات بجسم مضاد أحادي النسيلة للفأر مضاد لـ β-galactosidase (40-1 أ) في الساعة 1:30 (Dobrowolski وآخرون.، 1997). تم تحسين الإشارات باستخدام بيروكسيداز الفجل - جسم مضاد ثانوي مترافق للأرنب أو الفأر (1: 10000) واكتشافه باستخدام نظام الكشف عن النشاف الغربي ECL + Plus (Amersham Biosciences ، Piscataway ، NJ). تم قياس كمية البقع الغربية باستخدام برنامج التحليل الجزيئي Molecular Dynamics (Sunnyvale، CA) Storm 860 phosphoimager and Bio-Rad (Hercules، CA) Molecular Analyst.

المجهر الإلكتروني

تم تعليق الطفيليات في محلول رينجر للثدييات (بالمللي مولار: 155 NaCl ، 3 KCl ، 2 CaCl2، 1 مغكل2، 3 NaH2ص4، 10 HEPES ، 10 جلوكوز) عند 10 8 طفيليات لكل مليلتر ومعالجتها مسبقًا بـ 2 ميكرومتر JAS ، 1٪ DMSO ، أو 1 ميكرومتر CytD (مجسات جزيئية) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل السماح لها بالانزلاق على بولي- l -lysine ساترة مغلفة لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. تم صوت Coverslips في KHMgE (بالمللي مولار: 70 KCl ، 30 HEPES ، 5 ​​MgCl2، 3 EGTA عند درجة حموضة 7.2-7.4) بالإضافة إلى 2 ميكرومتر JAS ، 1٪ DMSO ، أو 1 ميكرومتر CytD مع ميكروبروب مثبت على Mega-Mix Sonicator (GCA / Precision Scientific ، Winchester ، VA) لثلاث نبضات من ∼5 كل في أقصى كثافة. تم بعد ذلك تثبيت العينات في KHMgE plus 2 ٪ glutaraldehyde ، وتم تجميدها بسرعة في النيتروجين السائل ، والتجفيف بالتجميد ، والمغلفة بالبلاتين كما هو موصوف سابقًا (Håkanssonوآخرون.، 1999). تم فحص النسخ المتماثلة وتصويرها باستخدام المجهر الإلكتروني للإرسال JEOL CX100 (Jeol ، Peabody ، MA).

الفحص المجهري المرئي

تم إعادة تعليق الطفيليات المعزولة حديثًا في محلول رينجر الذي يحتوي على 1 ٪ FBS ، وعولجت بتركيزات مختلفة من JAS ، 1 ميكرومتر لاترنكولين B (LatB) (مجسات جزيئية) ، أو 1 ٪ DMSO ، وتم السماح لها بالانزلاق على ميكروويلز ذات قاع زجاجي (MatTek Corp ، Ashland، MA) مطلية مسبقًا بـ 50٪ FBS في برنامج تلفزيوني. تم إجراء الفحص المجهري المرئي باستخدام Zeiss Axiovert المجهز بمجهر تباين الطور و epifluorescence ومرحلة التحكم في درجة الحرارة (Medical Systems Corp. ، Greenvale ، NY) للحفاظ على حضانة 37 درجة مئوية كما هو موضح سابقًا (Håkansson وآخرون.، 1999). يتم تصحيح المسار البصري في هذا المجهر لمحاكاة الاتجاه القائم ، وبالتالي تظهر الكائنات في اتجاهها الحقيقي فيما يتعلقx و ذ طائرات. لوحظت الحركة في غضون دقائق من إضافة الطفيليات المعالجة بالعقاقير إلى الغرفة الساخنة وتم تسجيلها على مدى فترة تصل إلى 30 دقيقة.

تم جمع الصور المستخدمة في القياس الكمي في الوقت الفعلي تحت إضاءة منخفضة الإضاءة باستخدام كاميرا CCD C2400 مكثفة (Hamamatsu Photonics KK ، Bridgewater ، NJ) عند تكبير 63 ×. تمت معالجة إشارة الفيديو رقميًا باستخدام لوحة التقاط إطار الفيديو (Perceptics Corp ، Knoxville ، TN) يتحكم فيها برنامج تحليل الصور Biological Detection Systems (BDS Image V 1.4.1 ، Oncor Imaging ، Gaithersburg ، MD) يعمل على Macintosh Quadra 900 كمبيوتر (أجهزة كمبيوتر Apple ، كوبرتينو ، كاليفورنيا). تم تسجيل الإخراج التناظري على شريط S-VHS باستخدام مسجل فيديو JVC موديل SR-S360U. للتحليل ، تم تتبع مسارات الطفيليات من شاشة الفيديو إلى أوراق الشفافية. تم استخدام أطوال التشغيل وإطارات البدء والإيقاف لكل حركة لحساب السرعات. طول T. جوندي (7 ميكرومتر) قدمت معيار تكبير. تم تحليل خمسة أمثلة من ثلاث تجارب منفصلة للحصول على متوسط ​​قيم ± SEM.

تم استخدام صور الفاصل الزمني لإنشاء الشكل 4 ومقاطع الفيديو التكميلية تحت إضاءة منخفضة الإضاءة باستخدام كاميرا Hamamatsu ORCA ER. تم تسجيل مقاطع الفيديو رقميًا بمعدل ثمانية إطارات تقريبًا في الثانية مع الإصدار 3.0.5 من Openlab (Improvision ، Lexington ، MA) ، تم اقتصاصها ، واستيرادها إلى Adobe Premiere 6.0 ، وحفظها كأفلام Quicktime.


مناقشة

تم إجراء هذه الدراسة لتوضيح الملاحظة التي من خلالها يمكن أن يؤثر إلغاء تحديد موقع β-actin mRNA على حركية الخلية والقطبية في الخلايا الليفية. وقد لوحظ أن إلغاء تحديد موقع β-actin mRNA مع قليل النوكليوتيدات المضاد للاندماج يقلل من حركية CEFs (2) وخلايا العضلات الملساء (15).

