معلومة

هل يمكنني تكوير الحمض النووي من الحالة المذابة؟

هل يمكنني تكوير الحمض النووي من الحالة المذابة؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لدي حبيبة بلازميد مذابة في الماء. هل يمكنني تكويرها مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي عند 13000 دورة في الدقيقة؟ إذا لم يكن كذلك ، فلماذا؟


لا، لا يمكنك تكوير الحمض النووي المذاب باستخدام تنبيذ فائق.

نعم، يمكنك استعادة الحبيبات باستخدام علاجات إضافية ، على غرار الطريقة التي حصلت عليها بها في المقام الأول ؛ فقط بدلاً من أن تكون مدخلاتك عبارة عن خلايا متجانسة ، أو أنسجة ، أو مستخلص ، أو أيًا كان ما استخدمته للحصول على الحمض النووي الخاص بك ، فسيكون الآن مجرد محلول مائي للحمض النووي.

على سبيل المثال ، ربما تكون قد أجريت استخلاص TRIzol لفصل الحمض النووي الخاص بك إلى مرحلة مائية ، قبل تدويره عبر أعمدة إعداد صغيرة لاستخراج الحمض النووي المنقى في الماء. يمكنك تنفيذ الإجراء مرة أخرى وستحصل على الحبيبات مرة أخرى بعد خطوة ترسيب الكحول النهائية (الإيثانول أو الأيزوبروبانول).

الفكرة الأساسية في تكوير الحمض النووي (أو أي حمض نووي) هي جعله غير قابل للذوبان ؛ يتم تحقيق ذلك باستخدام الكحوليات والأملاح. إذا كانت قابلة للذوبان ، فإن الأحماض النووية لا يمكن أن "تخرج من المحلول" لتكوين حبيبات.


ما هو ترسيب الحمض النووي؟ (مع الصور)

يعتبر ترسيب الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA) خطوة أساسية في عزل وتنقية المواد الوراثية في العلوم. بشكل عام ، تحتوي عينة من الأنسجة البيولوجية على DNA أو RNA جنبًا إلى جنب مع باقي أجزاء الجسم ، ولاختبار الحمض النووي ، يجب على العالم فصل الحمض النووي عن جميع المواد الأخرى. يشير ترسيب الحمض النووي على وجه التحديد إلى خطوة تتضمن فصل الحمض النووي الذائب عن السائل المنحل فيه. وتشمل الطرق الشائعة لترسيب الحمض النووي إضافة الإيثانول أو الإيزروبانول أو الجليكوجين إلى السائل ، مما يجعل الحمض النووي يتجمد في كتل ويسقط في الجزء السفلي من العينة السائلة. & # 13

يمكن أن تكون الخطوات الأولية في تنقية الحمض النووي من عينة بسيطة مثل سحق الأوراق في وعاء لتحطيم بعض البنية. ثم يمكن تكسير الهريس بمواد كيميائية أو إنزيمات تترك الحمض النووي سليمًا. بشكل عام ، يستخدم علماء الوراثة جهاز طرد مركزي للمساعدة في تقسيم المكونات المختلفة للعينة. هذه آلة تقوم بتدوير عينة بحيث يغرق أثقل مكون في الأسفل ، ويرفع الأخف إلى الأعلى. & # 13

عن طريق إزالة العديد من المكونات غير المرغوب فيها ، عادةً ما يُترك عالم الوراثة بسائل صافٍ يحتوي على المادة الوراثية. يحتاج بعد ذلك إلى إخراج الحمض النووي المذاب في ذلك السائل ، والتخلص من السائل والمواد الأخرى الموجودة في السائل. ترسيب الحمض النووي هو الطريقة التي يتم بها تحقيق ذلك. في أغلب الأحيان ، يحتاج العالم إلى إضافة مادة كيميائية إلى السائل لإجراء ترسيب الحمض النووي. & # 13

يعتبر الإيثانول أو الأيزوبروبانول ، وكلاهما شكلين من الكحول ويقعان في مجموعة المواد الكيميائية المذيبة ، أكثر المواد الكيميائية شيوعًا المستخدمة في ترسيب الحمض النووي. الجليكوجين مادة أخرى يمكن أن تترسب الحمض النووي ، لكنها أقل استخدامًا ، بصرف النظر عن ترسيب تركيزات منخفضة من المواد الجينية. عندما تختلط هذه المواد الكيميائية بالحمض النووي المذاب ، فإن كيميائها تسمح لها بتغيير الطريقة التي يتلاءم بها الحمض النووي مع بيئته. في حين أنه في السابق ، كان الحمض النووي يختلط بسهولة مع السائل ، بعد الإضافة الكيميائية ، فإنه يتوقف عن الارتباط بالسائل ويتشكل بدلاً من ذلك في مادة صلبة. & # 13

هذه المادة الصلبة عادة ما تكون بيضاء وتتكتل معًا. نظرًا لأن بعض المواد الصلبة لا تزال في جزيئات صغيرة ، فإن العالم عادة ما يضع العينة في جهاز طرد مركزي لتدوير جميع المواد الصلبة معًا في حبيبات أسفل أنبوب العينة. هذا هو الشكل المنقى للحمض النووي الموجود أصلاً في العينة ، وهو مفيد للاختبار. بشكل عام ، يتم إزالة السائل الذي تم تعليق الحبيبات فيه من الأنبوب ، ويمكن أيضًا تجفيف الحبيبات للسماح للمواد الكيميائية بالتبخر ، من أجل جعل الحبيبات نقية قدر الإمكان.


DNA: معلومات أساسية

ما الذي يرمز إليه الحمض النووي؟

يرمز DNA للحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين.

الحمض النووي هو جزيء طويل على شكل حلزون مزدوج - حلزونان يلتفان حول بعضهما البعض. هذه اللوالب هي العمود الفقري للحمض النووي ، وتتكون من السكريات والفوسفات. ترتبط الحلزونات بمواد كيميائية تعرف بالقواعد ، والتي تمتد بين الحلزونات مثل درجات السلم. يحتوي الحمض النووي على أربعة أنواع من القواعد: الأدينين (A) ، الثايمين (T) ، الجوانين (G) والسيتوزين (C). دائمًا ما ينضم A و T معًا ، كما يفعل G و C.

ماذا يفعل الحمض النووي؟

تتكون جيناتنا من الحمض النووي ، ويحتوي الحمض النووي على شفرتنا الجينية الفريدة.
مثل كتاب وصفات أو تعليمات ليجو ، فإن الحمض النووي يحمل التعليمات لصنع جميع البروتينات لدينا ، والتي تؤدي جميع الوظائف في أجسامنا.

الجينات المشتركة

أنت لا تشبه إلى حد كبير ذبابة أو دودة. لكن ، صدق أو لا تصدق ، أنت تشارك الجينات مع كل منهما ومع كل كائن حي آخر. يدرس العلماء الجينات في البكتيريا وسمك الزرد والكائنات الحية الأخرى لمعرفة المزيد عن البشر.

ما مقدار الحمض النووي الذي تشاركه مع هذه الكائنات الحية؟


لماذا نستخدم سائل غسيل الأطباق؟

سائل غسيل الأطباق يفتح خلايا الفراولة ويطلق الحمض النووي.

لماذا نستخدم الملح؟

يضمن فصل البروتينات في الخلية عن الحمض النووي.

ماذا يفعل الكحول؟

عندما تكون الجزيئات غير قابلة للذوبان (غير قابلة للذوبان) ، فإنها تتجمع معًا وتصبح مرئية. الحمض النووي غير قابل للذوبان في الكحول ، لذلك فهو يجعل خيوط الحمض النووي تتكتل معًا وتصبح مرئية للعين المجردة.


مراجع

أمان ، R.I. ، Ludwig ، W. & amp Schleifer ، K.-H. تحديد النشوء والتطور فى الموقع الكشف عن الخلايا الميكروبية الفردية بدون زراعة. ميكروبيول. القس. 59, 143–169 (1995).

Radajewski، S.، Ineson، P.، Parekh، N. & amp Murrell، J. Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology. طبيعة سجية 403, 646–649 (2000).

دومون ، إم. & amp Murrell، J.C. نظير مستقر يربط الهوية الميكروبية بوظيفة. نات. القس ميكروبيول. 3, 499–504 (2005).

Neufeld ، J.D. ، Dumont ، MG ، Vohra ، J. & amp Murrell ، J.C الاعتبارات المنهجية لاستخدام فحص النظائر المستقرة في البيئة الميكروبية. ميكروب. ايكول. (دوى: 10.1007 / s00248-006-9125-x).

