معلومة

10.5: معالجة الحمض النووي الريبوزي في نوى حقيقيات النوى - علم الأحياء

10.5: معالجة الحمض النووي الريبوزي في نوى حقيقيات النوى - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

في معظم حقيقيات النوى ، يقوم جين الرنا الريباسي الكبير في معظم حقيقيات النوى بنسخ نسخة سليفة 45 ثانية تحتوي (من الأقصر إلى الأطول) 5.8S rRNA و 18SrRNA و 28S rRNA. يرمز حرف "S" إلى Svedberg ، عالم الكيمياء الحيوية الذي طور سرعة الترسيب تنبيذ فائق تقنية لفصل الجزيئات مثل الحمض النووي الريبي حسب الحجم. كلما زادت قيمة S ، زاد حجم الجزيء وبالتالي زادت سرعة تحركه عبر تدرج السكر اللزج أثناء الطرد المركزي. RNA Polymerase I ينسخ 45S rRNAs (preRNAs) من وحدات نسخ كبيرة متعددة في الجينوم (كما هو موضح أدناه).

تتم معالجة 45S pre-rRNA عن طريق الانقسام. يمكن توقع النسخ العديدة (200-400!) من الجين 45S في الخلايا حقيقية النواة ، نظرًا لأن تصنيع البروتينات (وبالتالي الريبوسومات) سيكون نشاطًا خلويًا مستهلكًا بالكامل. في البشر ، يتم توزيع جينات 45S (45S rDNA) بين خمسة كروموسومات acrocentric (تلك التي تحتوي على centromere قريب جدًا من أحد طرفي الكروموسوم). معبأة 45S rDNA في الكروموسومات في النواة داخل النوى.

نظرًا لوجود هذه الجينات في العديد من النسخ ومنظمة في منطقة معينة من الكروماتين ، فمن الممكن تصور النسخ 45S قيد التقدم في الصور المجهرية الإلكترونية مثل تلك الموجودة أدناه.

المصطلح مصباح جاء من شكل الجينات 45S في عملية النسخ ؛ تبدو الرناوات الممتدة من قالب الحمض النووي وكأنها فرشاة قديمة الطراز تُستخدم لتنظيف مدخنة مصباح الكيروسين.

نسخ الجينات المتعددة ترميز 5S rRNAs. ومع ذلك ، على عكس الجينات 45S rRNA ، قد ينتشر جين 5S rRNA بين العديد من الكروموسومات (سبعة في نيوروسبورا كراسا، قالب الخبز). أو في حالة البشر ، يتم توزيع نسخ الجين 5S RNA على طول الكروموسوم 1. يتم نسخ جينات 5S rRNA بواسطة RNA polymerase III مع الحد الأدنى من المعالجة اللاحقة للنسخ. كما لوحظ بالفعل ، فإن مروجي جينات 5S موجودون داخل الجزء المنسوخ من الجينات ، بدلاً من المنبع لوحدات النسخ 5S الخاصة بهم.


10.5: معالجة الحمض النووي الريبوزي في نوى حقيقيات النوى - علم الأحياء

على الرغم من المعرفة المتزايدة حول وظيفة الريبوسوم وهيكله وكيف تتجمع الوحدات الفرعية الريبوسومية في المختبر في البكتيريا ، فإن الدور الحي للعديد من بروتينات الريبوسوم يظل غامضًا في كل من الكائنات الأولية وحقيقيات النوى. كشف تحليلنا المنهجي لبروتينات ريبوسوم الخميرة (بروتينات r) للوحدة الفرعية الصغيرة أن معظم بروتينات r حقيقية النواة تؤدي أدوارًا مختلفة في تكوين الريبوسوم الحيوي ، مما يجعلها لا غنى عنها للنمو. تتحكم بروتينات r المختلفة في خطوات متميزة من معالجة الرنا الريباسي النووي والهيولي لما قبل 18S ، وبالتالي تضمن أن الريبوسومات المجمعة بشكل صحيح فقط هي التي تشارك في الترجمة. كشف التحليل المقارن لمقايسات النضج الديناميكي والمستقر عن أن العديد من بروتينات r مطلوبة للتصدير النووي الفعال لما قبل 18S rRNA ، مما يشير إلى أنها تشكل منصة تفاعل مع آلية التصدير. في المقابل ، فإن وجود بروتينات r أخرى مطلوب بشكل أساسي قبل بدء التصدير النووي. ترسم دراساتنا علاقة بين التجميع في المختبر ، والتوطين الهيكلي ، ووظيفة البروتينات في الجسم الحي.


خيارات الوصول

احصل على حق الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

جميع الأسعار أسعار صافي.
سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

جميع الأسعار أسعار صافي.


المواد والأساليب

الأجسام المضادة الأولية والمجسات

تم استخدام الأجسام المضادة مع الخصائص التالية: مصل المناعة الذاتية البشري الموجه ضد الفيبريلارين (Gautier et al. 1994) مصل الأرانب متعدد النسيلة الموجه ضد النوكليولين البشري (هدية لطيفة من C. Faucher ، LBME ، CNRS ، تولوز ، فرنسا) ثقافة وحيدة النسيلة طاف التعرف على X. laevis البروتين النووي NO38 ، وهو متماثل للبروتين النووي للثدييات B23 (No-63 Schmidt-Zachmann et al. 1987) وسوائل استسقاء الفأر أحادية النسيلة التي تتعرف على X. laevis مجمع RNA pol I (هدية طيبة من M. Schmidt-Zachmann ، DKFZ ، هايدلبرغ ، ألمانيا).

يتوافق مسبار rDNA للكشف عن الرنا الريباسي مع الكل X. laevis يتم إدخال وحدة النسخ الريبوزومي في pBR322 (استنساخ pXcr7 ، يرجى تقديمه من قبل F. Amaldi ، Universito Tor Vergata ، روما ، إيطاليا). تم تصنيف مجسات الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل باستخدام مجموعة ترجمة النيك (GIBCO BRL) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة باستخدام biotin-14-dCTP. مجسات الكشف عن U3 و U8 هي أليغنوكليوتيدات مكملة لثلاث مناطق (المواضع 9-31 63-85 و101-122 ل U3 و 33-60 72-93 و107-136 ل U8). تم تصنيفها باستخدام biotin-14-dCTP باستخدام 3 & # x02032 ترانسفيراز الطرفي (Boehringer Mannheim).

تجميع النوى في مستخلص بيض X. laevis

تم الحصول على البيض من الإناث X. laevis وتم تحضير مستخلصات البيض منخفضة السرعة بين الأطوار كما هو موصوف سابقًا (Almouzni 1998). يمكن الحفاظ على هذا المستخلص الخام على الجليد لمدة 4 ساعات دون تحلل ملموس لنشاط التجميع النووي. منزوع الغشاء X. laevis تم تحضير نوى الحيوانات المنوية وتنفيلها باستخدام ليسوليسيثين (Almouzni 1998). للتجميع النووي ، تمت إضافة 10 5 رؤوس حيوانات منوية إلى 100 & # x003bcl من مستخلص البيض والحفاظ عليها عند 23 & # x000b0C. بعد 45 دقيقة ، عندما حدث التفكيك الأقصى للنواة ، تمت معالجة النوى من أجل المجهر الضوئي والإلكتروني.

تحضير النوى الجنينية من X. laevis

تم إنتاج الأجنة عن طريق الإخصاب في المختبر (Almouzni و Wolffe 1995) وتم السماح لها بالتطور عند 23 & # x000b0C في محلول Barth المعدل 0.1 & # x000d7 (Gurdon and Wickens 1983) لأوقات مختلفة بعد الإخصاب. عند درجة الحرارة هذه ، تم جمع الأجنة في المراحل التالية: الأريمة المبكرة ، 6 ساعات بعد الإخصاب (المرحلة 8) midblastula ، 7 ساعات بعد الإخصاب (المرحلة 8.5) الأريمة المتأخرة ، 9 ساعات بعد الإخصاب (المرحلة 9) المعدة المبكرة ، 10 ساعات بعد الإخصاب الإخصاب (المرحلة 10) معدة ، 11 ساعة بعد الإخصاب (المرحلة 10.5) والمعدة المتأخرة ، 13 ساعة بعد الإخصاب (المرحلة 12) كما هو محدد بواسطة Nieuwkoop and Faber 1994. في بعض الحالات ، تمت إضافة الأكتينوميسين D لمنع بداية النسخ أثناء تطوير. نظرًا لأن تفكك البلاستوميرات كان مطلوبًا للوصول إلى الأدوية ، تم نقل الأجنة بعد 3 ساعات و 30 دقيقة من الإخصاب إلى Ca 2+ - و Mg 2+ - وسط خالٍ يحتوي على 88 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 1 ملي مول كلوريد ، 2.4 ملي مولار NaHCO3، و 7.5 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.6 ، كما هو موصوف سابقًا (دوفال وآخرون 1990). تمت إضافة Actinomycin D (شركة Sigma Chemical) إلى وسط الحضانة بالتركيز المطلوب من محلول مخزون عند 5 مجم / مل. كعنصر تحكم ، تم تحضين الأجنة في Ca 2+ - و Mg 2+ - وسط خالٍ من الأكتينوميسين د. Chemical Co.) كمثبطات للنسخ في X. laevis الأجنة. عندما تمت إضافة & # x003b1-amanitin إلى وسط الحضانة ، فإنه لم يخترق في blastomeres المنفصلة وكان لـ DRB تأثير ضار على انقسام الأجنة. تم تحضير معلقات النوى الجنينية من الأجنة المأخوذة في أوقات محددة بعد الإخصاب كما هو موصوف (Verheggen et al.1998).

