معلومة

كيفية تأكيد تكوين الهيكل الثانوي للسلائف ميرنا على هلام؟

كيفية تأكيد تكوين الهيكل الثانوي للسلائف ميرنا على هلام؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أريد أن أطوي السلائف-ميرنا في هيكلها الثانوي ثم أؤكدها على الهلام. في البداية ، أقوم بتسخينه في عازلة التلدين عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم أبرد ببطء. ثم أقوم بتشغيله على هلام ولكن العينات في نفس موضع التخفيف الأصلي.


إخلاء المسئولية: على الرغم من أنني حاولت إجراء بقع شمالية لـ miRNA ، إلا أنني لم أقم في الواقع بنوع التجربة التي تتحدث عنها.

بادئ ذي بدء ، تحتاج إلى عناصر تحكم.

  1. عنصر تحكم سلبي: نفس طول الحمض النووي الريبي (RNA) الذي لن ينثني (يمكنك إدخال بعض الطفرات في تسلسل ما قبل ميرنا لتعطيل الاقتران الأساسي). يمكنك استخدام أدوات التنبؤ بالهيكل الثانوي لـ miRNA لتصميم عناصر التحكم هذه بشكل منطقي.
  2. عنصر تحكم إيجابي: ربما يكون pre-miRNA مطويًا متشابكًا. بصراحة ، لم أجد أي شخص يستخدم عوامل التشابك هذه لدراسة البنية الثانوية للحمض النووي الريبي. ومع ذلك ، فقد رأيت بعض الأوراق البحثية القديمة حول هذا الموضوع (Wagner and Garrett ، 1978 ، Rabin and Crothers ، 1979). يمكنك أيضًا تجربة بعض الشروط (تركيزات الملح وما إلى ذلك) التي يتم فيها طي الحمض النووي الريبي (تمت دراستها باستخدام المقايسات الفيزيائية الحيوية).

الآن ، لا يمكنك تشغيل المواد الهلامية agarose. ستحتاج إلى هلام بولي أكريلاميد طويل ~ 15٪. تحتاج أيضًا إلى استخدام المخازن المؤقتة الصحيحة. يفترض أن 0.5-1x TBE يعمل. قد ترغب في تشغيل عينتك في حالتين: تغيير طبيعة (مع 8M يوريا) أو عدم تغيير طبيعة. يمكنك الرجوع إلى هذا البروتوكول (Petrov et al. 2013).

يجب أن يهاجر تحكمك الإيجابي بشكل أسرع من عنصر التحكم السلبي. إذا كان الحمض النووي الريبي الخاص بك مطويًا (كليًا أو جزئيًا) ، فيجب أن ينتقل بين عناصر التحكم الإيجابية والسلبية في الهلام غير المتحول. في هلام تغيير الطبيعة ، يجب أن يهاجر الحمض النووي الريبي الخاص بك في نفس مستوى التحكم السلبي. يجب ألا يتأثر التحكم الإيجابي (إذا نجح) باليوريا.

أيضًا ، يتم تسخين الجل أثناء الرحلان الكهربائي والذي بدوره يمكن أن يتسبب في تسنين الحمض النووي الريبي. قد ترغب في تشغيل الجل الذي لا يتحول إلى طبيعة في الغرفة الباردة.

بعد قولي هذا كله ، أنصح أنه بدلاً من بذل الكثير من الجهد في الفحص المستند إلى الهلام ، يمكنك استخدام معدات أكثر حساسية لدراسة طي الحمض النووي الريبي. هناك العديد من الدراسات الفيزيائية الحيوية على في المختبر طي الحمض النووي الريبي. يمكنك التحقق منها.


تصميم قائم على التسلسل للجزيئات الصغيرة النشطة بيولوجيًا التي تستهدف السلائف الرنا الميكروي

تم تصميم قليل النوكليوتيدات لاستهداف الحمض النووي الريبي باستخدام قواعد الاقتران الأساسية ، ولكن يمكن إعاقتها بسبب ضعف التوصيل الخلوي والتحفيز غير المحدد لجهاز المناعة. تُفضل الجزيئات الصغيرة كأدوية أو مجسات رصاصية ولكن لا يمكن تصميمها من التسلسل. هنا ، نصف نهجًا يسمى Inforna يصمم جزيئات صغيرة تؤدي إلى الحمض النووي الريبي من التسلسل فقط. تم تطبيق Inforna على جميع سلائف دبوس الشعر للـ microRNA البشري ، وحدد الجزيئات الصغيرة النشطة بيولوجيًا التي تمنع التكوُّن الحيوي عن طريق ربط مواقع معالجة نوكلياز (44٪ معدل إصابة). من بين 27 تفاعلًا مع الرصاص ، يكون التفاعل الأكثر حماسة بين البنزيميدازول (1) والسلائف microRNA-96. مجمع 1 يمنع بشكل انتقائي التولد الحيوي للـ microRNA-96 ، وينظم هدف البروتين (FOXO1) ويحفز موت الخلايا المبرمج في الخلايا السرطانية. يتم استئصال موت الخلايا المبرمج عندما FOXO1 يتم التخلص من تعبير mRNA بواسطة siRNA ، مما يثبت صحة الانتقائية المركبة. بشكل ملحوظ ، يظهر التنميط microRNA ذلك 1 يؤثر فقط على التكوين الحيوي microRNA-96 وهو على الأقل انتقائي مثل قليل النوكليوتيد.


خيارات الوصول

احصل على حق الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

جميع الأسعار أسعار صافي.
سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

جميع الأسعار أسعار صافي.


المقدمة

خلال العقد الماضي ، تم ملء صندوق أدوات البيولوجيا التركيبية بعدد كبير من الأجزاء والأجهزة الجينية المختلفة لمعالجة الوظيفة الخلوية (تمت مراجعتها في (1،2)). ومع ذلك ، لا يزال استكشاف قابلية تطبيق العديد من اللبنات الأساسية ضعيفًا. لا يُعرف الكثير عن الوحدة الجينية وقابلية نقل الأدوات الفردية ، وبالتالي إهمال الإمكانات الكبيرة لمزيج من الهياكل المختلفة لإنتاج عناصر قابلة للتحويل. تسمح الطبيعة المرنة للأنظمة القائمة على الحمض النووي الريبي على وجه الخصوص بالتركيبات المعيارية لمنظم الريبوريتور مع كل إطار عمل آخر من رنا اصطناعي أو مشتق طبيعيًا ، على الرغم من حقيقة أن وحدات البناء الفردية قد يكون لها وظائف مختلفة تمامًا. على الرغم من نشر العديد من المحاولات الناجحة لإظهار التعبير الجيني الشرطي بأجهزة RNA الاصطناعية (تمت مراجعتها في (2،3)) ، فإن العوائق الرئيسية هي إما الذخيرة المحدودة للأجزاء الجينية المناسبة ، أو الفشل في دمج الأجزاء الموجودة من مصادر مختلفة في أطر عمل قوية (4). الغالبية العظمى من أنظمة التنظيم ذات الخصائص الجيدة مصممة للاستخدام في البكتيريا وحقيقيات النوى المنخفضة. ومع ذلك ، لا يزال يتعين الوصول إلى الإمكانات الكاملة للمنظمات القائمة على الحمض النووي الريبي للتطبيقات في خلايا الثدييات (5).