Evershed ، R.P. وآخرون. 13 C- وضع العلامات على الدهون للتحقيق في المجتمعات الميكروبية في البيئة. بالعملة. رأي. التكنولوجيا الحيوية. 17, 72–82 (2006).

فريدريش ، MW فحص النظائر المستقرة للحمض النووي: نظرة ثاقبة على وظيفة الكائنات الحية الدقيقة غير المزروعة من metagenomes المسمى بالنظائر. بالعملة. رأي. التكنولوجيا الحيوية. 17, 59–66 (2006).

مادسن ، إي. استخدام تقنيات فحص النظائر المستقرة في المفاعلات الحيوية والدراسات الميدانية حول المعالجة الحيوية. بالعملة. رأي. التكنولوجيا الحيوية. 17, 92–97 (2006).

بروسر ، جي آي ، رانجيل كاسترو ، ج. & amp Killham، K. دراسة التفاعلات بين النبات والميكروبات باستخدام تقنيات النظائر المستقرة. بالعملة. رأي. التكنولوجيا الحيوية. 17, 98–102 (2006).

Wagner، M.، Nielsen، P.H.، Loy، A.، Nielsen، J.L. & amp Daims، H. ربط بنية المجتمع الميكروبي بالوظيفة: التألق فى الموقع التهجين - التصوير الشعاعي الدقيق وصفائف النظائر. بالعملة. رأي. التكنولوجيا الحيوية. 17, 83–91 (2006).

Whiteley، A.S.، Manefield، M. & amp Lueders، T. فتح "الصندوق الأسود الميكروبي" باستخدام تقنيات فحص النظائر المستقرة القائمة على الحمض النووي الريبي. بالعملة. رأي. التكنولوجيا الحيوية. 17, 67–71 (2006).

Whely، A.S.، Thomson، B.، Leuders، T. & amp Manefield، M. RNA فحص النظائر المستقرة. نات. البروتوكولات (في الصحافة). DOI: 10.1038 / nprot.2007.115.

Dumont ، MG ، Radajewski ، SM ، Miguez ، CB ، McDonald ، I.R. and Murrell، J. بيئة. ميكروبيول. 8, 1240–1250 (2006).

Manefield ، M. ، Whiteley ، A.S. ، Griffiths ، R.I. & amp Bailey ، M.J. RNA ، فحص النظائر المستقرة ، وسيلة جديدة لربط وظيفة المجتمع الميكروبي بالتطور. تطبيق بيئة. ميكروبيول. 68, 5367–5373 (2002).

Lueders، T.، Manefield، M. & amp Friedrich، M.W. حساسية محسّنة للتحقيق في النظائر المستقرة القائمة على الحمض النووي الريبيوزي منقوص الأكسجين (DNA) والرنا الريباسي (rRNA) عن طريق التجزئة والتحليل الكمي لتدرجات الطرد المركزي المتساوية. بيئة. ميكروبيول. 6, 73–78 (2004).

كاديش ، ج وآخرون. الاعتبارات التقنية لاستخدام 15 سبر نظائر N-DNA مستقرة للنشاط الميكروبي الوظيفي في التربة. التواصل السريع. كتلة الطيف. 19, 1424–1428 (2005).

Cupples ، A.M. ، Shaffer ، E.A. ، Chee-Sanford ، J.C. & amp Sims ، G.K. تحولات كثافة طفو الحمض النووي خلال 15 فحصًا للنظائر المستقرة N-DNA. ميكروبيول. الدقة. (دوى: 10.1016 / j.micres.2006.01.016).

Sambrook، J. & amp Maniatis، T. الاستنساخ الجزيئي: دليل معمل (مطبعة مختبر كولد سبرينغ هاربور ، كولد سبرينغ هاربور ، نيويورك ، 2001).

ريكوود ، د. (محرر) الطرد المركزي: نهج عملي (IRL ، أكسفورد ، 1983).


  • يجب جمع الخلايا المراد دراستها.
  • كسر أغشية الخلايا لفضح الحمض النووي مع السيتوبلازم داخل (تحلل الخلية).
    • يتم تكسير الدهون من غشاء الخلية والنواة بالمنظفات والمواد الخافضة للتوتر السطحي.
    • تكسير البروتينات بإضافة البروتيز (اختياري).
    • تحطيم الحمض النووي الريبي عن طريق إضافة RNase (اختياري).
      عادة عن طريق الإيثانول المثلج أو الأيزوبروبانول. نظرًا لأن الحمض النووي غير قابل للذوبان في هذه الكحوليات ، فسوف يتجمع معًا ، مما يعطي حبيبات مضغوطة عند الطرد المركزي. يتم تحسين ترسيب الحمض النووي عن طريق زيادة القوة الأيونية ، عادة عن طريق إضافة أسيتات الصوديوم. التي فيها بروتينات الفينولدات في العينة. بعد الطرد المركزي للعينة ، تبقى البروتينات المشوهة في الطور العضوي بينما يتم خلط الطور المائي المحتوي على الحمض النووي مع الكلوروفورم لإزالة بقايا الفينول من المحلول. يعتمد ذلك على حقيقة أن الأحماض النووية قد ترتبط (الامتزاز) بالمرحلة الصلبة (السيليكا أو غيرها) اعتمادًا على الرقم الهيدروجيني وتركيز الملح في المخزن المؤقت.
  • يمكن إزالة البروتينات الخلوية والهيستون المرتبطة بالحمض النووي إما عن طريق إضافة البروتياز أو عن طريق ترسيب البروتينات مع أسيتات الصوديوم أو الأمونيوم ، أو استخلاصها بمزيج الفينول وكلوروفورم قبل ترسيب الحمض النووي.

    بعد العزل ، يتم إذابة الحمض النووي في محلول قلوي قليلًا ، عادةً في محلول TE ، أو في ماء شديد النقاء.

    تتضمن بعض طرق استخراج الحمض النووي الأكثر شيوعًا الاستخراج العضوي واستخراج Chelex واستخراج المرحلة الصلبة. [3] تنتج هذه الطرق باستمرار الحمض النووي المعزول ، لكنها تختلف في كل من جودة وكمية الحمض النووي الناتج. عند اختيار طريقة استخراج الحمض النووي ، هناك العديد من العوامل التي يجب مراعاتها ، بما في ذلك التكلفة والوقت والسلامة وخطر التلوث.

    يتضمن الاستخراج العضوي إضافة وحضانة في العديد من المحاليل الكيميائية المختلفة [3] بما في ذلك خطوة التحلل ، واستخلاص الفينول كلوروفورم ، وترسيب الإيثانول ، وخطوات الغسيل. غالبًا ما يستخدم الاستخراج العضوي في المختبرات لأنه رخيص الثمن وينتج كميات كبيرة من الحمض النووي النقي. على الرغم من أنه سهل ، إلا أن هناك العديد من الخطوات المتضمنة ، ويستغرق وقتًا أطول من الطرق الأخرى. كما يتضمن الاستخدام غير المواتي للمواد الكيميائية السامة الفينول والكلوروفورم ، وهناك خطر متزايد للتلوث بسبب نقل الحمض النووي بين أنابيب متعددة. [4] تم تطوير العديد من البروتوكولات القائمة على الاستخراج العضوي للحمض النووي بشكل فعال منذ عقود ، [5] على الرغم من تطوير ونشر إصدارات محسّنة وأكثر عملية من هذه البروتوكولات في السنوات الأخيرة. [6]

    تتضمن طريقة استخراج Chelex إضافة راتينج Chelex إلى العينة ، وغلي المحلول ، ثم تدويره وطرده مركزيًا. ترتبط المواد الخلوية بخرز Chelex ، بينما يتوفر الحمض النووي في المادة الطافية. [4] طريقة Chelex أسرع وأبسط بكثير من الاستخراج العضوي ، ولا تتطلب سوى أنبوب واحد ، مما يقلل من خطر تلوث الحمض النووي. لسوء الحظ ، لا ينتج عن استخراج Chelex كمية كبيرة والحمض النووي الناتج هو أحادي السلسلة ، مما يعني أنه لا يمكن استخدامه إلا للتحليلات القائمة على PCR وليس من أجل RFLP. [4]

    يستفيد استخراج المرحلة الصلبة مثل استخدام طريقة الاستخراج القائمة على عمود الدوران من حقيقة أن الحمض النووي يرتبط بالسيليكا. تضاف العينة التي تحتوي على الحمض النووي إلى عمود يحتوي على هلام السيليكا أو حبيبات السيليكا وأملاح تشوتروبيك. تعمل أملاح Chaotropic على تعطيل الرابطة الهيدروجينية بين الخيوط وتسهيل ارتباط الحمض النووي بالسيليكا عن طريق التسبب في أن تصبح الأحماض النووية كارهة للماء. هذا يفضح بقايا الفوسفات حتى تكون متاحة للامتصاص. [7] يرتبط الحمض النووي بالسيليكا ، بينما يتم غسل باقي المحلول باستخدام الإيثانول لإزالة الأملاح المتقلبة والمكونات الأخرى غير الضرورية. [3] يمكن بعد ذلك ترطيب الحمض النووي بمحلول مائي قليل الملح مما يسمح بشطف الحمض النووي من الحبيبات.