التألق المناعي والتهجين الموقعي

تم إصلاح النوى المعاد تشكيلها في المختبر ومعلقات النوى الجنينية مع 1 حجم 4 ٪ بارافورمالدهيد في برنامج تلفزيوني. يمكن تخزين تعليق النوى الثابتة عدة أسابيع عند 4 & # x000b0C. من أجل التألق المناعي ودراسات التهجين في الموقع ، تم طرد النوى على ساترة. بعد الغسل ، تم تثبيت الأغطية المختلفة لاحقًا في الميثانول ، وتم تنفيسها في 0.1 ٪ Triton X-100 (IBI) في برنامج تلفزيوني ، وشطفها.

من أجل وضع العلامات المناعية ، تم تحضين الأغطية بالأجسام المضادة الأولية ، متبوعة بالأجسام المضادة الثانوية المقترنة بـ FITC أو TRITC (مختبرات IgG Jackson المناعية للأرانب المضادة للإنسان أو المضادة للفأر أو الأرانب) أو الأجسام المضادة للفأر المقترنة cy3 (Sigma Chemical Co.) ، مغسول ، مضاد للبقع بـ DAPI (4 & # x02032-6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride Polysciences ، Inc.) ومثبت بمحلول مضاد للبهتان (Citifluor).

تم إجراء تهجين في الموقع للـ rRNAs بعد الوسم المناعي كما هو موصوف سابقًا (Verheggen et al.1998). يحتوي خليط تهجين الرنا الريباسي على 40٪ فورماميد (GIBCO BRL) ، و 10٪ (وزن / حجم) كبريتات ديكستران (شركة سيغما الكيميائية) ، و 50 نانوغرام / & # x003bcl ، وخصي السلمون الصوتي DNA (شركة سيجما للكيماويات) ، و rDNA المكوّن من حمض نووي. المجس المخفف إلى تركيز نهائي قدره 1 نانوغرام / & # x003bcl في 2 & # x000d7 SSC. للكشف عن U3 و U8 ، احتوى خليط التهجين على 30٪ فورماميد ، و 10٪ (وزن / حجم) كبريتات ديكستران ، و 50 نانوغرام / & # x003bcl ، خصى السلمون الصوتية ، و 3 & # x02032 قليل النوكليوتيدات المكملة ل U3 و U8 مخفف إلى تركيز نهائي قدره 2 نانوغرام / & # x003bcl في 2 & # x000d7 SSC. كعنصر تحكم لاكتشاف الحمض النووي الريبي ، سبق التهجين بهضم RNase كما هو موصوف (Highett et al. 1993).

المجهر الإلكتروني

تم إصلاح النوى المعاد تشكيلها في المختبر مع 2 ٪ من الجلوتارالدهيد في محلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 مولار ، الرقم الهيدروجيني 7.4 ، عند 4 & # x000b0 درجة مئوية. تم غسلها في محلول كاكوديلاتي ، بعد التثبيت في 1٪ OsO4 لمدة ساعة واحدة عند 4 & # x000b0C ، مجففة في الكحول ، ومدمجة في Epon 812. تمت مقارنة المقاطع الرقيقة للغاية مع أسيتات اليورانيل لمدة ساعة وسيترات الرصاص لمدة دقيقتين ، وتم فحصها في مجهر إلكتروني Philips EM412.

في فحص النسخ الموقع

لتحديد مواقع النسخ ، تم دمج 5-bromouridine-5 & # x02032-triphosphate (Br-UTP) في النوى الجنينية كما هو موصوف سابقًا (Verheggen et al. 1998). باختصار ، تم نفاذية النوى غير الثابتة واحتضانها في مخزن النسخ المؤقت في وجود Br-UTP لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (Masson et al. 1996). قبل الوسم المناعي ، تم إصلاح النوى بنسبة 2 ٪ بارافورمالدهيد في برنامج تلفزيوني وتم تنفيسها باستخدام 0.1 ٪ Triton X-100. تم استخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة & # x02013Br-deoxyuridine والذي يتعرف أيضًا على Br-UTP (Boehringer Mannheim). تم استخدام الأجسام المضادة البشرية المضادة للليفريلارين كواسم نووي. تم الحصول على إشارات النسخ والفيبريلارين باستخدام أضداد الماعز المترافق مع FITC & # x02013mouse و TRITC-conjugated goat anti & # x02013human Antibodies (Jackson ImmunoResearch Laboratories) ، على التوالي.

المجهر الضوئي

تم التقاط الصور باستخدام مجهر Leica epifluorescence المجهز بكاميرا جهاز اقتران الشحن المبرد إلكترونيًا (CCD) (لايكا). تم جمع الصور ذات التدرج الرمادي بشكل منفصل مع مجموعات المرشحات لـ FITC و rhodamine / TRITC باستخدام عدسة مغمورة بالزيت (63 & # x000d7 ، NA I.4 plan Apochromat). تم تلوين الصور ذات التدرج الرمادي ودمجها باستخدام برنامج Adobe Photoshop 5.0.


تسلسل الحمض النووي الريبي

5.2 المشهد النسخي: الحمض النووي الريبي التنظيمي

قد يؤدي التسلسل العميق المستهدف إلى التحديد الدقيق لجزيئات الحمض النووي الريبي الصغيرة والكبيرة من مواقع جينومية مختلفة في أنواع خلايا مختلفة. إن تحديد الأنواع المختلفة من جزيئات الحمض النووي الريبي يضفي درجة عالية من التعقيد على النسخ. يتم تمثيل المشهد النسخي للثدييات من خلال الجينات التي تعبر عن فئات مختلفة من جزيئات الحمض النووي الريبي ، بما في ذلك RNAs الريبوزومي ، ونقل RNAs ، ورسول RNAs ، و RNAs النووية الصغيرة ، و RNAs النووية الصغيرة ، و RNAs الطويلة غير المشفرة ، و microRNAs ، و PIWI المتفاعلة RNAs ، والمحفز القصير المرتبط RNAs ، وبدء النسخ RNAs ، و RNAs موقع لصق (الشكل 5.1).

الشكل 5.1. تمثيل رسومي للـ RNA المشفر وغير المشفر على مشهد نصي للثدييات.

تاريخيًا ، كانت جزيئات الحمض النووي الريبي تعتبر جزيئات بسيطة ومتوسطة بين الجينات والبروتينات. يعتبر Messenger RNA أو mRNA أكثر جزيئات RNA دراسة على نطاق واسع. يعمل كقالب انتقالي ويتم ترجمته مباشرة إلى بروتينات عبر الكود الجيني. يعمل نقل RNA (tRNA) كجزيء محول ، بينما يوفر RNA الريباسي (rRNA ، المعبر عنه بشكل أساسي في جميع الخلايا) منصة أثناء تخليق البروتين. أظهرت الدراسات التي أجريت على نطاق الجينوم وجود رنا تنظيمي خارج الحدود المعروفة للجينات المشفرة للبروتين التي تتحكم في نشأة الإنسان.