ركزت العديد من الدراسات الحديثة على أهمية RNAs الصغيرة غير المشفرة لتنظيم الجينات حقيقية النواة وكشفت عن دور مهم لمختلف العمليات ذات الصلة بيولوجيًا (تمت مراجعتها في (6)). لتعميق المعرفة حول هذه الجزيئات ووظائفها ، يجب تكييف ذخيرة الأساليب والأدوات الحالية مع خصوصيات هدف البحث الفردي. ستستفيد مثل هذه الإعدادات التجريبية من استخدام الأنظمة القابلة للتحويل التي توفر التحكم في وفرة الحمض النووي الريبي ذي الصلة للتحقيق في أهميتها الفسيولوجية. MicroRNAs (miRNAs) هي مرشح رئيسي لتطوير مثل هذه الأنظمة القابلة للتحويل. تؤثر هذه الفئة من الحمض النووي الريبي غير المشفر على إسكات الجينات بعد النسخ في حقيقيات النوى في عملية تسمى تداخل الحمض النووي الريبي (تمت مراجعته في (7)). تعمل على الترجمة واستقرار mRNA ، تؤثر miRNAs على وظائف 60 ٪ على الأقل من جينات ترميز البروتين البشري (8). وبالتالي ، فإن الطفرات المتسلسلة وكذلك التغييرات في وفرة الحمض النووي الريبي غالبًا ما تؤدي إلى خلل جيني وقد يؤدي إلى ظهور نمط ظاهري (9). علاوة على ذلك ، تم تحديد الحمض النووي الريبي (miRNAs) كسبب لأمراض مختلفة وتظهر خصوصية نسيجية ملحوظة. نتيجة لذلك ، فهم مرشحون مثاليون للتشخيص والعلاج المبكر المتعلق بالعلامات الحيوية (10). حتى الآن ، تم فهرسة 2500 mRNAs بشري (miRbase ، الإصدار 21 ، http://mirbase.org/) ، ومعظم أهدافها والوظائف ذات الصلة غير معروفة حتى الآن. في ضوء الاهتمام الخاص بوظيفة miRNA ومشاركتها في التسبب في المرض ، فإن تطوير أداة محددة وعالمية لتنظيم التكوُّن الحيوي لـ miRNA بطريقة تعتمد على الترابط سيوفر جهازًا مفيدًا للتحقيق في تأثير miRNAs على الخلايا (mal )وظيفة.

نظرًا لأهميتها في تنظيم الجينات بعد النسخ ، يجب تنظيم التكوين الحيوي للـ miRNA بشكل صارم لضمان كمية مناسبة من ميرنا الوظيفي. يتضمن التولد الحيوي لل miRNA خطوتين متتاليتين لمعالجة الجير الناضج من نسخة أولية أطول (pri-miRNA) (تمت مراجعته في (7)). تعمل Drosha و Dicer ، المكونان الرئيسيان لآلة المعالجة ، جنبًا إلى جنب مع العوامل المساعدة مع معايير التعرف على الركيزة المحفوظة التي يجب الوفاء بها من أجل المعالجة الناجحة لـ miRNA. لخطوة النضج الثانية ، التي نفذتها RNase III Dicer ، كل من تسلسل السلائف ميرنا (ما قبل ميرنا) وخصائص الحلقة الطرفية لها صلة (11 ، 12). يعمل Dicer كحاكم جزيئي & # x02018 & # x02019 ، وبالتالي فإن طول المنطقة المزدوجة التي تقطعت بهم السبل في pre-miRNA وتشكيل هيكل دبوس الشعر النموذجي يساهم أيضًا في التعرف والمعالجة الدقيقة (9،12 & # x0201314). غالبًا ما يكون التعديل الهيكلي في pre-miRNA مصحوبًا بانقسام غير دقيق أو ناقص ، مما يؤدي إما إلى منطقة بذرة متغيرة أو خسارة كاملة للـ miRNA الناضج (12 ، 15). وبالتالي ، فإن التصميم والتنفيذ الناجح لأداة miRNA الاصطناعية جزئيًا يجب أن يفي بمتطلبين: يجب أن يشبه العنصر القابل للتحويل المدمج الهيكل الأصلي للنظام الطبيعي ، ويجب أن يتيح تنظيمًا قويًا يعتمد على الترابط في نفس الوقت. ومن ثم ، فإن المرونة الهيكلية والحجم الصغير لـ RNA aptamer يجعلها مناسبة بشكل مثالي للعمل كمستشعر قوي ومجال مشغل. Aptamers عبارة عن أليغنوكليوتيدات شديدة التنظيم تظهر ارتباطًا تقاربًا عاليًا بجزيء مستهدف محدد (تمت مراجعته في (16)). ال من جديد اختيار aptamer عبر SELEX (S ystematic E volution لـ L igands بواسطة Ex ponential إثراء) يمكن إجراؤه ضد أي نوع تقريبًا من الترابطات بدءًا من الجزيئات الصغيرة فوق البروتينات وحتى الهياكل الخلوية الأكثر تعقيدًا (تمت مراجعتها في (17)).

لإعداد منصة لمعالجة ما قبل ميرنا المتحكم فيه من قبل aptamer ، من المستحسن أن يكون لديك نظام يسمح بالتبديل العكسي في نطاقات زمنية ذات صلة بيولوجيًا. من بين العديد من أزواج aptamer-ligand الموجودة ، يشكل aptamer الملزم Tet Repressor (TetR) المشتق من SELEX وبروتين TetR أساسًا مثاليًا لتصميم وتنفيذ مفتاح miRNA قابل للانعكاس. تم التعرف على الأبتامر في شكل مركب في المختبر و في الجسم الحي نهج الاختيار ويربط TetR بألفة ربط عالية للغاية (18). تقارب TetR بين aptamer و tetO المشغل DNA متساوية (19). يؤدي ربط التتراسيكلين (tc) أو الدوكسيسيكلين (dox) ، وهو نظير هيكلي لـ tc ، إلى TetR إلى حدوث تغيير توافقي في جوهر بروتين TetR والذي بدوره يضعف الارتباط بـ aptamer (19) ، مما يسمح بربط الترابط القابل للانعكاس. تعتبر كل من طبيعة نظام الجمع بين الحمض النووي الريبي (RNA) / البروتين / الجزيء الصغير والخصائص الحركية الدوائية المناسبة لكل من ligands tc و dox مناسبة بشكل مثالي للاستخدام في خلايا الثدييات وتنظيم التكوُّن الحيوي لـ miRNA (20).

تم بالفعل تأكيد قابلية تطبيق نظام TetR aptamer في الكائنات الحية المختلفة من خلال مناهج مختلفة. أظهر المنشور الأصلي الاستخدام الناجح لـ TetR aptamer للتحكم في التعبير الجيني في الإشريكية القولونية (18). بعد ذلك ، تم توضيح قابلية النظام وقابلية تطبيقه على نطاق أوسع من خلال استخدامه الناجح في المنطقة الأولية المتصورة المنجلية وفي الخميرة (21 ، 22). علاوة على ذلك ، تمت إضافة طبقة تنظيمية إضافية إلى نظام TetR aptamer بتصميم مفتاح مستجيب لجزيء صغير أثبت فعاليته في الثدييات (23). تسلط هذه الأساليب الضوء على الطبيعة العالمية والقدرة على التكيف لنظام TetR aptamer.

ركزت معظم طرق التحكم في تداخل الحمض النووي الريبي حتى الآن على shRNAs المعدلة لتطوير الأداة وتنفيذها. تمثل هندسة الهيكل المعقد المرتبط بـ miRNA تحديًا كبيرًا بسبب الاعتماد القوي على معايير التعرف على الركيزة المحفوظة للمعالجة. على عكس ما قبل miRNAs الطبيعية ، تتميز shRNAs بجذع مهجن تمامًا تعلوه حلقة قصيرة (24). يمكن الوصول بسهولة إلى هذا الهيكل الثانوي غير المعقد من أجل (1) إعادة تصميم محددة تتوافق فعليًا مع أي تسلسل مستهدف ، و (2) إلى في السيليكو التنبؤ بمواقع انشقاق المقامر. لا يتطلب تعديل بنية shRNA اتباع قواعد المعالجة الصارمة التي تنطبق على ما قبل miRNAs. وبالتالي ، يمكن تجاوز المشكلات المرتبطة بهندسة الهياكل الأكثر تعقيدًا الموجودة في ما قبل miRNAs الطبيعية. اندماج في المختبر تم اختيار aptamer الثيوفيلين مع shRNA مما مكن من تنظيم معالجة Dicer وتسهيل التحكم في مستويات GFP أو الألبومين البشري بطريقة تعتمد على الترابط (25). في نهج مشابه ، تم دمج العديد من الأبتاميرات جنبًا إلى جنب مع الخيوط المتنافسة في هياكل حلقة shRNA التي تؤثر على معالجة shRNAs المعنية عن طريق التبديل المعتمد على ligand بين اثنين من المطابقات الهيكلية (26). علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن الأشكال المرتبطة بالبروتين لبروتين U1A البشري و L7Ae ، أو aptamer المرتبط بـ p50 الموجود في منطقة حلقة shRNA ينظم معالجة shRNA بواسطة Dicer (27 ، 28). في تصميم آخر ، تم دمج جزيء صغير أو أبتاميرات مرتبطة بالبروتين في الجزء القاعدي من pri-miRNA الاصطناعي الذي يحمل siRNA. بتقليد pri-miRNA ، تم التحكم في معالجة Drosha ، مما أدى إلى تحكم يعتمد على الترابط GFP التعبير (29،30).

