معلومة

هل سيكون تخصيب أشواط البيريميدين لاثنين من النيوكليوتيدات الأخرى مؤشرًا مبكرًا على تلف الحمض النووي؟

هل سيكون تخصيب أشواط البيريميدين لاثنين من النيوكليوتيدات الأخرى مؤشرًا مبكرًا على تلف الحمض النووي؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أقوم بتحليل فئتين من جينات ترميز البروتين لمقارنة خصائصها النسبية. ما ألاحظه هو أن أحدهما ، بالمقارنة مع الآخر ، مخصب في مسارات بيريميدين (اثنان من خام بيريميدينات متتالية). لقد قمت بحساب عدد هذه الأشواط (لا أسميها ديمرز لأنني لا أملك بيانات تبرز ارتباطًا متقاطعًا بين قاعدتين أو أكثر من قواعد بيريميدين) لكل جين ترميز بروتيني يؤدي ثم اختبار مان ويتني الذي يشير إلى أن أحد هذين يتم إثراء مجموعة الجينات فيما يتعلق بالآخر. أفترض أن هذا التخصيب يمكن أن يكون مؤشرًا مبكرًا على الحمض النووي للخضوع لتغييرات التشكل المحلية. من خلال تجربتك ، هل يمكن أن تكون هذه الفرضية موثوقة أم أنني أضلل تمامًا ما أراقبه؟


هل سيكون تخصيب أشواط البيريميدين لاثنين من النيوكليوتيدات الأخرى مؤشرًا مبكرًا على تلف الحمض النووي؟ - مادة الاحياء

a Institut de Chimie Mol & # 233culaire de l’Universit & # 233 de Bourgogne، ICMUB CNRS UMR 6302، UBFC Dijon، France
بريد الالكتروني: [email protected]

b Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale، IPBS، Universit & # 233 de Toulouse، CNRS، UPS، Toulouse، France

c & # 201quipe Labellis & # 233e la Ligue Contre le Cancer 2018 ، تولوز ، فرنسا
بريد الالكتروني: [email protected]

الملخص

إتلاف الحمض النووي هو استراتيجية حالية وفعالة لمكافحة تكاثر الخلايا السرطانية. توجد العديد من الآليات لمواجهة تلف الحمض النووي ، يشار إليها مجتمعة باسم استجابة تلف الحمض النووي (DDR) والتي عادة ما تكون غير منظمة في الخلايا السرطانية. المعرفة الدقيقة بهذه الآليات ضرورية لتحسين استهداف الحمض النووي للعلاج الكيميائي. كشف بحث جديد عن نزع السلاح والتسريح وإعادة الإدماج عن سلسلة من الأهداف العلاجية الواعدة ، والبروتينات والأحماض النووية ، مع التطبيق بشكل ملحوظ عبر نهج يشار إليه باسم العلاج المركب أو الوفاة التركيبية التوليفية. في هذه المراجعة ، نلخص الاكتشافات الأساسية التي أفسحت المجال لاعتبار الحمض النووي هدفًا مضادًا للسرطان ، والتلاعب بمسارات DDR كاستراتيجية قيمة لمكافحة السرطان. نصف بالتفصيل مسارات DDR والإصلاح التي يتم تنشيطها استجابة لتلف الحمض النووي. ثم نلخص الفهم الحالي لطيات الحمض النووي غير B ، مثل G-quadruplexes وتقاطعات الحمض النووي ، عندما يتم تشكيلها ولماذا يمكن أن تقدم هدفًا علاجيًا أكثر تحديدًا مقارنةً بالـ B-DNA الأساسي. أخيرًا ، نقوم بدمج هذه الموضوعات لتصوير استراتيجية العلاج الكيميائي الجديدة والواعدة للغاية والتي تجمع بين عوامل استهداف الحمض النووي الضارة وعوامل الاستهداف DDR. وبالتالي ، تسلط هذه المراجعة الضوء على كيف أدت البيولوجيا الكيميائية إلى ظهور تطورات علمية كبيرة بفضل الجهود البحثية المتعددة التخصصات التي تجمع بين البيولوجيا الجزيئية والخلوية والكيمياء والفيزياء الحيوية. نهدف إلى تزويد القارئ غير المتخصص ببوابة إلى هذا المجال المثير والقارئ المتخصص بمنظور جديد حول أحدث النتائج التي تم تحقيقها والاستراتيجيات الموضوعة.


