معلومة

8.5: إنزيمات التقييد - علم الأحياء

8.5: إنزيمات التقييد - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

يمكن قطع الحمض النووي بواسطة نوكليازات تقييد (إعادة). نوكليازات داخلية هي إنزيمات يمكنها تحلل بوليمر الحمض النووي عن طريق تكسير الفوسفوديستر الرابطة بين الفوسفات والبنتوز على العمود الفقري للحمض النووي. هذه رابطة تساهمية قوية جدًا بينما تحافظ الروابط الهيدروجينية الأضعف على تفاعلاتها وتقطيعها المزدوج.

كما يوحي الاسم ، فإن نوكليازات التقييد (أو إنزيمات التقييد) هي "محدد"في قدرتها على قطع أو هضم الحمض النووي. القيد الذي يفيد علماء الأحياء هو عادة متناوب تسلسل الحمض النووي. المتواليات المتناظرة هي نفس التسلسل للأمام وللخلف. بعض الأمثلة على المتناظرات: RACE CAR ، CIVIC ، A MAN A PLAN A CANAL PANAMA. فيما يتعلق بالحمض النووي ، هناك سلسلتان تعملان بشكل معاكس لبعضهما البعض. لذلك ، فإن المكمل العكسي لأحد الخيطين مطابق للآخر. يميل علماء الأحياء الجزيئية أيضًا إلى استخدام هذه المقصات الجزيئية الخاصة التي تتعرف على متناظرات من 6 أو 8. باستخدام 6 قواطع أو 8 قاطعات ، تحدث التسلسلات عبر امتدادات كبيرة نادرًا ، ولكن غالبًا ما تكون ذات فائدة.

تحلل إنزيمات التقييد روابط فسفودايستر تساهمية للحمض النووي لتترك إما نهايات "لزجة / متماسكة" أو نهايات "غير حادة". هذا التمييز في القطع مهم لأن ايكو ارى يمكن استخدام الطرف اللاصق لمطابقة قطعة من الحمض النووي مقطوعة بنفس الإنزيم من أجل لصقها أو ربطها معًا مرة أخرى. بينما تقطع نوكليازات الحمض النووي ، إنزيمات دمج الجزيئات انضم إليهم مرة أخرى معًا. هضم الحمض النووي مع ايكو ارى يمكن ربطها مرة أخرى مع قطعة أخرى من الحمض النووي المهضوم بها ايكو ارى، ولكن ليس للقطعة المهضومة بها SmaI. قاطع غير حاد آخر هو EcoRV مع تسلسل التعرف على GAT | ATC.

ايكو ارى يولد نهايات لزجة متماسكة SmaI يولد نهايات حادة

الهضم المقيّد


أنزيمات التقييد

إنزيمات التقييد ، أو نوكليازات التقييد ، أو المقص الجزيئي هي إنزيمات تنتجها البكتيريا يمكنها أن تقطع بين شريطين من دنا في مناطق تسمى مواقع التعرف. تم اكتشاف إنزيمات التقييد لأول مرة أثناء المعوية القولونية ابحاث. تعتبر إنزيمات التقييد من النوع الثاني (REs) ذات أهمية خاصة في مجالات الاستنساخ الجزيئي وتسلسل الجينات ورسم خرائط الحمض النووي حيث يمكن لهذه المجموعة قطع الحمض النووي بالقرب من مواقع التعرف المحددة ولا تتطلب طاقة في شكل ATP.


مختبر شمال غرب المحيط الهادئ الوطني ، ريتشلاند ، واشنطن

ماسي وشركاه ، تشابل هيل ، نورث كارولينا

مختبر شمال غرب المحيط الهادئ الوطني ، ريتشلاند ، واشنطن

ماسي وشركاه ، تشابل هيل ، نورث كارولينا

ملخص

يتم تعريف الطلاب على إنزيمات التقييد ومحاكاة نشاط إنزيمات التقييد بالمقص. يتم تقديمهم أيضًا إلى خرائط التقييد ويطلب منهم إجراء تنبؤات بسيطة بناءً على الخريطة. تم اكتشاف إنزيمات التقييد في الأصل من خلال قدرتها على تكسير الحمض النووي الغريب. يمكن أن تميز إنزيمات التقييد بين الحمض النووي الموجود عادة في الخلية والحمض النووي الغريب ، مثل إصابة الحمض النووي للعاثمة. إنهم يدافعون عن الخلية من الغزو عن طريق تقطيع الحمض النووي الغريب إلى أجزاء وبالتالي جعلها غير فعالة. يبدو أن إنزيمات التقييد تصنع حصريًا بدائيات النوى. يتم تقديم عمل إنزيمات التقييد ونمذجه في نشاط مقص DNA. يتم تقديم فكرة إعادة الانضمام إلى شظايا التقييد والحاجة إلى التكامل في "ذيول" أحادية الجديلة في نشاط مقص DNA. تلعب إنزيمات التقييد و DNA ligase دور البطولة في استنساخ الحمض النووي. أعطى اكتشاف إنزيمات التقييد للعلماء طريقة لتقطيع الحمض النووي إلى أجزاء محددة. في كل مرة يتم فيها قطع قطعة معينة من الحمض النووي باستخدام إنزيم معين ، يتم إنتاج نفس الأجزاء. يمكن إعادة هذه القطع المحددة معًا بطرق جديدة. تمت صياغة عبارة جديدة لوصف جزيء الحمض النووي الذي تم تجميعه من جزيئات بداية مختلفة: الحمض النووي المؤتلف. بعد الهضم المقيد ، غالبًا ما يتم فصل أجزاء الحمض النووي عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام. يقدم الفصل أيضًا إجابات لأسئلة التمرين.