توفر الأدوات المذكورة أعلاه دراسات قيمة لإثبات المفهوم. ومع ذلك ، فقد تم بناؤها على أساس هياكل هندسية غير طبيعية ولا تزال تعاني من نطاقات ديناميكية منخفضة ونقص في المرونة التنظيمية. علاوة على ذلك ، فإن إمكانية تطبيق الأدوات المستندة إلى shRNA لتنظيم الجينات محدودة ، أي أنها تستهدف تسلسلًا محددًا واحدًا ، في حين أن miRNAs قادرة على الارتباط بعدة مواقع ربط. تزداد شعبية تداخل الحمض النووي الريبي (RNA) كطريقة مفضلة لإسكات الجينات والتحليل الوظيفي. ونتيجة لذلك ، هناك حاجة متزايدة إلى أدوات تداخل قوية وموثوقة (31). حتى الآن ، لم يتم إثبات تعديل ميرنا الطبيعي الذي أدى إلى تنظيم فعال لمستويات الحمض النووي الريبي الناضج.

هنا ، نقترح نهجًا لتنظيم أنظمة miRNA الطبيعية. من خلال أجهزتنا القائمة على الحمض النووي الريبي ، سعينا إلى إنشاء وحدة تبديل عالمية وقابلة للانعكاس تتكون من مكون aptamer اصطناعي كمجال لاستشعار الترابط مقترنًا بـ pre-miRNA لتمكين وفرة miRNA التي يتم التحكم فيها بواسطة ligand (الشكل & # x200B (الشكل 1 ). 1). في نظامنا ، يستبدل aptamer TetR الحلقة الطرفية الطبيعية لما قبل miR بطريقة يمكن استخدامها عالميًا لمختلف miRNAs. يتم توصيل aptamer بجذع pre-miRNA من خلال وحدة اتصال ، وبالتالي الاحتفاظ بمعالجة pre-miRNA مع تقديم النظام المعتمد على ligand وقابل للعكس في نفس الوقت. من خلال مفتاحنا pre-miR ، نوفر أداة قابلة للتطبيق عالميًا تمنع معالجة ميرنا بكفاءة بنطاق ديناميكي من 40 إلى 140 ضعفًا عند ربط TetR. يتم تخفيف القمع تمامًا عن طريق إضافة dox. وبالتالي ، فإننا نقدم الدليل الأول للتكوين الحيوي الخاضع للرقابة لثلاثة جزيئات مختلفة من الحمض النووي الريبي باستخدام نظام تنظيم جديد ومتعدد الاستخدامات ومرن يعتمد على الحمض النووي الريبي في الثدييات.


مناقشة

Dicer أو نظائرها عناصر لا غنى عنها لجميع مسارات RNAi. ليس هناك شك في أن التنظيم الدقيق لهذه المسارات ، بما في ذلك تنظيم جميع البروتينات المعنية ، هو عملية معقدة للغاية. في الآونة الأخيرة ، تم تحديد العديد من المنظمين المحتملين لنشاط Dicer. وقد تبين أن المركبات الرابطة الرباعية (البورفيرازينات ومركبات بيسكينولينيوم) يمكن أن تمنع الهضم بوساطة دايسر لسلائف سيرنا الغنية بجوانوزين [34]. ما وآخرون. ذكرت أن مجال هيليكاز المفترض من دايسر يمكن أن يمارس تأثيرًا ذاتيًا على هذا الإنزيم [35]. ليما وآخرون أظهر أن Dicer البشري يمكن أن يتفاعل مع مناطق مختلفة من نسخ الحمض النووي الريبي (RNA) ويرتبط بجزيئات RNA أحادية ومزدوجة تقطعت بهم السبل [36]. تم الإبلاغ أيضًا عن أن فيروسات الغد تحمي الحمض النووي الريبي الخاص بها عن طريق إنتاج كمية كبيرة من النسخ التكميلية الذاتية الطويلة ، والتي تتنافس بشكل فعال على ربط Dicer مع الجزيئات الأخرى. ونتيجة لذلك ، فإن النسخ الفيروسية المتبقية محمية من الانقسام [37]. في الآونة الأخيرة ، تم إثبات أن جزيئات الحمض النووي الريبي يمكن أن تتداخل مع نضوج ميرنا عن طريق عزل RNase III Drosha ، وهو إنزيم آخر يعمل في عملية التكوُّن الحيوي للـ mRNA [38]. ومع ذلك ، حتى الآن لم تكن هناك تقارير تظهر أن جزيئات الحمض النووي الريبي يمكن أن تستهدف بشكل انتقائي كلاً من سلائف ميرنا و Dicer وبالتالي تنظيم نضوج ميرنا الفردي. في دراستنا ، حددنا أوليغومرات الحمض النووي الريبي (RNA) التي عملت كمنظمين وظيفيين. أثرت هذه القلة على وجه التحديد على نضج miR-210 من خلال ربط كل من Dicer و pre-miR-210 (الأشكال 1 ، & # x200B ، 2 ، 2 ، & # x200B ، 3 ، 3 ، S1 و S2). وبشكل أكثر تحديدًا ، بالإضافة إلى ربط Dicer ، قاموا بدور فريدة antagomiRs ، أي جزيئات RNA القصيرة التي ترتبط بـ miRNAs وتمنع عملها السليم [39]. ومع ذلك ، في حالتنا ، كنا نتعامل مع antagopre-miRs ، أي جزيئات RNA القصيرة التي تتفاعل مع pre-miRNAs وتمنع تكون miRNA.

أحد الأمثلة المدروسة على نطاق واسع للتنظيم الانتقائي لمعالجة ما قبل ميرنا يتضمن بروتين ربط الحمض النووي الريبي Lin28 و let-7 pre-miRNA [29] ، [30] ، [40] ، [41]. يمكن لـ Lin28 عزل ما قبل let-7 miRNA لمنع المعالجة بوساطة Dicer. لقد تبين أن Lin28 يرتبط مباشرة بـ pre-let-7 ، على الأرجح من خلال التعرف المحدد للحلقة الطرفية let-7 pre-miRNA. بيسكونوفا وآخرون أظهر أن بقايا السيتوزين المحفوظة في حلقة pre-let-7 g ضروري لربط Lin28 [42]. في المقابل ، هيو وآخرون. أكد دور نموذج تسلسل رباعي النوكليوتيدات (GGAG) الموجود في الحلقة الطرفية لـ pre-let-7 في الارتباط الانتقائي لـ Lin28 مع هذا السلائف [43]. أظهر المؤلفون أن Lin28 يجند ترانسفيراز uridylyl طرفي (TUTase) إلى pre-let-7. يضيف هذا البوليميراز غير الكنسي ذيلًا أوليغوريدين إلى ما قبل السماح 7 ، وبالتالي يمنع معالجة السلائف المعدلة بكفاءة بواسطة Dicer. يتحلل الحمض النووي الريبي متعدد اليوريدات لاحقًا ، وبالتالي ، لوحظ نضوب let-7 miRNA. في المقابل ، فإن بروتين ربط آخر لـ RNA ، وهو بروتين KSRP التنظيمي للربط من نوع KH ، يعزز نضوج بعض pre-miRNAs ، على سبيل المثال ، pre-let-7a-1 [31]. ترابوتشي وآخرون. وجد أن أحد مجالات KSRP يتعرف على امتداد قصير غني بـ G موجود في الحلقة الطرفية لـ pre-let-7a-1a بخصوصية عالية وتقارب. أظهروا أيضًا أن KSRP يمكن أن يعمل كمكون لكل من مجمعي Drosha و Dicer. علاوة على ذلك ، من خلال الارتباط بالحلقات القمية لبعض سلائف miRNA ، يشارك KSRP في النقل النووي السيتوبلازمي للـ pre-miRNAs المستهدفة بواسطة exportin-5. بناءً على تجارب الترسيب المناعي ، حدد المؤلفون مجموعتين من سلائف miRNA ، تلك المرتبطة بمجمعات المعالجة بما في ذلك KSRP وتلك المرتبطة بالمجمعات التي تفتقر إلى KSRP. ومن المثير للاهتمام أن Michlewski et al. أظهر أن hnRNP A1 ، وهو البروتين المرتبط بـ RNA المتضمن في العديد من جوانب معالجة RNA ، قد يرتبط بالحلقة النهائية لسلائف miRNA هذه والتي لا تتأثر المعالجة بـ KSRP [44]. افترض هؤلاء المؤلفون أن هناك مجموعة من سلائف ميرنا ذات حلقات قمية محفوظة وأن معالجتها تعتمد بشدة على ارتباط العوامل المساعدة (مثل hnRNP A1) بهذا العنصر الهيكلي المحفوظ. أحد هذه الجزيئات المحددة هو مقدمة لـ miR-18a. Michlewski وآخرون. ذكرت أن أليغنوكليوتيدات مكملة للحلقة الطرفية المحفوظة لسلائف miR-18a ألغت معالجتها بشكل انتقائي. في المقابل ، فإن قليلات النوكليوتيدات التي تستهدف الحلقات الطرفية غير المحفوظة من سلائف miR-16-1 و -27a لم تؤثر على نضوج هذه الجزيئات. اقترح المؤلفون أن hnRNP A1 ليس ضروريًا لمعالجة سلائف miRNA التي تحمل حلقات طرفية غير محفوظة ، مثل miR-16-1 و -27a.