تم تحديد فئات جديدة من الحمض النووي الريبي الصغير المشترك (snRNAs) في وقت لاحق في النواة عن طريق التجزئة البيوكيميائية. يتم تحديد العديد من هذه الحمض النووي الريبي كجزء من مجمعات البروتينوكليوبروتين (RNP). يتم التعرف على إحدى فئات snRNAs على أنها جزيئات RNAs spliceosomal التي تلعب دورًا مركزيًا في تضفير الحمض النووي الريبي (RNA). تتضمن هذه snRNAs U2 و U4 و U5 و U6 ومن المعروف أنها تشارك في تفاعلات RNA-RNA و RNA- البروتين. التعرف على موقع لصق 5ʹ ونقطة الفرع بواسطة U1 و U2 على التوالي ، متبوعًا بتجنيد U4 و U5 و U6 ، وإزاحة U1 والتفاعل مع U2 (عبر U6) ، بالإضافة إلى مواقع 5ʹ و 3ʹsplice (من خلال U5) هي بعض الوظائف الرئيسية أثناء تجميع ووظائف spliceosomes. تم تحديد U11 و U12 و U4atac و U6atac على أنها أقل وفرة من snRNAs ، وإلى جانب U5 لها دور في لصق متغير "ثانوي" يسمى U12-type (Wang and Burge ، 2008). تم تحديد الحمض النووي الريبي النووي الصغير (snoRNAs) المترجمة إلى النواة لتعديل الرنا الريباسي الكيميائي ، والرنا المرسال ، و snRNAs كيميائيًا. التعديلات الكيميائية مطلوبة أساسًا لنضج الحمض الريبي النووي النقال و الرنا المرسال وأثناء الربط قبل الرنا المرسال (يتطلب تعديل U2 snRNA) ، وبالتالي الحفاظ على وظائف الريبوسوم والخلوية الطبيعية. يتم فحص فئة snoRNAs ، مربع H / ACA فئة فرعية ، لتوجيه pseudouridylation ، في حين أن الفئة الفرعية للمربع C / D معروفة بتوجيه مثيلة rRNAs و tRNAs و snRNAs (Henras et al. ، 2004 Meier ، 2005). يؤدي تعطيل وظائف snoRNAs إلى فقدان معالجة الرنا الريباسي 5.8S و 18S و 28S (أو 25S في النباتات). تم التعرف على جزيئات الحمض النووي الريبوزي الأخرى المعروفة باسم الحمض النووي الريبي الصغير الخاص بجسم الكاجال (scaRNAs) لتكون موجودة في الهياكل دون النووية تسمى أجسام Cajal المعروفة بمعالجة الحمض النووي الريبي التيلوميراز.

فئة أخرى من الرناوات الصغيرة ، والمعروفة باسم microRNAs (miRNAs) من 20-24 نيوكليوتيد في الطول ، تمنع الترجمة وتسريع تحلل الرنا المرسال المستهدف عن طريق تكوين الاقتران الأساسي غير الكامل مع 3ʹUTRs من الرنا المرسال المستهدف. يمكن لهذه الجزيئات الدقيقة تنظيم عدد كبير من الرنا المرسال المستهدفة ، وبالمثل ، تحتوي العديد من الرنا المرسال على مواقع مستهدفة لعدد كبير من الجزيئات الدقيقة ، وبالتالي تتحكم / تنظم العديد من العمليات الفسيولوجية والتطورية والمرضية (جارج ، 2015). مثل miRNA ، فإن الرنا الصغير المتداخل (siRNAs) عبارة عن رنا غير مشفر مع نفس الحجم من الرنا المرسال. تنظم كلتا فئتي الجزيئات بعد النسخ التعبير الجيني عن طريق إسكات الرنا المرسال المستهدف. ومع ذلك ، فإن siRNAs محددة مع مرنا هدف واحد ، في حين أن miRNAs لها أهداف متعددة. تشارك Drosha و Dicer والعديد من بروتينات الأرجونوت (AGO) ، الجينات والإنزيمات الرئيسية في التكوّن الحيوي لسلائف الرنا المزدوج الجديلة. يتم التوسط في انشقاق سلائف الرنا المزدوج الجديلة وتصديرها من النواة إلى السيتوبلازم بواسطة Drosha و Exportin-5 ، متبوعًا بمعالجتها الإضافية بواسطة Dicer إلى شقوق RNA صغيرة مزدوجة الشريطة. يتم تحميل خيط واحد من الرنا المزدوج الجديلة (21-24 نيوكليوتيد) في بروتينات AGO لمركب الإسكات الناجم عن الحمض النووي الريبي (RISC). يتم توجيه RISC بواسطة خيوط RNA الصغيرة لأهداف RNA التكميلية من أجل قمعه / زعزعة استقراره الترجمي (Zeng et al.، 2003 Garg، 2015). ترتبط الطبقة الفرعية من بروتينات AGO المسماة PIWI (توجد غالبًا في النواة) والبروتينات الشبيهة بـ PIWI بفئة أخرى من RNAs تُعرف باسم RNAs المتفاعلة PIWI (piRNAs). piRNAs هي رنا صغيرة (26-30 نيوكليوتيد) وتلعب دورًا تنظيميًا مهمًا عن طريق إسكات الترانسبوزونات في الخلايا الجرثومية (Girard et al.، 2006). RNAs لبدء النسخ (tiRNAs) و RNAs في موقع لصق (spliRNAs) هي 17-18 نيوكليوتيدات في الطول وتوجد في الحيوانات ولكن ليس في النباتات. ترتبط هذه الفئات من RNAs الصغيرة و tiRNAs و spliRNAs ببدء مواقع النسخ واللصق ، على التوالي. لم يتم تحديد أصلها ووظائفها تمامًا ، ولكن يُقترح أن تلعب دورًا في تعديل موضع الكروماتين لعامل ربط CCCTC (CTCF) وتحديد موضع الجسيمات النووية. تشتمل الفئات الأخرى من RNAs الأقل تميزًا على النصوص المنبثقة للمروج (PROMPTS) ، والـ RNAs القصيرة المرتبطة بالمروج (PASRs) ، و RNAs المرتبطة بموقع بدء النسخ (TSSa-RNAs) ، والتي قد تلعب دورًا في إسكات الجين النسخي الموجه من RNA (Kapranov) وآخرون ، 2007 Han et al. ، 2007).

فئة أخرى جديرة بالملاحظة من RNAs الطويلة غير المشفرة (lncRNAs) هي RNAs غير مشفرة للبروتين. وهي غير بولياديدينيلات ، يبلغ طولها حوالي 200 نيوكليوتيد وتقع بين الجينات (تُعرف أيضًا باسم RNA كبير بين الجينات غير المشفر [lincRNA]) ، و intronic ومضاد للحساسية للجينات المشفرة للبروتين (ميرسر وآخرون ، 2009). تُظهر الروابط التي تعبر عن lncRNAs بنية كروماتين إرشادية ، وحفظ المروج ، والتنظيم بواسطة عوامل التشكل والنسخ التقليدية (Johnsson et al. ، 2014). إعادة تشكيل الكروماتين ، وتنظيم العمليات اللاجينية (تعويض جرعة كروموسوم X ، والطبع الأبوي) ، والتحكم في النسخ ، والمعالجة اللاحقة للترجمة هي الوظائف المهمة الموكلة إليهم. تحدد الدراسات المستندة إلى ثقافة الخلية وظائفها في تطور الشبكية والكريات الحمر ، وتمايز البشرة ، وتطور الثدي ، وتنظيم موت الخلايا المبرمج والنقائل ، والعديد من العمليات الأخرى (Conesa et al. ، 2016).

النشاف الشمالي و PCR الكمي هما طريقتان منخفضتان للإنتاجية ويقتصران على تحديد نسخة واحدة. أساليب ميكروأري القائمة على التهجين هي على الرغم من الإنتاجية العالية والتقنيات الأرخص للتقدير الكمي على مستوى الجينوم للتعبير الجيني ولكن لها عدد من القيود ، والتي تشمل (1) دقة محدودة نحو التقدير الكمي للجينات المعبر عنها بشكل منخفض والتي يتم التعبير عنها بدرجة عالية جدًا ، (2) قبل معلومات عن التسلسلات التي يتم استجوابها ، و (3) ظهور القطع الأثرية للتهجين المتقاطع أثناء تحليل التسلسلات المتشابهة للغاية (Shendure ، 2008). من ناحية أخرى ، توفر الطرق المستندة إلى التسلسل تحديدًا مباشرًا لتسلسل النص. يعد إنشاء مكتبات علامة التسلسل المعبر عنها (EST) وطريقة إنهاء سلسلة dideoxy لتسلسل Sanger للحمض النووي التكميلي (cDNA) طريقة إنتاجية منخفضة لتقدير النصوص. الأساليب القائمة على العلامات مثل التحليل التسلسلي للتعبير الجيني (SAGE) والتعبير الجيني لتحليل الغطاء (CAGE) تحدد عددًا من التسلسلات الموسومة وتزيد من الدقة ، ومع ذلك ، فإنها تفشل في تحديد التعبير عن الأشكال الإسوية لصق. تسلسل الجيل التالي (NGS) هو تسلسل عالي الإنتاجية لـ cDNA ، ويوفر تحليلاً كاملاً لـ RNA وأحدث ثورة في علم النسخ (Wang et al. ، 2009).