النشاط النسبي لأنزيمات التقييد في المخازن المؤقتة العالمية والقاعدية

يتم تزويد إنزيمات التقييد الخاصة بنا بمخزن مؤقت عالمي مثالي (واحد من خمسة مخازن عالمية موضحة باللون الأزرق في الجدول أدناه). يتم تطبيع النشاط النسبي في كل من المخازن المؤقتة العالمية الأخرى إلى المخزن المؤقت الأمثل ، حيث يتم التعبير عن نشاط كل إنزيم في المخزن المؤقت الأمثل بنسبة 100٪. تشير القيم الموجودة في () إلى المخازن المؤقتة التي من المحتمل أن تتأثر بنشاط النجوم. من أجل تجنب هذه الآثار ، يوصى باستخدام المخازن المؤقتة المظللة باللون الأزرق أو الوردي.

يتم تزويد بعض الإنزيمات المحددة (AccIII و BalI و BcnI و BglI و Bpu1102I و Cfr10I و Eco52I و NruI و PshBI و SnaBI و SspI و TaqI و VpaK11BI) بمخزن أساسي متخصص للإنزيم المعين. تختلف تركيبات هذه المحاليل القاعدية باختلاف الإنزيم.

انزيم التقييد الأنشطة النسبية (٪)
إلمحكT + BSAالقاعدية ***
آاتي & lt20 & lt20 & lt20 & lt20 100 120
AccI 20 100 & lt20 (& lt20) 160 80
أكيي (260) 100 & lt20 20 200 160
AccIII (& lt20) (& lt20) 20 (80) (& lt20) 100
افاي 60 60 40 60 100 100
AflII 20 80* & lt20 & lt20 140 120
ألوي 100 100 & lt20 40 200 120
Aor13HI & lt20 20 & lt20 80 * 80 100
Aor51HI 80 100 & lt20 20 120 120
ابي 100 & lt20 & lt20 & lt20 & lt20 120
أبالي 100 20 & lt20 & lt20 120 120
افاي (& lt20) 100 20 40 100 120
افي 80 100 & lt20 20 100 100
بالي 20 20 & lt20 & lt20 40 100
بامهي (& lt20) & lt20 40 100 (& lt20) 80
باني (120) (120) 100 80 (100) 100
أنا & lt20 20 40 60 60 100
BglI & lt20 & lt20 20 40 & lt20 100
BglII & lt20 20 100 (100) (60) 100
أنا & lt20 20 40 100 20 120
BmeT110I & lt20 & lt20 20 100 & lt20 140
BmgT120I & lt20 & lt20 100 40 & lt20 240
بو 1102 ا & lt20 & lt20 & lt20 40 60 100
BspT104I 100 60 & lt20 & lt20 100 120
BspT107I & lt20 20 80 100 20 100
أنا 100 20 & lt20 & lt20 60 100
Bsp1407I 20 60 20 20 100 100
BssHII 100 100 60 20 140 100
BstPI (& lt20) (60) 100 (100) (100) 100
BstXI & lt20 40 100 & lt20 & lt20 120
Bst1107I (& lt20) 60 100 100 40 100
CFR10I (& lt20) (& lt20) (& lt20) 40 (20) 100
CLI 40 100 120 100 60 100
CpoI & lt20 & lt20 80 100 & lt20 100
دراي 100 100 60 100 80 80
EaeI 60 100 & lt20 & lt20 120 160
EcoO65I (20) (60) 60 * 40 40 100
إيكو 109 أ 100 60 & lt20 & lt20 100 160
ايكو ارى (20) (100) 100 (120) (80) 120
EcoRV (& lt20) (40) 100 (120) (40) 100
EcoT14I (& lt20) (40) 100 120 (60) 100
EcoT22I & lt20 20 100 (140) (20) 120
Eco52I & lt20 & lt20 & lt20 & lt20 & lt20 100
Eco81I & lt20 100 & lt20 & lt20 100 160
FbaI (& lt20) (& lt20) (80) 100 (20) 100
فوكي (20) (60) & lt20 & lt20 (200) 100
هايي 80 100 & lt20 80 140 100
هايييي 60 100 100 60 100 100
HapII 100 60 & lt20 & lt20 100 80
HhaI 80 100 100 120 120 100
HincII 20 100 20 40 100 80
هند III (60) 100 & lt20 200 (100) 80
HinfI 80 100 100 160 60 100
هين 1 40 80* & lt20 20 60 160
هبا & lt20 (40) 20 100 (80) 100
أنا 100 60 & lt20 & lt20 (100) 80
مبوي 20 40 60 100 40 100
مبوي 100 60 & lt20 & lt20 60 100
MflI 100 80 & lt20 & lt20 80 100
أنا 60 60 100 (100) 60 100
MspI 80 80 & lt20 100 100 80
موني (200) 100* & lt20 & lt20 160 100
MvaI (& lt20) (40) 80 100 (20) 120
ناي 100 & lt20 & lt20 & lt20 100 120
NcoI (40) (60) 20 60* (60) 160
NdeI & lt20 40 100 100 80 100
أنا (120) 100 & lt20 & lt20 (160) 100
لا (& lt20) (& lt20) 20** & lt20 (& lt20) 100
NruI 0 & lt20 20 20 & lt20 100
NsbI 40 20 & lt20 60 100 100
PmaCI 100 80 & lt20 & lt20 100 100
PshAI 20 40 & lt20 100 60 160
PshBI (20) (40) 20 40 40 100
PS1406I 20 60 & lt20 & lt20 100 100
PstI (& lt20) (60) 100 80 (20) 80
PvuI (& lt20) (20) (40) 80* (40) 120
PvuII (80) 100 40 & lt20 (40) 100
ساسي 100 60 & lt20 & lt20 80 80
SacII 40 20 & lt20 & lt20 100 40
سالي & lt20 & lt20 100 (20) & lt20 120
Sau3AI (60) 80 100 & lt20 (80) 100
ScaI (& lt20) (& lt20) 100 (60) (& lt20) 100
SfiI (40) 100 & lt20 & lt20 100 100
SmaI & lt20 & lt20 & lt20 & lt20 100 100
SmiI & lt10 & lt20 100 40 & lt10 100
سنابي (20) (40) & lt20 & lt20 (40) 100
SpeI (80) 100 80 100 (80) 100
SphI (20) (40) 100 120 (20) 100
Sse8387I (120) 60* & lt20 & lt20 (60) 100
SSPI (& lt20) (60) 40 (100) (80) 100
ستوي 60 100 60 80 140 100
تقي 40 80 60 60 80 100
Tth111I (20) 80 40 100 (80) 120
فان 91 & lt20 (20) 60 100 (60) 100
VpaK11BI & lt20 & lt20 60 (40) & lt20 100
XbaI & lt20 80* 20 & lt20 120 120
XhoI & lt20 60 100 160 60 100
XspI & lt20 60 & lt20 100 160 100