تُظهر نتائجنا أن القليل من مضادات المعنى ولكن ليس التحكم (الإحساس) تسبب في إلغاء تحديد موقع ليس فقط β-actin mRNA ، ولكن أيضًا بروتين β-actin والنهايات الشائكة من الحافة الأمامية للخلايا الليفية وأدى إلى توزيع عشوائي لجميع الثلاثة. كان هذا قابلاً للعكس عند إزالة قليل النوكليوتيدات المضادة المعنى. من خلال التحقيق في مواقع نواة خيوط الأكتين ، أظهرنا أنه تم تحديد موقعها نتيجة لتعطيل استهداف β-actin mRNA. تكشف هذه النتيجة عن آلية محتملة لإنشاء قطبية الخلية:-actin protein ، و / أو البروتينات ذات الرموز البريدية ذات الصلة ، تحدد موقع نواة بلمرة الأكتين ، وبالتالي قطبية الخلية والحركة الاتجاهية.

يمكن أن تعتمد الآلية الجزيئية التي تتأثر بها قطبية زحف الخلية بتوطين β-actin mRNA على عدة أحداث مترابطة: (أنا) يؤدي التوليف الموضعي لـ β-actin من mRNA المترجمة إلى بروز lamellipod. (ثانيا) β-actin isoform تفاعلات بروتينية محددة مسؤولة عن النتوء. (ثالثا) الترجمة إلى الحافة الأمامية من mRNAs لبروتينات أخرى بالإضافة إلى β-actin ، على سبيل المثال ، مجمع النواة الذي يحتوي على Arp 3 mRNA. مناقشة الأدلة لكل من هذه مفصلة أدناه.

التوليف المترجم لـ β-Actin من mRNA المترجمة.

استنادًا إلى 2،500 جزيء أكتين مرنا المقدرة لكل خلية ، وبمعدل التحويل المحدد البالغ 1.5 أكتين في الثانية لكل جزيء مرنا ، ستقوم الخلية بتجميع 3900 جزيء أكتين في الثانية أو 2.34 × 10 5 لكل دقيقة (2). في الخلايا المتحركة ، تستخدم منطقة البلمرة 3.6 × 10 6 جزيئات أكتين على الأقل في الدقيقة (9). لذلك ، من غير المحتمل أن تساهم مساهمة 6.5٪ من الأكتين المركب حديثًا بشكل كبير في معدل بلمرة الأكتين عند الحافة الأمامية. ومع ذلك ، إذا تم تصنيع كل β-actin في حجم مقيد ، نتيجة لتوطين β-actin mRNA إلى الحافة الأمامية ، فإن المعدل المحلي لتخليق β-actin قد يؤثر بشكل كبير على أحداث بلمرة الأكتين في هذا الحجم المقيد وبالتالي ، إنشاء موقع مفضل لبلمرة الأكتين.

سيتم دعم النموذج أعلاه بشكل أكبر إذا كان للأكتين المركب حديثًا معدل بلمرة أسرع ، أو تقارب أعلى لمركب التنوي من الأكتين "الأقدم" ، والذي يمكن تعديله بعد الترجمة. على سبيل المثال ، يمكن أن يؤدي تفاعل الكفيل مع سلسلة-actin الوليدة (16) إلى تعزيز تجميع مركب النواة بالقرب من موقع التوليف.

التفاعلات البروتينية النوعية لأكتين الأكتين.

يمكن تخزين شكل isoform من الأكتين بشكل تفضيلي باعتباره المونومر المستخدم للبلمرة عند الحافة الأمامية. في هذه الفرضية ، فإن التراكم المحلي لشكل غير خيطي من الأكتين يمكن إطلاقه فجأة عند تحفيز الحركة سيحدد موقع بلمرة الأكتين. تم تحديد جزيئات التخزين المحتملة التي تحتوي على الأكتين غير الخيطي من خلال مقارنة أنماط توطين البروتين المرتبط بفيتامين د ، والذي يرتبط بـ G-actin بـ 5 نانومتر ك.د، و phalloidin ، الذي يرتبط بالأكتين (17). توجد مخازن الأكتين غير الخيطية هذه في الحافة الأمامية وتقع بجوار مواقع بلمرة الأكتين وفي منطقة الخلية حيث يوجد مرنا β-actin أيضًا. من المحتمل أن تكون هذه المواقع ناتجة عن تخليق جزر بيتا أكتين.

تم العثور على أكتين بيتا في طليعة الخلايا الزاحفة. β-actin لا يحل محل الأكتين العضلي سواء في تكوين ألياف الإجهاد (17) أو اللييفات العضلية في خلايا عضلة القلب (18). بالإضافة إلى ذلك ، يبدو أنه يتفاعل بشكل أكثر إحكامًا مع بعض بروتينات ربط الأكتين التي قد تعمل عند الحافة الأمامية للخلايا الزاحفة. يرتبط Ezrin (19) و profilin (20) و thymosin β 4 (21) و L-plastin (22) بقوة أكبر مع بيتا أكتين من ألفا أكتين. قد يغطي بروتين السد ، β-cap 73 ، النهاية الشائكة بطريقة خاصة بالشكل الإسوي (23). هناك أدلة متزايدة على أن مركب Arp2 / 3 مطلوب لتنوى خيوط الأكتين عند الحافة الأمامية (12 ، 24-27). إذا كان مجمع Arp2 / 3 هو نشاط التنوي السائد عند الحافة الأمامية ، فإن التفضيل المحتمل للشكل الإسوي β-actin بواسطة مجمع Arp2 / 3 سيتطلب تخليقًا محليًا لـ β-actin لتزويد المونومر المفضل للبلمرة. لذلك ، قد يكون توطين تخليق بيتا أكتين عند الحافة الأمامية مهمًا وظيفيًا للقطبية والحركة.

التعريب إلى الحافة الرائدة في mRNAs المرتبطة بالحركة.

