معلومة

4.3: وفرة الحمض النووي الريبي - علم الأحياء

4.3: وفرة الحمض النووي الريبي - علم الأحياء



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

إن توفر تحقيقات الحمض النووي المستنسخة للعديد من الجينات قد سهل إلى حد كبير تحليل كميات الحمض النووي الريبي في خلايا مختلفة أو في ظل ظروف مختلفة. على سبيل المثال ، من الشائع جدًا تسمية مسبار DNA الذي سوف يتهجين ليصبح mRNA ؛ يأتي الحمض النووي إما من استنساخ (كدنا) أو من استنساخ جينومي يحتوي على إكسون. ثم يتم تهجين المسبار المسمى بـ RNA الكلي أو المحتوي على polyA (يسمى الأخير polyA + RNA ، وهو مكافئ تقريبًا لـ mRNA) من خلية. تركيز المجس أكبر بكثير من تركيز مرنا الهدف للجين المحدد ، وبالتالي فإن المسبار في فائض كبير ويجب دفع كل الرنا المرسال من الجين المعني إلى مزدوج مع المسبار. كمية المجس المحمي من الهضم بواسطة نوكلياز محدد أحادي الخيط مثل نوكلياز S1 يعطي مقياسًا لكمية الرنا المرسال المحدد الموجود في الخلية. (يختلف هذا الموقف في بعض الجوانب المهمة عن تقدير عدد الجينات المعبر عنها والوفرة من حركية التفاعلات التي يحركها RNA. في تلك المادة ، كان المرء ينظر إلى مجموعات كاملة من mRNAs ، بينما في هذه الحالة ، ينظر المرء فقط إلى مرنا واحد - المكمل للمسبار المسمى.)

[ملاحظتان تقنيتان: يقيس الفحص التشخيصي هنا كمية الحمض النووي المسمى في مزدوج الاتجاه ويتم هضم الحمض النووي غير المهجن. إذا كان مسبار الحمض النووي في الأصل مزدوج الشريطة ، فسيتم تغيير طبيعته في البداية قبل التهجين ، ولكن الآن كيف يمكنك التمييز بين حماية نوكلياز الناشئة عن ازدواج DNA-mRNA مقابل تلك التي تنشأ من خيطي إعادة ربط الحمض النووي؟ أنظف نهج هو مجرد توليف وتسمية حبلا الحمض النووي المكمل لـ mRNA ؛ يمكن القيام بذلك عن طريق الاختيارات المناسبة من البادئات لتخليق الحمض النووي من البلازميدات الحاملة للحمض النووي المستخدم كمسبار. بدلاً من ذلك ، يمكن تحضير مسبار DNA مزدوج المسمى يمتد إلى ما بعد جزء ترميز mRNA من الجين ، بحيث يكون مزدوج DNA-DNA الناتج عن إعادة الختم أكبر من DNA مزدوج RNA الناتج عن التهجين إلى mRNA. أيضًا ، يتم استخدام ظروف التهجين التي تحتوي على تركيزات عالية من الملح والفورميد التي تفضل ازدواج DNA-RNA على ازدواج DNA-DNA. (2) نهج مكافئ هو توليف مسبار RNA مشتق من DNA المستنسخ ؛ يشكل هذا "الحمض النووي الريبي التكميلي" ازدواجًا أقوى مع الرنا المرسال أكثر من الحمض النووي الريبي (كدنا) ؛ تكون الدوبلكس RNA-RNA أقوى من الدوبلكس RNA-DNA في ظل ظروف عالية من تركيزات الملح والفورماميد. ثم يتم الكشف عن الأجزاء المحمية من الهضم بواسطة RNases.]

أ) خلايا كريات الدم الحمراء في الفئران (MEL) تكافئ الخلايا الطليعية ، التي تم تخليدها بواسطة مركب فريند فريند بحيث يمكن أن تنمو بشكل مستمر في الثقافة. العلاج بمركبات عضوية صغيرة مثل ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) سيحثهم على النضج إلى أرومات الكريات الحمر ، مع زيادة كبيرة في التعبير عن جينات محددة من الكريات الحمر (آلية هذا الاستقراء لا تزال غير معروفة). لنفترض أنك عزلت الحمض النووي الريبي الكلي من كل من الخلايا غير المستحثة (غير المعالجة) وعدد متساوٍ من الخلايا التي يسببها DMSO. تم تهجين عينات الحمض النووي الريبي (RNA) إلى فائض من مسبار الحمض النووي المشع إشعاعيًا من جين الفأر b-globin ، وتم تحديد كمية المسبار المهجن إلى mRNA عن طريق معالجة العينات باستخدام نوكلياز S1 ، ورحلان كهربائي على هلام بولي أكريلاميد ، والقياس. كمية النشاط الإشعاعي في الجزء الناتج عن ازدواج الحمض النووي المرنا. يظهر أدناه رسم توضيحي للانعكاسات غير المتجانسة ، وعلاج نوكلياز S1 ، والصورة الشعاعية الناتجة عن الهلام. يحتوي الجزء المحمي من الخلايا غير المستحثة على 10000 نسخة في الدقيقة ، والجزء المحمي من الخلايا المستحثة يحتوي على 500000 نسخة في الدقيقة. التحكم السلبي مع الحمض النووي الريبي من خط الخلايا اللمفاوية التائية ، والذي لا ينتج غلوبين مرنا ، لا يعطي أي حماية ، أي 0 نسخة في الدقيقة للجزء التشخيصي. يتم تحفيز التعبير عن هذا الجين b-globin إلى أي مدى في خلايا MEL التي عولجت بـ DMSO؟

ب) يعطي الاختبار السابق الكميات النسبية من الرنا المرسال في ظل الشرطين ، وهذا اختبار قوي للغاية ومستخدم على نطاق واسع. ولكن ماذا يعني هذا من حيث جزيئات الرنا المرسال لكل خلية ، أي كيف تتغير الوفرة عند الاستقراء؟ يمكن للمرء أن يغير هذا الاختبار إلى حد ما للحصول على مقياس للوفرة ، مشابه من حيث المبدأ للحسابات الواردة في القسم VIIF. أولاً ، يحتاج المرء إلى قياس عدد جزيئات الرنا المرسال لكل خلية. لنفترض أنك حصدت 107 خلية MEL وعزلت 3 ملغ من polyA + RNA (بشكل أساسي mRNA). ما هو العدد الإجمالي لجزيئات mRNA لكل خلية MEL ، بافتراض أن متوسط ​​طول mRNA 2000 نيوكليوتيد؟

ج) إذا قام أحدهم بتسمية الحمض النووي الريبي في خلايا MEL ، على سبيل المثال عن طريق إنماء الخلايا في وجود [3H] يوريدين ، الذي يتم دمجه فقط في الحمض النووي الريبي ، يمكن تهجين polyA + RNA المعزول المسمى إلى فائض من DNA (غير المسمى الآن) المكمل لـ mRNA محل الاهتمام. يمكن الكشف عن الحمض النووي الريبي على الوجهين مع الحمض النووي من خلال حمايته من الهضم بواسطة نوكليازات مثل RNase A و RNase T1 ؛ سيبدو التصوير الشعاعي الناتج مثل ذلك الموضح أدناه ، مع نطاقات تحتوي على مزيد من النشاط الإشعاعي ممثلة بحشوة أغمق. نظرًا لأن الحمض النووي لا يزال زائدًا ، يجب دفع كل مكمل mRNA للمسبار إلى مزدوج ، ويمكن للمرء بسهولة قياس جزء polyA + RNA التكميلي لكل مسبار. يوفر الجدول التالي بعض البيانات التمثيلية والمثالية لـ polyA + RNA من خلايا MEL غير المستحثة والمستحثة ، بما في ذلك إجمالي RNA المدخل (غير المعالج بالنوكليازات) والمقدار المحمي من هضم النيوكلياز عن طريق التهجين مع وجود فائض من DNA الجين b-globin DNA ، DNA ترميز عامل نسخ الكريات الحمر GATA1 ، وترميز الحمض النووي الألبومين البيضاوي (الذي لا يتم التعبير عنه في خلايا MEL ، أي أنه عنصر تحكم سلبي). أي جزء من mRNA (أو polyA + RNA) يتكون من mRNA من هذه الجينات الثلاثة ، وما هي وفرتها في الخلايا غير المستحثة والمستحثة؟

مسبار الحمض النوويخلايا MEL غير المستحثة المحمية cpmخلايا MEL المحمية المستحثة cpm
[الإدخال المسمى RNA][1,000,000][1,000,000]
ب-غلوبين5,000250,000
جاتا 12525
الألبومين البيضاوي00

د) بشكل عام ، ما هو توزيع الرنا المرسال في نوع معين من الخلايا المتمايزة ، أي ما مدى وفرة فئات التعقيد المختلفة من الرنا المرسال؟

استخدام قواعد بيانات التسلسلات والطفرات والبيانات الوظيفية

4.6 استخدمنا التخليق الحيوي للأرجينين لتوضيح تحليل التكميل وبناء المسار. الخطوات المتبعة في تخليق الأرجينين هي أيضًا جزء من دورة اليوريا. أحد الإنزيمات يحفز تكوين سيترولين من فوسفات الكربامويل والأورنيثين. دعنا نتعرف أكثر على هذا الإنزيم المسمى أورنيثين ترانسكاربامويلاز أو OTC.