الأزرق: المخزن المؤقت المزود بإنزيم التقييد
اللون الوردي: يوصى باستخدام مخزن مؤقت بديل

* + 0.01٪ BSA & rarr 100٪ AflII، EcoO65I، FokI، Hin1I، MunI، NcoI، PvuI، SplI، Sse8387I، XbaI
** + 0.01٪ BSA + 01٪ Triton X-100 & rarr 100٪ NotI
*** تركيبات المخازن القاعدية خاصة بالإنزيم.


نوكليازات تقييدية

مع أكثر من 40 عامًا من تقديم الإنزيمات المقيدة لمجتمع البحث ، اكتسب NEB سمعة كونه رائدًا في تقنيات الإنزيم. من خلال العمل المستمر ليكون جديرًا بهذا التميز ، يسعى NEB جاهدًا لتطوير إنزيمات بأعلى درجة نقاء وأداء لا مثيل له.

لقد تحولت جميع إنزيمات التقييد الخاصة بـ NEB إلى نظام عازل جديد. قم بزيارة NEBCutSmart.com لمزيد من التفاصيل.

راحة

  • يتم تضمين قارورة من 6X Purple Load Dye مع معظم الإنزيمات المقيدة.
  • أكثر من 210 إنزيمات تقييد نشطة 100٪ في مخزن مؤقت واحد & ndash CutSmart & trade Buffer.
  • & gt190 إنزيمات التقييد مؤهلة لتوفير الوقت ، مما يعني أنه يمكنك هضم الحمض النووي في 5-15 دقيقة ، أو هضم الحمض النووي بأمان بين عشية وضحاها.
  • اختر من بين & gt280 إنزيمات التقييد ، أكبر مجموعة متاحة تجاريًا.

أداء

  • اختر إنزيم تقييد عالي الدقة (HF & reg) ، والذي تم تصميمه لتقليل نشاط النجوم ، والهضم السريع (5-15 دقيقة) والنشاط بنسبة 100٪ في CutSmart Buffer. يتم تضمين قارورة من 6X Purple Load Dye مع كل إنزيم تقييد HF.
  • تخضع جميع إنزيمات التقييد الخاصة بنا لاختبارات صارمة لمراقبة الجودة ، مما يضمن أعلى مستويات النقاء والاتساق بين الكثير.

استخدم Enzyme Finder لتحديد إنزيمات التقييد بالاسم أو التسلسل أو البروز أو النوع.


8.5: إنزيمات التقييد - علم الأحياء

أمثلة على إنزيمات تقييد الفئة الثانية

من عند
المستدمية aegytius

من عند
طريق المستدمية النزلية

يتم الحصول على إنزيمات التقييد من العديد من بدائيات النوى وتم عزل حوالي 1500 إنزيم مع مواقع التعرف على التسلسل المعروفة. تتبع تسمية هذه نوكليازات نظامًا اقترحه ناثانز وسميث. يحتوي كل اسم على حرف واحد كبير على الأقل وحرفين صغيرين متبوعين برقم روماني. الأحرف هي الأحرف الأولى من الجنس وأنواع المنشأ ويمثل الرقم عدد الإنزيمات المكتشفة في الكائن الحي. (تاريخيًا ، حدد الرقم ذروة البروتين التي تم فيها فصل الإنزيم أثناء الفصل الكروماتوغرافي.) يمكن إضافة معلومات إضافية كحرف. بالنسبة لـ Eco RI ، يشير R إلى سلالة معينة من E. coli.

قد تتعرف إنزيمات التقييد من كائنات مختلفة على تسلسل الحمض النووي نفسه. إذا تعرفت الإنزيمات على نفس الموقع وانشقت في نفس الموضع ، فسيتم تسميتها المتشابهات. تلك التي تتعرف على نفس الموقع ولكنها تنقسم في أوضاع مختلفة هي متغايرة الفكازومرات أو الفكيزومرات الجديدة.

مثال Isoschizomer

من عند
Streptomyces phaeochromogenes

من عند
Bacillus sp. Bu 17091

مثال Heteroisoschizomer أو neoschizomer

من عند
Xanthomonas malvacea الروم

تضيف الأيزو أو الكيزومرات غير المتجانسة مرونة في التصميم التجريبي. التكلفة وحساسيات المثيلة وأنواع "النهايات" هي اعتبارات بالإضافة إلى شروط عازلة للنشاط الأمثل.