قد يكون توطين β-actin mRNA ممثلًا لتوطين عائلة من mRNAs ذات الصلة بالرموز البريدية 3 ′ UTR ، والتي يعمل العديد منها بشكل تآزري في المقدمة. لذلك قد يكون للبروتينات التي تم ترميزها بواسطة هذه الرنا المرسال وظائف ذات صلة. لقد قمنا بتحليل 3-UTRs من mRNAs ، والتي ترمز للبروتينات التي يعتقد أن لها وظائف ربط أكتين في المقدمة ، لوجود تسلسل إجماع الرمز البريدي. تم العثور على هذا التسلسل GACUX7–38ACACC في-actin mRNAs المعروف أنها تستهدف الحافة الأمامية من جميع الفقاريات. إلى جانب β-actin mRNAs ، يحتوي mRNA للسلسلة الثقيلة Arp3 و myosin IIB على تسلسل الإجماع ومن المتوقع أن يتم التعرف عليه بواسطة آلية التوطين التي تستهدف β-actin mRNA إلى الحافة الرائدة. من المعروف أن تسلسل إجماع ACACCC ، عند حدوث طفرة في β-actin mRNA ، يؤدي إلى فشل في توطين mRNA إلى الحافة الأمامية للخلايا (2 ، 7) ، حتى لو ظل تسلسل تشفير β-actin سليمًا ويتم استخدامه كمراسل مرنا. تشير النتائج الأولية إلى أن Arp3 mRNA ، مثل β-actin mRNA ، يترجم أيضًا إلى الحافة الرائدة (G. Liu و W. Grant و D. Persky و V.L Lathaur و RHS و JC ، عمل غير منشور). يشير التوطين المعتمد على المصل لـ β-actin mRNA إلى أن آليات الإشارة متورطة في توطين mRNAs المرتبطة بالحركة ، وبالتالي تنسيق توزيعها الزماني والمكاني والتعبير عنها (28). علاوة على ذلك ، من الممكن أن يحدد التوليف الموضعي لـ Arp3 ، على سبيل المثال ، توطين مجمع Arp2 / 3 في الحافة الأمامية للخلايا حتى لو كانت mRNAs التي ترميز المكونات الأخرى لمجمع Arp2 / 3 موزعة بشكل أكثر انتشارًا. يمكن أن يحدد مركب Arp2 / 3 وبيتا-أكتين ، وكلاهما موضعي في الحافة الأمامية ، مواقع التنوي لبلمرة الأكتين. يمكن أن تتفاعل خيوط الأكتين المشكلة حديثًا مع بروتينات الارتباط الخاصة بـ β-actin ، وبالتالي استقرار قطبية الخلية والحركة الاتجاهية الناتجة (29).

الحافة الأمامية للخلية عبارة عن مركب معقد من البروتينات الموزعة بشكل غير متماثل يعمل العديد منها في تناسق لإنتاج استجابة الحركة. من المحتمل أن البروتينات الأخرى مثل الأكتين يتم تصنيعها أيضًا بشكل غير متماثل وبالتالي لن توفر فقط تركيزًا تفاضليًا لهذه البروتينات ولكن أيضًا احتمالية متزايدة للتفاعلات بين البروتينات ذات الصلة في منطقة خلوية حيث تعتمد الوظيفة على هذه التفاعلات. لذلك نفترض أن مجموعة من الرنا المرسال التي تشتمل على تعقيد كبير من التسلسلات تكون مترجمة إلى الصفيحة للتأثير على الأحداث المعقدة التي تتطلبها الحركة. نتوقع أن تحتوي هذه التسلسلات على فكرة و / أو بنية مشتركة في 3-UTR تميزها بأنها mRNAs للبروتينات المرتبطة بالحركة. من المحتمل أن تكشف التحقيقات الإضافية عن تسلسل الإجماع (انظر أدناه).

لا يقتصر توطين β-actin mRNA على الخلايا الليفية ، ولكن يبدو أنه سمة من سمات الخلايا الموضعية الأخرى. تقوم الخلايا العصبية بترجمة β-actin mRNA إلى مخروط نمو العصبونات النامية (30 ، 31). ينتج عن وجود الرنا المرسال ترجمة محددة لبروتين بيتا أكتين في مخروط النمو. مثل الخلايا الليفية ، ينتج عن إلغاء تحديد موقع mRNA تراجع مخروط النمو وعدم اتجاه توجيه مخروط النمو (37). بالإضافة إلى مخاريط نمو الخلايا العصبية ، قد تقوم خلايا القمة العصبية الجنينية بتوطين β-actin mRNA في مقدمة الخلية ، في اتجاه هجرتها. تعطيل Xenopus يبدو أن متماثل ZBP1 يمنع هجرتهم ويؤدي إلى عيوب جنينية شديدة في نمو الدماغ الأمامي (J. Yisraeli ، التواصل الشخصي). علاوة على ذلك ، إذا تم نقل الرمز البريدي لـ β-actin mRNA إلى بروتين آخر ، ليس عادةً عند الحافة الأمامية ، في هذه الحالة vimentin ، ينتج عن التشكل المشوه حيث يتم تشعب بنية الخلية في الحافة الأمامية وتخفيفها (32). تجادل هذه النتائج بأن تخليق البروتين الصحيح في المكان الصحيح (بالقرب من الحافة الأمامية) يعد مطلبًا مهمًا لبنية الخلية والقطبية.

بالإضافة إلى توطين β-actin mRNA في الخلايا الليفية (1) ، تم تطوير مجال توطين الحمض النووي الريبي من خلال اكتشاف عدد من الأنظمة حيث يمكن أن يؤدي التحديد الخاطئ للـ RNA إلى تغيير النمط الظاهري أو الفتك بشكل كبير (33-36). في العديد من هذه الحالات ، يكون توطين mRNA مطلوبًا للتطور الطبيعي والتمايز لأن رموز mRNA المحلية للعوامل النووية وانقسامات الخلايا الناتجة تفصل mRNAs عن هذه المحددات المورفولوجية. ومع ذلك ، فإن طبيعة التوطين التي نصفها هنا مهمة لسبب مختلف: فهي تحدد التوجه المكاني والتشكل والسلوك لهذه الخلايا الجسدية. في هذا الجانب الثاني من توطين الحمض النووي الريبي ، يتم تنظيم مجمع البروتينات المشاركة في هجرة الخلايا ، والتفاعل الخلوي مع البيئة وتطور قطبية الخلية داخل السيتوبلازم بحكم الفصل المكاني للـ mRNAs المشابه لها ، وليس على المدى القصير المتعلقة بنسخ الجينات. بهذه الطريقة ، يمكن لمكونات الآلية التي تتحكم في سلوك الخلية وهيكلها أن تتجمع بسرعة داخل الخلية. في هذا النموذج ، سيتم تقسيم البروتينات المشاركة في تكوين هذه المجمعات متعددة الببتيد (مجمع النواة ، على سبيل المثال) استجابة للإشارات البيئية وأحداث نقل الإشارة اللاحقة ، ثم يتم تصنيعها بالقرب من بعضها البعض حيث تتفاعل بشكل تفضيلي بسبب ارتفاعها. التركيزات المحلية. من المحتمل أن تكون هذه التركيزات الأعلى من البروتينات قادرة على تنظيم تركيبها الذاتي. بهذه الطريقة ، نقترح أن توطين β-actin mRNA يمثل آلية واحدة للتجميع المكاني المجزأ للمجمعات الخلوية.