استخدم مستعرض الويب المفضل لديك للانتقال إلى URL الخاص بـ NCBI (المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية).

  • http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
  • انقر فوق زر Entrez. يوفر Entrez بوابة لأنواع عديدة من المعلومات على هذا الخادم. لنبدأ بتسلسل الحمض النووي والبروتين.
  • انقر على زر النيوكليوتيدات.
  • أدخل "X00210" واضغط على زر البحث. لا تدخل علامات التنصيص ، فهذه هي الأصفار وواحد ، وليست O أو l.
  • يجب أن تحصل على تقرير عن الجين الخاص بـ OTC في بكتريا قولونية، مسمى أرجي.
  1. ما هو حجم منطقة ترميز البروتين ، من كودون بدء الترجمة إلى كودون الإنهاء؟ ما حجم البروتين المشفر؟
  2. اين ال أرجي الجين على بكتريا قولونيةكروموسوم؟ ارجع إلى خادم Entrez (حيث قمت بالنقر فوق Nucleotides من قبل). انقر فوق الجينوم ، ثم حدد الإشريكية القولونية. أدخل "argI" في نافذة البحث (لا تدخل علامات الاقتباس ، وهذا هو الحرف I "eye" وليس "واحدًا").

4.7 هو بكتريا قولونية بروتين OTC المرتبط بأي بروتينات أخرى في قواعد بيانات التسلسل؟ تحتاج إلى الحصول على تسلسل البروتين ، والذي يمكنك القيام به بالنقر فوق أرجيأثناء وجودك في خريطة الجينوم ، أو يمكنك العودة إلى إدخال الجين (رقم الانضمام X00210). إذا كنت في GenBank Report لإدخال X00210 ، فأنت بحاجة إلى النقر فوق الزر Protein في أعلى الصفحة ، ثم تحديد FastA Report من الصفحة التالية. (إذا اتخذت المسار الافتراضي تقرير GenPept ، فلا بأس بذلك ، يمكنك الحصول على تقرير FastA من هناك أيضًا.) قم بعمل نسخة من تسلسل OTC هذا بتنسيق FastA (قد ترغب في حفظه في برنامج آخر ، على سبيل المثال معالج الكلمات المفضل للراحة).

انقر الآن على زر Blast في أعلى الصفحة ، وفي الصفحة التالية حدد Basic Blast search. في خادم Blast ، حدد blastp من القائمة المنسدلة بجوار البرنامج (يؤدي هذا إلى محاذاة تسلسل البروتين ؛ يقوم blastn الافتراضي بمحاذاة تسلسلات النوكليوتيدات) ، والصق بكتريا قولونيةتسلسل OTC بتنسيق FastA في نافذة الإدخال. لاحظ أن القائمة المنسدلة تمنحك خيار إدخال رقم التعريف (40962) بدلاً من التسلسل. قواعد بيانات التسلسل الافتراضي هي nr ، وهي عبارة عن تجميع غير مكرر لقواعد البيانات من الولايات المتحدة وأوروبا واليابان. سنستخدم ذلك ، لكن لاحظ أن القائمة المنسدلة تسمح لك بتحديد قواعد بيانات أخرى.

أ) انقر فوق الزر إرسال الاستعلام. عندما يتم تشغيل المهمة أخيرًا (قد يستغرق ذلك دقيقة أو أكثر عندما يكون الخادم مشغولاً) ماذا ترى؟

ب) هو بكتريا قولونية بروتين OTC المرتبط بأي بروتين بشري؟ قم بالتمرير لأسفل في جدول الضربات ، بعد العديد من العقاقير OTCs البكتيرية (النيسرية, بيروكوكس...) حتى تصادف بعض الثدييات. برصيد 172 ، يجب أن تجد ارتباطًا تشعبيًا لـ sp | P00480 | OTC_HUMAN ORNITHINE CARBAMOYLTRANSFERASE PECURSOR. انقر فوق هذا الارتباط التشعبي.

4.8 إدخال OTC البشري (P00480 ، وهو نفس 400687) طويل جدًا.

أ) ما الذي يشغل الكثير من جدول الميزات؟ ماذا يخبرك هذا عن OTCالجين في البشر؟

ب) باستخدام إما جدول الميزات لإدخال GenBank 400687 (أو P00480) أو الأفضل من ذلك ، ارجع إلى الصفحة الرئيسية لـ NCBI وانقر على زر OMIM للانتقال إلى On-Line Medelian Inheritance In Man (من Victor McKusick ، MD). اين الجين؟ ماذا يحدث لنقص OTC؟

4.9 ما الذي تخبرك به تسلسلات الأحماض الأمينية المتوافقة للبروتينات البكتيرية والبشرية؟ هل المناطق المحفوظة مرتبطة بالمناطق الوظيفية؟ على سبيل المثال ، هل طفرة أي من الأحماض الأمينية في المناطق المحفوظة تؤدي إلى النمط الظاهري في البشر؟

منذ أن ولّد بحث Blast العديد من الزيارات ذات الدرجات الأعلى من بكتريا قولونية- زوج بشري ، سيتعين علينا استخدام أداة مختلفة لرؤية المحاذاة. في الصفحة العليا لخادم Blast (حيث حددت Basic Blast search من قبل) ، حدد تسلسلات Blast 2. تسمح لك هذه الأداة بإدخال أي تسلسلين وإنشاء محاذاة زوجية بواسطة برنامج Blast2. يجب عليك استخدام و بكتريا قولونية تسلسل البروتين OTC أو أرقام المدخلات الخاصة بهم ، وتأكد من اختيار blastp كبرنامج. عند القيام بذلك في يوليو من عام 1998 ، واجهت مشكلة مع الأداة المساعدة في إنشاء نسخة مكررة من كل تسلسل أدخلته (لا أعرف ما إذا كانت هذه مشكلة من جانبي أم أنها مشكلة) ؛ من المحتمل أن تكون هذه حالة مؤقتة. إذا واجهت مشكلة ، فجرب خادمًا مختلفًا ، مثل خادم تحليل التسلسل على genome.cs.mtu.edu/sas.html. اختر محاذاة التسلسل الزوجي ، وأدخل التسلسلات الخاصة بك وقم بتشغيل GAP أو SIM على تسلسلات البروتين.

الكروماتينية

4.10 من أهم الأدلة المبكرة التي ساعدت في تحديد بنية الجسيم النووي هو نمط انشقاق النيوكلياز في الكروماتين. في هذه التجربة ، عولج الكروماتين لفترة وجيزة بإنزيم ، نوكلياز مكورات دقيقة ، الذي يحط من الحمض النووي ، ثم تمت إزالة كل البروتين وحل الحمض النووي المنقى عن طريق الرحلان الكهربي. شوهد نمط منتظم من النطاقات العريضة ؛ متوسط ​​أحجام أجزاء الحمض النووي كانت مضاعفات 200 زوج قاعدي ، أي 200 ، 400 ، 600 ، 800 زوج قاعدي ، إلخ. ماذا تخبرك هذه النتيجة عن بنية الكروماتين؟ كانت شرائط عصابات الحمض النووي سميكة ومنتشرة وليست حادة ؛ ماذا يخبرك هذا عن مواقف الانقسام بواسطة نوكلياز المكورات الدقيقة؟

4.11 ما هي الهيستونات الموجودة في قلب النواة؟ ما هي تفاعلات البروتين البروتين في القلب؟ ما مجالات البروتين التي تتوسط هذه التفاعلات؟

4.12 يحتوي فيروس الثدييات SV40 على كروموسومات صغيرة يتم فيها تعبئة DNA مزدوج الاتجاه الدائري في نيوكليوسومات. عندما تتم إزالة الهستونات من الكروموسومات المصغرة ، وجد أن الحمض النووي الناتج يكون ملفوفًا بشكل سلبي للغاية. ماذا يخبرك هذا عن حالة الحمض النووي في minichrosomes ومسار الحمض النووي حول nucleosome؟

4.13 هل العبارات التالية صحيحة أم خاطئة؟

  1. يلتف الحمض النووي حول الهستونات حوالي 1.65 لفة لكل نواة نواة.
  2. عادةً ما يكون الحمض النووي في الكروماتين الذي يحتوي على الجينات المنسوخة بنشاط أكثر حساسية لـ DNases من الحمض النووي في الكروماتين غير المنسوخ.

4.14 نسبة التعبئة لمركب بروتين الحمض النووي هي النسبة بين طول الحمض النووي العاري في شكل B الطبيعي إلى طول بنية البروتين-DNA. على سبيل المثال ، إذا قامت مجموعة من البروتينات بطي جزيء DNA بحجم 100 في هيكل يبلغ طوله 25 ، فإن هذا الهيكل له نسبة تعبئة تبلغ 4.

أ) بالنظر إلى أبعاد البنية النووية ، ما هي نسبة التعبئة للحمض النووي في نواة النواة؟ لاحظ أن الملعب هو المسافة بين نقاط المنتصف لمزدوج الحمض النووي حيث يدور حول الهستونات في القلب.