تتناسب بعض الظروف العازلة مع جميع إنزيمات التقييد تقريبًا ولكن لا يوجد محلول واحد يسمح بنشاط كل إنزيم. يوفر موردو الإنزيمات دائمًا مخزنًا مؤقتًا للتفاعل (تركيز 10x) وهو الأمثل للإنزيم. عادةً ما تكون مكونات المخزن المؤقت 1x 10-100 ملي مولار تريس عند درجة الحموضة 7.3 إلى 8.5 ، ومستويات مختلفة من الأملاح مثل KCl و NaCl (10 إلى 150 ملم) ، و 10 ملي ميغاغرام (2+) ، و 2 ملي مولار بيتا مركابتوإيثانول. في بعض الأحيان يتم تضمين 0.01٪ Triton- X100 (منظف) وألبومين مصل البقر كمثبتات. (بدلاً من ذلك ، يمكن استخدام جيلاتين جلد الخنازير ويوفر مزايا تتمثل في ثباته في التعقيم وتكلفته حوالي 1/15 من مساحة سطح الجسم).

نظرًا لأن إنزيمات التقييد يمكن أن تتطلب ظروف عازلة مختلفة ، يجب استخدام بعض الإستراتيجيات للقيام بهضم مزدوج. الطريقة المفضلة هي الهضم في وقت واحد مع كلا الإنزيمين في مخزن مؤقت متوافق. يمكن استخدام هذه الطريقة حتى إذا كان أحد الإنزيمات غير نشط بشكل كامل (على سبيل المثال ، 75٪ نشط). يمكن إضافة أكثر من إنزيم واحد (على سبيل المثال ، 1 يو من إنزيم A + 1.33 يو إنزيم ب) لتحقيق كفاءة قطع متساوية. هناك حدود للإنزيم الزائد بسبب زيادة الجلسرين في التفاعل الذي يمكن أن يقلل من خصوصية بعض الإنزيمات.

طريقة بديلة هي الهضم مع إنزيم "قليل الملح" ثم إضافة المزيد من المخزن وإنزيم "عالي الملح" لإكمال الهضم. من الواضح أن هذا يضاعف الوقت اللازم لعملية الهضم. في الحالات القصوى ، يمكن أن يترسب الحمض النووي بعد هضم واحد ويذوب في محلول الهضم الثاني. تتم عمليات الهضم عند 37 درجة مئوية ما لم يذكر خلاف ذلك للإنزيم.

يمكن أن يحدث الانقسام النوعي غير المحدد أو المسترخى أو النشاط "النجمي" إذا تم استخدام الظروف غير المثلى. تشمل الشروط التي تشجع نشاط النجوم ما يلي:


انزيم التقييد

سيراجع محررونا ما قدمته ويحددون ما إذا كان ينبغي مراجعة المقالة أم لا.

انزيم التقييد، وتسمى أيضا نوكلياز تقييد، وهو بروتين تنتجه البكتيريا التي تشق الحمض النووي في مواقع محددة على طول الجزيء. في الخلية البكتيرية ، تشق الإنزيمات المقيدة الحمض النووي الغريب ، وبالتالي تقضي على الكائنات الحية المعدية. يمكن عزل إنزيمات التقييد من الخلايا البكتيرية واستخدامها في المختبر لمعالجة أجزاء من الحمض النووي ، مثل تلك التي تحتوي على جينات لهذا السبب فهي أدوات لا غنى عنها لتكنولوجيا الحمض النووي المؤتلف (الهندسة الوراثية).

تستخدم البكتيريا إنزيمًا مقيدًا للدفاع ضد الفيروسات البكتيرية التي تسمى العاثيات. عندما تصيب العاثية بكتيريا ، فإنها تُدخل الحمض النووي الخاص بها في الخلية البكتيرية بحيث يمكن تضاعفها. يمنع إنزيم التقييد تكرار الحمض النووي للعاثية عن طريق تقطيعه إلى عدة قطع. تمت تسمية إنزيمات التقييد بسبب قدرتها على تقييد أو الحد من عدد سلالات العاثيات التي يمكن أن تصيب البكتيريا.

يتعرف كل إنزيم تقييد على تسلسل قصير ومحدد لقواعد النوكليوتيدات (الوحدات الفرعية الكيميائية الأساسية الأربعة لجزيء الحمض النووي الخطي مزدوج الشريطة - الأدينين والسيتوزين والثايمين والجوانين). تسمى هذه المناطق تسلسلات التعرف ، أو مواقع التعرف ، ويتم توزيعها بشكل عشوائي في جميع أنحاء الحمض النووي. تصنع الأنواع البكتيرية المختلفة إنزيمات تقييدية تتعرف على تسلسلات النيوكليوتيدات المختلفة.

عندما يتعرف نوكلياز التقييد على تسلسل ، فإنه يقص خلال جزيء الحمض النووي عن طريق تحفيز التحلل المائي (تقسيم رابطة كيميائية عن طريق إضافة جزيء ماء) للرابطة بين النيوكليوتيدات المجاورة. تمنع البكتيريا الحمض النووي الخاص بها من التدهور بهذه الطريقة عن طريق إخفاء تسلسل التعرف عليها. تضيف الإنزيمات المسماة methylases مجموعات الميثيل (–CH3) إلى قواعد الأدينين أو السيتوزين ضمن تسلسل التعرف ، والذي يتم تعديله وحمايته من نوكلياز داخلي. يشكل إنزيم التقييد والميثيلاز المقابل له نظام تعديل التقييد للأنواع البكتيرية.