مقال عن الوراثة والسرطان | أنواع | الأمراض | مادة الاحياء

في هذا المقال سوف نناقش دور الوراثة في زيادة السرطان والتركيز الرئيسي في هذا المقال على أوتار وأوتار السرطان التي تنتشر في العائلات.

1. مقال عن المخاطر الوراثية:

الجينات المشاركة في كبح تكاثر الخلايا:

عندما يقال إن بعض أنواع السرطان وراثية ، فهذا لا يعني أن الناس يرثون السرطان من آبائهم. ومع ذلك ، فإن ما يمكن توريثه هو زيادة القابلية للإصابة بالسرطان. تسمى السرطانات التي تنشأ بسبب هذا الاستعداد الوراثي بالسرطانات العائلية أو السرطانية الوراثية ، بينما يشار إلى السرطانات الأكثر شيوعًا التي لا تظهر نمطاً موروثاً واضحاً على أنها سرطانات متفرقة أو غير وراثية. يمكن للطفرات الموروثة في عدة فئات مختلفة من الجينات أن تؤهب الشخص للإصابة بالسرطان.

لأن الطفرات التي تحدثها المواد المسرطنة عشوائية إلى حد كبير ، يلعب الحظ دورًا أيضًا. إذا كان لدى شخصين تعرّضين معرّفين وغير مألوفين لنفس المواد المسرطنة ، فقد يصاب أحدهما بالسرطان بينما لا يحدث ذلك فقط لأن الطفرات العشوائية حدثت لتتلف الجينات الحرجة لدى الفرد سيئ الحظ.

لكن هناك ما هو أكثر من هذا في القصة. بالنظر إلى نفس مجموعة الظروف بالضبط ، ليس لدى كل شخص نفس فرصة الإصابة بالسرطان لأن الوراثة تجعل بعض الناس أكثر عرضة من غيرهم. ما بين 80 إلى 90٪ من السكان و 8217s تأتي مخاطر الإصابة بالسرطان بشكل عام من العوامل البيئية ونمط الحياة ، مما يترك 10٪ إلى 20٪ مشتقة من التركيب الوراثي.

في حين أن تأثير الوراثة ضئيل بالنسبة للسكان ككل ، فإن هذا لا يعني أن الوراثة هي عامل ثانوي لكل شخص. يرث بعض الأفراد والخجولين الطفرات الجينية التي تزيد بشكل كبير من خطر الإصابة بالسرطان.

في الواقع ، تزيد بعض الطفرات الموروثة من خطر الإصابة بالسرطان إلى ما يقرب من 100٪ ، مما يجعل من المؤكد افتراضيًا أن الشخص سيصاب بالسرطان خلال حياته أو حياتها ، مما يؤدي إلى زيادة مخاطر الإصابة بالسرطان ، ولكنها لا تزال كبيرة. لقد تبين أن دراسة مثل هذه الطفرات توضح فهمنا ليس فقط للسرطانات الوراثية ، ولكن أيضًا لأشكال السرطان غير الوراثية.

الطفرات الموروثة ومخاطر الإصابة بالسرطان:

لبدء مناقشتنا حول الطفرات الموروثة ومخاطر الإصابة بالسرطان ، سيكون من المفيد مراجعة بعض المبادئ الأساسية التي تحكم أنماط الوراثة. تمتلك الخلايا البشرية بخلاف الحيوانات المنوية والبيض نسختين من كل كروموسوم ، وبالتالي يُقال إنها ثنائية الصبغيات (من الكلمة اليونانية دبلوس ، والتي تعني & # 8220double & # 8221).

تحتوي الخلية ثنائية الصبغية العادية على مجموعتين من 23 كروموسومًا ، مما ينتج عنه إجمالي 46 كروموسوم. يشار إلى العضوين من كل زوج كروموسوم على أنهما كروموسومات متجانسة ، ويرث عضو واحد من كل زوج من الأب والآخر من الأم.