ب) إذا كانت النيوكليوسومات معبأة بإحكام في ملف لولبي مع 6 نيوكليوسومات في كل دورة ، فما هي نسبة التعبئة الآن؟ افترض أن كل دورة من الملف اللولبي تترجم 110 Å ، أي أن المسافة بين نقاط المنتصف للنيوكليوسومات في المنعطفات المتتالية للملف اللولبي هي 110 Å.

4.15 ما مدى قرب حواف الحمض النووي أثناء تقوسها حول سطح النواة النووية؟


عنصر WLE2 الأدنى ليس كافيًا لتوجيه التوطين القمي في غياب الحمض النووي الريبي الذي يحتوي على الطول الكامل بدون أجنحة 3'UTR

يتم ترجمة mRNAs المشفرة بواسطة متماثل ذبابة الفاكهة Wnt-1 ، بدون أجنحة ، إلى منطقة صغيرة من السيتوبلازم القمي في الخلايا الظهارية الجنينية المبكرة. يتطلب هذا نشاط تسلسلات التمثيل داخل المنطقة غير المترجمة الثلاثة التي تسمى عناصر التوطين بدون أجنحة (WLEs). تم تحديد واحد من هؤلاء ، WLE2 ، في البداية على أنه تسلسل مؤثر في رابطة الدول المستقلة يوجه التوطين القمي للـ mRNAs المعبر عنها في الجسم الحي في 4-5 ساعات من أجنة ذبابة الفاكهة. لتحديد النشاط الدقيق لـ WLE2 أثناء التوطين القمي بدون أجنحة ، أجرينا طفرات متعمقة لهذا التسلسل. باستخدام كل من الحقن المباشر والمقايسات المعدلة وراثيًا في الجسم الحي ، قررنا أن WLE2 ، في حد ذاته ، لا يكفي لتوجيه الارتباط بالعوامل العابرة التي تتوسط نقل الحمض النووي الريبي القمي في الخلايا الجنينية. بدلاً من ذلك ، يتم نقل RNAs التي تحتوي على WLE2 فقط بشكل قمعي فقط في وجود RNA ثانٍ يحتوي على متواليات توطين أخرى تعمل بنظام cis للمنطقة غير المترجمة بدون أجنحة 3. من المحتمل أن يكون هذا المطلب المشترك لـ WLE2 وتسلسلات UTR الإضافية غير المجنحة وظيفة مطلوبة أثناء التوطين القمي ، حيث يمكن للطفرات داخل WLE2 تعديل نشاط التوطين القمي لجزيئات الحمض النووي الريبي التي تحتوي على إشارات توطين أخرى بدون أجنحة. يشير هذا إلى أنه ، على غرار mRNAs الموضعية الأخرى مثل bicoid ، قد يتطلب التوطين بدون أجنحة تفاعلات RNA-RNA محددة بالإضافة إلى التعرف على مجمعات توطين الحمض النووي الريبي السيتوبلازمي.


مقدمة

تحرير RNA ، تعديل نيوكليوتيدات معينة في تسلسل الحمض النووي الريبي ، يوسع التنوع في البروتينات وآليات تنظيم الجينات [1 ، 2]. النوع الأكثر شيوعًا من تحرير الحمض النووي الريبي في الخلايا البشرية هو تحرير A-to-I ، والذي يشير إلى نزع أمين الأدينوزين (A) إلى إينوزين (I) ويتم تحفيزه بواسطة ديامينازات الأدينوزين التي تعمل على عائلة إنزيمات RNA (ADAR) [ 3]. يتم تشفير ثلاثة جينات ADAR في الجينوم البشري ، وهي ADAR1 و ADAR2 و ADAR3. يتم التعبير عن ADAR1 و ADAR2 النشطين حفازًا على نطاق واسع عبر الأنسجة. في المقابل ، يتم التعبير عن ADAR3 حصريًا في مناطق معينة من الدماغ وهو غير نشط محفزًا [4]. نظرًا لأنه يتم التعرف على الإينوزين على أنه غوانوزين (G) في الترجمة والتسلسل ، يُشار أيضًا إلى تحرير A-to-I باسم تحرير A-to-G. على الرغم من الكشف عن الملايين من أحداث التحرير عبر النسخ البشرية ، إلا أن نسبة صغيرة فقط من أحداث التحرير تم تمييزها وظيفيًا. تأثيرات معظم مواقع التحرير ، بشكل أساسي داخل المناطق غير المشفرة ، لم يتم اكتشافها بعد [5 ، 6].

أثبتت الأدلة المتزايدة أهمية خلل التنظيم في تعديل الحمض النووي الريبي في السرطان. حدد عدد من الدراسات آليات يمكن من خلالها لمواقع تحرير الحمض النووي الريبي الفردية ، التي تسبب في الغالب أحداث إعادة الترميز (أي تغيرات الأحماض الأمينية) ، تعزيز أو كبت تطور الورم [7،8،9،10]. إلى جانب العمل في عملية تكوين الأورام ، يمكن ترجمة نسخ RNA المحررة إلى ببتيدات محررة ، والتي يمكن التعرف عليها كمستضدات للسرطان وتنشيط الاستجابة المناعية المضادة للورم [11 ، 12]. علاوة على ذلك ، عبر أنواع مختلفة من السرطان ، لوحظت انحرافات على مستوى الجينوم في تحرير الحمض النووي الريبي (RNA) وارتبطت بالسمات السريرية [13 ، 14 ، 15]. في كل نوع من أنواع السرطان ، زادت مستويات التعديل أو انخفضت بشكل عام في الأورام ، مقارنةً بالعينات الطبيعية المتطابقة. ارتبطت مستويات التحرير لمواقع محددة بمرحلة الورم ، والنوع الفرعي ، وبقاء المريض ، وللمجموعة الفرعية الأصغر من المواقع غير المجهولة ، وتحرير تكاثر الخلايا المتغير وحساسية الأدوية في تجارب خط الخلية [13]. نظرًا لأن تحرير الحمض النووي الريبي لديه القدرة على توفير المعلومات لتطوير تشخيصات السرطان المحسنة والعلاجات الخاصة بالمريض ، هناك حاجة إلى إجراء تحقيق شامل للوظائف الدقيقة والآليات التنظيمية للعديد من تغييرات تحرير الحمض النووي الريبي (RNA) الخاصة بنوع السرطان [10].

في تطور السرطان ، يُسهل تنشيط الانتقال الظهاري واللحمة المتوسطة (EMT) النقائل عن طريق تمكين الخلايا السرطانية من اكتساب النمط الظاهري الغازي ، والتسلل إلى الدورة الدموية والجهاز الليمفاوي ، والوصول إلى مواقع بعيدة للاستعمار [16 ، 17 ، 18]. تم ربط عدد قليل من مواقع تحرير RNA بهذه العملية حتى الآن. على وجه التحديد ، تم عرض أحداث التحرير في SLC22A3 و FAK و COPA و RHOQ و miR-200b لتسريع ورم خبيث [12 ، 19 ، 20 ، 21 ، 22 ، 23]. في حين أن miR-200b يستهدف عادةً ZEB1 و ZEB2 ، وهما عاملان أساسيان يحفزان EMT ، فإن التحرير يغير أهدافه ويعزز غزو الخلية وقدرتها على الحركة [23]. عزز حدث إعادة الترميز SLC22A3 أيضًا EMT ، مما تسبب في تغيرات التعبير في جينات علامة EMT [19]. في المقابل ، أدى حدث إعادة ترميز في GABRA3 إلى تثبيط ورم خبيث وكان موجودًا فقط في خطوط الخلايا غير الغازية والأورام غير المنتشرة [22]. تسلط هذه الدراسات الضوء على الأهمية الوظيفية لتحرير الحمض النووي الريبي في ورم خبيث وميزة إجراء تحقيق أكثر شمولاً.

هنا ، نقدم تحليلًا عالميًا ومقارنة لمحات تحرير الحمض النووي الريبي بين الأنماط الظاهرية (E) واللحمة المتوسطة (M) للأورام الأولية عبر أنواع السرطان المتعددة. باستخدام بيانات RNA-seq المستمدة من الأورام الكبيرة والخلايا المفردة ، لاحظنا أنماط تحرير مميزة بين الأنماط الظاهرية ، وغالبًا ما يتم إثراء اختلافات التحرير بين جينات مسار الاستجابة المناعية. بدعم من الأدلة التجريبية ، نظهر أن مواقع التحرير التفاضلي تؤثر على وفرة الجين المضيف mRNA وتحديد آلية جديدة للتثبيت المعتمد على التحرير لـ mRNAs بواسطة ILF3. أحد الجينات المستهدفة لـ ILF3 هو EIF2AK2 ، الذي يرمز إلى بروتين كيناز R (PKR) ، وهو لاعب رئيسي في الاستجابة المناعية والفيروسية.