تقليديا ، يتم التعرف على أربعة أنواع من إنزيمات التقييد ، المعينة الأول والثاني والثالث والرابع ، والتي تختلف بشكل أساسي في الهيكل وموقع الانقسام والخصوصية والعوامل المساعدة. يتشابه النوعان الأول والثالث من الإنزيمات في أن كلاً من أنشطة التقييد والميثيلاز يتم تنفيذها بواسطة مركب إنزيم كبير واحد ، على عكس نظام النوع الثاني ، حيث يكون إنزيم التقييد مستقلاً عن ميثيلازه. تختلف إنزيمات التقييد من النوع الثاني أيضًا عن النوعين الأول والثالث من حيث أنها تشق الحمض النووي في مواقع محددة داخل موقع التعرف ، بينما يشق الآخرون الحمض النووي بشكل عشوائي ، وأحيانًا مئات القواعد من تسلسل التعرف. تم تحديد عدة آلاف من إنزيمات التقييد من النوع الثاني من مجموعة متنوعة من الأنواع البكتيرية. تتعرف هذه الإنزيمات على بضع مئات من التسلسلات المميزة ، يتراوح طولها بشكل عام بين أربع وثمانية قواعد. إنزيمات التقييد من النوع الرابع تشق الحمض النووي الميثلي فقط وتظهر خصوصية تسلسل ضعيفة.

تم اكتشاف وتمييز إنزيمات التقييد في أواخر الستينيات وأوائل السبعينيات من قبل علماء الأحياء الجزيئية فيرنر أربر وهاملتون أو.سميث ودانييل ناثانز. مكنت قدرة الإنزيمات على قطع الحمض النووي في مواقع محددة الباحثين من عزل الأجزاء المحتوية على الجينات وإعادة تجميعها مع جزيئات أخرى من الدنا ، أي لاستنساخ الجينات. تُشتق أسماء إنزيمات التقييد من الجنس والأنواع وتسميات السلالة للبكتيريا التي تنتجها ، على سبيل المثال ، الإنزيم سابقة بمعنى البيئةيتم إنتاج RI بواسطة الإشريكية القولونية سلالة RY13. يُعتقد أن إنزيمات التقييد نشأت من بروتين سلف مشترك وتطورت للتعرف على تسلسلات محددة من خلال عمليات مثل إعادة التركيب الجيني وتضخيم الجينات.

محررو Encyclopaedia Britannica تمت مراجعة هذه المقالة وتحديثها مؤخرًا بواسطة كارا روجرز ، كبيرة المحررين.


إنزيمات التقييد: الأنواع & # 038 أمثلة

من أهم خطوات علم الأحياء الجزيئي ، وخاصة علم الوراثة الجزيئية والتحليل ، عزل الحمض النووي عن الجينوم البشري وعمل نسخ عديدة منه. الآن ، يمكن استخدام هذه النسخ لمزيد من التحليل من أي نوع.

كان أحد الأحداث الرئيسية في تطوير منهجية علم الوراثة الجزيئي هو اكتشاف إنزيمات التقييد ، والمعروفة أيضًا باسم نوكليازات تقييدية.

مقدمة

أ انزيم التقييد هو نوع من إنزيم نوكلياز القادر على شق الحمض النووي مزدوج الشريطة. قد تشق الإنزيمات الحمض النووي بتسلسلات عشوائية أو محددة يشار إليها باسم مواقع التقييد. تعتبر مواقع التعرف متجانسة في الأصل ، أي أنها التسلسلات التي تُقرأ بنفس الطريقة للأمام والخلف.

يتم إنتاج إنزيمات التقييد بشكل طبيعي بواسطة البكتيريا. تستخدمه الأنواع البكتيرية كشكل من أشكال آلية الدفاع ضد الفيروسات. ومع ذلك ، في البكتيريا ، توجد إنزيمات تقييدية كجزء من نظام مشترك يسمى نظام تعديل التقييد. تعدل الأنواع البكتيرية الحمض النووي الخاص بها بمساعدة الإنزيمات التي تقوم بميثيلها. هذه العملية الخاصة لميثلة الحمض النووي البكتيري تحميها من الانقسام من نوكليازات التقييد الخاصة بها.

أنواع

يوجد نوعان مختلفان من إنزيمات التقييد:

  1. نوكليازات خارجية: نوكليازات التقييد هي المسؤولة بشكل أساسي عن التحلل المائي للنيوكليوتيدات الطرفية من نهاية جزيء الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي إما من 5 "إلى 3" أو اتجاه 3 "إلى 5" على سبيل المثال- نوكلياز خارجي I ، نوكلياز خارجي II ، إلخ.
  2. نوكلياز: تتعرف نوكليازات التقييد على تسلسلات أساسية معينة (مواقع تقييد) داخل جزيء الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي وتحفز انقسام رابطة الفوسفوديستر الداخلية لـ exEcoRI و Hind III و BamHI ، إلخ.

تاريخ

كان أول إنزيم تقييد تم اكتشافه هو Hind II في عام 1970. وفي عام 1978 ، مُنح دانيال ناثانز و Werner Arber و Hamilton O. Smith جائزة نوبل في علم وظائف الأعضاء أو الطب.

تسمية إنزيم التقييد

يتكون اسم إنزيمات التقييد من ثلاثة أجزاء:

  1. اختصار للجنس وأنواع الكائن الحي إلى 3 أحرف ، على سبيل المثال- Eco لـ Escherichia coli المحدد بالحرف الأول ، E ، للجنس والحرفين الأولين ، co ، من النوع.
  2. يتبعه حرف أو رقم أو مزيج من كلاهما للدلالة على سلالة النوع.
  3. رقم روماني للإشارة إلى الترتيب الذي تم فيه العثور على أنظمة تعديل التقييد المختلفة في نفس الكائن الحي أو السلالة في حد ذاتها.