    تنتج هذه الطريقة DNA عالي الجودة ومزدوج الشريطة إلى حد كبير والذي يمكن استخدامه لتحليل كل من PCR و RFLP. يمكن أتمتة هذا الإجراء [4] وله إنتاجية عالية ، على الرغم من أنه أقل من طريقة الفينول كلوروفورم. هذه طريقة من خطوة واحدة ، أي يتم إكمال الإجراء بأكمله في أنبوب واحد. هذا يقلل من خطر التلوث مما يجعله مفيدًا جدًا في الاستخراج الشرعي للحمض النووي. يتم تصنيع مجموعات تجارية لاستخراج المواد الصلبة المتعددة وتسويقها من قبل شركات مختلفة ، والمشكلة الوحيدة هي أنها أغلى ثمناً من الاستخراج العضوي أو استخراج Chelex.

    يجب اختيار تقنيات محددة لعزل الحمض النووي من بعض العينات. العينات النموذجية ذات عزل الحمض النووي المعقد هي:

    • عينات أثرية تحتوي على حمض نووي متحلل جزئيًا ، انظر الحمض النووي القديم [8]
    • عينات تحتوي على مثبطات لإجراءات التحليل اللاحقة ، وعلى الأخص مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مثل حمض الدبالية من التربة ، والنيلي وأصباغ النسيج الأخرى أو الهيموجلوبين في الدم
    • عينات من الكائنات الحية الدقيقة ذات الجدار الخلوي السميك ، مثل الخميرة
    • عينات تحتوي على DNA مختلط من مصادر متعددة

    من السهل بشكل عام عزل الحمض النووي خارج الصبغيات ، وخاصة البلازميدات التي يمكن عزلها بسهولة عن طريق تحلل الخلية متبوعًا بترسيب البروتينات ، والتي تحبس الحمض النووي الصبغي في جزء غير قابل للذوبان وبعد الطرد المركزي ، يمكن تنقية DNA البلازميد من جزء قابل للذوبان.

    استخراج Hirt DNA هو عزل لجميع الحمض النووي خارج الصبغيات في خلية الثدييات. تتخلص عملية استخراج Hirt من الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي ، تاركةً فقط الحمض النووي منخفض الوزن الجزيئي للميتوكوندريا وأي حلقات فيروسية موجودة في الخلية.

    سيؤكد مؤشر diphenylamine (DPA) وجود الحمض النووي. يتضمن هذا الإجراء التحلل المائي الكيميائي للحمض النووي: عند تسخينه (على سبيل المثال -95 درجة مئوية) في الحمض ، يتطلب التفاعل سكر ديوكسيريبوز وبالتالي يكون خاصًا بالحمض النووي. في ظل هذه الظروف ، يتم تحويل 2-deoxyribose إلى w-hydroxylevulinyl aldehyde ، والذي يتفاعل مع المركب ، diphenylamine ، لإنتاج مركب أزرق اللون. يمكن تحديد تركيز الحمض النووي بقياس شدة امتصاص المحلول عند 600 نانومتر باستخدام مقياس طيف ضوئي ومقارنة بالمنحنى القياسي لتركيزات الحمض النووي المعروفة.

    يتم استخدام قياس شدة امتصاص محلول الحمض النووي بأطوال موجية 260 نانومتر و 280 نانومتر كمقياس لنقاء الحمض النووي. يمكن قياس كمية الحمض النووي عن طريق قطع الحمض النووي باستخدام إنزيم تقييد ، وتشغيله على هلام agarose ، وتلطيخ بروميد الإيثيديوم (EtBr) أو صبغة مختلفة ومقارنة كثافة الحمض النووي بعلامة الحمض النووي ذات التركيز المعروف.

    باستخدام تقنية اللطخة الجنوبية ، يمكن عزل هذا الحمض النووي وفحصه بشكل أكبر باستخدام تحليل PCR و RFLP. تسمح هذه الإجراءات بالتمييز بين التسلسلات المتكررة داخل الجينوم. هذه هي التقنيات التي يستخدمها علماء الطب الشرعي للمقارنة والتعرف والتحليل.

    في هذه الطريقة ، يتم عزل نوى النبات عن طريق طحن الأنسجة فعليًا وإعادة تكوين النوى السليمة في مخزن عزل نووي فريد (NIB). يتم تحرير DNA البلاستيد من العضيات ويتم التخلص منها بمحلول تناضحي عن طريق الغسل والطرد المركزي. يتم بعد ذلك تحلل النوى المنقاة وتنظيفها عن طريق الاستخراج العضوي ، ويتم ترسيب الحمض النووي الجينومي بتركيز عالٍ من CTAB. يتم استخراج gDNA عالي النقاء وعالي الوزن الجزيئي من النوى ، ويتم إذابته في محلول درجة حموضة عالي ، مما يسمح بالتخزين المستقر على المدى الطويل. [9]


    بيولوجيا التعايش بين السوطيات الحيوانية

    بداية واستقرار وانهيار التعايش

    تم العثور على Zooxanthellae في العديد من أنواع الشعاب المرجانية ، والتي تغطي أجناسًا وعائلات لا حصر لها. من الأعلى إلى الأسفل: Fungia sp. (الفطريات) ، Caulastraea sp. (الآن عضو في Merulinidae) و Trachyphyllia geoffroyi (Trachyphylliidae).

    متي Symbiodinium تعيش بحرية في المحيط ، فهي موجودة في شكلين قابلين للتبديل (Freudenthal 1962). الأول هو zoospore متحرك ، يدفع نفسه إلى الأمام بجلد. الشكل الثاني عبارة عن كيس نباتي ، وليس متحركًا لأنه يفتقر إلى السوط. يمكن أن تتكاثر الأكياس الخضرية لاجنسيًا ، عندما تكون حرة أو في حالة تكافل ، عن طريق الانقسام الخلوي الذي ينتج خليتين أو ثلاث خلايا ابنت. هناك مؤشرات على أن Symbiodinium النيابة. يمكن أيضًا أن تتكاثر جنسيًا (Stat et al.2006). الكيس الخضري هو الشكل السائد عندما تعيش دينوفلاجيلات في تعايش مع الحيوانات ، وتشير الدلائل إلى أن الحيوان المضيف يستخدم إشارات كيميائية لإبقائها في هذه الحالة غير المتحركة (كويكي وآخرون ، 2004). في معظم حالات التكافل ، تعيش zooxanthellae داخل خلية مضيفة حيوانية ، يحدها غشاء حيواني ، يُعرف باسم الغشاء المتعايش (Venn et al.2008). أما في المحار Tridacnid ، فإن zooxanthellae تعيش خارج الخلية ، بين خلايا البطلينوس وخلايا البطلينوس # 8217 (Ishikura et al. 1999). في الشعاب المرجانية ، تعيش zooxanthellae في gastroderm ، طبقة الخلية التي تغطي الجوف المعوي ، أو معدة الأورام الحميدة. في السنوات الأخيرة ، تمت دراسة الآليات الكامنة وراء ظهور التعايش المرجاني zooxanthellae في المختبر. في الوقت الحالي ، قسّم العلماء التعايش بين الكائنات المجوفة والطحالب إلى ست مراحل من الاتصال الأولي ، والابتلاع ، والفرز ، والتكاثر ، والاستقرار ، وأخيرًا الخلل الوظيفي (ديفي وآخرون ، 2012).

    نظرة عامة على المراحل الست المعروفة للتعايش اللعابي والطحالب. 1: الاتصال السطحي الأولي بين zooxanthella والخلية المضيفة للحيوان 2: الابتلاع المتعايش بواسطة الخلية المضيفة 3: فرز المتعايشين ، المحاطين الآن بغشاء من أصل مضيف ، مما يؤدي إلى رفض أو قبول المتعايش 4: نمو المتعايش عن طريق الانقسام الخلوي داخل الأنسجة المضيفة 5: الاستقرار ، مع مجموعة متعايش مستقرة 6: اختلال وظيفي وانهيار التعايش بسبب الإجهاد. أعيد رسمها من ديفي وآخرون. (2012).