نظرًا لأن كل نوع من الكروموسوم موجود في نسختين ، فإن كل جين ممثل في زوج من الكروموسومات المتجانسة سيكون موجودًا في نسختين. قد تكون نسختا كل جين - تسمى الأليلات - متطابقة أو مختلفة قليلاً. إذا كان الأليلين لجين معين متطابقين ، يُقال إن الشخص متماثل الزيجوت بالنسبة لهذا الجين إذا كان الأليلين مختلفين ، فيُقال إن الشخص متغاير الزيجوت.

عندما تكون الخلية متغايرة الزيجوت بالنسبة لجين معين ، غالبًا ما يكون أحد الأليلين هو المسيطر والآخر متنحي. تنقل هذه المصطلحات فكرة أن الأليل السائد يحدد كيف ستظهر السمة في فرد متغاير الزيجوت.

بمعنى آخر ، الشخص الذي لديه أليل مهيمن وأليل متنحي واحد لسمة معينة سيعبر عن الأليل السائد. على الرغم من أن هؤلاء الأفراد غير المتجانسين لا يعبرون عن السمة المتنحية ، إلا أنهم يستطيعون تمرير هذا الأليل المتنحي إلى أطفالهم. للتعبير فعليًا عن سمة متنحية ، يجب أن يكون الشخص متماثلًا للأليل المتنحي (الشكل 1).

ليس كل الأفراد الذين يرثون الطفرات المهيمنة أو المتنحية يعبرون عن الصفة المتوقعة. يُعرف التردد الذي ينتج به أليل سائد أو متنحي متماثل السمة المتوقعة داخل مجموعة سكانية باسم الاختراق. على سبيل المثال ، سنرى قريبًا أن بعض الطفرات الجينية موروثة باعتبارها سمات سائدة تزيد بشكل كبير من خطر إصابة الشخص بالسرطان.

في بعض الحالات ، كل شخص يرث نسخة متحولة يصاب بالسرطان في نهاية المطاف ، وبالتالي يقال إن الاختراق يكون 100٪. وبشكل أكثر شيوعًا ، فإن أقل من 100٪ من الأفراد الذين يرثون نسخة متحولة يصابون بالفعل بالسرطان. في مثل هذه الحالات ، يُقال إن الشكل المتحور للجين يُظهر اختراقًا غير كامل.

يمكن للأفراد الذين يرثون الطفرة ولكن لا يصابون بالسرطان أن ينقلوا الطفرة إلى أطفالهم. ينشأ الاختراق غير الكامل عندما تؤثر الظروف البيئية والتشوهات أو المكونات الأخرى للتركيب الجيني للشخص على ما إذا كان سيتم التعبير عن سمة معينة.

الورم الأرومي الشبكي:

إن فهمنا الحالي للعلاقة بين الطفرات الموروثة في الجينات التي تكبح تكاثر الخلايا وتطور السرطان يرجع كثيرًا إلى دراسة الورم الأرومي الشبكي ، وهو سرطان نادر يصيب الأطفال الصغار وينشأ في خلايا الشبكية الممتصة للضوء الموجودة في الجزء الخلفي من العين . قبل منتصف القرن التاسع عشر ، كان الورم الأرومي الشبكي مميتًا بشكل شبه دائم لأن الأورام لم يتم تشخيصها عادة إلا بعد غزوها من خلال الجزء الخلفي من مقلة العين إلى الدماغ.

أدى اختراع منظار العين في عام 1850 إلى تغيير الوضع بشكل كبير ، حيث كان لدى الأطباء أخيرًا أداة تسمح لهم برؤية داخل العين واكتشاف الأورام قبل أن تغزو الأنسجة المحيطة ، مما يسمح بإزالة الأورام في مراحلها المبكرة.

ومن المفارقات أن هذا التقدم الطبي المذهل كان له نتيجة غير متوقعة: ظهر شكل جديد من الورم الأرومي الشبكي لم يسبق له مثيل. قبل اختراع منظار العين ، نجا عدد قليل من الأطفال المصابين بالورم الأرومي الشبكي حتى سن البلوغ. الآن ما يقرب من 90٪ شُفيوا ويعيشون حياة طبيعية.