أساليب

خطوط الخلية

الورم الأرومي النخاعي البشري (DAOY HTB-186 ATCC) ، وسرطان الغدة الرئوية البشري (A549 هدية من R. Randall ، جامعة سانت أندروز ، المملكة المتحدة) ، و Vero (مركز بيولوجيا الكلى القرد الأخضر ، CAS ، CZ) نمت في وسط منخفض الجلوكوز DMEM مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، 1٪ مضادات حيوية - مضادات الفطريات (أمفوتريسين ب 0.25 ميكروغرام / مل ، بنسلين G 100 وحدة / مل ، ستربتومايسين 100 ميكروغرام / مل) ، و 1٪ L- ألانيل-ل - الجلوتامين. يُشتق خط خلية داوي HTB-186 من الورم الأرومي النخاعي المخيخي المتورم لذكر قوقازي يبلغ من العمر 4 سنوات [36]. A549s مشتق من نسيج سرطاني بالرئة (الخلايا الظهارية القاعدية السنخية) لرجل قوقازي يبلغ من العمر 58 عامًا [37]. تُشتق خلايا فيرو من الخلايا الظهارية للكلية من القرد الأخضر الأفريقي (Cercopithecus aethiops). نمت خلايا PS (مستقرة الكلى الخنازير) في وسط L15 مع 3 ٪ من مصل العجل حديثي الولادة (NCS) ، ومضادات حيوية ومضادات حيوية بنسبة 1 ٪ ، و 1 ٪ L-alanyl-L-glutamine [38]. نما خط خلايا ساركوما العظام البشرية MG-63 (Sigma-Aldrich) في وسط RPMI 1640 مكملًا بنسبة 10 ٪ FBS ، و 1 ٪ من المضادات الحيوية - مضادات الفطريات ، و 1 ٪ L- ألانيل- L- الجلوتامين ، و 50 نانومتر β- مركابتوإيثانول. تم استكشافها من رجل قوقازي يبلغ من العمر 14 عامًا [39].

بالنسبة لتجارب وضع العلامات الأيضية ، نمت جميع خطوط الخلايا في وسط RPMI 1640 مكملًا بـ 10 ٪ FBS ، و 1 ٪ من المضادات الحيوية - مضادات الفطريات ، و 1 ٪ L- ألانيل- L- الجلوتامين ، و 50 نانومتر β-مركابتوإيثانول. نمت جميع خطوط الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون2 باستثناء خلايا PS (37 درجة مئوية بدون CO إضافي2).

تعداء والبلازميدات

بولي جيت في المختبر تم استخدام كاشف تعداء (SignaGen # SL100688) لترنسفكأيشن. تم تنفيذ الإجراء وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. بالنسبة لـ GFP و رينيلا تم استخدام تعبير luciferase ، نواقل تعبير الثدييات phMGFP (Promega) و pRL-CMV (Promega) ، على التوالي. كان ناقل تعبير wt viperin للثدييات هدية لطيفة من Lisa F.P. Ng (شبكة علم المناعة في سنغافورة ، وكالة العلوم والتكنولوجيا والبحوث (A * STAR) ، سنغافورة) ، حيث يتم نسخ الجين viperin مع علامة C-terminal c-myc تحت سيطرة محفز CMV [40].

الفيروسات والعدوى

تم استخدام ممثلين من النوع الفرعي TBEV الأوروبي الغربي بدرجات مختلفة من الضراوة - متوسط ​​(Neudoerfl) وشديد (Hypr). تختلف كلتا السلالتين في تسلسل الترميز الخاص بهما عن طريق 12 بديلاً فقط للأحماض الأمينية غير المحافظة [41] ، وفي طول وبنية 3´UTR [42]. عندما أصيبت الفئران محيطيًا ، أظهرت سلالة Hypr غزوًا عصبيًا واضحًا وتسببت في بقاء أقصر من سلالة Neudoerfl [41]. تم تقديم سلالة TBEV ذات الممر المنخفض ، Neudoerfl (الممر الرابع في أدمغة الفئران الرضيعة رقم انضمام GenBank رقم TEU27495) من قبل الأستاذ ف. هاينز (جامعة فيينا الطبية ، النمسا) [43]. الممر المنخفض سلالة TBEV ، Hypr (المقطع الرابع في أدمغة الفئران الرضيعة GenBank accession no. TEU39292) ، متاح في معهد علم الطفيليات ، مركز الأحياء في CAS ، تشيسكي بوديوفيتش ، جمهورية التشيك [44]. تم التعامل مع الفيروسات في ظل ظروف السلامة الأحيائية المستوى 3.

تمت إضافة TBEV إلى الخلايا بعد يوم واحد من البذر. تم تحضين الخلايا بعد ذلك لمدة ساعتين ، وغسلها باستخدام PBS ، وأخيرًا تمت إضافة وسط جديد مُسخَّن مسبقًا. تم استخدام تعليق الدماغ من الفئران الرضيعة غير المصابة كعنصر تحكم سلبي.

معايرة الفيروس

تم تحديد العدادات الفيروسية بواسطة فحص البلاك كما هو موصوف [45] ، مع تعديلات طفيفة. باختصار ، نمت الطبقات الأحادية لخلايا PS (9 × 10 4 خلايا لكل بئر) في 24 طبقًا جيدًا وحضنت بتخفيفات تسلسلية 10x من العينات المعدية لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية. تم بعد ذلك تغطية العينات بمزيج تراكب 1: 1 (ت / ت) (كاربوكسي ميثيل السليلوز ووسط 2x L15 بما في ذلك 6٪ NCS ، 2٪ مضادات حيوية - مضادات الفطريات ، و 2٪ L- جلوتامين). بعد خمسة أيام ، تمت إزالة الوسط مع التراكب ، وغسل الخلايا بمحلول فسيولوجي ، ثم يتم تثبيتها وصبغها (0.1٪ نفثالين أسود في محلول حمض أسيتيك بنسبة 6٪) لمدة 45 دقيقة. تم حساب اللويحات الناتجة عن الفيروسات ، وتم تحديد العيار على أنها PFU / ml.

الأجسام المضادة والكواشف

تم استخدام الأجسام المضادة الأولية التالية: الأجسام المضادة متعددة النسيلة المضادة لـ TBEV C (يتم إنتاجها داخليًا) ، والأجسام المضادة متعددة النسيلة المضادة لـ TBEV NS3 (هدية كريمة من دكتور إم. علمي # PA5-22281) ، جسم مضاد لـ GAPDH [EPR16891] (Abcam # ab181602) ، جسم مضاد أحادي النسيلة لفأر الفايبر (Hycult Biotech # HM1016) ، جسم مضاد أحادي النسيلة NPM1 FC-61991 (Thermo Fisher Scientific # MA1-1560) ، والجسم المضاد لـ POLR1A (Abcam # ab222065). تم استخدام الأجسام المضادة الثانوية / الثانوية التالية: HRP Goat Anti-Guinea Pig (Novex # A18769) ، HRP Rabbit Anti-Chicken IgY (H + L) الأجسام المضادة الثانوية (Thermo Fisher Scientific # A16130) ، HRP Horse Anti-Mouse IgG Antibody ( VectorLabs # PI-2000) ، HRP Goat Anti-Rabbit IgG Antibody (VectorLabs # PI-1000) ، الأجسام المضادة Biotinylated Anti-Streptavidin (VectorLabs # BA-0500) ، Streptavidin المترافق مع AP (VectorLabs # SA-5100) ، Streptavidin-DyLabidin 549 (VectorLabs Cat # SA-5549) ، Goat Anti-Rabbit IgG-DyLight 594 (Abcam # ab96897) ، Goat Anti-Guinea Pig DyLight 594 (Abcam # ab150188) ، و Goat Anti-Chicken IgY H & ampL-DyLight 488 (Abcam # ab96947).

تم استخدام L-azidohomoalanine (انقر فوق أدوات الكيمياء # 1066-25) و 5-ethynyl-uridine (انقر فوق أدوات الكيمياء # 1261-25) لوضع العلامات الأيضية للبروتينات الوليدة أو RNA ، على التوالي. تم استخدام Biotin-PEG4-Alkyne (انقر فوق أدوات الكيمياء # TA105-25) و Biotin Picolyl Azide (انقر فوق أدوات الكيمياء # 1167-25) للكشف اللاحق عن L-azidohomoalanine أو 5-ethynyl-uridine على التوالي. تم شراء Cycloheximide من Sigma-Aldrich (# 01810-1G).