    أولاً ، يجب أن تواجه zooxanthellae التي تعيش بحرية عوائل محتملة مثل الشعاب المرجانية. على الرغم من أن بعض أنواع الشعاب المرجانية تنقل zooxanthellae إلى نسلها عبر البيض ، وهي عملية تسمى الانتقال الرأسي ، تحتاج العديد من الأنواع إلى اكتساب متعايشات جديدة كل جيل. تقوم يرقات المرجان والأورام الحميدة بذلك عن طريق أخذها من عمود الماء ، وهو ما يسمى بالنقل الأفقي. إن التعرف على zooxanthellae على أنها تكافؤ محتمل من قبل الشعاب المرجانية ليس مفهومًا تمامًا ، ولكنه يتطلب عددًا لا يحصى من جزيئات الإشارة الموجودة على سطح الخلية لكلا الشريكين. بعد أن تعرفت الخلايا المرجانية & # 8217s بنجاح على zooxanthellae المتوافق المحتمل ، تبتلعها الخلايا من خلال عملية تسمى البلعمة (من اليونانية فجينأو أن تلتهم kytosأو الخلية و osis، عملية المعنى). بعد ذلك ، تبدأ عملية الفرز ، مما يؤدي إلى هضم zooxanthellae غير المرغوب فيه ، واستمرار الآخرين. يعتمد تفضيل coral & # 8217s لنوع معين من zooxanthellae ، أو clade ، على العديد من العوامل ، بما في ذلك الأنواع. عندما يواجه المرجان zooxanthellae غير المتوافق ، يتم تشغيل استجابة مناعية ، ويتم تدمير دينوفلاجيلات وطردها. سوف تتكاثر zooxanthellae المناسب في جميع أنحاء الشعاب المرجانية والأديم المعدي ، وسيترتب على ذلك تعايش مستقر. بمجرد إنشاء تكافل مستقر ، يمكن أن تستفيد zooxanthellae والشعاب المرجانية بشكل متبادل من التعاون من خلال تبادل العناصر الغذائية (انظر أيضًا أدناه). ومع ذلك ، عندما يتم الضغط على الشعاب المرجانية ، من خلال درجات حرارة المياه المرتفعة أو كثافة الضوء العالية على سبيل المثال ، يمكن أن تحدث ظاهرة تعرف باسم تبيض المرجان. يحدث هذا بسبب اختلال وظيفي في التعايش ، المرحلة السادسة والأخيرة المعروفة. يُعتقد أن الخلل الوظيفي أثناء الحرارة أو الإجهاد الخفيف يحدث بسبب الضرر الذي تلحقه آلية التمثيل الضوئي (أو أنظمة ضوئية) من zooxanthellae ، مما يتسبب في تدفق الجزيئات السامة إلى أنسجة المرجان (Venn et al. 2008). تسمى هذه الجزيئات السامة بأنواع الأكسجين التفاعلية ، وهي تشمل جذور الأكسيد الفائق (O2 & # 8211) وبيروكسيد الهيدروجين (H.2ا2). كاستجابة لهذه السموم ، من المحتمل أن يتم تدمير zooxanthellae بواسطة الخلايا المعوية الجلدية وطردها ، وبعد ذلك من خلال فم المرجان.

    يعتقد أن الآلية تكمن وراء انهيار التعايش المرجاني. يتسبب الإجهاد الحراري والضوء في تلف الأنظمة الضوئية داخل zooxanthella ، مما يؤدي إلى إنتاج جذور الأكسجين الفائق (O2-) وبيروكسيد الهيدروجين (H2O2). يتسبب هذا في تلف zooxanthella والخلية المضيفة للشعاب المرجانية ، مما يؤدي إلى تدمير وطرد zooxanthella ، وفي النهاية التبييض. أعيد رسمه من Venn et al. (2008).

    إن اختلال التعايش بين السوطيات الحيوانية والحيوانية بفعل العوامل البيئية ليس بالأمر الهين. عندما تكون الشعاب المرجانية في حالة التبييض ، فإنها لم تعد مستدامة بالمغذيات الحيوية من zooxanthellae ، وعليها أن تستعيد تعايشها بسرعة للبقاء على قيد الحياة. لسوء الحظ ، غالبًا ما تمنع فصول الصيف الطويلة الدافئة الشعاب المرجانية من فعل ذلك بالضبط ، ويترتب على ذلك وفيات هائلة للشعاب المرجانية. في الأحواض ، تم إجراء ملاحظات مماثلة. رأى العديد من علماء الأحياء المائية تأثيرات الحرارة والإجهاد الخفيف في المنزل ، خلال فصول الصيف الدافئة أو بعد ترقية أضواء حوض السمك. بعد عدة أيام من ارتفاع درجة حرارة الماء أو شدة الضوء ، قد تبيض الشعاب المرجانية وشقائق النعمان تمامًا ، مما ينتج عنه حوض مائي شاحب وعديم اللون. لذلك من المهم الحفاظ على استقرار درجة حرارة الحوض ، وزيادة شدة الضوء ببطء للسماح لـ zooxanthellae بالتكيف.

    من المعروف أن حساسية zooxanthellae للحرارة والإجهاد الخفيف تتفاوت بين الكتل ، مع كون الكليد D هو الأكثر تحملاً للحرارة (Baker et al. 2004). ربما يرجع هذا إلى حقيقة أن هذه zooxanthellae لها أغشية التمثيل الضوئي التي تظل مستقرة حتى عند درجات حرارة حوالي 93 درجة فهرنهايت (32 درجة مئوية) ، ولا تطلق أنواع الأكسجين التفاعلية السامة في الأنسجة المرجانية عند درجة الحرارة المرتفعة هذه (Tchernov et al. 2004) ). وهذا ما يفسر سبب تبييض بعض الشعاب المرجانية خلال فصل الصيف الحار ، والبعض الآخر لا يفعل ذلك.

    تبادل المغذيات ضمن التعايش

    طالما أن التعايش بين zooxanthellae والشعاب المرجانية سليم ، يستفيد كلا الشريكين من التبادل المعقد للمغذيات. تزود الخلايا المرجانية zooxanthellae بالكربون غير العضوي والنيتروجين (ثاني أكسيد الكربون ، الأمونيوم) ، الناتج عن تحلل المركبات العضوية التي تم الحصول عليها من zooxanthellae (الجلسرين ، الجلوكوز ، الأحماض الأمينية ، الدهون) والمياه المحيطة (العوالق ، المخلفات العضوية المذابة شيء). تستخدم zooxanthellae ، بدورها ، مركبات غير عضوية يتم الحصول عليها من الشعاب المرجانية ومياه البحر (ثاني أكسيد الكربون ، البيكربونات ، الأمونيوم ، النترات ، فوسفات الهيدروجين) لإنتاج جزيئات عضوية من خلال عملية التمثيل الضوئي. يتم نقل جزء كبير من هذه الجزيئات العضوية ، التي تسمى الآن التمثيل الضوئي ، مرة أخرى إلى المضيف. يسمح تبادل المغذيات هذا بين الشعاب المرجانية و zooxanthellae باستخدام العناصر الغذائية النادرة المتوفرة في المحيط بكفاءة. سمح انتقال المركبات الغنية بالطاقة من zooxanthellae إلى مضيفها للشعاب المرجانية ببناء شعاب مرجانية شاسعة ، من خلال إفراز الهياكل العظمية لكربونات الكالسيوم.

    نظرة عامة على تبادل العناصر الغذائية بين خلية مرجانية واحدة وخلية zooxanthella. يأخذ المرجان المركبات العضوية مثل العوالق ، المخلفات (أو الجسيمات العضوية ، POM) ، اليوريا ، الأحماض الأمينية ، والجلوكوز (أو المادة العضوية المذابة ، DOM) من مياه البحر. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يتلقى جزيئات عضوية من zooxanthellae ، مثل الجلسرين. تقوم الخلية المرجانية بتقسيمها إلى الأمونيوم وثاني أكسيد الكربون ، والتي يتم امتصاصها لاحقًا بواسطة zooxanthella. يأخذ zooxanthella أيضًا مركبات غير عضوية من الماء ، مثل الأمونيوم (NH4 +) والنترات (NO3-) وفوسفات الهيدروجين (HPO42-) وبيكربونات (HCO3-) وثاني أكسيد الكربون (CO2) ، ويحولها إلى جزيئات عضوية ، بشكل أساسي من خلال التمثيل الضوئي. يتم إخراج جزء كبير من هذه المركبات مرة أخرى في الخلية المضيفة المرجانية. يسمح هذا الدوران للمغذيات بين الخلايا المضيفة للشعاب المرجانية و zooxanthellae التكافلي للشعاب المرجانية بالنمو في البيئات الفقيرة بالمغذيات. أعيد رسمها من ديفي وآخرون. (2012).