عندما يكبر هؤلاء الناجون من الورم الأرومي الشبكي ويكون لديهم أسر خاصة بهم ، فقد يكون أطفالهم أيضًا معرضين لخطر الإصابة بالورم الأرومي الشبكي. عادةً ما يكون لدى الطفل فرصة أقل من 1 من 20000 للإصابة بالورم الأرومي الشبكي ، ولكن في عائلات بعض الناجين من الورم الأرومي الشبكي ، يُصاب ما يقرب من 50٪ من الأطفال بالمرض (الشكل 2).

يُطلق على هذا الشكل المعين من الورم الأرومي الشبكي ، والذي يسري في مجموعات عائلية ، ورم أرومي شبكي عائلي لتمييزه عن الورم الأرومي الشبكي المتقطع الذي يُرى في الأطفال الذين ليس لديهم تاريخ عائلي للإصابة بالمرض. حوالي 40٪ من حالات الورم الأرومي الشبكي هي عائلي والباقي متقطع. غالبًا ما يصاب الأطفال المصابون بالشكل العائلي من المرض بأورام متعددة في كلتا العينين ، في حين أن الورم الأرومي الشبكي المتقطع دائمًا ما يكون ورمًا واحدًا.

نموذج ذو ضربتين لدراسة تطور الورم الأرومي الشبكي:

يتوافق نمط الوراثة المرئي في الورم الأرومي الشبكي العائلي مع انتقال جين واحد متحور من الوالد إلى النسل. لكن ماذا عن الشكل المتقطع للمرض؟ هل نفس الجين متورط ، أم أن شكلي سرطان العين ينشأان بآليات مختلفة؟ في عام 1971 ، اقترح ألفريد كنودسون النموذج ذو الضربتين لمعالجة هذه المشكلة. وفقًا لنظريته ، فإن وجود طفرتين مطلوب لتكوين ورم أرومي شبكي.

في الشكل المتقطع للمرض ، حيث لا توجد طفرات وراثية ، يجب أن تظهر الطفرتان تلقائيًا داخل نفس الخلية. نظرًا لأن معدلات الطفرات النموذجية في الخلايا البشرية تبلغ حوالي واحد في المليون لكل جين لكل انقسام خلية ، فإن فرصة حدوث الطفرتين المطلوبتين في نفس الخلية بعيدة للغاية.

في الورم الأرومي الشبكي العائلي ، تكون طفرة واحدة موروثة بالفعل من أحد الوالدين ، وبالتالي فهي موجودة في جميع خلايا الجسم ، بما في ذلك خلايا الشبكية. لذلك تحتاج خلية شبكية فردية إلى الحفاظ على طفرة إضافية واحدة فقط لتكوين الجينين الطافرين المطلوبين لإنتاج السرطان.

نظرًا لوجود أكثر من عشرة ملايين خلية في شبكية العين ، وبما أن معدل الطفرة يبلغ حوالي واحد في المليون لكل جين لكل انقسام خلوي ، فمن المحتمل أن تتعرض خلية شبكية واحدة أو أكثر تلقائيًا للطفرة الثانية المطلوبة لنشوء السرطان. هذا من شأنه أن يفسر سبب ارتفاع معدلات الورم الأرومي الشبكي في العائلات المصابة بالشكل الوراثي للمرض ولماذا غالبًا ما يصاب الأطفال في هذه العائلات بأورام متعددة.

ومع ذلك ، يترك النموذج السابق سؤالًا مهمًا دون إجابة: هل تشتمل الطفرتان على جينات مختلفة وخجولة ، أم أننا نتعامل مع أليلين معيبين من نفس الجين ، أحدهما مقيم على كل عضو في زوج كرومو وخبيث؟ قدم الفحص المجهري لكروموسومات خلايا الورم الأرومي الشبكي دليلًا مبكرًا.

وجد أحيانًا أن الخلايا المأخوذة من أفراد مصابين بالورم الأرومي الشبكي العائلي تعرض مقطعًا محذوفًا في منطقة معينة من الكروموسوم 13. علاوة على ذلك ، فقد لوحظ الحذف ليس فقط في الخلايا السرطانية ولكن في جميع خلايا الجسم ، مما أدى إلى حدوث ورم أرومي شبكي متورط. الجين الموجود في المنطقة المحذوفة من الكرومو والخداع 13.