تحليل التدفق الخلوي

تم زرع خلايا DAOY قبل يوم واحد من الإصابة في اللوحة المكونة من 12 بئراً بكثافة 2.5 × 10 5 خلية / بئر. في الفترات الزمنية المحددة بعد الإصابة بـ TBEV ، تم غسل الخلايا ببرنامج تلفزيوني ، وتريبسين ، وتثبيتها بنسبة 4 ٪ بارافورمالدهيد في برنامج تلفزيوني (روث). بعد النفاذية (0.1 ٪ Triton X-100) ، تم تلوين الخلايا باستخدام الأجسام المضادة الثانوية لخنزير غينيا (تخفيف 1: 1500) والأجسام المضادة الثانوية DyLight 594 (تخفيف 1: 500) لخنزير غينيا. تم إجراء قياس التدفق الخلوي على مقياس خلوي FACS Canto II وتم تحليل البيانات باستخدام برنامج FACS DIVA الإصدار 5.0 (BD Biosciences).

عزل الحمض النووي الريبي

تم عزل الحمض النووي الريبي الخلوي الكلي باستخدام كاشف RNA Blue القائم على Trizol (Top-Bio # R013) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم إذابة كريات الحمض النووي الريبي في الماء المعالج بـ DEPC واستخدمت مباشرة إما في الوقت الحقيقي لـ PCR أو التحليل على هلام تغيير طبيعة الحمض النووي الريبي.

تقدير الرنا الريباسي

تم تحليل كمية وسلامة الرنا الريباسي في مجموع عينات الحمض النووي الريبي باستخدام محلل بيولوجي 2100 باستخدام مجموعة Agilent RNA 6000 Nano (Agilent Technologies # 5067-1511). تم تحديد تركيز كل عينة بطريقة القياس الطيفي قبل قياس المحلل الحيوي وتم تخفيف العينات وفقًا لنسبة عدد الخلايا (كانت التركيزات الناتجة بين 10-20 نانوغرام / ميكرولتر). تم تحميل 1 ميكرولتر من عينات الحمض النووي الريبي المخفف على شريحة Bioanalyzer وتم إجراء الفحص الكهربي وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم تحليل جميع العينات في ثلاث نسخ فنية. تم استخدام 1.2 ٪ من هلام تغيير طبيعة agarose MOPS المخزن مؤقتًا (مع 6.7 ٪ من الفورمالديهايد) لتجزئة إجمالي الحمض النووي الريبي المعزول. تم تصور الحمض النووي الريبي بإضافة صبغة GelRed (Biotium) في الجل. تم قياس الإشارة لاحقًا باستخدام برنامج فيجي.

عينة التوحيد

لاحظنا أن قابلية الخلايا المصابة بـ TBEV Hypr قد تأثرت سلبًا في 36 و 48 ساعة pi. (الشكل 1 د). لذلك ، من أجل تقليل تأثير هذه الظاهرة على بياناتنا ، قررنا التوحيد القياسي في تجاربنا على عدد الخلايا.

أصيبت خلايا DAOY بسلالة TBEV Neudoerfl أو Hypr (وزارة الداخلية 5). (أ) تم تحليل العدادات الفيروسية (المشار إليها في خطوط الاتجاه) التي تم تحديدها بواسطة فحص البلاك على خلايا PS ومعدل الإصابة (المشار إليه في القضبان) التي تم تحديدها بواسطة الكشف عن التدفق الخلوي للخلايا الملطخة بـ TBEV C عند 12 ، 18 ، 24 ، 36 ، 48 ساعات بي يتم عرض ملخص رسومي لثلاث تجارب مستقلة مع القيم المعبر عنها على أنها تعني مع SEM. (ب) تم عزل إجمالي الحمض النووي الريبي في 24 و 48 ساعة في البوصة. والقياس الكمي النسبي qPCR لـ TBEV gRNA باستخدام Δ-cر تم تنفيذ طريقة التطبيع مع رقم الخلية. البيانات هي ملخص لثلاث تجارب مستقلة ويتم التعبير عن القيم في الرسوم البيانية على أنها تعني مع SEM. (C) تم تحديد مستويات بروتينات TBEV NS3 و C في خلايا DAOY المصابة عن طريق التكتل المناعي عند 12 ، 18 ، 24 ، 36 ، 48 ساعة pi. البيانات هي ملخص لثلاث تجارب مستقلة. (D) تم تحديد قابلية بقاء الخلايا المصابة باستخدام كاشف alamarBlue ، في الفترات الزمنية المحددة pi. البيانات هي ملخص لثلاث تجارب مستقلة ويتم التعبير عن القيم على أنها تعني مع SEM ، تم تطبيعها لتزوير الخلايا المصابة.

تم إجراء التطبيع لأرقام الخلايا لتحليلات PCR في الوقت الحقيقي ، والنشاف الغربي ، والنشاف الشمالي ، وتحليلات وضع العلامات الأيضية. لهذا ، أنشأنا طريقة قائمة على الجدوى باستخدام كاشف alamarBlue (Thermo Fisher Scientific # DAL1025). توضح بياناتنا أن قياس الصلاحية يتناسب طرديًا مع رقم الخلية ، وبالتالي فإن هذه الطريقة مناسبة تمامًا للتطبيع مع رقم الخلية (S1 الشكل). تم تنفيذ الإجراء وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. باختصار ، تم غسل الخلايا باستخدام PBS وأضيف وسط نمو جديد مُسخَّن مسبقًا مع كاشف alamarBlue المخفف (نسبة التخفيف 1:10 ت / ت). تم تحضين الخلايا لمدة 2 - 2.5 ساعة وتم قياس مضان المنتج المختزل على قارئ لوحة BioTek (λالسابق = 550 نانومتر λم = 590 نانومتر). تم استخدام وسط النمو مع alamarBlue بدون خلايا كفراغ. تم تحليل جميع العينات في ثلاث نسخ فنية. تم تطبيع متوسط ​​قيم التألق للعينة المعالجة بـ TBEV إلى خلايا التحكم الوهمية ذات الصلة. تم استخدام عامل الجدوى (f) لاحقًا كعامل تطبيع لحساب مدخلات RNA / البروتين بناءً على مدخلات التحكم الوهمية المحددة مسبقًا.

الوقت الحقيقي qPCR

لتحليلات qPCR في الوقت الفعلي ، تم استخدام KAPA SYBR FAST Universal One-Step qRT-PCR Kit وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تمت معالجة البيانات التي تم الحصول عليها عن طريق القياس الكمي النسبي باستخدام دلتا جر (Δ-جر) طريقة تم تعديل كمية الحمض النووي الريبي إلى رقم الخلية بدلاً من cر قيم الجين المرجعي التدبير المنزلي. تمت معالجة جميع العينات باستخدام dsDNase وتم تخفيفها بعد ذلك 5 × في ماء خالٍ من RNAse قبل تحليل PCR في الوقت الفعلي. تم تحليل جميع العينات في ثلاث نسخ فنية. يمكن العثور على قائمة الاشعال المستخدمة في الجدول S1.

النشاف الغربي

تم غسل الخلايا باستخدام محلول PBS و RIPA (25 ملي مولار Tris-HCl pH 7.6 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 1٪ NP-40 ، 0.1٪ SDS ، 1٪ ديوكسيكولات الصوديوم) مع مثبطات الأنزيم البروتيني (Thermo Fisher Scientific # 78430). تم إجراء تحلل الخلية لمدة 15 دقيقة على الجليد أثناء رجها برفق. تم فصل محلولات البروتين المصفى والمطهر في المخزن المؤقت RIPA على 12 ٪ من المواد الهلامية بولي أكريلاميد التي تغير طبيعة المواد الهلامية وتم مسحها على أغشية PVDF. تم تطبيع كمية البروتينات مع رقم الخلية. تم حظر الأغشية (5٪ لبن منزوع الدسم في PBS-T) واحتضانها بأجسام مضادة أولية وثانوية وثالثية أيضًا بين كل خطوة تلطيخ ، وغُسلت الأغشية ثلاث مرات في PBS-T. كانت الأجسام المضادة الأولية المستخدمة هي مضادات C لخنزير غينيا (تم إنتاجه داخليًا 1: 1500) ، ومضاد الدجاج لـ NS3 (مختبر M. علمي 1: 500) ، مضاد للأفعى (Hycult Biotech 1: 500). كانت الأجسام المضادة الثانوية / الثالثة المستخدمة هي الماعز المضادة للأرانب HRP (VectorLabs 1: 1000) ، والأرانب المضادة للدجاج HRP (Thermo Fisher Scientific 1: 1000) ، و HRP ضد الفأر (VectorLabs 1: 1000). تم تطوير إشارة الإشعاع الكيميائي باستخدام مجموعة Novex CDP-Star للفوسفاتيز القلوي (Thermo Fisher Scientific) أو مجموعة WesternBright Quantum لبيروكسيداز الفجل (Advansta # K-12042-D20). تم قياس الإشارة لاحقًا باستخدام برنامج فيجي [46]. لتجريد الأجسام المضادة ، تم تحضين الأغشية بمحلول تجريد (62.5 ملي مولار تريس هيدروكلوريد الأس الهيدروجيني 6.8 ، 2 ٪ SDS ، 0.8 ٪ β- مركابتوإيثانول) لمدة 45 دقيقة عند 50 درجة مئوية. بعد ذلك ، تم غسل الأغشية على نطاق واسع ست مرات باستخدام برنامج تلفزيوني. بعد ذلك ، تم حظر الأغشية ، وتم إجراء التلوين المناعي مرة أخرى كما هو موضح أعلاه.