ركزت الدراسات المذكورة أعلاه على البروتينات التي تشارك في تنظيم نضج ميرنا. ركزت دراساتنا على مسألة ما إذا كانت جزيئات الحمض النووي الريبي يمكنها أيضًا تعديل معالجة ما قبل miRNAs الفردية. لم نفكر في الحفاظ على سلائف الحمض النووي الريبي ، لكننا درسنا ما إذا كانت ما قبل ميرنا قد أظهرت بنى ثانوية يمكن الوصول إليها للتفاعلات مع جزيئات الحمض النووي الريبي الأخرى. تمشيا مع البيانات المنشورة ، أظهرنا أن مناطق الحلقة الطرفية مهمة للتحكم في معالجة ميرنا بواسطة Dicer. في الواقع ، قد تعمل هذه المنطقة من سلائف ميرنا كمنصة ملزمة لـ Dicer [45] والعوامل المساعدة الأخرى المشاركة في نضوج ميرنا [31] ، [42] ، [44]. لقد أظهرنا أن أليغنوكليوتيدات RNA التي تستهدف الأجزاء القمية لما قبل miR-21 و -33a و -210 أثرت على معالجتها بواسطة Dicer (الشكلان 2 و & # x200B و 3). 3). ومع ذلك ، لاحظنا أيضًا أن أوليغومر الحمض النووي الريبي المكمل لمنطقة الحلقة الطرفية لسلائف miR-16-1 أثرت بشكل ضعيف على نضج هذه الميرنا (الشكل 3). تتوافق هذه النتيجة مع ملاحظات Michlewski وآخرون ، الذين أفادوا أن قليلات النوكليوتيدات التي تستهدف الحلقة النهائية لسلائف miR-16-1 (pri-miR-16-1) لم تمنع تشكيل miR-16-1 الناضج. Michlewski وآخرون. افترض أن معالجة السلائف miR-16-1 لم تتأثر بأوليغنوكليوتيدات تكميلية لأنها تفتقر إلى عنصر هيكلي محفوظ وبالتالي لا يتم التعرف عليها بواسطة العوامل المساعدة. تشير نتائجنا إلى أن تركيبة النوكليوتيدات للجزء القمي من السلائف miR-16-1 (تسلسل غني بالاتحاد الأفريقي) قد تكون مسؤولة عن التأثير الملحوظ. لا يمكن للتسلسل الغني بـ AU أن يشكل ازدواجًا ثابتًا مع نيوكليوتيدات تكميلية 12-nt (الشكلان 3 و & # x200B و 4). 4). وبالتالي ، لا يمكن لهذا الأخير أن يمنع بشكل فعال معالجة هذا ما قبل ميرنا. عندما طبقنا أوليغومرات الحمض النووي الريبي (RNA) التي كانت مكملة للجزء الآخر الجزئي الذي تقطعت به السبل من قبل miR-16-1 ، لاحظنا حظرًا أكثر كفاءة لنضج miR-16-1 (الشكل 5). في الوقت الحالي ، لا يمكن التحقق من أي من هذه التفسيرات أو تزويرها بشكل لا لبس فيه لأن الدراسات التي أجراها Michlewski et. آل. يتعلق بمعالجة pri-miRNA بوساطة Drosha في النواة ، في حين ركز بحثنا على انشقاق pre-miRNA بوساطة Dicer ، والذي يحدث في السيتوبلازم. علاوة على ذلك ، فقد ثبت مؤخرًا أن نفس سلائف الرنا المرسال يمكن استهدافها بشكل مختلف بواسطة عوامل متطابقة تقريبًا في حجرات خلوية مختلفة. بيسكونوفا وآخرون ذكرت أنه على الرغم من أن Lin28A و Lin28B يحظران بشكل انتقائي نفس معالجة let-7 pre-miRNA ، وكلاهما يتمتع بدرجة عالية من هوية التسلسل وتنظيم المجال المحفوظ ، إلا أنهما يعملان من خلال آليات مختلفة. يعمل Lin28A في السيتوبلازم ، ويعمل Lin28B في النواة [41]. وجدنا أيضًا أن أوليغومرات AL-21 و 2OMe-AL-16-1 أثرت على انقسام ما قبل ميرنا بشكل مختلف ، على الرغم من أن كلاهما قادر على تكوين مجمعات ذات وحدات مزدوجة مستهدفة قبل ميرنا بقيم Tm متشابهة جدًا (الشكلان 3 ب و # x200B و 4 A). 4 ا ). قد تشير هذه النتائج إلى أن Tm للازدواج المكون من oligomer وسلائف miRNA ليس هو العامل الوحيد الذي يؤثر على قدرة قليل القسيمات لقمع معالجة pre-miRNA بواسطة Dicer. هنا ، نوضح أن إمكانية الوصول إلى سلائف ميرنا للربط مع جزيئات أخرى قد تحدد أيضًا مستوى إنتاج ميرنا.

بالنسبة إلى أزواج ما قبل miR-16-1 / AL16-1_2 وما قبل miR-21 / AL-21 ، لاحظنا أن الأوليغومرات تمنع بالمثل معالجة ميرنا في كلا النظامين المختبرين (الإنزيم التجاري مقابل المستخلص). لوحظ تأثير مختلف لاثنين من الأزواج الأخرى التي تم فحصها ، ما قبل miR-33a / AL-33a و pre-miR-210 / AL-210. لاحظنا تثبيطًا أضعف بشكل ملحوظ لتكوين ميرنا في التجارب التي أجريت في المستخلصات السيتوبلازمية مقارنة بالتجارب المقابلة التي أجريت باستخدام Dicer التجاري (الشكلان 4 أ و & # x200 ب و 6). 6). لاحظنا أيضًا أنه في التفاعلات التي تفتقر إلى المثبط (AL-33a أو AL-210) ، كان انقسام ما قبل ميرنا أقل كفاءة بشكل كبير في نظام الاستخراج منه في نظام Dicer التجاري. تم الإبلاغ عن ملاحظة مماثلة بواسطة Obernosterer et al. ، الذين افترضوا أن العوامل المثبطة المحددة الموجودة في السيتوبلازم قد ترتبط بسلائف miRNA الفردية وتمنع تحولها إلى miRNAs ناضجة [28]. يبدو أننا لاحظنا ظاهرة مماثلة. الفرضية البديلة هي أن عامل غير معروف يتداخل مع قليل القسيمات ، مما يمنع ارتباطه بـ pre-miRNA. ومع ذلك ، لا يمكن أن يكون هذا هو الحال لأننا لاحظنا أيضًا انخفاض معالجة ميرنا في مخاليط التفاعل التي تفتقر إلى مثبط في نظام الاستخراج.