    من الواضح أن zooxanthellae لا تنقل ببساطة أي مواد زائدة إلى مضيفها المرجاني. يتم تحفيز إطلاق التمثيل الضوئي من zooxanthellae بذكاء بواسطة الشعاب المرجانية بما يسمى & # 8220host factor & # 8221، or HRF. هذا المنتج عبارة عن مادة ينتجها المرجان ، وربما خليط من الأحماض الأمينية المحددة ، والتي تؤدي إلى إطلاق الجلسرين والجلوكوز المغذيين من قبل zooxanthellae (Gates et al. 1995 Wang and Douglas 1997). في الواقع ، عند إضافة قطرة من ملاط ​​أنسجة المرجان إلى أ Symbiodinium الثقافة ، سوف تحفز بسرعة إطلاق المغذيات عن طريق الدينوفلاجيلات (Trench 1971). ومع ذلك ، ديفي وآخرون. (2012) يشير إلى أن HRF يجب ألا يتم تعميمه عبر الأنواع المضيفة ، حيث تشير الدلائل إلى أن الأنواع المختلفة قد تستخدم أنواعًا مختلفة من HRF & # 8217s.

    على الرغم من أن الشعاب المرجانية تتلقى كميات كبيرة من المركبات العضوية من zooxanthellae ، تشير الأبحاث بقوة إلى أن مصدرًا خارجيًا للغذاء مطلوب للحفاظ على النمو الأمثل (راجعه Houlbrèque و Ferrier-Pagès 2009). هذا لأن الشعاب المرجانية تتطلب بروتينًا ودهونًا إضافيًا لتنمية الأنسجة والمصفوفة العضوية ، وهي بروتينية & # 8220 سقالة & # 8221 توفر مواقع لترسيب بلورات كربونات الكالسيوم. إن تزويد الشعاب المرجانية بدفعة يومية من العوالق الحيوانية ، مثل مجدافيات الأرجل أو نوبلي الروبيان المالح ، لا يوفر لهم الغذاء فحسب ، بل إن الزيادة الطفيفة في العناصر الغذائية غير العضوية ستغذي أيضًا zooxanthellae. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تحفيز دورة العناصر الغذائية داخل التعايش. بعض الأحياء المائية خالية جدًا من العناصر الغذائية ، بسبب استخدام الترشيح الثقيل جنبًا إلى جنب مع ندرة التغذية ، لدرجة أن zooxanthellae يتوقف عن النمو ويموت. هذا يجعل الشعاب المرجانية تبدو مبيضة ، وعندما يحدث هذا ، من الضروري تقليل معدل الترشيح و / أو زيادة التغذية.

    يتم تعليق الشعاب المرجانية من سلك للوزن تحت الماء أو للطفو.


    المقدمة

    تطلبت التطورات البحثية الحديثة في الاضطرابات الجينية جمع كميات كبيرة من الحمض النووي عالي الجودة الذي يجب الحصول عليه من مصادر عينات مختلفة. تعد كتابة الحمض النووي حاليًا أكثر الطرق المصدق عليها للتعرف الشخصي على بقع السوائل الجسدية البشرية الموجودة في مسرح الجريمة. في مجموعة متنوعة من الدراسات الجينية ، تتمثل الطريقة الشائعة الاستخدام في الحصول على الحمض النووي الجيني من الخلايا المنواة للدم المحيطي نتيجة لغزو هذا النهج ، وقد يكون من الصعب الحصول على عينات من الأشخاص الخاضعين للدراسة. 1 ، 2 كانت مخططات العزلة مملة ، كما كانت أوقات التحليل الإجمالية طويلة إلى حد ما. تشمل المصادر البديلة الأخرى لعزل الحمض النووي الخلايا الشدقية ، والشعر مع بصيلات ، والبول ، والتي يسهل الحصول عليها بطريقة غير باضعة عن طريق جمع الدم الغازي. 2 يمكن إجراء جمع الخلايا الشدقية بسهولة عن طريق مسحة شدق بمسحة قطنية أو باستخدام إجراء غسل الفم. 3 يوفر عزل الحمض النووي باستخدام مسحات الشدق العديد من المزايا ، مثل المعالجة الفعالة من حيث التكلفة ، ومتطلبات حجم العينة الأقل ، والأرشفة طويلة الأجل ، ومدى ملاءمة الجمع الذاتي. إنه أكثر راحة للمريض ، وتوفر المسحات الشدقية حمضًا نوويًا كافيًا لـ PCRs ، لأنها تتطلب عددًا قليلاً من النانوجرامات من الحمض النووي. 3

    يعد شعر الإنسان أحد أكثر المواد البيولوجية شيوعًا المرتبطة بالتحقيقات القانونية وقد تم استخدامه في العمل السكاني القائم على الإحصاء والتحليل القائم على الحمض النووي في علم الجريمة. 4 الطريقة الأكثر قيمة لاختبار الحمض النووي هي تحليل التكرار الترادفي القصير للحمض النووي النووي. 5 هذا ممكن عند وجود جزء الجذر من الشعر و / أو الأنسجة الملتصقة. ومع ذلك ، فإن الشعر التيلوجيني (الشعر المتساقط) ، المرتبط غالبًا بمسرح الجريمة ، قد لا يحتوي على أي مواد نووية. 5 الميتوكوندريا الخلوية والحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) لا يزالان على حالهما ، 5 ، 6 بينما تتحلل النواة مع تصلب جذع الشعرة أثناء التقرن ، ويمكن تحليل mtDNA من الشعر المتقرن. لسوء الحظ ، تتطلب الطبيعة الغنية بالبروتين لعينات الشعر خطوات إضافية لتحطيم العمود وإطلاق الحمض النووي (مثل التجزئة باستخدام طاحونة زجاجية مجهرية ، متبوعة باستخلاص مذيب عضوي) 7 & # x02013 9 ، وبالتالي تعريض العينة إلى زيادة خطر التلوث. إن تحقيق الطب الشرعي لبقع البول البشرية له أهمية كبيرة عند تحديد الموقع الدقيق للجريمة ونوع الوفاة. 10 بول الإنسان هو عينة مناسبة لتحليل السموم في اختبارات تعاطي المنشطات وفحص الأدوية. 11

    ومع ذلك ، نظرًا للصعوبات العملية والأسباب المنهجية ، من الضروري تحسين الظروف لتعظيم إنتاجية ونقاء الحمض النووي الذي يتم الحصول عليه من أنواع مختلفة من العينات باستخدام طرق مختلفة. طريقة مبسطة ، موضحة في هذه الدراسة ، لاستخراج الحمض النووي من خصلات الشعر التي تقلل من الخطوات غير الضرورية تقضي فعليًا على تلوث الحمض النووي وتحافظ أيضًا بشكل كبير على المدة الزمنية للتحليل الذي سيكون مفيدًا لمجتمع الطب الشرعي وكذلك مجتمع البحث القائم على السكان. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مطلب انخفاض حجم العينة المقترن بجمع العينة بطريقة غير باضعة يسمح بأخذ عينات من الأطفال تظهر بسهولة في توظيف الدراسة الأوسع في دراسات الحالة المستندة إلى السكان. علاوة على ذلك ، يمكن تصور تطوير هذه الطريقة المبسطة حيث يمكن تطبيقها كأداة تشخيص طبية مع تحليل الحمض النووي التي يمكن إجراؤها على نطاق زمني قصير إلى حد معقول (& # x0223c8 h) للكشف عن حالات المرض ، وهو التشخيص الطبي الحالي. مجال رغباته بفارغ الصبر.


    النفايات النيتروجينية في الطيور والزواحف: حمض اليوريك

    طورت الطيور والزواحف قدرتها على تحويل الأمونيا السامة إلى حمض اليوريك أو الجوانين بدلاً من اليوريا.

    أهداف التعلم

    قارن المنتج الثانوي الرئيسي لعملية التمثيل الغذائي للأمونيا في الثدييات بتلك الموجودة في الطيور والزواحف

    الماخذ الرئيسية

    النقاط الرئيسية

    • تميل النفايات النيتروجينية في الجسم إلى تكوين الأمونيا السامة ، والتي يجب إخراجها.
    • تفرز الثدييات مثل البشر اليوريا ، بينما تنتج الطيور والزواحف وبعض اللافقاريات الأرضية حمض اليوريك كنفايات.
    • تميل الكائنات القشرية إلى إفراز نفايات حمض البوليك على شكل معجون أبيض أو مسحوق.
    • يعتبر تحويل الأمونيا إلى حمض البوليك أكثر استهلاكًا للطاقة من تحويل الأمونيا إلى يوريا.
    • يعتبر إنتاج حمض اليوريك بدلاً من اليوريا مفيدًا لأنه أقل سمية ويقلل من فقد الماء والحاجة اللاحقة للماء.