قياسات mRNA والبروتين

تركيزات وإنتاج ومعدلات دوران mRNA والبروتينات في حالة مستقرة

من التقنيات المذكورة أعلاه ، لدينا الآن قياسات للتركيزات المطلقة للـ mRNAs والبروتينات من الكائنات الحية المختلفة ، بما في ذلك خلايا الثدييات والديدان والذباب والخميرة وعدد قليل من أنواع البكتيريا 1،5،19. بشكل عام ، في كل من البكتيريا وحقيقيات النوى ، ترتبط التركيزات الخلوية للبروتينات بوفرة mRNAs المقابلة لها ، ولكن ليس بقوة. غالبًا ما تظهر معامل ارتباط بيرسون التربيعي بقيمة & # x0223c0.40 ، مما يعني أنه يمكن تفسير & # x0223c40٪ من التباين في تركيز البروتين من خلال معرفة وفرة الرنا المرسال 1،19 (الشكل 2 أ). كما لوحظت ارتباطات أعلى 1،19. لشرح النسبة المتبقية & # x0223c60٪ من التباين ، يجب استدعاء مزيج من التنظيم اللاحق للنسخ وضوضاء القياس.

أ | ترتبط وفرة نسخ الرنا المرسال جزئيًا بوفرة البروتين ، وعادة ما تفسر ما يقرب من ثلث إلى ثلثي التباين في مستويات بروتين الحالة المستقرة ، اعتمادًا على الكائن الحي. يتضح هذا الاتجاه في البيانات المأخوذة من خلايا الخلايا الليفية للماوس NIH3T3. ب | في خلايا الثدييات ، كما هو موضح هنا لخط خلايا الورم الأرومي النخاعي DAOY البشري ، & # x0223c30 & # x0201340٪ من التباين في وفرة البروتين تفسر بوفرة الرنا المرسال. يمكن تفسير جزء كبير مماثل من التباين من خلال عوامل أخرى ، والتي تشير إلى التنظيم بعد النسخ والترجمة وتدهور البروتين 5،24. ج | ومع ذلك ، تعد مستويات mRNA وكيلًا ممتازًا (بشكل عام) لوجود بروتين & # x02014 أو ، بشكل أكثر دقة ، لإمكانية اكتشافه باستخدام تقنيات البروتينات الحالية. تمت ملاحظة دالة الخطوة & # x02018lazy الناتجة & # x02019 في البكتيريا والخميرة وزراعة الخلايا البشرية: بعد تركيز معين من الرنا المرسال ، لا يزيد احتمال اكتشاف بروتين في العينة. د | تشير الدلائل الأولية أيضًا إلى أنه عند النظر في أخصائي تقويم العظام عبر الأنواع شديدة التباين ، يتم الحفاظ على وفرة البروتينات أكثر من وفرة mRNAs المقابلة 39،40 ، مما يشير إلى أن وفرة البروتين قد تكون مفضلة تطوريًا. (تشير الأرقام إلى معاملات ارتباط رتبة سبيرمان بين الوفرة الجزيئية.) تدعم مثل هذه البيانات دورًا مهمًا للآليات التنظيمية التي تحدث في اتجاه مجرى النهر من تحديد مستويات الرنا المرسال. لوحة أ من هذا الرقم مقتبس ، بإذن ، من REF. 5 & ​​# x000a9 (2011) Macmillan Publishers Ltd. جميع الحقوق محفوظة. لوحة ب من هذا الرقم مقتبس من المرجع. 24. لوحة ج من هذا الرقم مقتبس ، بإذن ، من REF. 42 & # x000a9 (2009) مطبعة جامعة أكسفورد. لوحة د من هذا الرقم مقتبس ، بإذن ، من REF. 40 & # x000a9 (2010) وايلي.

قد يختلف تركيز البروتينات في مجموعات الخلايا ذات الحالة المستقرة في ظل ظروف النمو المختلفة. غالبًا ما يتم التعبير عن هذا الاختلاف كنسبة لوغاريتمية للوفرة المقاسة ويشار إليه هنا بالوفرة النسبية (المربع 1). قد تحدث أو لا تحدث الوفرة النسبية للبروتينات بما يتناسب مع مستويات الرنا المرسال النسبية. على سبيل المثال ، في خلايا الخميرة أحادية الصيغة الصبغية مقابل خلايا الخميرة ثنائية الصبغة ، هناك ارتباط معتدل (ص = 0.46 إلى 0.68) بين الوفرة النسبية في البروتينات و mRNAs (على الأقل تلك التي تم قياسها جيدًا). وبالمثل ، تم توقع الوفرة النسبية جزئيًا فقط من خلال الوفرة النسبية للرنا المرسال عبر ثلاثة خطوط من الخلايا البشرية (ارتباط سبيرمان = 0.63).

يتم تحديد وفرة البروتين و mRNA المذكورة أعلاه من خلال العلاقات بين معدلات العمليات التي تنتج وتحط من الجزيئات المشاركة. أصبحت التقديرات الأولية واسعة النطاق متاحة الآن أيضًا لهذه المعدلات الخاصة بالعمليات المختلفة لتعبير البروتين (الشكل 1). في خلايا الثدييات ، يتم إنتاج mRNAs بمعدل أقل بكثير من البروتينات في المتوسط ​​، وتنتج خلية الثدييات نسختين من mRNA معين في الساعة ، بينما تنتج عشرات النسخ من البروتين المقابل لكل mRNA في الساعة. وبالمثل ، فإن mRNAs أقل استقرارًا من البروتينات (بمتوسط ​​عمر نصف يبلغ 2.6 & # x020137 ساعة مقابل 46 ساعة ، على التوالي). تم تأكيد فترات نصف العمر الطويلة للبروتينات من خلال دراسات مستقلة في أنظمة أخرى 17،18 وتشير إلى دور كبير محتمل للبروتين & # x02018dilution & # x02019 & # x02014 أي انخفاض تركيز البروتين بسبب انقسام الخلايا 17. إن فترات نصف العمر الطويلة للثدييات mRNAs تتناقض بشدة مع نصف عمر الرنا المرسال البكتيري المقاس ، والذي بلغ متوسطه حوالي 7 دقائق 23.

تلخص كل هذه المقارنات متوسط ​​الخصائص والاتجاهات العالمية بين الجينات. قد يكون لأي بروتين معين معدلات أو وفرة تختلف اختلافًا كبيرًا عن متوسط ​​البحث لمعدلاته الخاصة ووفرة قد يساعد في إلقاء الضوء على البيولوجيا المثيرة للاهتمام ذات الصلة بالبروتين ، وربما يشير إلى تنظيم قوي للغاية للنسخ أو ما بعد النسخ. على سبيل المثال ، تميل RNAs والبروتينات من جينات التمثيل الغذائي للثدييات إلى أن تكون مستقرة جدًا 5 ولديها نسبة عالية من البروتين إلى mRNA 24 على النقيض من ذلك ، تميل البروتينات التي تشارك في تنظيم الكروماتين وتنظيم النسخ إلى التدهور السريع 5. وبالتالي فإن تنظيم وفرة البروتين يعكس أدوارًا بيولوجية محددة: قد يتعين إنتاج البروتينات التنظيمية وتدهورها بسرعة كبيرة للتفاعل مع المنبه ، في حين أن البروتينات الهيكلية أو التدبير المنزلي ستكون أطول عمراً.

مرنا ومستويات البروتين استجابة للاضطراب

بالإضافة إلى قياسات الحالة المستقرة ، تحولت الجهود الآن أيضًا إلى الأنظمة المضطربة (المربع 1). لوصف التغيرات الديناميكية في البروتينات ، فإن القياسات المعتمدة على الوقت ضرورية. كانت هذه الدراسات محدودة حتى وقت قريب بسبب عوامل مثل ضوضاء القياس ، وعدد صغير نسبيًا من الملصقات النظائرية المتاحة والطبيعة المتسلسلة & # x02014 على عكس الطبيعة القابلة للتوازي بسهولة & # x02014 لتجارب قياس الطيف الكتلي ، مما يقلل من عدد العينات يمكن تحليلها. ومع ذلك ، فقد زودنا العمل الأخير بمجموعات بيانات مفصلة تقدم نتائج متناقضة. على سبيل المثال ، تعرضت الخميرة لضغط الأسمولية وتم قياس تغيرات التعبير المعتمدة على الوقت 25. وجد المؤلفون أنه بالنسبة للجينات المنتظمة ، فإن الحد الأقصى من الرنا المرسال وتركيز البروتين الأقصى مرتبطان جيدًا ، لكن هذا الاتجاه لم يكن صحيحًا بالنسبة للجينات الخاضعة للتنظيم. في دراسة متسلسلة زمنية مختلفة ، لم تظهر الخميرة التي تعرضت للإجهاد التأكسدي هذا السلوك ولكنها أشارت إلى تنظيم كبير بعد النسخ لجزء كبير من الجينات بشكل مستقل عن تنظيمها العلوي أو السفلي 26،27. يبدو أن الأمر نفسه ينطبق على البكتيريا حيث تكشف تحليلات الدورة الزمنية للأنظمة المضطربة عن اختلافات كبيرة بين تغيرات وفرة البروتين و mRNA 28،29. من الواضح أن فهمنا للأنظمة المضطربة لا يزال غير مكتمل ويتطلب مزيدًا من التحليلات.