تصنيف نوكليازات تقييدية

بناءً على أنواع التسلسلات التي تم تحديدها ، وطبيعة القطع التي تم إجراؤها في الحمض النووي ، وهيكل الإنزيم ، هناك ثلاث فئات:

  1. النوع الأول من إنزيمات التقييد ،
  2. إنزيمات تقييد النوع الثاني ، و
  3. إنزيمات تقييد النوع الثالث.

أ. النوع الأول من إنزيمات التقييد

  • تمتلك إنزيمات التقييد من النوع الأول كلاً من أنشطة التقييد والتعديل. في هذه الحالة ، سيعتمد التقييد على حالة المثيلة لتسلسل الحمض النووي المستهدف.
  • يحدث الانقسام ما يقرب من 1000 زوج أساسي بعيدًا عن موقع التقييد.
  • هيكل موقع التعرف غير متماثل. تتكون من جزئين. يتكون أحد أجزاء موقع التعرف من 3-4 نيوكليوتيدات بينما يحتوي الجزء الآخر على 4-5 نيوكليوتيدات. يتم فصل الجزأين بواسطة فاصل غير محدد من حوالي 6-8 نيوكليوتيدات.
  • من أجل وظيفتها ، تتطلب إنزيمات التقييد من النوع الأول S- adenosylmethionine (SAM) و ATP و Mg 2+
  • وهي تتألف من 3 وحدات فرعية ، ووحدة فرعية خاصة تحدد موقع التعرف ، ووحدة فرعية للتقييد ، ووحدة فرعية للتعديل.

ب. النوع الثاني من إنزيمات التقييد

  • يتوسط إنزيمان منفصلان التقييد والتعديل. من الآن فصاعدًا ، يمكن شق الحمض النووي في حالة عدم وجود إنزيمات معدلة. على الرغم من أن التسلسل المستهدف المحدد بواسطة الإنزيمين هو نفسه ، إلا أنه يمكن تنقيتهما بشكل منفصل عن بعضهما البعض.
  • النيوكليوتيدات مشقوقة في موقع التقييد فقط. تسلسل التعرف متماثل دورانيًا ، يسمى التسلسل المتناوب. يمكن أن يكون الموقع المتناوب المحدد إما مستمرًا (على سبيل المثال ، يحدد KpnI التسلسل 5´-GGTACC-3´) أو غير مستمر (على سبيل المثال ، يتعرف BstEII على التسلسل 5´-GGTNACC-3´ ، حيث يمكن أن يكون N أي نوكليوتيد)
  • هذه تتطلب Mg 2+ كعامل مساعد ولكن ليس ATP.
  • إنها مطلوبة في رسم الخرائط الجينية وإعادة بناء الحمض النووي في المختبر فقط لأنها تحدد مواقع معينة وتنقسم في تلك المواقع فقط.

كيف هؤلاء يعملون:

  • تقوم إنزيمات التقييد من النوع الثاني أولاً بإنشاء اتصال غير محدد مع الحمض النووي وترتبط بها في شكل مخفتات.
  • ثم يتم الكشف عن التسلسل المستهدف من خلال توليفة من عمليتين. إما أن ينتشر الإنزيم خطيًا / ينزلق على طول تسلسل الحمض النووي على مسافات قصيرة أو قفزات / يقفز على مسافات طويلة.
  • بمجرد تحديد التسلسل المستهدف ، تحدث تغييرات توافقية مختلفة في الإنزيم وكذلك الحمض النووي. هذه التغييرات التوافقية ، بدورها ، تنشط المركز التحفيزي.
  • يتم تحلل رابطة الفوسفوديستر ، ويتم تحرير المنتج.

تراكيب أشكال BamHI الحرة وغير النوعية والمحددة المرتبطة بالحمض النووي

C. النوع الثالث من إنزيم التقييد

  • تتعرف إنزيمات النوع الثالث على تسلسل الحمض النووي نفسه وميثيله. ومع ذلك ، فإنها تشق ما يقرب من 24-26 زوجًا قاعديًا بعيدًا.
  • وهي تتألف من وحدتين فرعيتين مختلفتين. يتم إجراء التعرف على الحمض النووي وتعديله بواسطة الوحدة الفرعية الأولى- & # 8216M & # 8217 ويتم تقديم نشاط نوكلياز بواسطة الوحدة الفرعية الأخرى "R".
  • يتم مساعدة انقسام الحمض النووي بواسطة ATP وكذلك Mg 2+ بينما SAM مسؤول عن تحفيز الانقسام.
  • يتم شق واحد فقط من خيوط الحمض النووي. ومع ذلك ، لكسر الحمض النووي مزدوج الشريطة ، يلزم وجود موقعين للتعرف في اتجاهين متعاكسين.

نشاط النجوم

بعض إنزيمات التقييد قادرة على شق مواقع التعرف التي تشبه تسلسل التعرف المحدد ولكنها غير متطابقة في ظل ظروف تفاعل غير قياسية (قوة أيونية منخفضة ، ودرجة حموضة عالية).

المتشيزومرات المتشابهة ، والنيوسكيزومرات ، والإيزوكودومرز

  • المتشيزومرات هي إنزيمات التقييد التي تتعرف وتلتصق في نفس موقع التعرف. على سبيل المثال ، يعتبر SphI (CGTAC / G) و BbuI (CGTAC / G) متماثلان لبعضهما البعض.
  • Neoschizomers هي إنزيمات التقييد التي تتعرف على نفس الموقع ولها نمط انقسام مختلف. على سبيل المثال ، SmaI (GGG / CCC) و XmaI (G / GGCCC) عبارة عن مفككات جديدة لبعضها البعض.
  • Isocaudomers هي إنزيمات التقييد التي تتعرف على تسلسلات مختلفة قليلاً ولكنها تنتج نفس النهايات. على سبيل المثال ، يقدم كل من Sau3a و BamHI نهاية مثبتة 5’-GATC-3 على الرغم من أن كلاهما لهما تسلسل تمييز مختلف.