العمل الموقد للأنابيب الدقيقة في حركية الخلية

تلعب هجرة الخلايا دورًا مهمًا في تكوين الجنين والتئام الجروح والمناعة والوظائف الأساسية الأخرى. حركة الخلايا عبارة عن مناورة معقدة ومنسقة تتضمن تمديد صفيحة غنية بالخيوط الدقيقة عند الحافة الأمامية ، واستقطاب الخلية في اتجاه الحركة ، وإنشاء جهات اتصال بؤرية عند الحافة الأمامية بالإضافة إلى إزالة جهات الاتصال عند الحافة الأمامية. الحافة الخلفية والإجهاد تراجع الذيل بوساطة الألياف. يوفر إعادة التشكيل المنظم للهيكل الخلوي للأكتين القوة الدافعة لحركة الخلية.

لم يتم توثيق تورط الأنابيب الدقيقة في حركة الخلية بشكل واضح. أشارت الدراسات إلى أن الأدوية القادرة على تثبيط أو تعزيز تجميع الأنابيب الدقيقة يمكن أن تقلل من هجرة معظم أنواع الخلايا ، ولكن تم الإبلاغ عن العديد من الاستثناءات (تم تلخيصها في المرجع 1) على سبيل المثال ، تبين أن العلاج الدوائي يزيد بدلاً من تثبيط حركة الكريات البيض. 2 أدت استثناءات مثل هذه إلى تصور أن دور الأنابيب الدقيقة في الحركة هو نوع الخلية المحدد. 3 على الرغم من أن مثل هذا التفسير ممكن ، فمن المحتمل أيضًا أن تُعزى بعض الاختلافات المبلغ عنها إلى الاستخدام العشوائي لتركيزات الأدوية العالية التي قد تسبب سمية لا علاقة لها بالتأثيرات على تجميع الأنابيب الدقيقة. على الجانب الآخر ، تم الإبلاغ عن أن تركيزات الدواء المنخفضة جدًا التي لا تعطل الأنابيب الدقيقة يمكن أن تمنع هجرة الخلايا ، وتكهن مؤلفو إحدى الدراسات بأن الأدوية قد تعمل عن طريق قمع ديناميكيات الأنابيب الدقيقة. نشأ التباس إضافي فيما يتعلق بالآلية التي يمكن أن تؤثر بها الأنابيب الدقيقة على حركية الخلية ، حيث اقترح العديد من الباحثين تأثيرات الأنابيب الدقيقة على بلمرة الأكتين ، ونقل الحويصلات إلى الأرجل الصفائحية المتنامية ودوران لويحات الالتصاق. 3 ، 5

بدأت الدراسات الحديثة في توضيح هذه القضايا. على الرغم من أنه يُعتقد حاليًا أن عمل دواء الأنبوب الدقيق يتم توسطه بالكامل تقريبًا عن طريق قمع ديناميكيات الأنابيب الدقيقة ، فقد أظهرت التجارب الآن أن هذه العوامل تسبب تغيرات واضحة تعتمد على التركيز في سلوك الأنابيب الدقيقة. تركيزات الدواء المنخفضة مع عدم وجود تأثير على تنظيم الأنابيب الدقيقة أو مستويات البوليمر كانت قادرة على قمع ديناميكيات الأنابيب الدقيقة والتسبب في تثبيط موازٍ لهجرة الخلايا. 6 ، 7 لم يكن لهذه التركيزات المنخفضة أي تأثير على انقسام الخلايا في سلالات الخلايا من النوع البري أو السلالات المتحولة التي تعتمد على الأدوية للتكاثر. في التركيزات الأعلى بمقدار 10 أضعاف اللازمة لمنع الانقسام الفتيلي ، عملت الأدوية بواسطة آلية تم اكتشافها حديثًا تتضمن ثباتًا متغيرًا في ارتباط الأنابيب الدقيقة بالجسيمات المركزية وأقطاب المغزل. The relationship between microtubule dynamics and cell migration was further supported by studies with 㬣, a tubulin isotype that is normally restricted to neurons but whose expression in non-neuronal tumors has been associated with resistance to therapy. 8 Transfection of 㬣 was found to have no direct effect on cell motility, but it counteracted the ability of microtubule drugs to inhibit cell migration by preventing them from suppressing microtubule dynamics. 9 Unpublished studies from our laboratory have further shown that expression of 㬦, a tubulin isotype normally restricted to mammalian platelets, potently suppresses microtubule dynamics and also inhibits cell migration. 10 It has thus become clear that microtubules must be dynamic in order for cells to move, and that the dynamics can be suppressed by drug concentrations that are much lower than those needed to block cell division or alter microtubule polymer levels. These observations suggest the possibility of using low, non-toxic concentrations of microtubule inhibitors to block cell migration-mediated processes, such as tumor metastasis and angiogenesis.