فحص Luciferase

لتحليلات رينيلا نشاط لوسيفيراز في الخلايا المعالجة بـ CHX ، رينيلا تم استخدام Luciferase Assay Kit من Promega (# E2810) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. باختصار ، تم زرع 5 × 10 4 خلايا DAOY لكل بئر على لوحة 96 بئر. تم نقل الخلايا باستخدام 100 نانوغرام من ناقل pRL-CMV لكل بئر باستخدام كاشف تعداء PolyJet وحضنت مع cycloheximide (50-300 ميكروغرام / مل) لمدة 2 و 4 و 6 و 14 و 24 ساعة. At 24 hours post-transfection, the viability of cells was measured using alamarBlue. Subsequently, cells were lysed and Renilla luciferase activity was determined.

Metabolic labelling of من جديد synthesised proteins

Cells were seeded in 6-well plates at a density of 1×10 6 (Vero, A549) or 5×10 5 (DAOY, MG-63) cells per well. At indicated time intervals p.i., cells were washed with PBS and starved for 1 hour by addition of complete methionine-free RPMI medium (methionine-free RPMI medium containing 10% FBS, 1% L-alanyl-L-glutamine, 1% antibiotics/antimycotics, and 0.27 mM L-cystine). Subsequently, fresh complete methionine-free RPMI medium was added with 50 μM L-azidohomoalanine (AHA) and 1× AlamarBlue reagent. Metabolic labelling with AHA was performed for 2 hours. Afterwards, cell viability was measured as described earlier. Cells were then washed with PBS and lysed on ice for 15 minutes in 200 μl RIPA buffer with protease inhibitors (Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail Thermo Fisher Scientific). Lysates were separated on 12% polyacrylamide gels and transferred by electroblotting onto the PVDF membrane. The quantity of proteins loaded onto the gel was normalised to the cell numbers. Subsequently, the modified detection method Click-on-membrane was performed according to Kočová et al. (in preparation). Briefly, membranes were washed in 0.1 M potassium phosphate buffer pH 7.0 and the Click reaction was performed as follows: membranes were incubated in Click reaction buffer (0.1 M potassium phosphate buffer pH 7.0 with 0.25 mM sodium ascorbate, 0.5 mM THPTA, 0.1 mM CuSO4, and 10 μM biotin-alkyne) for 1 hour in the dark at room temperature. Membranes were washed three times with PBS, blocked (5% skimmed milk in PBS-T) and incubated with primary (AP-streptavidin VectorLabs 1:500), secondary (biotinylated anti-streptavidin VectorLabs 1:1000) and tertiary antibodies (AP-streptavidin VectorLabs 1:2000). Between each staining step, membranes were washed three times in PBS-T. Chemiluminescence signal was developed using Novex CDP-Star kit (Invitrogen #WP20002). Signal was subsequently quantified using Fiji software [46].

Metabolic labelling of من جديد synthesised RNA

DAOY cells were seeded in 6-well plates at a density of 5×10 5 cells per well. At the indicated time intervals p.i., 5-ethynyl uridine (5-EU) was added to the cells (final concentration of 5-EU was 1 mM) as well as alamarBlue reagent. Metabolic labelling with 5-EU was performed for 2 hours. Cell viability was measured as described earlier. Cells were then washed with PBS and lysed using RNA Blue reagent. Total RNA was isolated according to the manufacturer’s instructions. Next, RNA was separated in MOPS-buffered denaturing gel, as described above. The quantity of RNA was normalised to the cell number. Capillary blotting of RNA to the PVDF membrane (GE Healthcare) using 20× SSC buffering system was performed afterwards. Subsequently, the modified detection method Click-on-membrane was performed according to the method described by Kočová et. آل. (in preparation). Briefly, the UV-fixed membrane was washed in 0.1 M potassium phosphate buffer pH 7.0 and the Click reaction on membrane was performed as follows: membranes were incubated in Click reaction buffer (0.1 M potassium phosphate buffer pH 7.0 with 0.25 mM sodium ascorbate, 0.5 mM THPTA, 0.1 mM CuSO4, and 10 μM picolyl biotin azide) for 1 hour in the dark at room temperature. Blocking and triple labelling using biotin-streptavidin system was performed as described above. The chemiluminescence signal was developed using Novex CDP-Star kit (Invitrogen #WP20002), and signal was subsequently quantified using Fiji software [46].

تألق مناعي

DAOY cells were seeded in chamber slides (0,3 cm 2 /well 5×10 3 cells/well) and at the indicated time intervals p.i. processed as previously described [47]. Rabbit anti-POLR1A (Abcam 1:200) and chicken anti-NS3 (a kind gift from Dr. M. Bloom, NIAID, NIH 1:5000) antibodies were used. As the secondary antibodies, anti-rabbit DyLight 594 (Abcam 1:500) and anti-chicken DyLight 488 (Abcam 1:500), were used. In the case of metabolic labelling of nascent RNA, the Click reaction was performed فى الموقع before the blocking step. 10 μM Picolyl biotin azide was used for the detection of incorporated 5-EU. For subsequent fluorescent labelling, streptavidin conjugated with DyLight 549 was used (VectorLabs 1:500). Slides were eventually mounted in Vectashield mounting medium (VectorLabs). The Olympus Fluoview FV10i confocal microscope was used for imaging and subsequent export of images was done in FV10-ASW software (v.1.7).

Statistical analyses

All statistical analyses were performed in MS Excel using one-sample two-tailed Studentʼs t-test. Only in case of qPCR analysis of over-expressed viperin and GFP, an unpaired two-tailed Student’s t-test was used. In this case, datasets were first tested for the equality of variances by F-test. If the experiment was performed in technical replicates, the statistics was performed using the means of the independent biological replicates.


مراجع

Kennedy, S., Wang, D. & Ruvkun, G. A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. ايليجانس. طبيعة سجية 427, 645–649 (2004).

Buhler, M., Mohn, F., Stalder, L. & Muhlemann, O. Transcriptional silencing of nonsense codon-containing immunoglobulin minigenes. مول. زنزانة 18, 307–317 (2005).

Buhler, M., Verdel, A. & Moazed, D. Tethering RITS to a nascent transcript initiates RNAi- and heterochromatin-dependent gene silencing. زنزانة 125, 873–886 (2006).

Iida, T., Kawaguchi, R. & Nakayama, J. Conserved ribonuclease, Eri1, negatively regulates heterochromatin assembly in fission yeast. بالعملة. بيول. 16, 1459–1464 (2006).

Cheng, Y. & Patel, D.J. Crystallographic structure of the nuclease domain of 3′hExo, a DEDDh family member, bound to rAMP. جيه مول. بيول. 343, 305–312 (2004).

Dominski, Z., Yang, X.C., Kaygun, H., Dadlez, M. & Marzluff, W.F. A 3′ exonuclease that specifically interacts with the 3′ end of histone mRNA. Mol. زنزانة 12, 295–305 (2003).

Timmons, L. Endogenous inhibitors of RNA interference in أنواع معينة انيقة. Bioessays 26, 715–718 (2004).

Duchaine, T.F. وآخرون. Functional proteomics reveals the biochemical niche of C. ايليجانس DCR-1 in multiple small-RNA-mediated pathways. زنزانة 124, 343–354 (2006).

Lee, R.C., Hammell, C.M. & Ambros, V. Interacting endogenous and exogenous RNAi pathways in أنواع معينة انيقة. RNA 12, 589–597 (2006).

Gabel, H.W. & Ruvkun, G. The exonuclease ERI-1 has a conserved dual role in 5.8S rRNA processing and RNAi. نات. هيكل. مول. بيول. advance online publication, doi:10.1038/nsmb.1411 (27 April 2008).

Yang, X.C., Purdy, M., Marzluff, W.F. & Dominski, Z. Characterization of 3′hExo, a 3′ exonuclease specifically interacting with the 3′ end of histone mRNA. J. بيول. تشيم. 281, 30447–30454 (2006).

Moore, P.B. & Steitz, T.A. The involvement of RNA in ribosome function. طبيعة سجية 418, 229–235 (2002).

Lecompte, O., Ripp, R., Thierry, J.C., Moras, D. & Poch, O. Comparative analysis of ribosomal proteins in complete genomes: an example of reductive evolution at the domain scale. الدقة الأحماض النووية. 30, 5382–5390 (2002).