أنماط الانقسام

يتم وصف أنماط الانقسام من HindIII و SmaI و EcoRI و BamHI على النحو التالي. تتعرف معظم الإنزيمات على التسلسلات التي يتراوح طولها من 4 إلى 6 أزواج قاعدية. ومع ذلك ، يمكن أن يصل طولها أيضًا إلى 8 أزواج أساسية.

تتوج عملية انقسام الحمض النووي بواسطة إنزيم التقييد بتشكيل نهايات لزجة أو نهايات غير حادة.

يمكن ربط الأجزاء غير الحادة مع جزء الحمض النووي فقط بمساعدة الوصلات والمحولات.


مختبر شمال غرب المحيط الهادئ الوطني ، ريتشلاند ، واشنطن

ماسي وشركاه ، تشابل هيل ، نورث كارولينا

مختبر شمال غرب المحيط الهادئ الوطني ، ريتشلاند ، واشنطن

ماسي وشركاه ، تشابل هيل ، نورث كارولينا

تسجيل الدخول المؤسسي
قم بتسجيل الدخول إلى مكتبة Wiley Online

إذا سبق لك الحصول على حق الوصول باستخدام حسابك الشخصي ، فيرجى تسجيل الدخول.

شراء فصل واحد
  • عرض غير محدود للمقال / الفصل PDF وأي ملاحق وأرقام مرتبطة.
  • يمكن طباعة المقال / الفصل.
  • يمكن تحميل المادة / الفصل.
  • المادة / الفصل يمكن ليس يتم إعادة توزيعها.

ملخص

يتم تعريف الطلاب على إنزيمات التقييد ومحاكاة نشاط إنزيمات التقييد بالمقص. يتم تقديمهم أيضًا إلى خرائط التقييد ويطلب منهم إجراء تنبؤات بسيطة بناءً على الخريطة. تم اكتشاف إنزيمات التقييد في الأصل من خلال قدرتها على تكسير الحمض النووي الغريب. يمكن أن تميز إنزيمات التقييد بين الحمض النووي الموجود عادة في الخلية والحمض النووي الغريب ، مثل إصابة الحمض النووي للعاثمة. إنهم يدافعون عن الخلية من الغزو عن طريق تقطيع الحمض النووي الغريب إلى قطع وبالتالي جعلها غير فعالة. يبدو أن إنزيمات التقييد مصنوعة حصريًا بواسطة بدائيات النوى. يتم تقديم عمل إنزيمات التقييد ونمذجه في نشاط مقص DNA. يتم تقديم فكرة إعادة الانضمام إلى شظايا التقييد والحاجة إلى التكامل في "ذيول" أحادية الجديلة في نشاط مقص DNA. تلعب إنزيمات التقييد و DNA ligase دور البطولة في استنساخ الحمض النووي. أعطى اكتشاف إنزيمات التقييد للعلماء طريقة لتقطيع الحمض النووي إلى أجزاء محددة. في كل مرة يتم فيها قطع قطعة معينة من الحمض النووي باستخدام إنزيم معين ، يتم إنتاج نفس الأجزاء. يمكن إعادة هذه القطع المحددة معًا بطرق جديدة. تمت صياغة عبارة جديدة لوصف جزيء الحمض النووي الذي تم تجميعه من جزيئات بداية مختلفة: الحمض النووي المؤتلف. بعد الهضم المقيد ، غالبًا ما يتم فصل أجزاء الحمض النووي عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام. يقدم الفصل أيضًا إجابات لأسئلة التمرين.


8.5: إنزيمات التقييد - علم الأحياء

ملخص المقال:

ما هي إنزيمات التقييد؟

إنزيمات التقييد أو استخدام اسمها الصحيح ، نوكليازات مقيدة ، هي نوع من الإنزيمات التي لديها القدرة على "قطع" جزيئات الحمض النووي. غالبًا ما يشار إليهم باسم "المقص الجيني".

يتعرف إنزيم التقييد على تسلسل فريد من النيوكليوتيدات في خيط الحمض النووي ، والذي يتراوح طوله عادةً بين أربعة إلى ستة أزواج قاعدية. يحتوي خيط الحمض النووي التكميلي على نفس التسلسل ولكن في الاتجاه العكسي ، مما يضمن قطع كل من خيوط الحمض النووي في نفس الموقع.

أين توجد إنزيمات التقييد؟

توجد إنزيمات التقييد في العديد من سلالات البكتيريا المختلفة والغرض البيولوجي منها هو المشاركة والمساعدة بنشاط في الدفاع الخلوي. تمنع هذه الإنزيمات و "تقيد" (ومن هنا جاءت تسميتها) أي دنا أجنبي ، أي الحمض النووي الفيروسي الذي قد يدخل الخلية ، عن طريق تدميرها. تحتوي الخلية المضيفة على نظام تعديل تقييد داخلي يحمل في ثناياه عوامل ميثيل الحمض النووي الخاص بها في مواقع محددة لأنزيمات التقييد الخاصة بها ، وبالتالي تحميها من الانقسام الذاتي.