The mechanism by which microtubule dynamics affect cell migration is also starting to come into focus. When dynamics are suppressed, cells located at the edge of a scratch wound continue to extend lamellipodia and polarize in the direction of the wound, but they remain stretched for an extended period of time and appear to have difficulty retracting their tails. 7 This observation could indicate that drug treated cells are defective in removing adhesion sites from the tail, a process that has been reported to require microtubules. 3 However, this interpretation is insufficient to explain recent experiments indicating that micro-tubules are not needed for motility (our unpublished studies). For example, a plot of cell migration as a function of drug concentration produces a “U-shaped” curve. Low drug concentrations suppress microtubule dynamics and inhibit cell migration with no obvious change in microtubule organization or assembly. Migration remains inhibited as the drug concentration increases to the point that microtubules depolymerize, whereupon cell migration recovers. It should be noted that still higher drug concentrations again inhibit cell migration, most likely because of additional toxic drug effects. Based on these and other observations, we propose a model in which microtubules act to inhibit, rather than promote, cell migration ( رسم بياني 1 ). The concept is similar to the tensegrity model, in which microtubules act as struts to oppose contractile forces, and it is consistent with studies showing that microtubules inhibit muscle contraction. 11 , 12 The model is also consistent with the observation that stable microtubules are oriented toward the leading edge of migrating cells, whereas dynamic micro-tubules are oriented toward the tail. 13 As long as the microtubules are dynamic, they can remodel and allow the tail to retract, but when dynamics are suppressed, microtubules remain immobile and physically retard tail retraction. It should be noted that, while this model explains many of the contradictory reports regarding drug effects on cell migration, it does not necessarily rule out the other actions proposed for microtubules in migrating cells. However, the ability of cells to move efficiently in the absence of microtubules argues that any involvement of the microtubule cytoskeleton in actions such as adhesion site turnover or delivery of membrane vesicles to the leading edge is not rate limiting for cell motility.

The role of microtubule dynamics in cell migration. Cells normally move by extending lamellipodia and elongating in the direction of movement. The more stable, less dynamic microtubules (solid lines) are oriented toward the leading edge the less stable, more dynamic microtubules (dotted lines) are oriented toward the trailing edge. Forward progression occurs when the tail retracts, a process facilitated by the presence of dynamic microtubules but opposed by stable microtubules. A low drug concentration sufficient to suppress microtubule dynamics does not prevent the extension of lamellipodia or cell elongation, but the cells remain in the elongated state for a protracted amount of time and appear unable to retract the tail. The morphologies that are shown were traced from HeLa cells moving into a scratch wound, and the numbers indicate the time in minutes from an arbitrary start.


ملحوظات

Abbreviations used: CCL and CCR, CC chemokine ligand and receptor, respectively CMFDA, 5-chloromethylfluorescein diacetate CXCL, CXC chemokine ligand DOCK2, dedicator of cytokinesis 2 FRC, fibroblastic reticular cell GEF, guanine nucleotide exchange factor HEV, high endothelial venule PBT cell, peripheral blood T cell PH, pleckstrin homology PI3K, phosphoinositide 3–kinase PIP3, phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate plt, paucity of LN T cell PTX, pertussis toxin WMN, wortmannin.


Chemotaxis pathways that work in parallel with PtdIns(3,4,5)ص3 إرسال الإشارات

The recent experimental observations described in the previous two sections support a model in which the PI3K-PTEN pathway is important for regulating the actin cytoskeleton in ديكتيوستيليوم chemotaxis and in mammalian cells, but it is not the only pathway regulating chemotaxis. In support of this, other parallel pathways are now thought to contribute to chemotactic movement and gradient sensing.

Phospholipase A2 and phospholipase C in ديكتيوستيليوم

The chemoattractant cAMP stimulates several second-messenger systems in ديكتيوستيليوم, including adenylyl cyclase, guanylyl cyclase, the uptake of Ca 2+ and its release from internal stores, phospholipase C (PLC), PI3K and phospholipase A2 (PLA2 encoded by plaA). Two groups have independently demonstrated that PLA2 regulates chemotaxis in parallel with PI3K (Fig. 2) (Chen et al., 2007 van Haastert et al., 2007). Further analysis of the two pathways revealed that inhibition of either pathway in shallow gradients inhibits chemotaxis, whereas, in steep gradients, both pathways must be inhibited to prevent proper chemotaxis.

دراسات سابقة في ديكتيوستيليوم have suggested that products of PLA2 action, such as arachidonic acid, affect chemoattractant-induced Ca 2+ influx and can trigger Ca 2+ influx directly (Schaloske and Malchow, 1997). In mammalian cells, arachidonic acid is involved in the release of Ca 2+ from internal stores by regulating calcium channels (Osterhout and Shuttleworth, 2000 Shuttleworth and Thompson, 1999). Cells lacking PLA2 display a decrease in the levels of 3 H-arachidonic acid, or a closely related derivative, after stimulation (Chen et al., 2007). Although disrupting PLA2 has no effect on Ca 2+ uptake (Chen et al., 2007), simultaneous inhibition of Ca 2+ uptake and Ca 2+ release does make cells sensitive to PI3K inhibitors (van Haastert et al., 2007). These results suggest that the PLA2-dependent pathway involves a rise in intracellular Ca 2+ that might be regulated by arachidonic acid or derivatives via the release of Ca 2+ from internal stores. Cytosolic Ca 2+ might also have a regulatory effect on PLA2 activation (Chen et al., 2007 van Haastert et al., 2007).

Inhibition of both PLA2 and PLC almost completely inhibits the cAMP-mediated PtdIns(3,4,5)ص3 response and causes drastic chemotactic defects (van Haastert et al., 2007), although inhibition of PLC alone does not affect chemotaxis (Drayer et al., 1994). This result implicates PLC in the regulation of the PI3K-mediated chemotaxis pathway – it probably acts by regulating phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate [PtdIns(4,5)ص2] levels and PTEN (Fig. 2). In addition, PLC signaling might cross-talk with the PLA2 pathway at the level of intracellular Ca 2+ regulation. PLC controls intracellular Ca 2+ levels by generating inositol phosphates [inositol (1,4,5)-trisphosphate Ins(1,4,5)ص3] and diacylglycerol (DAG), which activates Ca 2+ -sensitive enzymes such as protein kinase C (PKC) (Drin and Scarlata, 2007).

The exact role of PLA2 and its derivatives in chemotaxis and the degree to which the pathways have overlapping functions or influence different aspects of chemotaxis remain to be determined. The fact that cells are still able to sense gradients and move with a high directionality in the absence of PI3K or PLA2 confirms that the machinery responsible for directional sensing must act downstream of G-protein activation by chemoattractants but upstream of the PI3K-PTEN and PLA2 pathways. Components of this direction-sensing machinery could include Ras proteins, which help to control chemotaxis in ديكتيوستيليوم, in part via the regulation of PI3K and TORC2 (Funamoto et al., 2002 Lee et al., 2005 Lee et al., 1999 Sasaki et al., 2004). Interestingly, the expression of a dominant-negative RasG in ديكتيوستيليوم cells lacking the RasGEF Aimless (AleA) severely impairs directional sensing (Sasaki et al., 2004).