Cote, C.A., Greer, C.L. & Peculis, B.A. Dynamic conformational model for the role of ITS2 in pre-rRNA processing in yeast. RNA 8, 786–797 (2002).

Joseph, N., Krauskopf, E., Vera, M.I. & Michot, B. Ribosomal internal transcribed spacer 2 (ITS2) exhibits a common core of secondary structure in vertebrates and yeast. الدقة الأحماض النووية. 27, 4533–4540 (1999).

Yeh, L.C. & Lee, J.C. Structural analysis of the internal transcribed spacer 2 of the precursor ribosomal RNA from خميرة الخميرة. جيه مول. بيول. 211, 699–712 (1990).

Chen, F.W. & Ioannou, Y.A. Ribosomal proteins in cell proliferation and apoptosis. كثافة العمليات Rev. Immunol. 18, 429–448 (1999).

Lambertsson, A. The minute genes in ذبابة الفاكهة and their molecular functions. Adv. جينيه. 38, 69–134 (1998).

Fukuda, T. et al. DEAD-box RNA helicase subunits of the Drosha complex are required for processing of rRNA and a subset of microRNAs. نات. خلية بيول. 9, 604–611 (2007).

Oliver, E.R., Saunders, T.L., Tarle, S.A. & Glaser, T. Ribosomal protein L24 defect in belly spot and tail (Bst), a mouse Minute. تطوير 131, 3907–3920 (2004).

Draptchinskaia, N. et al. The gene encoding ribosomal protein S19 is mutated in Diamond-Blackfan anaemia. نات. جينيه. 21, 169–175 (1999).

Fatica, A. & Tollervey, D. Making ribosomes. بالعملة. رأي. خلية بيول. 14, 313–318 (2002).

Pillai, R.S. وآخرون. Inhibition of translational initiation by Let-7 microRNA in human cells. علم 309, 1573–1576 (2005).

Thermann, R. & Hentze, M.W. ذبابة الفاكهة miR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation. طبيعة سجية 447, 875–878 (2007).

Faber, A.W., Van Dijk, M., Raue, H.A. & Vos, J.C. Ngl2p is a Ccr4p-like RNA nuclease essential for the final step in 3′-end processing of 5.8S rRNA in خميرة الخميرة. RNA 8, 1095–1101 (2002).

Mitchell, P., Petfalski, E., Shevchenko, A., Mann, M. & Tollervey, D. The exosome: a conserved eukaryotic RNA processing complex containing multiple 3′ → 5′ exoribonucleases. زنزانة 91, 457–466 (1997).

Allmang, C. et al. The yeast exosome and human PM-Scl are related complexes of 3′ → 5′ exonucleases. تطوير الجينات. 13, 2148–2158 (1999).

Briggs, M.W., Burkard, K.T. & Butler, J.S. Rrp6p, the yeast homologue of the human PM-Scl 100-kDa autoantigen, is essential for efficient 5.8 S rRNA 3′ end formation. J. بيول. تشيم. 273, 13255–13263 (1998).

van Hoof, A., Lennertz, P. & Parker, R. Three conserved members of the RNase D family have unique and overlapping functions in the processing of 5S, 5.8S, U4, U5, RNase MRP and RNase P RNAs in yeast. EMBO J. 19, 1357–1365 (2000).

Denli, A.M., Tops, B.B., Plasterk, R.H., Ketting, R.F. & Hannon, G.J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. طبيعة سجية 432, 231–235 (2004).

Gregory, R.I. et al. The Microprocessor complex mediates the genesis of microRNAs. طبيعة سجية 432, 235–240 (2004).

Wu, H., Xu, H., Miraglia, L.J. & Crooke, S.T. Human RNase III is a 160-kDa protein involved in preribosomal RNA processing. J. بيول. تشيم. 275, 36957–36965 (2000).

Jalal, C., Uhlmann-Schiffler, H. & Stahl, H. Redundant role of DEAD box proteins p68 (Ddx5) and p72/p82 (Ddx17) in ribosome biogenesis and cell proliferation. الدقة الأحماض النووية. 35, 3590–3601 (2007).

Lau, N.C., Lim, L.P., Weinstein, E.G. & Bartel, D.P. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in أنواع معينة انيقة. علم 294, 858–862 (2001).


Extended Data Fig. 1 Tor2 promotes MTREC-dependent facultative heterochromatin assembly and gametogenic gene silencing.

أ و ب, ChIP-chip analyses of H3K9me2 at MTREC-dependent (أ) and MTREC-independent (ب) heterochromatin islands. ج, ChIP-chip analysis of H3K9me2 distribution at cen1. د, RNA-seq analyses of pir1, red1، و mtl1 expression in the indicated strains at 30 °C. ه, RNA-seq expression profiles of gametogenic gene transcripts at 30 °C. F, Composite plot showing the median expression level of a common set of 327 upregulated genes in WT and red1∆ cells grown in rich media at 30 °C. For ChIP-chip and RNA-seq, data representative of two independent experiments are presented.

Extended Data Fig. 2 Phosphorylation by Tor2/TORC1 stabilizes Pir1.

أ, Immunopurified fractions from cells expressing untagged or GFP-tagged Pir1 (left) and FLAG-tagged Tor2 (right) were subjected to mass spectrometry. The total PSM and coverage for the identified proteins is shown. ب, Multiple sequence alignment of S. بومبي proteins Pir1 and Red1 against human ZFC3H1 was performed using Macaw sequence alignment workbench. Pir1 aligns with ZFC3H1 in their shared serine/proline rich region. Thick rectangles indicate segments of best alignment and dotted lines indicate gaps. Alignments for two conserved regions are shown in detail. The serines that are phosphorylated in Pir1 are labelled with orange triangles. S285 is in a conserved motif which is underlined in red. Mass spectrometry results are from a single experiment. ج, Phosphorylation of Xpress-tagged recombinant WT Pir1 and mutant Pir1 with 12 serines (S215, S233, S237, S248, S265, S285, S299, S303, S325, S334, S434, S503) substituted with alanine by the FLAG–Tor2 complex was detected using anti-thiophosphate-ester antibody. د, Western blot analysis of GFP–Pir1 in the indicated strains at 30 °C. 12 SD, 12 serines replaced by aspartic acid. ه, Western blot analysis of Red1 in the indicated strains at 30 °C. SD, serine285 replaced by aspartic acid. ل ج-ه, two independent experiments were performed with similar results. Source data are provided.

Extended Data Fig. 3 Pir1 degradation by Ubi4 and Cul4–Ddb1 impacts gene silencing.

أ, Western blot analysis of GFP–Pir1 in tor2 + cells carrying pir1-WT, pir1-SD أو pir1-SA أليل. Cells were cultured in rich medium at 30 °C SD, serine285 replaced by aspartic acid SA, serine285 replaced by alanine. ب, Western blot analysis of Pir1 in strains grown at 30 °C with or without nitrogen (+N/–N). ج, IF of Pir1 in the indicated strains at 30 °C. د, Serial dilutions of the indicated strains were spotted onto rich medium (YEA) and low adenine (YE) plates, and then incubated at 30 °C for 3 days. ال spd1∆ was introduced to suppress the growth defect of cul4∆ و ddb1∆ المسوخ. ه, RNA-seq expression profiles of sme2 و mei2 transcripts in the indicated strains at 30 °C. F, Serial dilutions of the indicated strains were spotted and incubated as described in د. ز, RNA-seq analysis of MTREC regulon gene expression in the indicated homothallic strains at 30 °C. ل أ-ز, data representative of two independent experiments are shown. Source data are provided.

Extended Data Fig. 4 Defects in the assembly of MTREC-dependent heterochromatin islands observed in tor2-ts6 can be suppressed by ubi4∆ أو ddb1∆.

أ, ChIP-chip analysis of H3K9me2 distribution at MTREC-dependent islands in the indicated strains. ب, ChIP-chip analysis of H3K9me2 at MTREC-dependent heterochromatin islands in WT, tor2-ts6, tor2-ts6 ubi4∆، و tor2-ts6 ddb1∆ cells at 30 °C. Heterochromatin island numbers correspond to those described previously 15 . The number of plus signs (+) indicates the relative level of detected H3K9me2. The minus sign (–) denotes a lack of detectable H3K9me2. Genomic coordinates correspond to the S. بومبي genome assembly v2.29. Data representative of two independent ChIP-chip experiments are shown.

Extended Data Fig. 5 Pir1 prevents untimely gene expression in suboptimal conditions.