كيف يتم استخدام إنزيمات التقييد في التكنولوجيا الحيوية؟

فيما يتعلق بالتكنولوجيا الحيوية ، تُستخدم إنزيمات التقييد لتقطيع الحمض النووي إلى خيوط أصغر من أجل دراسة الاختلافات والتشابهات في طول الجزء بين الأفراد كما هو الحال في تعدد أشكال طول الجزء المقيد (RFLP) أو في استنساخ الجينات. تم استخدام هذه التقنيات لتحديد أن الأفراد أو مجموعات الأفراد لديهم اختلافات مميزة في التسلسل الجيني وأنماط الانقسام التقييدية في مناطق معينة من الجينوم. أساس بصمة الحمض النووي مأخوذ من هذه المعرفة. تعتمد كل من عمليات الاستنساخ RFLP والجينات على استخدام الاغاروز الكهربائي للهلام للسماح بالفصل الكامل والدقيق لشظايا الحمض النووي.

ما أنواع إنزيمات التقييد الموجودة؟

هناك ثلاثة أنواع مختلفة من إنزيمات التقييد تسمى ببساطة النوع الأول والنوع الثاني والنوع الثالث.

النوع I تقوم إنزيمات التقييد بقطع الحمض النووي في مواقع عشوائية على بعد 1000 أو أكثر من أزواج القواعد من موقع التعرف.

النوع الثالث تقطع إنزيمات التقييد عند 25 زوجًا قاعديًا تقريبًا من موقع التعرف.

تتطلب كل من إنزيمات التقييد من النوع الأول والنوع الثالث طاقة على شكل أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) وقد توجد كأنزيمات أكبر تتكون من وحدات فرعية متعددة.

لكن، النوع الثاني الإنزيمات ، مثل تلك المستخدمة في الغالب في التكنولوجيا الحيوية ، تقطع الحمض النووي ضمن التسلسل المعترف به دون الحاجة إلى ATP ، وهي أصغر وأقل تعقيدًا من النوعين الأول والثالث. يتم إعطاء إنزيمات تقييد النوع الثاني أسماء محددة وفقًا للأنواع البكتيرية التي يتم عزلها منها. على سبيل المثال ، يسمى إنزيم التقييد من النوع الثاني المعزول من E. Coli باسم EcoR1.

تستطيع إنزيمات تقييد النوع الثاني إنشاء نوعين مختلفين من القطع ، والتي تعتمد على ما إذا كانت تقطع كلا الخيطين في مركز تسلسل التعرف ، أو كل حبلا أقرب إلى أحد طرفي تسلسل التعرف. سيولد القطع الأول "نهايات غير حادة" مع عدم وجود بروزات نيوكليوتيد متدلية ، في حين أن القطع الأخير يولد نهايات "لزجة" أو "متماسكة" ، نظرًا لأن كل جزء ناتج من الحمض النووي له نتوء متدلي يكمل الأجزاء الأخرى. يستخدم كلا النوعين على نطاق واسع في التكنولوجيا الحيوية ، لا سيما في مجالات علم الوراثة الجزيئية وعمليات هندسة البروتين.

تستغل التكنولوجيا الحيوية قدرة الإنزيمات المقيدة على شق الحمض النووي بشكل موثوق ودقيق في تسلسلات محددة ، مما أدى إلى انتشار استخدام هذه الأدوات الجينية في العديد من تقنيات الوراثة الجزيئية. يمكن استخدام إنزيمات التقييد لرسم خريطة لشظايا الحمض النووي أو الجينوم بأكمله ، وبالتالي تحديد الترتيب المحدد لمواقع إنزيمات التقييد في الجينوم. تُستخدم إنزيمات التقييد أيضًا بشكل متكرر للتحقق من هوية جزء معين من الحمض النووي ، بناءً على تسلسل مواقع إنزيم التقييد المعروف الذي يحتوي عليه.

كان الاستخدام المهم للغاية للإنزيمات المقيدة في توليد جزيئات الحمض النووي المؤتلف. هذه هي جزيئات DNA التي تتكون من جينات أو شظايا DNA من كائنين مختلفين. عادةً ما يتم ربط جزيء DNA الدائري الصغير المعروف باسم البلازميد ، والذي يتم الحصول عليه من البكتيريا ، بقطعة أخرى من الحمض النووي من جين آخر مهم.

يتم استخدام إنزيمات تقييد النوع الثاني في عدة نقاط خلال هذه العملية. يتم استخدامها لهضم الحمض النووي من كائن التجربة ، من أجل تحضير الحمض النووي للاستنساخ. بعد ذلك ، يتم شق البلازميد البكتيري أو الفيروس البكتيري بإنزيم ينتج عنه نهايات متوافقة. يمكن أن تكون هذه النهايات المتوافقة غير حادة بدون بروز ، أو لها تسلسلات متدلية تكميلية. يتم دمج الحمض النووي من الجين المعني مع الحمض النووي من البلازميد أو الفيروس ، وكلا النوعين من الحمض النووي مرتبطان بإنزيم يسمى DNA ligase.

حول المؤلف / معلومات إضافية:

إخلاء مسؤولية هام: جميع المقالات الموجودة على هذا الموقع هي معلومات عامة فقط وليست نصيحة احترافية أو خبراء. لا نتحمل أي مسؤولية عن صحة أو صحة المعلومات الواردة في هذه المقالة ، أو أي خسارة أو إصابة ناتجة عن ذلك. نحن لا نصادق على هذه المقالات ، ولسنا تابعين لمؤلفي هذه المقالات ولسنا مسؤولين عن محتواها. يرجى الاطلاع على قسم إخلاء المسؤولية للحصول على الشروط الكاملة.


شاهد الفيديو: 30- تكنولوجيا الجينات جزء 1,انزيمات الحمض النووي احياء توجيهي الأردن (قد 2022).