The regulation of PtdIns(4,5)ص2 and PtdIns(3,4,5)ص3 levels by PLC is also involved in the response to chemorepellents in ديكتيوستيليوم (Keizer-Gunnink et al., 2007). cAMP analogs, such as 8-para-chlorphenylthio-cAMP (8CPT-cAMP), can induce a repellent response in ديكتيوستيليوم by binding to the cAMP receptor cAR1 (Johnson et al., 1992). This induces a localized inhibition of PLC, which is normally activated by cAMP. Inhibition of PLC is proposed to cause the local accumulation of PtdIns(4,5)ص2, PTEN binding and PtdIns(3,4,5)ص3 degradation at the front of the cell. This leads to dominant PtdIns(3,4,5)ص3 signaling at the rear of the cell, resulting in a movement away from the repellent source. PLC therefore can act as a polarity switch, controlling the response to signals in the environment.

PLA2 and PI3K/PTEN regulate chemotaxis in ديكتيوستيليوم. في ديكتيوستيليوم, chemotaxis is regulated by at least two intertwined and partly redundant pathways involving PI3K and PLA2. Both pathways are regulated by extracellular cAMP. The PI3K pathway is regulated, via PtdIns(4,5)ص2 (PIP2)/PTEN, by PLC. The PLA2 pathway depends on cytosolic Ca 2+ , which is regulated by IP3 (thus partly by PLC), fatty acids and Ca 2+ uptake. In steep gradients, either pathway is dispensable in shallow gradients, both pathways are necessary to allow efficient chemotaxis (see text for details). Red arrows indicate enzymatic reactions. PL, phospholipids Lyso-PL, lyso-phospholipids Gαβγ, heterotrimeric G protein cAR1, cAMP receptor PIP3, PtdIns(3,4,5)ص3.

PLA2 and PI3K/PTEN regulate chemotaxis in ديكتيوستيليوم. في ديكتيوستيليوم, chemotaxis is regulated by at least two intertwined and partly redundant pathways involving PI3K and PLA2. Both pathways are regulated by extracellular cAMP. The PI3K pathway is regulated, via PtdIns(4,5)ص2 (PIP2)/PTEN, by PLC. The PLA2 pathway depends on cytosolic Ca 2+ , which is regulated by IP3 (thus partly by PLC), fatty acids and Ca 2+ uptake. In steep gradients, either pathway is dispensable in shallow gradients, both pathways are necessary to allow efficient chemotaxis (see text for details). Red arrows indicate enzymatic reactions. PL, phospholipids Lyso-PL, lyso-phospholipids Gαβγ, heterotrimeric G protein cAR1, cAMP receptor PIP3, PtdIns(3,4,5)ص3.

PLC and PLD in mammalian chemotaxis

PtdIns(4,5)ص2 has a pivotal role in both the PLC and PLD cellular signaling pathways. It serves as the major substrate for PLC proteins and simultaneously influences the subcellular localization and activity of PLD proteins. Studies on mouse neutrophils lacking PLC-β2 and PLC-β3 isoforms have indicated that the PLC pathways play an important role in chemoattractant-mediated production of superoxide, and in the regulation of protein kinases and chemokine-induced Ca 2+ signaling, but not in chemotaxis (Li et al., 2000 McNeill et al., 2007). Nevertheless, treatment of human neutrophils with PLC inhibitors blocks chemotactic responses to interleukin 8 (IL8) and leukotriene B4 (LTB4) (Hou et al., 2004). Thus, the function of PLC in neutrophil chemotaxis is not fully understood and might vary according to the chemoattractant. By contrast, PLC-β is clearly necessary for T-cell chemotaxis. It acts by transiently raising cytoplasmic Ca 2+ concentrations via inositol (1,4,5)-trisphosphate [Ins(1,4,5)ص3, IP3] but does not influence PKC activity (Bach et al., 2007 Smit et al., 2003). The identities of the Ca 2+ -dependent downstream components (such as calmodulin kinases, myosin light-chain kinase or Rho kinase) that mediate the chemotactic response in T-cells remain elusive.

The PH domain of PLC is thought to target it to particular lipids and membrane surfaces (Rebecchi and Scarlata, 1998). There is evidence that, in differentiating promyelocytes, PLC-β2 interacts with actin via the PH domain of PLC-β2 (Brugnoli et al., 2007). This promotes the association with cytoskeleton-associated PtdIns(4,5)ص2 in the plasma membrane, resulting in hydrolysis of PtdIns(4,5)ص2 and consequent cytoskeletal rearrangements and motility.

PLD hydrolyzes the phosphodiester bond in phosphatidylcholine (PC), resulting in the production of choline and the second messenger phosphatidic acid (PA) (Oude Weernink et al., 2007). The function of PLD during neutrophil chemotaxis has not been fully determined. Azuma et al. (Azuma et al., 2007) propose that PLD is required for activation of p38MAPK upon stimulation with fMLP under conditions that stimulate superoxide production, but not chemotaxis. By contrast, Powner et al. (Powner et al., 2007) have recently demonstrated that PLD regulates integrins that support stable adhesion during neutrophil migration. In that study, PA produced by PLD activity stimulated the generation of PtdIns(4,5)ص2 by stimulating phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase activity in response to fMLP. PtdIns(4,5)ص2 promoted the binding of talin to the surface-expressed β2-integrin CD18 and hence caused activation of the integrins CD11b/CD18, required for stable adhesion and migration. The study also pointed to the involvement of PLD in the distribution and function of actin stress fibers. في ديكتيوستيليوم, inhibition of PLD causes a dramatic decrease in PtdIns(4,5)ص2 synthesis, resulting in severe defects in actin-based motility (Zouwail et al., 2005). In mast cells, human PLD binds to actin, which is important for the regulation of PLD1b activity (Farquhar et al., 2007). Evidence thus supports a link between phosphatidylcholine hydrolysis and remodeling of the actin cytoskeleton in a variety of processes and cell types.