أ, Genes within the ‘meiotic coding’ and ‘non-meiotic coding’ groups in Fig. 4c were categorized separately based on GO biological process. ب, Growth curves of WT and pir1∆ cells cultured in rich or minimal medium at 26 °C. Optical density (OD) at 595 nm wavelength is plotted. Data representative of two independent experiments are shown. ج, Percent cell death was determined by methylene blue staining of cells grown on minimal medium at 26 °C. Two independent experiments were performed with similar results. د, Heatmap of log2 fold changes in expression in WT and pir1∆ cells grown in minimal or rich medium relative to WT cells grown in rich medium at 30 °C. Transcripts were clustered based on their function. ‘n’ indicates number of loci in each category. Data representative of two independent experiments are presented. ه, Schematic depicting how fluctuations in gametogenic gene expression, which occur upon changes in growth conditions, are controlled by MTREC–Pir1. F, Serial dilutions of the indicated strains were spotted onto rich medium and incubated at the indicated temperature for 3-4 days. Two independent experiments were performed with similar results. Source data are provided.

Extended Data Fig. 6 Synchronized meiosis system.

أ, Flowchart of pat1-as2 induced synchronized meiosis. ب, Progression of meiosis was monitored by fluorescence microscopy to determine the number of nuclei per cell in samples collected at the indicated time points after the addition of 1-NM-PP1. Two independent experiments were performed with similar results. ج, RT–qPCR analysis of meiotic gene expression. Samples were collected at the indicated time points. Two independent experiments were performed with similar results. د, Heatmap of log2 fold changes in expression relative to vegetative cells for synchronized meiotic cells, as determined by RNA-seq analyses. Clusters are grouped by expression pattern and only transcripts with peak log2 fold changes that were ≥1.5 were assigned to a group. Data representative of two independent experiments are shown. Source data are provided.

Extended Data Fig. 7 Temporal control of gene expression by Pir1 and MTREC during meiotic progression.

أ, The MTREC regulon genes grouped according to their function in meiosis. The expression peak was determined from RNA-seq analysis of the synchronized meiosis system. See also Supplementary Table 7. ب, RNA-seq analysis of MTREC regulon gene expression in the indicated strains. Data representative of two independent experiments are shown. ج, ChIP-chip analysis of meiotic DSBs (Rec12–DNA linkages) across chromosome 1 and 3 in cells expressing WT Pir1 or Pir1-SD protein. Data representative of two independent ChIP-chip experiments are shown.

Extended Data Fig. 8 Tor2 targets RNA elimination machinery to sustain cell proliferation and gametogenesis.

أ, Line plots showing the mean log2 fold change in expression of MTREC regulon transcripts in WT, pir1Δ، و red1Δ المسوخ. ب, Heatmap of log2 fold changes in expression of additional MTREC regulon genes relative to WT vegetative cells in WT, pir1∆، و red1∆. Data representative of two independent experiments are shown. Source data are provided.


المقدمة

Recent technological developments have enabled single cell studies at the level of genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics (1,2). For example, next generation sequencing technology allows unbiased and comprehensive sequencing of RNA from single cells (3𠄵). These pioneering studies have revealed cellular heterogeneity and stochastic gene expression at the single-cell level, which are overseen in analyses on cell populations. Such single cell variations can be caused by differences in cell-cycle phase, developmental stage, local signaling concentrations, transcriptional bursting or genetic alterations.

The first single-cell proteomics studies were performed using fluorescent reporter proteins. These studies all reported noise in the expression of the reporters (6𠄸). In a more recent pioneering study, a library of yeast strains containing over 2500 endogenously green fluorescent protein (GFP)-tagged proteins (9) was used to measure single-cell protein abundance of these genes. This study revealed that stochastic protein expression upon environmental changes is specific to particular gene classes (10). However, generating comprehensive libraries of endogenously tagged proteins is very labor intensive and impractical for higher eukaryotes. Recently, mass cytometry emerged as a novel technology to study the absolute abundance of proteins in single cells without the need to tag proteins but using endogenous antibodies to which heavy metals are coupled. This method currently allows quantifying up to 32 cellular proteins at the single-cell level in a single experiment (11,12). During the last decade, mass spectrometry-based proteomics emerged as a powerful tool to study the cellular proteome in an unbiased and comprehensive manner (13,14). The current state-of-the-art allows characterizing proteomes to substantial depth from as little as 10.000 mammalian somatic cells. Comprehensive mass spectrometry-based analyses of single mammalian cells is not yet feasible with current instrumentation and methods. Certain cells types, however, contain much more protein. Examples include oocytes or eggs which are several orders of magnitude larger than somatic cells.

لعدة سنوات، Xenopus embryos have been used to study early vertebrate development, elucidating key principles of gene regulation, cellular signaling, patterning and morphogenesis (15). Sequencing and assembly of the Xenopus tropicalis genome revealed a very good synteny with the human genome and has allowed characterizing chromatin state and transcription factor binding associated with the maternal to zygotic transition, mesoderm induction and gastrulation (16�). It also allowed to uncover embryonic transcriptome dynamics and identify patterns of transcript adenylation and deadenylation (20�). Due to the less complete genome annotation of Xenopus laevis, genome-wide transcriptome analyses have been more difficult (23,24). Coincidently, single X. laevis eggs contain enough protein for global mass spectrometry-based proteomic analyses.

Developmental processes are known to be tightly controlled, but it is currently unknown to what extent stochastic gene expression plays a role from the beginning of embryogenesis. Here, we present a comprehensive absolute proteome of multiple fertilized X. laevis eggs and compare it to both single egg transcriptomes and single gastrula stage embryonic proteomes. The single egg and single gastrula proteomes are both tightly controlled, thus revealing a reduced role for stochastic effects at the beginning of vertebrate development. Developmental dynamics at the protein level are not reflected well by changes at the mRNA level, thus emphasizing the importance of using mass spectrometry-based proteomics to study early embryogenesis.


الاستنتاجات

The above data support the formation of multifaceted initiation complexes for executing co-transcriptional processing of tRNA in human cells (Fig. 2). But why it matters to coordinate and couple processing with transcription for biosynthesis of tRNA? The human genome has > 500 tRNA genes, the majority of which are mapped in six chromosomes [ [158] ]. More than half of these genes are arranged in repeats on chromosomes 1 and 6. The tRNA gene cluster in chromosome 6 resides in a genetic region that constitutes a transcription hotspot opposing the extended major histocompatibility class I locus [ [158] ]. Remarkably, the tRNA gene cluster in chromosome 1 is transcribed as individual short transcripts and not as long polycistronic transcripts [ [159] ]. Therefore, the arrangement of tRNA genes in the human genome is nonrandom and necessitates a tethering regulatory mechanism in the nucleus. In this regard, it has been shown that there are

2000 foci of Pol III in the nucleus of a dividing HeLa cell and that each focus has

5 active polymerases [ [99] ]. Since these polymerases are supposed to act through facilitated recycling mode (one gene–one committed polymerase), it is plausible that several tRNA genes be clustered and transcribed in a focus, in which enzymes tethered to each other by assembling massive transcription complexes [ [99] ], possibly like the one described in Fig. 2. A similar clustering of rRNA gene repeats positioned in distinct chromosomes takes place in nucleolar organizer regions that aid in coordinating transcription and processing of the new transcripts [ [160] ]. In the budding yeast, tRNA genes are not arranged in tandem repeats, but they do cluster in the nucleolus that hosts RNase P and Pol III [ [88, 89] ]. But can Pol III carry out co-transcriptional processing, as this polymerase lacks a motif similar to the CTD shown to enable Pol II to recruit processing factors? In fact, the presence of a domain such as the CTD is not a prerequisite for coordinated transcription and processing of all RNAs. Thus, Pol I, which lacks this domain, facilitates partial co-transcriptional cleavages of precursor rRNA in the nucleolus, as described above. Additionally, the length of a precursor transcript is not a limiting factor for having co-transcriptional processing at one or more sites. Two classes of short RNAs, small nuclear RNAs and small nucleolar RNAs, are transcribed by Pol II and processed via co-transcriptional cleavage at the 3′ and 5′ end, respectively [ [161-164] ]. Accordingly, co-transcriptional processing of tRNA is possible and it matters for having high enzyme specificity and productivity in order to supply the cell with large amounts of mature tRNAs needed for growth and proliferation.


شاهد الفيديو: From DNA to protein - 3D (قد 2022).


تعليقات:

  1. Thorndike

    السؤال الجيد جدا

  2. Collier

    أعتقد أنك مخطئ.

  3. Tyrus

    أعتقد ، أن أي شيء خطير.

  4. Mac An Bhreatannaich

    لقد ضربت المكان. أعتقد أن هذه فكرة رائعة للغاية. اتفق معك تماما.

  5. Galileo

    لا يتفق على الإطلاق مع العبارة السابقة



اكتب رسالة