لوحظ حذف مماثل في بعض الأحيان في ورم أرومي شبكي متقطع أيضًا (على الرغم من أنه في هذه الحالة فقط في الخلايا السرطانية وليس في أي مكان آخر في الجسم). مجتمعة ، تشير هذه الملاحظات إلى أن الكروموسوم 13 يحتوي على جين يرتبط فقدانه بكل من الأشكال الوراثية وغير الوراثية للورم الأرومي الشبكي.

في حد ذاته ، فإن وراثة حذف واحد في هذه المنطقة من الكروموسوم 13 لا تسبب السرطان. لكي يتطور السرطان ، يجب أن تظهر طفرة تشمل نفس المنطقة من النسخة الثانية من الكروموسوم 13 أثناء الجولات العديدة لانقسام الخلايا التي تحدث أثناء تشكل الشبكية. تم توطين هذه الطفرة الثانية في النهاية في منطقة صغيرة من الكروموسوم 13 تحتوي على جين أطلق عليه اسم RB (لـ & # 8220 ورم أرومي شبكي & # 8221).

لذلك يمكن أخيرًا إعادة صياغة نظرية Knudson & # 8217s ذات الضربتين للورم الأرومي الشبكي بعبارات أكثر دقة (الشكل 3). تتضمن الضربتان & # 8220two & # 8221 المطلوبة لتطوير الورم الأرومي الشبكي نسختين من جين RB الذي نرثه كل منا ، واحدة من أبينا والأخرى من أمنا.

كل & # 8220hit & # 8221 عبارة عن طفرة (أو حذف) تعطل وظيفة نسخة واحدة من جين RB. وفقًا لهذا النموذج ، فإن طفرة RB متنحية لأن كلا الأليلين يجب أن يكونا متحولين (أو محذوفين) حتى ينشأ السرطان. ومع ذلك ، فإن متلازمات خطر الإصابة بالسرطان التي يرث فيها الأطفال خطرًا مرتفعًا جدًا للإصابة بالسرطان هي سمة سائدة لأن طفرة واحدة فقط من العصعص الصدغي يجب أن تُورث لخلق خطر مرتفع للغاية للإصابة بالسرطان.

إذا ورث الطفل مثل هذا الجين المعيب RB ، فإن طفرة النسخة الجيدة من الجين RB في خلية شبكية واحدة هي كل ما هو مطلوب لتطور السرطان. نظرًا لوجود ملايين الخلايا في شبكية العين ، وبما أن معدلات الطفرات الطبيعية تبلغ حوالي واحد في المليون لكل جين لكل انقسام خلية ، فإن فرصة حدوث طفرة معطلة من هذا القبيل في خلية شبكية واحدة على الأقل تكون عالية جدًا.

ما يقرب من 90 ٪ من الأطفال الذين يرثون جين RB الطافر من أحد الوالدين يكتسبون في النهاية هذه الطفرة الثانية ويصابون بالسرطان. بعبارة أخرى ، يبلغ تغلغل الورم الأرومي الشبكي لدى الأطفال الذين يرثون جينًا معيبًا واحدًا من RB 90٪.

في العائلات التي ليس لديها تاريخ للإصابة بالورم الأرومي الشبكي ، يولد الأطفال بنسختين جيدتين من جين RB. نتيجة لذلك ، لا يظهر الورم الأرومي الشبكي إلا في حالة حدوث طفرة في نسختين من جين RB في نفس الخلية ، مما يؤدي إلى نفس النتيجة الجينية كما في الورم الأرومي الشبكي العائلي.

يعتبر الورم الأرومي الشبكي أحد أنواع السرطان القليلة جدًا التي يبدو أن تعطيل كلتا النسختين من جين واحد أمر بالغ الأهمية في التسبب مباشرة في الإصابة بالسرطان. من الشائع أن تظهر السرطانات كعملية متعددة الخطوات تتضمن طفرات متتابعة في عدة جينات مختلفة.