    الشروط الاساسية

    • اليوريا: مركب عضوي قابل للذوبان في الماء ، CO (NH2) 2 ، يتكون من التمثيل الغذائي للبروتينات ويطرح في البول
    • ذرق الطائر: فضلات الطيور البحرية ، أو الخفافيش التي تعيش في الكهوف ، أو طيور البينيبيد ، أو الطيور بشكل عام.
    • البيورين: أي فئة من القواعد العضوية الحلقية غير المتجانسة التي تحتوي على حلقات بيريميدين و إيميدازول المنصهرة ، فهي مكونات للأحماض النووية
    • الزانثين: مقدمة لحمض البوليك الموجود في العديد من أعضاء الجسم
    • هيبوكسانتين: وسيط في التخليق الحيوي لحمض البوليك
    • حمض البوليك: مركب فينولي حلقي ثنائي الحلقات ، يتكون في الجسم عن طريق التمثيل الغذائي للبروتين ويطرح في البول

    النفايات النيتروجينية في الطيور والزواحف: حمض اليوريك

    من بين الجزيئات الأربعة الرئيسية في الأنظمة البيولوجية ، تحتوي كل من البروتينات والأحماض النووية على النيتروجين. أثناء هدم الجزيئات المحتوية على النيتروجين أو انهيارها ، يتم استخراج الكربون والهيدروجين والأكسجين وتخزينه في شكل كربوهيدرات ودهون. يتم إخراج النيتروجين الزائد من الجسم. تميل النفايات النيتروجينية إلى تكوين الأمونيا السامة ، مما يرفع درجة الحموضة في سوائل الجسم. The formation of ammonia itself requires energy in the form of ATP and large quantities of water to dilute it out of a biological system.

    While aquatic animals can easily excrete ammonia into their watery surroundings, terrestrial animals have evolved special mechanisms to eliminate the toxic ammonia from their systems. The animals must detoxify ammonia by converting it into a relatively-nontoxic form such as urea or uric acid.

    Nitrogen excretion: Nitrogenous waste is excreted in different forms by different species. These include (a) ammonia, (b) urea, and (c) uric acid.

    Birds, reptiles, and most terrestrial arthropods, such as insects, are called uricothelic organisms because they convert toxic ammonia to uric acid or the closely-related compound guanine (guano), rather than urea. In contrast, mammals (including humans) produce urea from ammonia however, they also form some uric acid during the breakdown of nucleic acids. In this case, uric acid is excreted in urine instead of in feces, as is done in birds and reptiles.

    Uric acid is a compound similar to purines found in nucleic acids. It is water insoluble and tends to form a white paste or powder. The production of uric acid involves a complex metabolic pathway that is energetically costly in comparison to processing of other nitrogenous wastes such as urea (from the urea cycle) or ammonia however, it has the advantages of reducing water loss and, hence, reducing the need for water.

    Uric acid is also less toxic than ammonia or urea. It contains four nitrogen atoms only a small amount of water is needed for its excretion. Out of solute, it precipitates and forms crystals. The enzyme xanthine oxidase makes uric acid from xanthine and hypoxanthine, which in turn are produced from other purines. Xanthine oxidase is a large enzyme whose active site consists of the metal, molybdenum, bound to sulfur and oxygen. Uric acid is released in hypoxic conditions.


    Can I pellet DNA back from dissolved state? - مادة الاحياء

    A simple and efficient method for DNA extraction from grapevine cultivars, Vitis species and Ampelopsis .

    Lodhi, Muhammad A., Guang-Ning Ye, Norman F. Weeden and Bruce I. Reisch. 1994.

    Plant Molecular Biology Reporter 12(1): 6-13.

    Department of Horticultural Sciences, New York State Agricultural Experiment Station, Cornell University, Geneva, NY 14456.

    Key Words: DNA extraction, Vitis sp., polyphenols, polysaccharides , RAPD, restriction digestion.

    A quick, simple and reliable DNA extraction method for grapevine species, hybrids and Ampelopsis ( Vitaceae ) has been developed. This method is a modification of Doyle and Doyle (1990). It is a CTAB-based extraction procedure modified by the use of NaCl to remove polysaccharides and PVP to eliminate polyphenols during DNA purification. The method also has been used successfully for extraction of total DNA from other fruit species such as apple ( Malus domestica ), apricot ( Prunus armeniaca ), cherry ( Prunus avium ), peach ( Prunus persica ), plum ( Prunus domestica ) and raspberry ( Rubus idaeus ). DNA yield from this procedure is high (up to 1 mg/g of leaf tissue). DNA is completely digestible with restriction endonucleases and amplifiable in the polymerase chain reaction (PCR), indicating freedom from common contaminating compounds.

    Vitis vinifera and related species have been the subject of extensive genetic studies due to their worldwide cultivation and importance. Recently this plant has been used for gene mapping (Yamamoto et al., 1991 Mauro et al., 1992 Weeden et al., 1992 Lodhi et al., 1992a 1992b1993 Hain et al., 1993), genetic transformation (Baribault et al., 1989 Baribault et al., 1990 Hébert et al., 1993), and DNA fingerprinting (Striem et al., 1990 Bourquin et al., 1991). The relatively small genome size of Vitis vinifera (0.50 pg/C) compared to many other perennial plant species (Arumuganathan and Earle, 1991) should facilitate molecular genetic studies of Vitis . However, DNA extraction from grapevine has been difficult due to the presence of contaminants such as polyphenols and polysaccharides. These compounds have also been reported to cause difficulty in DNA purification in other plant species polysaccharides (Murray and Thompson, 1980 Fang et al., 1992) polyphenolic compounds (Katterman and Shattuck, 1983 Couch and Fritz, 1990 Howland et al. 1991 Collins and Symons, 1992) and sticky and resinous materials (Webb and Knapp, 1990). The presence of these contaminants in DNA preparations often makes the samples viscous and renders DNA unrestrictable in endonuclease digestion and unamplifiable in PCR. The existing DNA extraction protocols often produce unsatisfactory yields and/or quality (Bourquin et al., 1991 Collins and Symons, 1992).

    Here we report a simple, inexpensive and quick DNA extraction procedure for grapevine Vitis species, hybrids and Ampelopsis . This procedure purifies greater amounts of clean DNA which can be amplified via PCR or digested with endonucleases.

    See Table I for the source of plant material used in this study.

    Extraction buffer: 20 mM sodium EDTA and 100 mM Tris-HCl, adjust pH to 8.0 with HCl, add 1.4 M NaCl and 2.0% (w/v) CTAB (cetyltrimethylammonium bromide). Dissolve CTAB by heating to π C. Store at 37 C. Add 0.2 % of ß-mercaptoethanol just before use.

    TE buffer: 10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA, adjust pH to 8.0 and autoclave

    RNAase A (Sigma R9009: 10 mg/mL)

    • Collect unexpanded young leaves in liquid nitrogen or on ice and store at or below -70°C until used. Avoid thawing before grinding the leaf tissue. Grind 0.5 g of leaves using mortar and pestle in the presence of liquid nitrogen. Although leaves should be thoroughly crushed before adding extraction buffer, it is important not to grind the leaves into a very fine powder as it results in shearing of DNA.

    • Add 5 mL of extraction buffer to the ground leaves and mix in the mortar.

    • Pour the slurry into clean 15 mL polypropylene centrifuge tubes (Laboratory Product Sales, Rochester, New York LX 4109), rinse the mortar and pestle with 1 mL of extraction buffer and add to the original extract.

    • Add 50 mg polyvinylpolypyrrolidone (PVP), (Sigma, P6755) and invert the tubes several times to mix thoroughly with the leaf slurry (100 mg PVP/g leaf tissue).

    • Incubate at 60°C for 25 minutes and cool to room temperature.

    • Add 6 mL of chloroform:octanol and mix gently by inverting the tubes 20 to 25 times to form an emulsion.

    • Spin at 6000 rpm for 15 minutes in a table top centrifuge at room temperature.

    • Transfer the top aqueous phase to a new 15 mL centrifuge tube with a wide-bore pipette tip. A second chloroform:octanol extraction may be performed if the aqueous phase is cloudy due to the presence of PVP.

    • Add 0.5 volume of 5M NaCl to the aqueous solution recovered from the previous step and mix well.