مرنا ومستويات البروتين في الخلايا المفردة

لقد تقدمت طرق الخلية المفردة بشكل كبير خلال السنوات القليلة الماضية وهي الآن قادرة على إجراء تحليل تفصيلي عالي الإنتاجية للعديد من الجينات ، وتتناقض نتائج هذه الاختبارات مع نتائج التحليلات على مستوى السكان (BOX 1). (للحصول على مراجعة ممتازة لتحليلات الخلية الواحدة ، انظر المرجع 30). مسح حديث واسع النطاق لفرد واحد الإشريكية القولونية تشير الخلايا إلى أن وفرة البروتينات البكتيرية و mRNAs غير مرتبطة تمامًا 13 ، على الرغم من أن هذه القياسات لم يتم جمعها بشكل شامل ولم يتم التحقق منها بشكل مستقل. ومع ذلك ، فإن متوسط ​​عدد السكان للإشارات من العديد من القياسات أحادية الخلية ينتج ارتباطات يمكن مقارنتها بالقياسات المجمعة على مجموعات الخلايا ، وتوضح تركيزات الرنا المرسال & # x0223c54 & # x0201377٪ التباين في متوسط ​​مستويات البروتين 13. يمكن تفسير عدم وجود ارتباط بين الحمض النووي الريبي (RNA) وتركيز البروتين في الخلايا المفردة من خلال الأعمار المختلفة للجزيئات: فالرنا المرسال البكتيري قصير العمر ويتم إنتاج عدد قليل من النسخ في كل خلية ، مما يتسبب في تذبذب تركيزاتها في الخلايا المفردة أكثر بكثير من تلك الموجودة في الخلايا المفردة. البروتينات المقابلة الأطول عمرا. عند حساب المتوسط ​​عبر السكان ، تختفي هذه التقلبات ، وترتبط تركيزات الرنا المرسال والبروتين.

بالإضافة إلى ذلك ، يلعب تنظيم الترجمة دورًا في عدم وجود ارتباط: عند مقارنة فئات مختلفة من الجينات عبر خلايا الخميرة ، تكون تركيزات البروتينات في نفس المركب أقل ضوضاءً مقارنة بالبروتينات التي لا توجد داخل مجمع واحد 31 ، على الرغم من أن هذا ليس صحيحًا على مستوى mRNAs 32. تعد مساهمات كل من الضوضاء البيولوجية داخل الخلايا وبين الخلايا مجالًا نشطًا للبحث وتتم مراجعتها في مكان آخر (على سبيل المثال ، المرجع 33).


4.3: وفرة الحمض النووي الريبي - علم الأحياء

يتم توفير جميع المقالات المنشورة بواسطة MDPI على الفور في جميع أنحاء العالم بموجب ترخيص وصول مفتوح. لا يلزم الحصول على إذن خاص لإعادة استخدام كل أو جزء من المقالة المنشورة بواسطة MDPI ، بما في ذلك الأشكال والجداول. بالنسبة للمقالات المنشورة بموجب ترخيص Creative Common CC BY ذي الوصول المفتوح ، يجوز إعادة استخدام أي جزء من المقالة دون إذن بشرط الاستشهاد بالمقال الأصلي بوضوح.

تمثل الأوراق الرئيسية أكثر الأبحاث تقدمًا مع إمكانات كبيرة للتأثير الكبير في هذا المجال. يتم تقديم الأوراق الرئيسية بناءً على دعوة فردية أو توصية من المحررين العلميين وتخضع لمراجعة الأقران قبل النشر.

يمكن أن تكون ورقة الميزات إما مقالة بحثية أصلية ، أو دراسة بحثية جديدة جوهرية غالبًا ما تتضمن العديد من التقنيات أو المناهج ، أو ورقة مراجعة شاملة مع تحديثات موجزة ودقيقة عن آخر التقدم في المجال الذي يراجع بشكل منهجي التطورات الأكثر إثارة في العلم. المؤلفات. يوفر هذا النوع من الأوراق نظرة عامة على الاتجاهات المستقبلية للبحث أو التطبيقات الممكنة.

تستند مقالات اختيار المحرر على توصيات المحررين العلميين لمجلات MDPI من جميع أنحاء العالم. يختار المحررون عددًا صغيرًا من المقالات المنشورة مؤخرًا في المجلة ويعتقدون أنها ستكون مثيرة للاهتمام بشكل خاص للمؤلفين أو مهمة في هذا المجال. الهدف هو تقديم لمحة سريعة عن بعض الأعمال الأكثر إثارة المنشورة في مجالات البحث المختلفة بالمجلة.


قاعدة بيانات وفرة الحمض النووي الريبي (RAD)

قدم RAD ، كما تم وصفه في الأصل ، مخططًا ونهجًا لالتقاط بيانات الجينوميات الوظيفية التي تهدف في المقام الأول إلى قياس وفرة النسخ. تم إعداد تطبيق RAD لتوفير الوصول إلى الدراسات من قبل المتعاونين في CBIL بالإضافة إلى إظهار ميزات RAD. نظرًا للتغيرات في التكنولوجيا والتمويل ، لم يعد موقع RAD الإلكتروني متاحًا (يتم توفير وصف تاريخي أدناه). لا يزال RAD كمخطط نشطًا جدًا ومدمجًا في نظام قاعدة بيانات GUS (مخطط الجينوم الموحد) الذي يستخدمه CBIL (EuPathDB و Beta Cell Genomics) وغيرها. يمكن عرض مخطط RAD جنبًا إلى جنب مع مساحات أسماء GUS الأخرى من خلال متصفح المخطط الخاص بنا.

كان موقع الويب RAD مصدرًا لدراسات التعبير الجيني ، حيث يخزن الدراسات المتوافقة مع MIAME المنسقة للغاية (أي التجارب) التي تستخدم مجموعة متنوعة من التقنيات مثل مصفوفات المرشح والمصفوفات الدقيقة ثنائية القناة وشرائح Affymetrix و SAGE و MPSS و RT-PCR. كانت البيانات متاحة للاستعلام والتحميل بناءً على الأنطولوجيا أو المنشورات أو الجينات MGED. كانت كل من الدراسات العامة والخاصة (الأخيرة قابلة للعرض فقط من قبل المستخدمين الذين لديهم عمليات تسجيل دخول وأذونات مناسبة) متاحة من هذا الموقع.

خضع RAD لتجديد كبير في عام 2003 (موصوف في Manduchi et al.، المعلوماتية الحيوية، 2004). كان الدافع وراء ذلك هو الجهد المستمر لمعايير ميكروأري من قبل MGED ، وتجربتنا مع دراسات ميكروأري ، والتحرك لوضع RAD ضمن نظام قواعد بيانات متكامل ، GUS. النسخة الأصلية من RAD الموصوفة في Stoeckert et al. (المعلوماتية الحيوية، 2001) بالإصدار المستند إلى GUS.

دراسات في موقع ويب RAD: تم استخدام RAD لعرض الدراسات وإتاحة الوصول إليها من قبل المتعاونين معنا. العديد من هذه كانت مرتبطة بعملنا كجزء من اتحاد الغدد الصماء البنكرياس و Beta Cell Biology Consortium. يمكن العثور على هذه الدراسات في قسم جينوم خلايا بيتا على موقع ويب بيولوجيا الخلية بيتا. ارتبطت الدراسات المتبقية بشكل أساسي بمشروع بيولوجيا القلب والأوعية الدموية بالتعاون مع البروفيسور بيتر ديفيز ومجموعته في جامعة بنسلفانيا. للوصول إلى هذه الدراسات ، انتقل إلى صفحة بيولوجيا القلب والأوعية الدموية. إذا وصلت إلى هنا أثناء البحث عن معلومات تكميلية لإحدى هذه الدراسات ، فستجد الروابط ذات الصلة في هذه الصفحة.

يرجى الاتصال بنا باستخدام الرابط الموجود في شريط القائمة إذا كانت لديك أسئلة أو طلبات إضافية تتعلق بـ RAD.


يؤدي تذبذب الحمض النووي الريبي (tRNA) في ثلاثة مواضع للكودون إلى الإضرار بإخلاص وحدة فك ترميز الترجمة

يمكن أن تنتج الترجمة غير المنطقية ، المسماة قراءة إيقاف الكودون ، عن فك التشفير الشاذ لكودونات الإيقاف بواسطة aminoacyl-tRNAs غير المعروفة (الأمثلة هي Gln [جاي جي/جAA] ، صور [UAيو/ UAج] و Lys [أاي جي/أAA] لكودونات الإيقاف UAA و UAG على التوالي Trp [UGجي] ، Arg [أGA] و Cys [UGيو/ UGج] لكودون الإيقاف UGA) [2 ، 33]. يسلط حدوث مثل هذه القراءة الضوء على إمكانية تذبذب الموضعين 3 و 1 في الآلية متعدية ويوفر إشارة إلى مدى شيوع أخطاء الترجمة في الكائنات الحية. في الشركات العملاقة ، أظهر التنميط الريبوسوم أن جميع أكواد الإيقاف الثلاثة يمكن أن يتم فك تشفيرها بشكل خاطئ ، في حين أن معدلات مثل هذا الترميز الخاطئ تعتمد على الموضع داخل جزيء الرنا المرسال (منطقة الترميز أو النهاية) [34]. لا يحدث تذبذب الموضع 1 في أكواد الإيقاف فحسب ، بل يحدث أيضًا في أكواد المعنى ، مثل قراءة الأرجينين الخاطئة جGU /جكودونات GC مثل السيستين يوGU /يوأكواد GC [35 ، 36]. By using the prokaryote ortholog of elongation factor Tu (EF-Tu) for targeted mass spectrometry, it has been reported that even position 2 can be misdecoded by noncognate tRNAs, as illustrated by the detection of the arginine CجيU codon misdecoded by tRNA GأG -Leu [5]. Thus, substantial misdecoding at all three positions is possible [2, 5] (Table 1). This consequently compromises the fidelity of the translation decoder.