بناءً على ملاحظاتنا ، يمكننا اقتراح استراتيجية جديدة للتنظيم الخاص بالسلائف لمعالجة ميرنا بواسطة Dicer (الشكل 7). سيتم لعب الدور الرئيسي في هذه الإستراتيجية بواسطة جزيئات RNA قصيرة قادرة على التفاعل مع الإنزيم أو pre-miRNA أو كليهما. تشير البيانات التي تم جمعها إلى أنه يمكن تنظيم معالجة ميرنا عبر عدة سيناريوهات مختلفة. في السيناريو الأول ، يعمل أوليغومر الحمض النووي الريبي كمنافس نموذجي. يمنع معالجة ميرنا من خلال التفاعل مع جيب ربط الركيزة Dicer. ومع ذلك ، في هذا السيناريو ، لا يتم هضم أوليغومر بواسطة دايسر (الشكل 7 ، ط). في السيناريو الثاني ، يعمل oligomer أيضًا كمنافس ، ولكن في هذه الحالة يتم قطعه بواسطة الإنزيم. بالإضافة إلى ذلك ، يرتبط أحد منتجات انقسام قليل القسيمات بواسطة Dicer بـ pre-miRNA ويمنع هضم السلائف (الشكل 7 ، 2). في السيناريو الثالث ، يؤدي استخدام أوليغومرات قصيرة جدًا إلى تعكير صفو البنية الأصلية لسلائف ميرنا من خلال التفاعل مع الجزء القمي. لم يتم التعرف على المركب الناتج وهضمه بواسطة Dicer (الشكل 7 ، ثالثًا). في السيناريو الرابع ، يتم تهجين أوليغومر أيضًا مع السلائف. ومع ذلك ، في هذه الحالة ، يتم التعرف على المركب الناتج بواسطة Dicer ويتم قطعه ولكن نمط انقسام السلائف يتغير وينضج ، ولا يتم تشكيل ميرنا الوظيفي (الشكل 7 ، 4). في جميع هذه الحالات ، تكون التفاعلات المدفوعة بالتكامل هي العامل الرئيسي المسؤول عن خصوصية تثبيط قليل القسيمات لتكوين ميرنا.

تمثيل تخطيطي لانقسام معياري قبل ميرنا بواسطة دايسر (اليسار). أربعة سيناريوهات مقترحة (i & # x02013iv) لتنظيم oligoRNA بوساطة معالجة ميرنا بواسطة Dicer. يتم تقديم الأوليغومرات التي تتفاعل مع Dicer على أنها هياكل حلقة جذعية زرقاء ، ويتم تقديم أوليغومرات غير القادرة على التفاعل مع Dicer كخطوط زرقاء قصيرة. وصف مفصل في النص.

في تجاربنا ، استخدمنا في المختبر- جزيئات RNA منتقاة أو مصطنعة. وفقًا لذلك ، قد لا تعكس ملاحظاتنا الظروف الأصلية. ومع ذلك ، هناك أدلة متزايدة على أن السيتوبلازم يحتوي على طيف واسع من جزيئات الحمض النووي الريبي القصيرة التي يمكن أن تتداخل افتراضيًا مع معالجة ميرنا. في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن اكتشاف أنواع من الحمض النووي الريبي (RNA) يبلغ طولها 12 نانومترًا تقابل المناطق 5 & # x02032 من miRNAs ، والتي يطلق عليها شبه miRNAs ، [46]. تم العثور على هذه RNAs التنظيمية الصغيرة التي تم تحديدها حديثًا لتعديل نشاط microRNAs التي يتم اشتقاقها منها. بالإضافة إلى ذلك ، أصبح من الواضح بشكل متزايد أن المواد الوسيطة المستقرة لتدهور الحمض النووي الريبي يمكن أن تتراكم في الخلية وتعمل كجزيئات إشارات أو تشارك في الآليات التي تتحكم في المسارات الخلوية [47] ، [48] ، [49] ، [50]. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات التفصيلية لتأكيد أن هذه الحمض النووي الريبي القصير تؤثر على التكوين الحيوي ميرنا في الجسم الحي.


استنتاج

باستخدام جميع قواعد بيانات النوكليوتيدات المتاحة للجمهور ، تم تحديد 682 miRNAs في 155 نوعًا نباتيًا متنوعًا. من خلال الجمع بين تحليل التعبير والنهج الحسابي ، وجدنا أن 6 miRNAs و 2 من الحمض النووي الريبي الصغير التي تم تحديدها فقط في Arabidopsis حتى الآن ، محفوظة أيضًا في براسيكا النيابة. ستكون هذه النتائج مفيدة لتتبع تطور الحمض النووي الريبي الصغير من خلال فحص تعبيرها في أسلاف مشتركين من الحمض النووي الريبي. أرابيدوبسيس-براسيكا النسب.


مراجع

نوغيرا ​​إف تي إس ، مادي إس ، شيتوود دي إتش ، خواريز إم تي ، تيمرمانس إم سي بي: اثنان من الحمض النووي الريبي التنظيمي الصغير يؤسسان مصائر متعارضة لمحور إنمائي. تنمية الجينات. 2007 ، 21: 750-755.

Chitwood DH ، Nogueira FTS ، Howell MD ، Montgomery TA ، Carrington JC ، Timmermans MCP: تشكيل النمط عبر تنقل RNA الصغير. الجينات و أمبير التنمية. 2009 ، 23: 549-554.

Rubio-Somoza I ، Cuperus JT ، Weigel D ، Carrington JC: التنظيم والتخصص الوظيفي للعقد الصغيرة المستهدفة للحمض النووي الريبي أثناء تطوير النبات. الرأي الحالي في بيولوجيا النبات. 2009 ، 12 (5): 622-627.

Shukla LI و Chinnusamy V و Sunkar R: دور microRNAs وغيرها من الحمض النووي الريبي الصغير الداخلي في استجابات إجهاد النبات. Biochimica et Biophysica Acta - آليات تنظيم الجينات. 2008 ، 1779 (11): 1874-9399.

Ruiz-Ferrer V ، Voinnet O: أدوار الحمض النووي الريبي للنباتات الصغيرة في استجابات الإجهاد الحيوي. المراجعة السنوية لبيولوجيا النبات. 2009 ، 60: 485-510.

Guo HS، Xie Q، Fei JF، Chua NH: MicroRNA يوجه انقسام الرنا المرسال لعامل النسخ NAC1 لتقليل تنظيم إشارات الأوكسين لتطوير جذر الأرابيدوبسيس الجانبي. الخلية النباتية. 2005 ، 17: 1376-1386.

Zhang B و Pan X و Wang Q و Cobb GP و Anderson TA: التحديد الحسابي لـ microRNAs وأهدافها. البيولوجيا الحاسوبية والكيمياء. 2006 ، 30 (6): 395-407.

Voinnet O: أصل وتكوين أحيائي ونشاط الحمض النووي الريبي الدقيق للنباتات. زنزانة. 2009 ، 136 (4): 669-687.

Rhoades MW و Reinhardt BJ و Lim LP و Burge CB و Bartel B و Bartel DP: التنبؤ بأهداف microRNA للنبات. زنزانة. 2002 ، 110: 513-520.

Zhao CZ و Xia H و Frazier TP و Yao YY و Bi YP و Li AQ و Li MJ و Li CS و Zhang BH و Wang XJ: يحدد التسلسل العميق الحمض النووي الريبي الدقيق الجديد والمحفوظ في الفول السوداني (Arachis hypogaea L.). بيولوجيا النبات BMC. 2010 ، 5 (10): 3-

Lu C ، Meyers BC ، Green PJ: بناء مكتبات RNA صغيرة (كدنا) للتسلسل العميق. أساليب. 2007 ، 43 (2): 110-117.

Sunkar R ، Jagadeeswaran G: في تحديد السيليكو للرنا الميكروي المحفوظ في عدد كبير من الأنواع النباتية المتنوعة. بيولوجيا النبات BMC. 2008 ، 8: 37-

Zhang BH و Pan XP و Wang QL و Cobb GP و Anderson TA: تحديد وتوصيف الرنا الميكروي الجديد للنبات باستخدام تحليل EST. أبحاث الخلايا. 2005 ، 15: 336-360.

Birch RG: الهندسة الأيضية في قصب السكر: المساعدة في الانتقال إلى اقتصاد قائم على الحيوية. تطبيقات هندسة التمثيل الغذائي للنبات. سبرينغر هولندا 2007249-281. 2007

Jannoo N ، Grivet L ، Chantret N ، Garsmeur O ، Glaszmann JC ، Arruda P ، D'Hont A: مقارنة تقويمية في منطقة غنية بالجينات بين الأعشاب تكشف عن الاستقرار في جينوم قصب السكر متعدد الصيغ الصبغية. مجلة النبات. 2007 ، 50: 574-585.