    • Add two volumes of cold (-20°C) 95% ethanol and refrigerate (4 to 6°C) for 15-20 minutes or until DNA strands begin to appear. The solution can be left for one hour or more if necessary.

    • Spin at 3000 rpm for three minutes and then increase speed to 5000 rpm for an additional three minutes at room temperature. This differential spinning step helps to keep DNA at the bottom of the centrifuge tube.

    • Pour off supernatant and wash pellet with cold (0 to 4°C) 76% ethanol. Completely remove ethanol without drying the DNA pellet by leaving the tubes uncovered at 37°C for 20 to 30 minutes.

    • Dissolve in 200 to 300 L TE.

    • Treat with 1 L RNAase A per 100 L DNA solution and incubate at 37°C for 15 minutes.

    • Quantify DNA in a spectrophotometer at A 260.

    • Keep DNA at -70 C for long term and -20°C for short term storage.

    We have obtained higher yields of clean DNA from grapevine leaves by using the modified DNA extraction procedure outlined above. The procedure used for DNA extraction is CTAB-based and is modified from Doyle and Doyle (1990). NaCl has been used to remove polysaccharides (Fang et al., 1992), and PVP to purge polyphenols (Maliyakal, 1992). This procedure does not involve CsCl density gradient purification steps.

    DNA yields from Vitis species, Ampelopsis and other woody perennial plant species by the above mentioned procedure range from 0.5 to 1.0 mg/g fresh leaf tissues with A 260 /A 280 between 1.8 and 2.0 (Table 1). The procedure is fast and simple and 30 to 40 DNA samples may be processed in a single day. Results of DNA restriction digestion with three endonucleases ( Eco RI, Eco RV and Hin dIII) showed complete digestion (Fig. 1a). It is also evident that the uncut DNA exhibits little shearing and is suitable for Southern (1975) hybridization (Fig. 1b). The DNA is also amplifiable in PCR using the RAPD technique (Williams et al., 1990) (Fig. 2).

    Proper choice of the leaf tissue is very important for DNA extraction. The use of very young leaf tissues has resulted in poor yields. We found that partially expanded leaves are the best material. This is consistent with the results reported by Mauro et al. (1992), in which the best results were obtained from rapidly expanding leaves, one to two nodes from the shoot tip. With fully expanded leaves the yield was low and the DNA was not completely digestible. However, we were able to get equally good results with fully expanded leaves when PVP was added to the extraction buffer. PVP has been used to remove polyphenols from mature, damaged and improperly stored leaf tissues (Rogers and Bendich, 1985 Doyle and Doyle, 1987, Howland et al., 1991). PVP forms complex hydrogen bonds with polyphenolic compounds which can be separated from DNA by centrifugation (Maliyakal, 1992). The presence of polyphenolic compounds can be reduced by keeping plant material frozen before extraction and by using PVP in the DNA extraction procedure. The developmental stage of the plant is also important. The optimal time for leaf collection was during the period of active shoot elongation following bud break. Later in the season DNA extraction was difficult and the DNA obtained was unstable for long term storage.

    Complete digestion with restriction endonucleases and amplification in PCR indicate the absence of polysaccharides. Polysaccharides are difficult to separate from DNA (Murray and Thompson, 1980). These compounds are easily identifiable in the DNA preparations as they impart a sticky, viscous consistency to the DNA preparations dissolved in TE buffer. Polysaccharides interfere with several biological enzymes such as polymerases, ligases and restriction endonucleases (Shioda et al., 1987 Richards, 1988). We found that when polysaccharides were not removed the DNA would not amplify. PCR amplification of the DNA with several ten base long oligonucleotides and complete DNA restriction results are consistent with these results. DNA amplification was possible due to the absence of contaminants (Webb and Knapp, 1990 Fang et al., 1992). Fang et al. (1992) found that 1 M NaCl facilitated the removal of polysaccharides by increasing their solubility in ethanol so that they did not co-precipitate with the DNA. However, we found higher concentrations of NaCl (more than 2.5 M) were more effective with the species under study.

    The simplicity of the procedure makes it very practical for DNA extraction especially from Vitis species, hybrids and Ampelopsis and generally from other plant species such as apple, apricot, peach, plum and raspberry. Moreover, DNA yield is higher compared with other procedures used for DNA extraction from grapevines (Bourquin et al., 1991, 5-20 g nuclear DNA /g FW Collins and Symons, 1992, 10-30 g DNA/g FW and Thomas et al., 1993, 25-150 g DNA/g FW). Doyle and Doyle (1987) reported DNA yields up to 1 mg/g of fresh leaf tissues from different plant species and this procedure was used by Mauro et al. (1992) for extraction of grapevine DNA. We have not been able to obtain such a high yield when this procedure was used on grapevine (data not shown). However, we found that DNA extracted by that procedure was occasionally brownish in color and difficult to digest with restriction endonucleases. Such samples also were found to have a shorter storage life. Likewise, the procedure of Doyle and Doyle (1987) gave similar results for different Vaccinium sp. (Rowland and Nguyen, 1993). Our modification of Doyle and Doyle (1990) consistently produces high quality DNA which remains usable for at least two years when stored at -20°C.

    Acknowledgments: We are thankful to Dr. Philip L. Forsline, USDA, ARS, National Clonal Germplasm Repository, Geneva, New York for providing us with Vitis species plant material, Dr. Robert L. Andersen for cherry, apricot, plum and peach, and Mr. Kevin E. Maloney for raspberry. We wish to thank Drs. John C. Sanford and Susan K. Brown for their critical review and valuable suggestions.

    Arumuganathan, K. and E.D. Earle. 1991. Nuclear DNA content of some important plant species. Plant Mol. بيول. Rep. 9:208-218.

    Baribault, T.J., K.G.M. Skene and N.S. Scott. 1989. Genetic transformation of grapevine cells. Plant Cell Rep. 8:137-140.

    Baribault, T.J., K.G.M. Skene, P.A. Cain and N.S. Scott. 1990. Transgenic grapevines: Regeneration of shoots expressing ß-glucuronidase. J. Exp. Bot. 41:1045-1049.

    Bourquin, J.-C., L. Otten and B. Walter. 1991. Identification of grapevine root-stocks by RFLP. C.R. Acad. علوم. Paris 312 Série III:593-598.

    Collins, G.G. and R.H. Symons. 1992. Extraction of nuclear DNA from grape vine leaves by a modified procedure. Plant Mol. بيول. Rept. 10:233-235.

    Couch, J.A. and P.J. Fritz. 1990. Isolation of DNA from plants high in polyphenolics. Plant Mol. بيول. Rep. 8:8-12.

    Doyle, J.J. and J.L. Doyle. 1987. A rapid DNA isolation procedure from small quantities of fresh leaf tissues. Phytochem Bull. 19:11-15.

    Doyle, J.J. and J.L. Doyle. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12:13-15.

    Fang, G., S. Hammar and R. Rebecca. 1992. A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA. BioTechniques 13:52-56.

    Hain, R., H.J. Reif, E. Krause, R. Langebartels, H. Kindl, B. Vornam, W. Wiese, E. Schmelzer, P.H. Schreier, R.H. Stöcker and K. Stenzel. 1993. Disease resistance results from foreign phytoalexin expression in a novel plant. Nature 361:153-156.

    Hébert, D., J.R. Kikkert, F.D. Smith and B.I. Reisch. 1993. Optimization of biolistic transformation of embryogenic grape cell suspensions. Plant Cell Rep. (In Press).

    Howland, D.E., R.P. Oliver and A.J. Davy. 1991. A method of extraction of DNA from birch. Plant Mol. بيول. Rep. 9:340-344.

    Katterman, F.R.H. and V.I. Shattuck. 1983. An effective method of DNA isolation from the mature leaves of Gossypium species that contain large amounts of phenolic terpenoids and tannins. Preparative Biochemistry 13:347-359.

    Lodhi, M.A., B.I. Reisch and N.F. Weeden. 1992a. Molecular genetic mapping and genome size of Vitis. Plant Genome-I, 9-11 November, San Diego, CA. (Abstract).

    Lodhi, M.A., B.I. Reisch and N.F. Weeden. 1992b. Molecular genetic mapping of the Vitis genome. أكون. J. Enol. Vitic. 43:393 (Abstract).

    Lodhi, M.A., B.I. Reisch and N.F. Weeden. 1993. Molecular genetic mapping and genome size of Vitis . 90th Meeting Am. شركة Hort. Sci., July 24-29 (1993), Nashville, TN. (Abstract) HortScience (in press).

    Maliyakal, E.J. 1992. An efficient method for isolation of RNA and DNA from plants containing polyphenolics. الدقة الأحماض النووية. 20:2381.