It has been reported that G•T mismatching occurs in both DNA and RNA duplex following tautomerization and ionization, and this plays important roles in replication and translation errors [37, 38]. The Watson-Crick-like mismatch can evade fidelity checkpoints and appears to occur with probabilities (10 −3 to 10 −5 ) that strongly imply a universal role of this mismatch in translation errors [38]. The rG•rT mismatch at position 3 may not lead to mistranslation in decoding center, because NNU and NNC (rG•rC/rU) code for the same amino acids in such twice-degenerated codons, and the same holds true for NNG and NNA (rU•rA/rG) (Fig 3). However, more mistranslation results if rG•rT mismatch takes place at position 1 and 2 [5, 35, 36]. Hence, in toto a picture emerges—that amino acid misincorporation in the nascent peptide chain is prone to occur mainly because of the absence of fully Watson-Crick pairing tRNAs and by excessive wobbling at all three codon positions [5].


5 Applications of Type VI CRISPR-Cas Systems

In the years following their discovery, biochemical and structural characterization, type VI CRISPR-Cas systems have attracted much attention because of efficient, highly specific, and programmable RNA-targeting properties and autonomous pre-crRNA processing. Transcriptome editing by Cas13 effectors also has important advantages over CRISPR-based genome editing: it is safer because of its transient and reversible nature, and the extent of editing is dose-dependent and can be modulated to suit various purposes. In addition, type VI CRISPR-Cas systems exhibit collateral ssRNA cleavage activity in bacteria and in vitro, which can be utilized for diagnostic applications. Thus, an increasing number of studies have aimed to develop type VI CRISPR-Cas systems into tools for basic research, biotechnology, and therapeutics. Most of these studies have recently been extensively reviewed and compared to other RNA-targeting tools elsewhere. [ 24, 33, 35, 36, 70-79 ] This article will give an overview of the reported applications, their principles and drawbacks before discussing possible strategies for optimizing efficiency and safety of the Cas13-based tools.

5.1 Transcriptome Engineering in Basic Research and Therapeutics

Cellular RNA, both protein-coding and noncoding, is fundamentally involved in a plethora of biological processes, including conveying genetic information for protein synthesis and playing diverse regulatory roles by interacting with proteins, DNA and other RNA molecules. Conversely, the fate of cellular RNA is determined by similarly diverse protein- and RNA-mediated regulation and modifications. While substantial advances in our understanding of these processes have been made through genome-scale observational studies, their functional characterization has been largely obstructed due to limited precision, efficiency, and utility of the commonly used tools for RNA manipulation such as RNAi and antisense nucleotides. [ 35 ] Recent studies, however, show that type VI CRISPR-Cas systems can overcome these barriers and provide new strategies for RNA manipulation (شكل 5). Additionally, Cas13-based transcriptome engineering for therapeutic purposes holds promise as safer and more versatile approach compared to the DNA-targeting CRISPR-Cas systems.

In one of the earliest reports on Cas13 application, Cox et al. linked C-terminally truncated catalytically inactive بريفوتيلا ص. P5-125 Cas13b (dPspCas13b) to the hyperactive mutant of deaminase domain of ADAR2 (adenosine deaminase acting on RNA 2) to develop a tool termed REPAIRv2 (RNA editing for programmable A to I replacement version 2) that can be packaged into adeno-associated viral (AAV) vector for cell delivery. [ 42 ] Accompanied with crRNA sequence targeting the gene of interest, REPAIRv2 conducts reversible and directed adenosine-to-inosine (A-to-I) edits on RNA transcripts since inosine mimics guanosine in translation and splicing, REPAIRv2 can be used to study or treat disease-relevant G to A mutations. [ 42 ] Further engineering of REPAIRv2 aimed at relaxing substrate preferences of ADAR2 deaminase domain yielded a new tool termed RESCUE (RNA editing for specific C to U exchange), which is capable of carrying out cytidine-to-uridine (C-to-U) conversions while retaining the original adenosine deaminase activity. [ 80 ] Although both REPAIRv2 and RESCUE exhibit high specificity (20 or less transcriptome-wide off-target edits detected upon transfection of 10 ng of REPAIRv2 vector, and 103 C-to-U and 139 A-to-I transcriptome-wide off target edits detected upon transfection of 150 ng of RESCUE vector), their current efficiency (up to 30% of on-target A-to-I edits by REPAIRv2 and ≈76% of on-target C-to-U edits by RESCUE) still has room for improvement. [ 42, 80 ]

شو وآخرون. established the first high-throughput phenotypic assay for functional studies of long noncoding (lnc) RNAs using Leptotrichia wadei Cas13a (LwaCas13a), which solves the problems observed with methods based on RNAi or antisense nucleotides, such as poor specificity, off-target effects, and ambiguity in assigning phenotypes to a single lncRNA. [ 81 ] In the assay, a library of K562 chronic myeloid leukemia cells stably expressing LwaCas13a and a unique crRNA targeting one of lncRNA transcripts was exposed to cancer drug-induced cellular stress, after which the roles of the studied lncRNAs in K562 cell viability were inferred from depletion or enrichment of each crRNA in the assayed cell population. [ 81 ]

Mapping RNA–protein interactions is essential for better understanding of various cellular processes. [ 82 ] Although efficient and robust methods such as cross-linking immunoprecipitation sequencing and RNA immunoprecipitation sequencing are broadly applied to identify RNAs bound to proteins of interest, currently available methods for detection of proteins bound to a specific RNA have severe limitations, including nonspecific binding and inability to detect weaker or transient interactions. [ 83, 84 ] To overcome these limitations, two Cas13-based methods have recently been developed for the RNA-centered study of RNA–protein interactions under natural conditions. [ 83, 84 ] The first method, termed CRUIS (CRISPR-based RNA-united interacting system), employs catalytically inactivated LwaCas13a (dLwaCas13a)-crRNA module to bind the RNA of interest, after which the bacterial ligase proteasomal accessory factor A (PafA) fused to dLwaCas13a ligates the small protein prokaryotic ubiquitin-like protein PupE to RNA-bound neighboring proteins. [ 83 ] The second method uses dRfxCas13d fused with (1) the double-stranded RNA-binding domain from human protein kinase R that would enhance and stabilize binding to targeted RNA after initial recognition by the dRfxCas13d-gRNA and (2) the modified plant peroxidase APEX2 which catalyzes 1 min promiscuous biotinylation of transiently interacting proteins for proximity labeling. [ 84 ] The two methods were successfully used to identify new endogenous interacting partners of the noncoding RNA activated by DNA damage (NORAD) and human telomerase RNA, respectively. [ 83, 84 ] It should be noted that careful design and screening of gRNAs is required for these two methods to find appropriate targeting sites within RNA of interest, as secondary RNA structure and possible steric hindrance caused by the size of Cas13 effectors may negatively affect target RNA binding and/or detection of some interacting proteins. [ 83, 84 ]

Type VI CRISPR-Cas systems also have considerable potential for implementation in research on various model organisms. Aiming to establish a cost-efficient and robust technique that would circumvent cytotoxic and off-target effects of the commonly used morpholinos, Kushawah et al. recently assessed the utility of type VI CRISPR-Cas systems in studying gene function in early development of teleost embryos. [ 85 ] Among investigated Cas13 effectors, RfxCas13d was found to efficiently and precisely disrupt maternal and zygotic gene function in zebrafish embryos without inducing toxicity, developmental abnormalities, direct off-target or collateral cleavage effects. [ 85 ] The study also demonstrated that coinjection of RfxCas13d protein and gRNAs can further accelerate knockdown of targeted maternal mRNA in dose-dependent manner and provide more penetrant phenotypes. [ 85 ] The established technique can be effectively used in other vertebrate embryos, including those of medaka, killifish, and mouse. [ 85 ] In another study related to model organisms, Jing et al. showed that type VI CRISPR-Cas systems can be used for RNA knockdown and single-base RNA editing in the fission yeast شيزوساكارومايس بومب, an important model organism used for studying cellular mechanisms conserved from yeast to humans. [ 86 ]

To investigate one potential therapeutic application, Konermann et al. delivered dRfxCas13d to cells via AAV vector to manipulate pathological alternative splicing of tau pre-mRNA in a neuronal model of frontotemporal dementia. [ 39 ] Later, Zhao et al. showed that Cas13 effectors can also be considered for therapeutic knockdown of oncogenes for which the use of small molecule inhibitors has thus far proven unsuccessful. [ 45 ] Programmed by crRNA to specifically target oncogenic kirsten rat sarcoma virus (KRAS) mutant and not wild-type KRAS mRNA transcripts, LwaCas13a efficiently decreased levels of mutant KRAS mRNA, inducing cell apoptosis in pancreatic cancer cells and tumor shrinkage in mice with pancreatic cell xenografts. [ 45 ] Furthermore, He et al. delivered active RfxCas13d to mouse liver for simultaneous and reversible knockdown of RNA transcripts associated with metabolic regulation, thus laying the groundwork for the use of type VI CRISPR-Cas systems in treatment of metabolic diseases. [ 87 ]