Varkonyi-Gasic E و Wu R و Wood M و Walton EF و Hellens RP: طريقة RT-PCR شديدة الحساسية لاكتشاف وقياس الحمض النووي الريبي الدقيق. طرق النبات. 2007 ، 3:12

Lam E و Shine J و Da Silva J و Lawton M و Bonos S و Calvino M و Carrer H و Silva-Filho MC و Glynn N و Helsel Z و Ma J و Richard E و Souza MG و Ming R: تحسين قصب السكر لإنتاج الوقود الحيوي: الهندسة لمواد وسيطة أفضل. GCB الطاقة الحيوية. 2009 ، 1: 251-255.

Chuck G ، Cigan AM ، Saeteurn K ، Hake S: متحولة الذرة غير المتجانسة عشب الذرة 1 ينتج عن الإفراط في التعبير عن الرنا الميكروي الترادفي. علم الوراثة الطبيعي. 2007 ، 39: 544-549.

Zhang BH و Pan XP و Cox SB و Cobb GP و Anderson TA: دليل على أن miRNAs مختلفة عن RNAs الأخرى. علوم الحياة الخلوية والجزيئية. 2006 ، 63: 246-254.

Paterson AH ، Bowers JE ، Bruggmann R ، Dubchak I ، Grimwood J ، Gundlach H ، Haberer G ، Hellsten U ، Mitros T ، Poliakov A ، Schmutz J ، Spannagl M ، Tang H ، Wang X ، Wicker T ، Bharti AK ، Chapman J ، Feltus FA، Gowik U، Grigoriev IV، Lyons E، Maher CA، Martis M، Narechania A، Otillar RP، Penning BW، Salamov AA، Wang Y، Zhang L، Carpita NC، Freeling M، Gingle AR، Hash CT، Keller B ، Klein P ، Kresovich S ، McCann MC ، Ming R ، Peterson DG ، Mehboob-ur-Rahman ، Ware D ، Westhoff P ، Mayer KFX ، Messing J ، Rokhsar DS: جينوم الذرة الرفيعة ثنائي اللون وتنويع الأعشاب. طبيعة سجية. 2009 ، 457 (7229): 551-556.

Notredame C ، Higgins DG ، Heringa J: T-Coffee: طريقة جديدة لمحاذاة تسلسل متعددة سريعة ودقيقة. مجلة البيولوجيا الجزيئية. 2000 ، 302: 205-217.

Lu C، Jeong DH، Kulkarni K، Pillay M، Nobuta K، German R، Thatcher SR، Maher C، Zhang L، Ware D، Liu B، Cao X، Meyers BC، Green PJ: تحليل على مستوى الجينوم لاكتشاف الأرز يكشف microRNAs microRNAs الطبيعي المضاد للحساسية (nat-miRNAs). وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم. 2008 ، 105 (12): 4951-4956.

Piriyapongsa J ، Jordan IK: عائلة من جينات microRNA البشرية من عناصر مصغرة قابلة للتحويل متكررة مقلوبة. بلوس واحد. 2007 ، 2 (2): e203-

Piriyapongsa J, Jordan IK: Dual coding of siRNAs and miRNAs by plant transposable elements. RNA. 2008, 14 (5): 814-21.

Zhang L, Chia JM, Kumari S, Stein JC, Liu Z, Narechania A, Maher CA, Guill K, McMullen MD, Ware D: A Genome-Wide Characterization of MicroRNA Genes in Maize. PLoS Genetics. 2009, 5 (11): e1000716-

Allen E, Xie Z, Gustafson AM, Sung GH, Spatafora JW, Carrington JC: Evolution of microRNA genes by inverted duplication of target gene sequences in Arabidopsis thaliana. Nature Genetics. 2004, 36: 1282-1290.

Xie F, Frazier TP, Zhang B: Identification and characterization of microRNAs and their targets in the bioenergy plant switchgrass (بانيكوم فيرجاتوم). Planta. 2010, 232 (2): 417-434.

Yao Y, Guo G, Ni Z, Sunkar R, Du J, Zhu JK, Sun Q: Cloning and characterization of microRNAs from wheat (Triticum aestivum L.). Genome Biology. 2007, 8 (6): R96-

Unver T, Budak H: Conserved microRNAs and their targets in model grass species Brachypodium distachyon. Planta. 2009, 230: 659-669.

Song C, Fang J, Li X, Liu H, Thomas Chao C: Identification and characterization of 27 conserved microRNAs in citrus. Planta. 2009, 230: 671-685.

Ha M, Lu J, Tian L, Ramachandran V, Kasschau KD, Chapman EJ, Carrington JC, Chen X, Wang XJ, Chen ZJ: Small RNAs serve as a genetic buffer against genomic shock in Arabidopsis interspecific hybrids and allopolyploids. وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم. 2009, 106: 17835-17840.

Nogueira FTS, Chitwood DH, Madi S, Ohtsu K, Schnable PS, Scanlon MJ, Timmermans MC: Regulation of small RNA accumulation in the maize shoot apex. PLoS Genetics. 2009, 5: e1000320-

Ovcharenko I, Boffelli D, Loots GG: eShadow: a tool for comparing closely related sequences. Genome Research. 2004, 14: 1191-1198.

Chang WC, Lee TY, Huang HD, Huang HY, Pan RL: PlantPAN: Plant promoter analysis navigator, for identifying combinatorial cis-regulatory elements with distance constraint in plant gene groups. BMC Genomics. 2008, 26: 561-

Vaucheret H, Fagard M: Transcriptional gene silencing in plants: targets, inducers and regulators. Trends in Genetics. 2001, 17 (1): 29-35.

Warthmann N, Das S, Lanz C, Weigel D: Comparative Analysis of the MIR319a MicroRNA Locus in Arabidopsis and Related Brassicaceae. Molecular Biology and Evolution. 2008, 25 (5): 892-902.

Jones-Rhoades MW, Bartel DP: Computational identification of plant microRNAs and their targets, including a stress-induced miRNA. Molecular Cell. 2004, 14: 787-799.

Llave C, Kasschau KD, Rector MA, Carrington JC: Endogenous and silencing-associated small-RNAs in plants. Plant Cell. 2002, 14: 1605-1619.

Sunkar R, Girke T, Jain PK, Zhu JK: Cloning and characterization of microRNAs from rice. Plant Cell. 2005, 17: 1397-1411.

Adai A, Johnson C, Mlotshwa S, Archer-Evans S, Manocha V, Vance V, Sundaresan V: Computational prediction of miRNAs in Arabidopsis thaliana. Genome Research. 2005, 15: 78-91.

Axtell MJ, Bowman JL: Evolution of plant microRNAs and their targets. اتجاهات نباتية. 2008, 13: 343-349.

Ding D, Zhang L, Wang H, Liu Z, Zhang Z, Zheng Y: Differential expression of miRNAs in response to salt stress in maize roots. Annals of Botany (London). 2009, 103: 29-38.

Vincentz M, Bandeira-Kobarg C, Gauer L, Schlögl P, Leite A: Evolutionary pattern of angiosperm bZIP factors homologous to the maize Opaque2 regulatory protein. Journal of Molecular Evolution. 2003, 56 (1): 105-116.

Iskandar HM, Simpson RS, Casu RE, Bonnett GD, MacLean DJ, Manners JM: Comparison of Reference Genes for Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction Analysis of Gene Expression in Sugarcane. Plant Molecular Biology Reporter. 2004, 22: 325-337.

Griffiths-Jones S, Grocock RJ, van Dongen S, Bateman A, Enright AJ: miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 2006, 34: D140-D144.

Gardner PP, Daub J, Tate JG, Nawrocki EP, Kolbe DL, Lindgreen S, Wilkinson AC, Finn RD, Griffiths-Jones S, Eddy SR, Bateman A: Rfam: Updates to the RNA families database. Nucleic Acids Research. 2009, 37: D136-140.

Zuker M: Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Research. 2003, 31 (13): 3406-3415.

Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ: CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research. 1994, 22: 4673-4680.

Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S: MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution. 2007, 24 (8): 1596-1599.