    Mauro, M.-C., M. Strefeler, N.F. Weeden and B.I. Reisch. 1992. Genetic analysis of restriction fragment length polymorphisms in Vitis . J. Hered. 83:18-21.

    Murray, M.G. and W.F. Thompson. 1980. Rapid isolation of high molecular weight DNA. الدقة الأحماض النووية. 8:4321-4325.

    Richards, E. 1988. Preparation of genomic DNA from plant tissue. In: Current Protocols in Molecular Biology. (eds. F.M. Ausubel, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman and K. Struhl), pp. 2.3.2-2.3.3. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York.

    Rogers, S.O. and A.J. Bendich. 1985. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues. Plant Mol. بيول. 5:69-76.

    Rowland, L.J. and B. Nguyen. 1993. Use of polyethylene glycol for purification of DNA from leaf tissue of woody plants. BioTechniques 14: 734-736.

    Shioda, M. and K. Marakami-Muofushi. 1987. Selective inhibition of DNA polymerase by a polysaccharide purified from slime of Physarum polycephalum . بيوتشيم. بيوفيز. الدقة. كومون. 146:61-66.

    Striem, M.J., P. Spiegel-Roy, G.Ben-Hayyim, J. Beckmann and D. Gidoni. 1990. Genomic fingerprinting of Vitis vinifera by the use of multi-loci probes. Vitis 29:223-227.

    Southern, E.M. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. جيه مول. بيول. 98:503-517.

    Thomas, M.R., S. Matsumoto, P. Cain and N.S. Scott. 1993. Repetitive DNA of grapevine: classes present and sequences suitable for cultivar identification. Theor. تطبيق جينيه. 86:173-180.

    Webb, D.M. and S.J. Knapp. 1990. DNA extraction from a previously recalcitrant plant genus. Plant Mol. بيول. Rep. 8:180-185.

    Weeden, N.F., G.M. Timmerman, M. Hemmat, B.E. Kneen and M.A. Lodhi. 1992. Inheritance and reliability of RAPD markers. In: Proc. Joint Plant Breeding Symposium Series. Applications of RAPD Technology to Plant Breeding. Crop Science Society of America, American Society for Horticultural Science and American Genetic Association. pp. 12-17.

    Williams, J.G.K., A.R. Kubelik, K.J. Livak, J.A. Rafalski and S.V. Tingey. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. الدقة الأحماض النووية. 18:6531-6535.

    Yamamoto, N., G. Ono, K. Takashima and A. Totsuka. 1991. Restriction fragment length polymorphisms of grapevine DNA with phenylalanine ammonia-lyase cDNA. Jap. J. Breed. 41:365-368.

    Table I. Sources and DNA yield of the plant material used for DNA extraction.

    كرمة العنب الاوروبي cv. Cabernet Sauvignon

    Ampelopsis brevipedunculata

    Apple ( Malus domestica cv. Red Delicious)

    Apricot ( Prunus armeniaca cv. NY 500)

    Cherry ( Prunus avium cv. NY 6476)

    Peach ( Prunus persica cv. Rutgers Red Leaf)

    Plum ( Prunus domestica cv. NY 65.363.1)

    Raspberry ( Rubus idaeus cv. NY 83)

    أ NYSAES (New York State Agricultural Experiment Station, Geneva, New York)


    Troubleshooting Guide for Genomic DNA Extraction & Purification (NEB #T3010)

    Need some help purifying genomic DNA with the Monarch Genomic DNA Purification Kit (NEB #T3010)? We&rsquore here to help. Our troubleshooting guide below outlines some of the most common pain points that scientists encounter during gDNA purification. You can also find guidance on choosing appropriate input amounts in our online resource, Choosing Input Amounts for the Monarch Genomic DNA Purification Kit. Still having trouble? Contact our technical support at any time.

    • Thaw cell pellets slowly on ice and flick tube several times to release the pellet from the bottom of the tube. Be sure to use cold PBS for resuspension, and resuspend gently by pipetting up and down 5&ndash10 times until a uniformly turbid cell suspension is obtained and the pellet is completely dissolved.
    • Add Proteinase K and RNase A to sample and mix well before adding the Cell Lysis Buffer, otherwise the high viscosity of the lysate will impede proper mixing of the enzymes.
    • Keep frozen blood samples frozen and add Proteinase K, RNase A and Blood Lysis Buffer directly to the frozen samples. Start lysis right away and let the samples thaw upon lysis incubation.
    • Fresh (unfrozen) whole blood should not be older than a week. Older samples will show a progressive amount of DNA degradation and loss of yield.
    • Digestion of whole blood samples from some animal species with high hemoglobin content (e.g. guinea pig) may lead to the accumulation of insoluble hemoglobin complexes that stain and clog the membrane, leading to reduced yield and purity. Reduce Proteinase K lysis time from 5 to 3 minutes to prevent the formation of these precipitates.
    • Cut starting material to the smallest possible pieces or grind with liquid nitrogen. In large tissue pieces, nucleases will destroy the DNA before the Proteinase K can lyse the tissue and release the DNA.
    • Proteinase K digestion of fibrous tissues (e.g. muscle, heart, skin, ear clips), brain tissue and all RNAlater-stabilized tissues leads to the release of small indigestible protein fibers that often gives the lysate a turbid appearance. These fibers will block the binding sites of the silica membrane reducing yield and causing protein contamination. To remove fibers, centrifuge lysate at maximum speed for 3 minutes, as indicated in the protocol. For ear clips and brain tissue, use no more than 12&ndash15 mg input material, otherwise the fiber removal will not be complete.
    • Samples that are stored for long periods of time at room temperature, 4°C or -20°C will show degradation and loss of the gDNA content over time. Flash freeze tissue samples with liquid nitrogen or dry ice and store them at -80°C. Alternatively, use stabilizing reagents to protect the gDNA and enable storage for longer periods of time at 4°C or -20°C.
    • Organ tissues like pancreas, intestine, kidney and liver contain significant amounts of nucleases. They should be treated with extreme care and stored properly to prevent DNA degradation. Keep frozen and on ice during sample preparation. Refer to the protocol for the recommended amount of starting material and Proteinase K to use.
    • Some organ tissues (e.g. spleen, kidney, liver) are extremely rich in genomic DNA. Attempting to process quantities larger than the recommended input amounts will result in the formation of clouds of tangled, long-fragment gDNA that cannot be eluted from the silica membrane. Reduce the amount of input material to get a higher yield.
    • Most samples are digested with 10 µl Proteinase K, but for brain, kidney and ear clips, using 3 µl will provide better yields.
    • Samples that are stored for long periods of time at room temperature, 4°C or -20°C will show degradation and loss of the gDNA content over time. Shock freeze tissue samples with liquid nitrogen or dry ice and store them at -80°C. Alternatively, use stabilizing reagents such as RNAlater to protect the gDNA and enable storage for longer periods of time at 4°C or -20°C.
    • Cut starting material to the smallest possible pieces or grind with liquid nitrogen. In large tissue pieces, nucleases will degrade the DNA before the Proteinase K can lyse the tissue and release the DNA.
    • Organ tissues like pancreas, intestine, kidney and liver have a very high nuclease content. They should be treated with extreme care (see &lsquoSample not stored properly&rsquo section above) to prevent DNA degradation. Keep frozen and on ice during sample preparation.
    • Fresh (unfrozen) whole blood should not be older than a week. Older samples will show a progressive amount of DNA degradation and loss of yield.
    • Thawing frozen blood samples releases DNase, causing degradation. Keep frozen blood samples frozen and add enzymes and lysis buffer directly to the frozen samples. Start lysis right away and let the samples thaw upon lysis incubation.

    Guanidine salt was carried over into the eluate:

    The binding buffer contains guanidine thiocyanate (GTC), which shows a very strong absorbance at 220&ndash230 nm.

    The most common way that salt is introduced into the eluate is by allowing the buffer/lysate mixture to contact the upper column area.

      When transferring the lysate/binding buffer mix, avoid touching the upper column area with the pipet tip always pipet carefully onto the silica membrane.


    شاهد الفيديو: ما حكم البصمة الوراثيه الشيخ د. عثمان الخميس (قد 2022).


تعليقات:

  1. Errapel

    انت مخطئ. دعنا نناقش. أرسل لي بريدًا إلكترونيًا إلى PM ، سنتحدث.

  2. Yeeshai

    واكر ، عبارتك ممتازة بكل بساطة

  3. Delrick

    يمكنك التحدث حول هذا الموضوع لفترة طويلة.

  4. Pancho

    إنه رائع ، قطعة مفيدة



اكتب رسالة