In addition to transcriptome manipulation, Cas13-based tools can also be used for studying and therapeutic regulation of epitranscriptome. One of the most prominent and abundant mRNA modifications is the N 6 -methyladenosine (m 6 A), a form of reversible and selective posttranscriptional methylation of adenosine residues that influences alternative splicing, conformation, expression, translation, and degradation of mRNA transcripts. [ 88, 89 ] The effects of m 6 A modifications on mRNA are mediated by m 6 A reader, writer, and eraser proteins. [ 88, 89 ] Previous transcriptome-wide m 6 A mappings suggest that distribution and pattern of m 6 A modifications are dynamic and associated with cell differentiation and various diseases such as cancers however, the lack of appropriate tools and methods has hitherto hindered deeper understanding of involvement of m 6 A-mediated epitranscriptome regulation in cellular processes and diseases. [ 88, 89 ] To study m 6 A regulation on individual RNA transcripts, Rauch and Dickinson recently designed a protocol in which dCas13b effectors fused to the functional output domains of the m 6 A reader proteins YTH domain-containing family protein 1 and 2 (YTHDF1 and YTHDF2) were transfected to cells along with crRNA targeting methylated sites in RNA transcript of interest, followed by assessment of protein levels with dual luciferase assay or RT-qPCR for evaluation of RNA levels. [ 90 ] In another study, the m 6 A eraser protein RNA demethylase alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase homolog 5 (ALKBH5) was linked to the C-terminus of dPspCas13b. [ 91 ] When combined with gRNA, the dPspCas13b-ALKBH5 fusion protein (named dm 6 ACRISPR) successfully demethylated targeted mRNA transcripts containing single or multiple m 6 A sites in human cell culture with low off-target effects. [ 91 ] dm 6 ACRISPR was also used to target m 6 A-modified transcripts of the oncogenes EGFR and MYC, which suppressed proliferation of HeLa cells and demonstrated that dm 6 ACRISPR can be applied in gene repression and regulation of cellular functions. [ 91 ] In the third study, Zhao et al. developed a photoactivable RNA m 6 A editing system using CRISPR-dCas13 (PAMEC) that includes two main components: (1) an RNA anchor probe consisting of the catalytically inactive Porhyromonas gulae Cas13b (dPguCas13b) fused to CIBN, a truncated variant of the light-sensitive protein calcium- and integrin-binding 1 (CIB1) that mediates light-dependent interaction with the photylase homology region of the cryptochrome circadian regulator (CRY2PHR), and (2) an m 6 A effector probe consisting of CRY2PHR fused to either m 6 A demethylase fat-mass and obesity-associated protein (FTO) for m 6 A erasure or the METTL3-METTL14 m 6 A methyltransferase complex for m 6 A writing. [ 92 ] The system enables efficient and robust m 6 A editing in cells illuminated by blue light, and it has been further optimized by adding an MS2 aptamer at 3′ end of crRNA for increased efficiency and by coupling it with an upconversion nanoparticle film for deep tissue m 6 A editing. [ 92 ] Considering significant attention that has lately been given to research on m 6 A-mediated epitranscriptome regulation and promising prospects of Cas13 effectors, it is likely that even more Cas13-based tools fused to various m 6 A reader/writer/eraser proteins will be developed in the near future.

5.2 Nucleic Acid Detection and Diagnostics

By harnessing the collateral cleavage activity and stringent crRNA-activator RNA complementarity requirements of type VI CRISPR-Cas systems, Gootenberg et al. designed a rapid, cheap, and ultrasensitive portable nucleic acid diagnostic platform named SHERLOCK (specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking). [ 43 ] SHERLOCK uses a Cas13-crRNA module that, once activated by a strictly complementary activator RNA from tested sample, promiscuously cleaves quenched fluorescent reporter RNA molecules at high turnover rate, thus generating a detectable and quantitative fluorescent signal (شكل 6). [ 43 ] The preceding recombinase polymerase amplification of samples followed by T7 transcription enables detection of both RNA and DNA samples at zeptomolar level. [ 43, 44 ] Subsequent development and standardization of the platform allowed detection of multiple target molecules using orthogonal type VI CRISPR-Cas systems, enhanced signal output by adding the type III CRISPR effector nuclease Csm6, simplified sample preparation by introducing the method termed HUDSON (heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases) and adapted the platform for convenient visual readout of results on a lateral flow strip. [ 44, 93, 94 ] SHERLOCK has been applied in diagnostics of viral infections, including COVID-19, cancer mutations, health-related single nucleotide polymorphisms (SNPs), and genetic traits in plants. [ 43, 44, 94-100 ] The utility of SHERLOCK as a cheap and reliable tool for diagnosing COVID-19 was recently evaluated on a larger scale in a clinical study conducted in Thailand. [ 101 ] Validated on 154 clinical COVID-19 samples, SHERLOCK exhibited 100% specificity and high sensitivity with both in-tube fluorescence and lateral flow readouts (96% and 88% sensitivity, respectively), successfully detected asymptomatic cases and its results were in full concordance with those from the commonly used RT-PCR tests. [ 101 ] SHERLOCK has also been adapted for simple, fast, and cheap monitoring of graft rejection and opportunistic infections by cytomegalovirus and BK polyomavirus in kidney transplant patients. [ 102 ] Available in form of qualitative lateral-flow readout that can be evaluated by a smartphone-based software, the test enables frequent and personalized point-of-care testing for early prevention of post-transplantation complications. [ 102 ]

As the COVID-19 pandemic highlighted the need for faster and less labor-intensive diagnostic tools with minimal equipment usage, SHERLOCK was recently further simplified into the diagnostic platform termed SHINE (SHERLOCK and HUDSON integration to navigate epidemics). [ 95 ] SHINE uses optimized protocol for HUDSON to speed up viral inactivation in nasopharyngeal swabs and saliva samples and combines the recombinase polymerase amplification, T7 transcription, and Cas13-mediated detection steps of SHERLOCK into a single-step reaction, thereby reducing time for obtaining COVID-19 test results to ≈50 min while maintaining 100% specificity and 90% sensitivity compared to RT-PCR tests. [ 95 ] In addition to lateral flow readout, SHINE test results can be visualized via in-tube fluorescent readout and interpreted by a smartphone application to avoid sample contamination and user bias. [ 95 ]

Apart from SHERLOCK, other Cas13-based diagnostic tools have been developed for various purposes, such as quantitative detection of microRNA or quantitative virus detection using automated microfluidic device. [ 48, 103, 104 ] Among these tools, CARMEN (combinatorial arrayed reactions for multiplexed evaluation of nucleic acids) should be noted for its capability to perform large-scale simultaneous testing of multiple samples for diverse pathogens at species, strain and SNP level—a feature particularly valuable for surveillance of spreading and evolution of infectious diseases. [ 104 ]

5.3 Nucleic Acid Imaging

Subcellular localization of RNA transcripts is spatiotemporally dynamic and directly associated with their function and fate. [ 78 ] Although fluorescent tools such as molecular beacons, the MS2-MCP system and fluorogenic RNA aptamers are available, their limitations make tracking individual RNA species in live cells difficult (شكل 7A–C). [ 78, 105 ] Wang and co-workers demonstrated that catalytically inactive dPspCas13b and dPguCas13b fused to enhanced green fluorescent protein can be employed as robust and fast RNA-labeling tools for real-time RNA imaging and tracking in living cells, with signal-to-noise ratio lower than that of MS2-MCP systems. [ 106 ] Both Cas13b orthologs were capable of efficient binding to cellular RNAs with medium level of abundance, and could be combined with an orthogonal dCas13 or MS2-MCP system for dual-color RNA–RNA imaging, or with a dCas9 system for RNA–DNA imaging (Figure 7A). [ 106 ] More recently, the same research group also published a detailed protocol for the aforementioned dCas13b-mediated imaging of RNA in living cells. [ 107 ] The protocol thoroughly describes every step, including gRNA design, selection of fluorescent proteins, preparation of cells for microscopy, data analysis, and troubleshooting. [ 107 ] Moreover, inactive RfxCas13d coupled with fluorescent-labeled crRNA has been used along with a dCas9-fluorescent crRNA system for real-time simultaneous visualization of transcript RNA and genomic DNA in the method known as CRISPR LiveFISH (live-cell fluorescent in situ hybridization). [ 108 ]

5.4 Antiviral Applications

Vaccines and commonly used antivirals (i.e., small-molecule inhibitors and monoclonal antibodies) are often hindered by costliness, long development time, and viral resistance that arises from high mutation rates. [ 109 ] Considering the importance of viral genome replication for completion of viral life cycle in host cells, viral inhibition through CRISPR-Cas-mediated degradation of highly conserved and essential genetic elements could potentially be used as cheaper and more efficient antiviral strategy. The efficacy and feasibility of this strategy was initially explored with CRISPR-Cas9 systems, which hold considerable promise in curing chronic viral infections caused by viruses with characteristic latency state such as human immunodeficiency virus, hepatitis B virus, herpes viruses and human papillomavirus. [ 110 ] However, ≈51%, 44%, and 70% of genera infecting humans, vertebrate animals, and plants, respectively, are ssRNA viruses that do not use DNA intermediates during their life cycles. [ 109, 111, 112 ] Even though the RNA-targeting CRISPR-Cas9 systems can be used, the exclusively ssRNA-targeting type VI CRISPR-Cas systems are more suitable for targeting ssRNA viruses (شكل 8).