In neutrophils, PI3Kγ becomes localized to the plasma membrane in response to stimulation by fMLP, increasing the formation of PtdIns(3,4,5)ص3 and thereby the recruitment of other factors that activate PLD (e.g. Rho and Arf-GTPases, as well as PKC isoforms) (Chen and Exton, 2004 Henage et al., 2006). The activity of PLD can be inhibited by prostaglandin E2 (PGE2), which stimulates protein kinase A (PKA). This in turn inhibits the translocation of the PLD-activating factors, possibly by inhibiting PI3K (Burelout et al., 2007 Burelout et al., 2004). However, it is unclear how PI3K might be inhibited, because the PI3K regulatory and catalytic subunits are not targets for PKA phosphorylation in vitro and are unlikely targets in vivo. PI3K activity is regulated by the binding of the subunits p101/p110γ to the Gβγ subunits released upon receptor activation (Brock et al., 2003 Stephens et al., 1997), but Gβγ-subunit protein sequences do not contain consensus sites for PKA phosphorylation, and phosphorylation by PKA has not been demonstrated. The fMLP receptor is also not phosphorylated by PKA (Burelout et al., 2007). Therefore, the mechanism that underlies the inhibitory effect of PKA on PI3K requires further analysis.

PLC and cofilin in adenocarcinoma cells

In adenocarcinoma cells, epidermal growth factor (EGF) stimulation induces two peaks of actin polymerization, which is similar to the biphasic F-actin-polymerization response to cAMP that is seen in ديكتيوستيليوم (Chan et al., 2000 Chan et al., 1998 Chen et al., 2003). The second peak is dependent on PI3K activity, both in carcinoma cells and in ديكتيوستيليوم (Chen et al., 2003 Hill et al., 2000). In carcinoma cells, the first peak was recently demonstrated to depend on PLC-γ and cofilin (Mouneimne et al., 2004). These results, and those from other studies, strongly argue that PLC, together with cofilin, mediates gradient sensing in these cells (Ghosh et al., 2004 Mouneimne et al., 2006). على النقيض من ذلك ، في ديكتيوستيليوم PLC regulates PIP2 levels and therefore cell motility, but not directional sensing. في ديكتيوستيليوم, cofilin is involved in actin remodeling and localizes to the leading edge during chemotaxis (Aizawa et al., 1995 Aizawa et al., 1997) but there is no evidence that it regulates gradient sensing and, in contrast to mammalian cofilin, ديكتيوستيليوم cofilin lacks the regulatory Ser at position 3. Interestingly, in cells lacking both PLA2 and PI3K activities (plaA – /pi3k1 – /2 – cells), the first peak of actin polymerization is significantly decreased, although both plaA – cells and pi3k1 – /2 – cells have nearly normal first peaks of actin polymerization, indicating that both pathways might be involved in the initial actin polymerization (Chen et al., 2007).

In carcinoma cells, cofilin is activated via PLC-γ, which acts by locally decreasing PtdIns(4,5)ص2. Cofilin is essential for the localized formation of barbed ends, which act as sites for new local actin polymerization cofilin thus determines the direction of cell protrusion and movement (Condeelis, 2001 DesMarais et al., 2005 Ghosh et al., 2004) (Fig. 3). Cofilin activity seems to be mainly dependent on PLC-γ-mediated PtdIns(4,5)ص2 hydrolysis and does not involve an IP3-mediated Ca 2+ release (Ma et al., 2000 Mouneimne et al., 2006 Yonezawa et al., 1991). In addition to activation by PLC-γ, mammalian cofilin is also phosphorylated at Ser3 by LIM kinase (LIMK), which inhibits the ability of cofilin to bind actin (Zebda et al., 2000), and is dephosphorylated by the phosphatase Slingshot (SSH) (Nishita et al., 2005 Niwa et al., 2002 Ohta et al., 2003). Phosphorylation of cofilin increases upon EGF stimulation (Mouneimne et al., 2004 Song et al., 2006) and is required for chemotactic sensing, although the exact function is not fully understood (Mouneimne et al., 2006). In Jurkat T-cells, cofilin is thought to be inactivated by phosphorylation by LIMK after stimulation with stromal cell-derived factor-1α (SDF-1α). This results in the formation of F-actin-rich lamellipodial protrusions (Nishita et al., 2005). Via the association with F-actin, the phosphatase Slingshot-1L becomes locally activated in the protrusions and dephosphorylates, and thereby re-activates, cofilin in the lamellipodium. This allows actin-filament turnover and ensures the dynamic nature of the lamellipodium (Nishita et al., 2005).

Recent studies of carcinoma cells indicate that the initial activation of cofilin does not involve dephosphorylation in response to chemoattractant stimulation (Mouneimne et al., 2004 Song et al., 2006). Cofilin is instead thought to be locally released and activated by hydrolysis of PtdIns(4,5)ص2 by PLC-γ and, simultaneously, be globally inactivated via phosphorylation by LIMK (Hitchcock-DeGregori, 2006 Mouneimne et al., 2006). This leads to an asymmetric distribution of cofilin activity, setting the direction of lamellipodium formation and subsequent migration. This model is consistent with earlier findings that cofilin is recruited to the leading edge immediately before lamellipod extension and is followed by the Arp2/3 complex and the extension of the lamellipod (DesMarais et al., 2004). However, it is not fully understood whether or not cofilin is completely deactivated by LIMK and whether the phosphatase SSH or 14-3-3 proteins might be involved in this process (Soosairajah et al., 2005).

Whereas the inhibition of PLC-γ/cofilin leads to defects in gradient sensing, inhibition of PI3K or PTEN decreases motility and speed in carcinoma cells, as it does in ديكتيوستيليوم (Mouneimne et al., 2006 Mouneimne et al., 2004). Full lamellipod extension requires PI3K activity, because the second peak of actin polymerization is dependent on PI3K (Hill et al., 2000). PI3K has been postulated to signal to WAVE and the Arp2/3 complex, which is necessary for lamellipod protrusion (Bailly et al., 2001 Higgs and Pollard, 2001 Takenawa and Miki, 2001). The PLC-γ/cofilin and PI3K/Arp2/3 signaling pathways thus cooperate in chemotactic gradient sensing and efficient lamellipod generation in response to EGF stimulation. By hydrolyzing PtdIns(4,5)ص2, PLC-γ activates cofilin, which promotes F-actin severing. This creates free barbed ends, defining the site for Arp2/3 activation. The Arp2/3 complex nucleates new filaments, which become elongated by Ena/VASP proteins, creating a branched actin network that allows stable lamellipod protrusion and migration.