Childs KL, Hamilton JP, Zhu W, Ly E, Cheung F, Wu H, Rabinowicz PD, Town CD, Buell CR, Chan AP: The TIGR Plant Transcript Assemblies database. Nucleic Acids Research. 2007, 35: D846-D851.


مناقشة

Numerous miRNAs have been previously shown to be repeat-derived [12], [19]–[21] and many snoRNAs have been described as retrogenes [16],[17]. Here, we hypothesize that some reported miRNAs have evolved from box H/ACA snoRNAs or snoRTs. Several lines of evidence support this possibility. Fourteen known box H/ACA snoRNAs encode smaller fragments of miRNA size that have been experimentally detected, three of which are reported miRNAs. Analysis of mammalian conservation patterns suggests that these genomic regions originally encoded the full-length H/ACA snoRNA molecules and not only the miRNAs. If a subgroup of miRNAs has indeed evolved from box H/ACA snoRNAs, we reasoned that although some of these miRNAs might have sufficiently evolved to no longer bear measurable similarity to H/ACA snoRNAs, others might display detectable H/ACA snoRNA features. In an effort to further characterise the prevalence of the relationship between these two classes of small RNA molecules, we scanned the regions encoding known miRNAs for the presence of box H/ACA snoRNA features using the snoGPS predictor. We identified twenty reported miRNAs from miRBase [25] that are encoded in larger regions predicted with high scores to be box H/ACA snoRNAs. The predicted box H/ACA snoRNAs display usual box H/ACA snoRNA features and resemble the fourteen box H/ACA snoRNAs that encode experimentally detected smaller fragments. In addition, the genomic sequence surrounding several of the predicted snoRNA-like miRNAs very closely resembles those described for some snoRTs [16]. These analyses show that some genomic regions previously reported to encode miRNAs resemble regions that encode H/ACA snoRNAs on numerous levels. This suggests that these miRNAs have evolved from H/ACA snoRNAs or snoRTs. We applied stringent selection criteria in our analysis, so anticipate that other box H/ACA snoRNA-like miRNA precursors also exist but have not been identified here.

Due to the inherent similarity between miRNAs and snoRNAs, such a relationship is easy to overlook as once a region is categorized as belonging to one molecular class, it is often no longer considered when searching for other types of molecules. The human genome has been scanned previously for the presence of box H/ACA snoRNAs using mammalian snoGPS [32]. However, the search space was limited to the 20% most well conserved regions between the human, mouse and rat genomes. In addition, the dataset was repeat-masked, thus eliminating repeat-derived regions such as those encoding many miRNAs. Finally, the dataset was restricted to sequences that do not overlap with known features in the UCSC Human Genome Browser database, thus probably eliminating all known miRNAs. As a consequence, it is not surprising that no miRNA encoding regions were identified as also encoding predicted snoRNAs. Moreover, at least one recent snoRNA predictor, SnoReport [38] uses miRNAs as negative training examples, thus making it very unlikely to identify any of the snoRNA-like miRNA regions described here.

Although no significant sequence similarity is detected between predicted snoRNA molecules encoding miRNAs and the known snoRNAs that target the same pseudouridylation sites, it is interesting to note that three snoRNAs (ACA52, HBI-61 and ACA19) share their target pseudouridylation sites with eight of the predicted snoRNAs encoding miRNAs (Table 2). This situation also exists amongst known snoRNAs, some of which share the same target site without displaying significant sequence similarity. In particular, examples exist of a snoRNA harbouring two guide regions, each of which is shared with a different snoRNA. For example, ACA22 which shares one of its targets with ACA33 and the other with U64, has no significant sequence similarity with either molecule. Similarly, ACA50 shares target sites with ACA36, ACA8 and ACA62 but while it has high sequence identity with ACA62, it has no significant sequence similarity with ACA8 or ACA36.

This redundancy in rRNA complementarity may suggest some box H/ACA snoRNAs and snoRTs are not under as much selective pressure to avoid mutations. We hypothesize that some of these snoRNA encoding regions might be in the process of evolving from functional snoRNAs to miRNA-like precursors. This process might be facilitated by the fact that box H/ACA snoRNAs have a structure (2 hairpins) that is probably favourable to the formation of miRNAs. ال in silico data presented here support these ideas. We tested the predictions by experimentally showing that the precursors of five of the predicted snoRNA-like miRNAs, mir-664, mir-151, mir-605, mir-215 and mir-140, interact with dyskerin, a protein component of functional H/ACA snoRNPs. While a lack of interaction to dyskerin could not rule out an evolutionary relationship between these miRNAs and snoRNAs as the miRNAs might have evolved sufficiently to no longer interact with functional protein components of snoRNPs, the detection of such an interaction considerably reinforces such claims. These results show that the snoRNA-like miRNA precursors sufficiently resemble box H/ACA snoRNAs to bind dyskerin, strengthening the possibility of an evolutionary relationship between these molecules. Further experiments will be necessary to investigate whether these molecules also retain the capability of targeting rRNA في الجسم الحي. It will also be necessary to experimentally test whether the remaining fifteen predicted snoRNA-like miRNA precursors also display aspects of H/ACA snoRNA functionality. The fact that three of these molecules (mir-548d-1, mir-1297 and mir-616) display the sequence AGA instead of the canonical ACA box could indicate that they have evolved sufficiently to no longer retain H/ACA snoRNA functionality. We do note that while identifying molecules that display both miRNA and snoRNA functionality supports our evolutionary hypothesis, we also expect to find a larger number of molecules that display features of both molecules but do not represent completely prototypical examples.

It is interesting to note that خميرة الخميرة has snoRNAs but no reported miRNAs, consistent with a relationship where primordial snoRNAs may have given rise to certain classes of miRNAs. This idea is supported by a recent article by Saraiya and Wang reporting that the primitive parasitic protozoan Giardia lamblia, which does not have RNA interference capabilities but has miRNA processing machinery, uses box C/D snoRNAs as miRNA precursors [39]. In addition to this, Taft and colleagues have recently reported that most snoRNAs in animals, أرابيدوبسيس و Schizosaccharomyces pombe generate small RNAs (of ∼20–24 nucleotides in length for animal box H/ACA snoRNAs), which are associated with argonaute proteins [40]. Current data such as these dual function molecules with both miRNA and snoRNA capabilities which exist in both human [24] and الجيارديا [39] and likely many other organisms [40] suggest this process of evolving from a snoRNA encoding genomic region to a miRNA-like encoding region could be ongoing.

In addition to investigating whether some of the H/ACA snoRNA-like miRNA precursors display functional H/ACA snoRNA capability by binding to dyskerin (Figure 5), we have also characterised the cellular localisation of two of these molecules: the precursors of mir-151 and mir-664 (Figure 6). While bands of the size of the predicted full-length H/ACA snoRNA molecules localise to the nucleolus, consistent with their binding to dyskerin, bands of the size of the predicted hairpin form of these miRNAs can be found in all three fractions considered but accumulate mainly in the nucleolus (in the case of mir-151) and in the nucleoplasm and cytoplasm (in the case of mir-664). The mature form of mir-151 accumulates mainly in the nucleoplasm which is unusual for a miRNA but might be a consequence of the snoRNA features displayed by its precursor. These results are consistent with a recent study showing that the precursors and/or mature form of a number of rat miRNAs accumulate in the nucleolus [41]. Further studies will be required to investigate the exact nature and role of each of these molecules in these cellular compartments as well as how they are processed.

While all the miRNAs characterised in Table 2 are classified as miRNAs in miRBase [25], they have not all been extensively analysed. Of the five extended miRNA regions that we experimentally found to be bound by dyskerin, three (mir-151, mir-140 and mir-215) have been further characterized and functionally validated, either by studies of their processing into their mature form or validation of their targets and effects. Indeed, mir-151 has been shown to be processed into its mature form by usual miRNA processing machinery [42] while functional targets of mir-140 have been experimentally validated [43]. And mir-215, which has been shown to have reduced expression in cancer tissues compared to normal cells, is capable of inducing cell-cycle arrest, colony suppression and cell detachment from a solid support when transfected into cells [44]. Mir-664 and mir-605 have not, to our knowledge, been further functionally validated and will require additional experimental evidence to confirm they are true miRNAs. In particular, mir-605 has only been identified previously with one sequence read [45]. Given that the extended region of mir-605 is predicted to serve as a guide for an experimentally validated pseudouridylation site whose guide is unknown, we postulate that this region encodes an H/ACA snoRNA rather than a miRNA. This type of analysis can thus be used to filter out unlikely miRNA candidates from the large miRNA repositories which contain many poorly characterized molecules.