The potential use of Cas13 systems in protecting plants against viruses was first demonstrated with LshCas13a, which was transgenically expressed in monocot and dicot plants to interfere with replication of economically important RNA viruses LshCas13a maintained its pre-crRNA processing activity in plants and did not cause cytotoxic effects. [ 47, 113, 114 ] RfxCas13d also exhibits robust and specific antiviral activity against RNA viruses in plants, at which it outperformed LwaCas13a and PspCas13b in both transient and stable overexpression assays in the study, RfxCas13d did not exert collateral cleavage effect in plants and was able to efficiently target two RNA viruses in parallel when crRNAs targeting both viruses were expressed in tested plants. [ 111 ] Recently published protocol describing transient expression of LbuCas13a and cognate CRISPR array in Nicotiana benthamiana will allow more extensive research on potential application of type VI CRISPR-Cas systems for antiviral defense in plants. [ 115 ]

Antiviral properties of Cas13 have also been tested against high doses of three distinct ssRNA viruses in mammalian cell lines lacking functional innate immune system, displaying potent viral inhibitory activity without affecting cell viability. [ 97 ] The authors of the study coupled Cas13-mediated virus targeting with SHERLOCK to create a comprehensive platform for diagnosis and treatment of viral diseases termed CARVER (Cas13-assisted restriction of viral expression and readout). [ 97 ] In the wake of COVID-19 pandemic and demands for alternative therapeutic approaches created by the lack of effective treatments and time required for vaccine development, Abbott et al. demonstrated the potential of Cas13-based therapy in combating emerging viral diseases. [ 116 ] Selecting RfxCas13d due to absence of PFS-imposed cleavage restrictions, robust and highly specific RNA interference and its compact size that would facilitate packaging and delivery, the authors developed PAC-MAN (prophylactic antiviral CRISPR in human cells) strategy for inhibiting SARS-CoV-2 and influenza A virus, as well as the majority of other coronavirus and influenza virus strains, by simultaneously targeting multiple highly conserved viral genomic regions. [ 116 ] The RfxCas13d-based PAC-MAN was shown to efficiently cleave SARS-CoV-2 RNA fragments and inhibit influenza A virus replication in human lung epithelial cell cultures, with greater inhibition at higher crRNA concentrations and lower viral titers. [ 116 ] The results of the study indicated that PAC-MAN could be effectively used for preventing new viral infections or as a complementary strategy along with traditional pharmaceuticals and vaccines. [ 116 ]

A variety of RNA viruses also infect domestic animals, thereby causing substantial economic losses. To investigate feasibility of repressing RNA virus infections in animals and humans with CRISPR-Cas13b systems, Cui et al. used PspCas13b to target two essential genes of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus in infected mammalian cells and almost completely inhibited viral gene transcription and expression. [ 117 ] Taking into account that delivery of Cas effector and gRNAs/CRISPR array via separate plasmids negatively affects targeting efficiency due to inconsistent expression levels of each component, the authors of the study also developed a single-vector delivery system that facilitates multiplexed targeting and further increases interference levels. [ 117 ]

In addition to potential application in targeting viruses in plants and mammals, type VI CRISPR-Cas systems could also be used in mosquitoes for suppressing mosquito-borne viral diseases such as dengue fever, chikungunya, and Zika. Tng et al. tested PspCas13b against a chimeric firefly luciferase reporter carrying the chikungunya virus (CHIKV) genomic sequence corresponding to the region encoding the nonstructural protein 2 (nsP2) and a CHIKV split replication system mimicking replication of viral RNA. [ 118 ] Guided by two gRNAs targeting nsP2 or CRISPR array targeting multiple sites in viral genome, PspCas13b performed efficiently against both the chimeric luciferase reporter and the CHIKV split replication system and significantly reduced viral RNA expression. [ 118 ] Interestingly, the two gRNAs targeting nsP2 were also capable of knocking down viral RNA in the absence of PspCas13b further investigation indicated that addition of PspCas13b enhanced viral RNA knockdown when U6 promoter-driven guides were used but did not increase suppression in cases when in vitro transcribed gRNAs were directly delivered to cells. [ 118 ] Since this phenomenon has not been observed in mammalian and plant cells, it is likely specific for mosquito cells, possibly because insect cells are generally more reliant on endogenous RNA interference systems that could utilize gRNAs to target viral sequences independently of PspCas13b. [ 118 ]


Scientists create tiny RNA molecule with big implications for life's origins

An extremely small RNA molecule created by a University of Colorado at Boulder team can catalyze a key reaction needed to synthesize proteins, the building blocks of life. The findings could be a substantial step toward understanding "the very origin of Earthly life," the lead researcher contends.

The smallest RNA enzyme ever known to perform a cellular chemical reaction is described in a paper published in the وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم. The paper was written by CU graduate student Rebecca Turk, research associate Nataliya Chumachenko and Professor Michael Yarus of the molecular, cellular and developmental biology department.

Cellular RNA can have hundreds or thousands of its basic structural units, called nucleotides. Yarus' team focused on a ribozyme -- a form of RNA that can catalyze chemical reactions -- with only five nucleotides.

Tom Blumenthal, a professor and chair of the MCDB department, noted that Tom Cech, a Nobel laureate and distinguished professor of chemistry and biochemistry at CU, and Professor Norman Pace of MCDB, independently discovered that RNA can act as an enzyme, carrying out chemical reactions. That "pioneering work" has been carried on further by Yarus, Blumenthal said.

Because proteins are complex, one vexing question is where the first proteins came from, Blumenthal said. "It now appears that the first catalytic macromolecules could have been RNA molecules, since they are somewhat simpler, were likely to exist early in the formation of the first life forms, and are capable of catalyzing chemical reactions without proteins being present," he said.

"In this paper the Yarus group has made the amazing discovery that even an extremely tiny RNA can by itself catalyze a key reaction that would be needed to synthesize proteins," Blumenthal said. "Nobody expected an RNA molecule this small and simple to be able to do such a complicated thing as that."

The finding adds weight to the "RNA World" hypothesis, which proposes that life on Earth evolved from early forms of RNA. "Mike Yarus has been one of the strongest proponents of this idea, and his lab has provided some of the strongest evidence for it over the past two decades," Blumenthal said.

Yarus noted that the RNA World hypothesis was complicated by the fact that RNA molecules are hard to make. "This work shows that RNA enzymes could have been far smaller, and therefore far easier to make under primitive conditions, than anyone has expected."

If very simple RNA molecules such as the product of the Yarus lab could have accelerated chemical reactions in Earth's primordial stew, the chances are much greater that RNA could direct and accelerate biochemical reactions under primitive conditions.

Before the advent of RNA, most biologists believe, there was a simpler world of chemical replicators that could only make more of themselves, given the raw materials of the time, Yarus said.

"If there exists that kind of mini-catalyst, a 'sister' to the one we describe, the world of the replicators would also jump a long step closer and we could really feel we were closing in on the first things on Earth that could undergo Darwinian evolution," Yarus said.

"In other words, we may have taken a substantial step toward the very origin of Earthly life," he said. "However, keep well in mind that the tiny replicator has not been found, and that its existence will be decided by experiments not yet done, perhaps not yet imagined."

"Dr. Yarus has brought an innovative approach to bear on the key question of how complex processes originated," said Michael Bender, a biologist who oversees protein synthesis grants at the National Institutes of Health's National Institute of General Medical Sciences. "By showing that a tiny segment of RNA can perform a key step of protein synthesis, this study has provided evidence that fundamental, protein-mediated cellular processes may have arisen from RNA-based mechanisms."

Yarus' work is supported by a $415,610 grant from the NIH. In 2008 he was named a fellow of the American Association for the Advancement of Science for "meritorious efforts to advance science or its applications."


Agricultural and Related Biotechnologies

4.25.4.4 Chloroplast Codon Optimization

It is well recognized that various organisms utilize certain codons in preference to others. Such preferential codon usage also occurs in chloroplasts. For example, the chloroplast of C.reinhardtii displays such codon bias, with codons containing adenine or uracil nucleotides in the third position favored over those with guanine or cytosine. 12,44 Codon usage bias is an important factor in limiting foreign gene expression in chloroplasts. 12,44 The adaption of foreign genes to the preferred codon usage of highly expressed chloroplast genes from كلاميدوموناس may be another effective strategy for increasing recombinant protein expression in algal chloroplasts. فرانكلين وآخرون. 39 demonstrated that the optimization of a GFP reporter to reflect chloroplast codon usage increased its expression at least 80-fold as compared to its nonoptimized counterpart. Similarly, Mayfield and Schultz 45 showed increased expression of the bacterial luciferase reporter when a chloroplast codon-optimized version of this gene was transformed into the chloroplast of C.reinhardtii. These results may indicate the necessity for codon optimization of any gene for which high levels of protein production are desired when using algal chloroplasts as an expression platform.


شاهد الفيديو: علم الأحياء تحت المجهر: ما الحمض النووي والحمض النووي الريبي (أغسطس 2022).