مقدمة

Bacterial motility is important for a wide variety of biological functions such as swarming, chemotaxis, biofilm formation, and virulence. For example, the Gram-negative bacterium Myxococcus xanthus exhibits a complex life cycle that includes swarming, predation, and fruiting body formation: motility is important for all of these functions. M. xanthus does not contain flagella, but is able to move across solid surfaces using two very different motility systems ( Hodgkin and Kaiser, 1979 ). The first motility system, called social (S-) motility, is similar to twitching motility in الزائفة الزنجارية and is powered by type-IV pili localized at the leading cell pole ( Wall and Kaiser, 1999 ). Cell movement occurs because the polar pili bind to polysaccharides on the substrate or on the surface of other cells: this triggers pilus retraction, which pulls the cells forward ( Wall and Kaiser, 1999 Sun وآخرون, 2000 Li وآخرون، 2003). The second motility system, called adventurous (A-) motility, is still not very well understood. Multiple genetic screens have led to the identification of over 40 genes required for A-motility, but their specific functions are mostly uncharacterized and a molecular motility engine has not been identified ( Rodriguez and Spormann, 1999 Youderian وآخرون, 2003 Yu and Kaiser, 2007 ). During the last 40 years, many models have been proposed to explain the mechanism of A-motility, including surfactant effects, moving chains of adhesions, rotating membrane embedded rotors, and, more recently, slime extrusion through nozzles ( Wolgemuth وآخرون, 2002 Mignot, 2007 ). However, clear-cut evidence for any of these models has been lacking.

Recently, several findings suggested that A-motility involves distributed motors and focal adhesion complexes. For example, observations of filamentous cells indicated that the A-motility gliding motors are not located at the lagging cell pole, but distributed along the cell bodies ( Sun وآخرون, 1999 Sliusarenko وآخرون، 2007). Furthermore, cytological studies showed that AglZ, an A-motility protein ( Yang وآخرون, 2004 ), is localized in clusters that originate at the leading cell pole. As cells moved forward, the clusters were localized at regular intervals along the cell body, where they remained at fixed positions relative to the substratum ( Mignot وآخرون، 2007). Based on this evidence, it was proposed that the AglZ clusters were associated with A-motility motors that power motility by coupling movement on a rigid cytoskeletal filament with adhesion complexes on the surface ( Wozniak وآخرون, 2004 Mignot, 2007 Mignot وآخرون، 2007). This proposed motility mechanism has similarities to eukaryotic focal adhesion complexes, where cell-surface ligands that provide anchor points with the extracellular matrix are connected to the actin–myosin network in the interior of the cell ( Wozniak وآخرون, 2004 ).

Motility in M. xanthus exhibits an additional complexity in that cells periodically reverse. During reversals, which usually occur about every 7–14 min depending on the cultural conditions, the polarity of cells inverts. Thus, the leading cell pole becomes the lagging pole and the old lagging pole becomes the new leading pole ( Mauriello and Zusman, 2007 ). During cell reversals, the A- and S-engines reverse direction coordinately. For example, the S-motility protein FrzS and the A-motility protein AglZ are transferred together from the old to the new leading pole ( Ward وآخرون, 2000 Yang وآخرون, 2004 Mignot وآخرون, 2005 , 2007 ). At the same time, proteins associated with the lagging cell pole, like the A-motility protein RomR ( Leonardy وآخرون, 2007 ), track to the new lagging pole. The frequency of cell reversals is controlled by the Frz (frizzy) signal transduction system ( Blackhart and Zusman, 1985 ). It is hypothesized that periodic cell reversals allows cells to reorient themselves to achieve directed motility ( Zusman وآخرون، 2007). Thus, most frz mutants rarely reverse and are defective in swarming and fruiting body formation in contrast, some frz mutants hyper-reverse and form very compact colonies as the cells show very little net surface translocation ( Bustamante وآخرون, 2004 ).

In this paper, we identified the actin-like protein MreB and the Ras-like protein MglA as critical components in the localization of the A- and S-motility proteins, FrzS and AglZ. We also found that MreB acts upstream of MglA in the positioning of polar motility proteins and the focal adhesion complexes. Finally, our data suggest that assembly of the focal adhesion clusters is an essential requirement for cells to achieve A-motility.


ملاحظات ختامية

Two photon microscopy-based investigation of T cell� interactions has uncovered factors that, in addition to pMHC abundance and affinity, regulate the dynamic interplay between these two cell types. Although tightly regulated T cell attraction to activated DCs promote adaptive immune responses by allowing rare cells to meet, excessive interactions with low-affinity pMHC-presenting DCs deteriorate the overall quality of clonal expansion. Furthermore, intrinsic wiring of the migratory behavior of T cells facilitates their scanning function. Thus, programmed Myo1g-induced meandering behavior permits sufficiently long interactions between T cells and DCs. In addition, continuous F-actin treadmilling during both migration and IS formation endows T cells with the capacity to quickly switch between migratory versus stationary modes. Thus, upon cessation of TCR signaling, T cells resume their motility, presumably to avoid overstimulation and to prepare for egress. These observations raise new interesting questions. For example, is the duration of phase 2-like stable interactions regulated by external chemoattractant gradients or cell-intrinsic mechanisms? Furthermore, desensitization of chemokine receptors, such as CCR5, and its impact on T cell motility patterns في الجسم الحي has not been investigated in detail. Such studies are relevant since CCR5 ligands attract cognate and non-cognate naïve CD8 + T cells, and would rapidly limit access to DCs unless CCR5 desensitization is allowing cell turnover. The continued examination of mechanisms that control T cell motility in lymphoid tissue and their impact on adaptive immune responses will remain a productive field of research in years to come.


شاهد الفيديو: الخلايا التائية HD1 (أغسطس 2022).