A recent large-scale study defining an expression atlas for mammalian miRNAs, by Landgraf and colleagues, classifies known miRNAs into four different groups: prototypical, repeat-derived, repeat-clustered and unclassified [46]. A lack of repetitiveness, evolutionary conservation and 5′ end processing were considered to classify miRNAs as prototypical. Only two (mir-215 and mir-140) of our twenty miRNAs encoded in predicted snoRNAs are classified as protypical in this study. The remaining eighteen miRNAs were either classified as repeat-derived (5 miRNAs), repeat-clustered (1 miRNA), unclassified (2 miRNAs) or were not considered in the study (10 miRNAs). The results of a recent deep-sequencing study [45] analysed in the context of the Landgraf study reveals that only 17% of all miRNAs identified in this manner are prototypical [46]. The remaining miRNAs displayed irregularities in their processing or unusual sequence conservation patterns [46]. The authors further went on to investigate possible functional implications, determining that unlike non-prototypical miRNAs, prototypical miRNAs showed enrichment of putative target sites in 3′UTRs [46]. In light of the relationship uncovered here between box H/ACA snoRNAs and miRNAs, it is reasonable to speculate that snoRNA-encoded miRNAs might be in the process of evolving into functional miRNAs but still retain some non-miRNA-like features which could preclude them from being classified as prototypical. Alternatively, perhaps these molecules should be classified as a separate small RNA class. Further analysis will be necessary to clarify the role and exact relationship of these molecules.


A dicistronic precursor encoding miR398 and the legume-specific miR2119 coregulates CSD1 and ADH1 mRNAs in response to water deficit

J. L. Reyes, Departamento de Biología Molecular de Plantas, Instituto de Biotecnología, UNAM, Av. Universidad 2001, Col. Chamilpa, Cuernavaca, Morelos 62210, Mexico.

Departamento de Biología Molecular de Plantas, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México, Av. Universidad 2001, Cuernavaca, Morelos, 62210 Mexico

Departamento de Biología Molecular de Plantas, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México, Av. Universidad 2001, Cuernavaca, Morelos, 62210 Mexico

Departamento de Biología Molecular de Plantas, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México, Av. Universidad 2001, Cuernavaca, Morelos, 62210 Mexico

J. L. Reyes, Departamento de Biología Molecular de Plantas, Instituto de Biotecnología, UNAM, Av. Universidad 2001, Col. Chamilpa, Cuernavaca, Morelos 62210, Mexico.

الملخص

Plant microRNAs are commonly encoded in transcripts containing a single microRNA precursor. Processing by DICER-LIKE 1 and associated factors results in the production of a small RNA, followed by its incorporation into an AGO-containing protein complex to guide silencing of an mRNA possessing a complementary target sequence. Certain microRNA loci contain more than one precursor stem-loop structure, thus encoding more than one microRNA in the same transcript. Here, we describe a unique case where the evolutionary conserved miR398a is encoded in the same transcript as the legume-specific miR2119. The dicistronic arrangement found in common bean was also observed in other legumes. في Phaseolus vulgaris, mature miR398 and miR2119 are repressed in response to water deficit, and we demonstrate that both are functional as they target the mRNAs for CSD1 and ADH1, respectively. Our results indicate that the repression of miR398 and miR2119 leads to coordinated up-regulation of CSD1 and ADH1 mRNAs in response to water deficit in common bean and possibly in other legumes. Furthermore, we show that miRNA directed CSD1 and ADH1 mRNAs up-regulation also occurs when common bean plants are exposed to flooding, suggesting that plant redox status and fermentation metabolism must be closely coordinated under different adverse conditions.

الشكل S1. Predicted RNA secondary structure of miR398a-miR2119 precursors in legumes. Sequences containing the mature miR398a and miR2119 were obtained from different sequence databases including NCBI Expressed Sequence Tags (EST) for P. acutifolius, G. max, M. truncatula و L. japonicus. Genomic sequences for V. angularis و V. radiata were obtained from Vigna Genome server (www.viggs.dna.affrc.go.jp) and for C. cajan و C. arietinum from the Legume Information System website (www.legumeinfo.org). EST accession numbers, a ‘-‘sign indicating minus strand orientation, or chromosome positions are indicated when available. Predicted structures were obtained using the MFold software (www.unafold.rna.albany.edu).

الشكل S2. mRNA splicing signal sequences in pvu-miR398a-miR2119 precursor. The aligned sequences corresponding to the full-length precursor (pri-miR398a-miR2119) and the fragment lacking a 76 nt segment (proc-mi398a-miR2119) from Figure 3C are shown along with the positions for mature miR398a (blue box), miR2119 (orange box). The positions for the putative 5′ splice site, branch site and 3′ splice site are also indicated, consistent with consensus sequences found in plants (Lorkovic, Wieczorek Kirk, Lambermon, & Filipowicz, 2000 . Pre-mRNA splicing in higher plants. Trends in Plant Science, 5: 160–167).

الشكل S3. Transient expression of precursor miRNA transcripts in Nicotiana benthamiana أوراق. The precursor for miR398a (shown as a blue box) and miR2119 (red box), with or without the intron (indicated by a green box with *), and derivatives including only pre-miR398a or only pre-miR2119 (1–4) were placed under the control of the 35S viral promoter (green arrow) and transiently expressed in N. benthamiana أوراق. The empty vector served as a negative control (5). Two days after infiltration, RNA was purified and used for RT-qPCR experiments to determine mature microRNA abundance. Endogenous miR159 abundance served as reference. The graph shows mature microRNA expression for each construct relative to that determined for the full-length bicistronic precursor (set arbitrarily to 1). Error bars indicate standard deviation for three technical replicates. Bottom panel shows a semi-quantitative RT-PCR amplification for the BAR gene present in the plasmid constructs to show similar infiltration efficiencies.

الشكل S4. Overexpression of pre-miR398a-miR2119 reduces accumulation of target mRNAs. Transgenic hairy roots were generated carrying the pBA-pre-miR398a-miR2119 plasmid or empty vector. Total RNA was purified and used to determine levels of A) mature miR398a (blue), miR2119 (red), miR398b (green), or B) CSD1 (grey), ADH1.1 (green) and ADH1.2 (light green) mRNAs. Accumulation of microRNAs was normalized to U6 snRNA and mRNAs were normalized to Act11 mRNA. Accumulation levels are represented relative to those determined for the empty vector samples (arbitrarily set to 1). Error bars represent standard deviation of three technical replicates.

Figure S5. Expression levels of ADH1.1 و CSD1 transcripts in leaves during water deficit. Total RNA samples from leaves of water-deficit treated plants (0, 10, 18 and 20 days) or control untreated plants were used for RT-qPCR assays. The accumulation of A) ADH1.1 (Phvul.009G134700) and B) CSD1 (Phvul.006G097000) mRNAs was normalized using Act11 mRNA as reference, and subsequently represented relative to levels of the untreated plants at each time point examined, arbitrarily set as 1.0. Results from one representative experiment are shown. Error bars represent standard deviation of three technical replicates.

Table S1. Oligonucleotides used in this study

يرجى ملاحظة ما يلي: الناشر غير مسؤول عن محتوى أو وظيفة أي معلومات داعمة مقدمة من المؤلفين. يجب توجيه أي استفسارات (بخلاف المحتوى المفقود) إلى المؤلف المقابل للمقالة.


الملخص

G-quadruplexes (G4s) are extremely stable DNA or RNA secondary structures formed by sequences rich in guanine. These structures are implicated in many essential cellular processes, and the number of biological functions attributed to them continues to grow. While DNA G4s are well understood on structural and, to some extent, functional levels, RNA G4s and their functions have received less attention. حضور ال bona fide RNA G4s in cells has long been a matter of debate. The development of G4-specific antibodies and ligands hinted on their presence في الجسم الحي, but recent advances in RNA sequencing coupled with chemical footprinting suggested the opposite. In this review, we will critically discuss the biology of RNA G4s focusing on the molecular mechanisms underlying their proposed functions.


شاهد الفيديو: 4- ماهي مستويات البنية الفراغية للبروتين الوحدة 2: العلاقة بين بنية و وظيفة البروتين . (قد 2022).