RB الجين كقمع لتكاثر الخلايا:

أي نوع من الجين هو RB الذي يجعله مركزيًا جدًا في تطور السرطان؟ المجموعات الوحيدة من الجينات المسببة للسرطان التي ناقشناها حتى الآن هي الجينات الورمية ، وهي فئة من الجينات يمكن أن يؤدي وجودها إلى تطور السرطان. على النقيض من ذلك ، فإن RB هو جين يرتبط غيابه (أو تعطيله) بدلاً من وجوده ويخجل من تطور السرطان. يجب أن يعمل مثل هذا الجين وفقًا لمبادئ مختلفة تمامًا عن الجينات الورمية ، والتي ترمز للبروتينات التي تعزز تكاثر الخلايا وبقائها.

اتضح أن الوظيفة الطبيعية للجين RB ليست تعزيز تكاثر الخلايا وبقائها بل تقييدها. إن التخلص من الجين الذي يقيد تكاثر الخلايا وبقائها يشبه تحرير دواسة الفرامل في السيارة ، بمعنى آخر ، إنه يسمح للخلايا بالتكاثر بطريقة غير منضبطة.

الطريقة التي يؤدي بها جين RB وظيفته التقييدية الطبيعية هي عن طريق تشفير بروتين Rb ، وهو جزيء يلعب دورًا رئيسيًا في التحكم في تكاثر الخلايا من خلال تنظيم المرور عبر نقطة تقييد دورة الخلية. يساعد دور بروتين Rb في التحكم في التقدم خلال دورة الخلية في تفسير سبب ملاحظة الورم الأرومي الشبكي عند الأطفال الصغار فقط.

بحلول الوقت الذي يبلغ فيه الطفل 5 أو 6 سنوات ، تكون شبكية العين مكتملة التكوين وتخرج معظم خلايا الشبكية من دورة الخلية وتتوقف عن الانقسام بشكل دائم. بمجرد حدوث ذلك ، لم تعد هذه الخلايا عرضة للتكاثر غير المنضبط لأن دورة الخلية قد توقفت بشكل دائم.

يشار إلى جينات مثل RB - التي تفتح خسارتها الباب أمام تكاثر الخلايا الخجولة والسرطان - باسم الجينات الكابتة للورم. هذا الاسم خاطئ إلى حد ما ، ومع ذلك ، لأن الوظيفة الطبيعية للجينات الكابتة للورم هي كبح تكاثر الخلايا بشكل عام ، وليس فقط تكوين الأورام.

ولكن إذا كان الجين RB متورطًا في التقييد العام لتكاثر الخلايا وتكاثرها ، ألا ينبغي أن يؤدي فقدانها إلى الإصابة بسرطانات في أنسجة أخرى غير الشبكية؟ في الواقع ، ليس الورم الأرومي الشبكي هو السرطان الوحيد الذي يظهر عند الأطفال الذين يرثون RB muta & shytions. غالبًا ما يصاب هؤلاء الأفراد بنوع ثانٍ من السرطان أيضًا ، عادةً ما يكون ساركوما عظمية ولكن في بعض الأحيان سرطان الدم أو سرطان الجلد أو سرطان الرئة أو سرطان المثانة. تظهر الخلايا السرطانية في هذه السرطانات طفرات في النسخة الثانية من جين RB ، تمامًا كما يحدث مع الورم الأرومي الشبكي.

تم اكتشاف طفرات RB أيضًا في عدة أنواع من السرطان التي لا تنطوي على استعداد وراثي و shyposition. على سبيل المثال ، سرطان الرئة ذو الخلايا الصغيرة - وهو نوع من السرطان ينشأ بشكل رئيسي لدى مدخني السجائر الذين ليس لديهم استعداد عائلي للإصابة بالسرطان - غالبًا ما تظهر طفرات RB التي يتم إنشاؤها بواسطة المواد المسرطنة الموجودة في دخان التبغ بدلاً من كونها موروثة.

وبالمثل ، فإن طفرات RB غير الموروثة تم تضمينها وتقلصها في تطوير بعض سرطانات المثانة والثدي. لذلك يلعب الجين RB دورًا أوسع في تطور السرطان مما قد يوحي به اسمه. يسمى الجين & # 8220RB & # 8221 لأنه تم تفكيكه في البداية في العائلات المعرضة لخطر الإصابة بالورم الأرومي الشبكي ، لكن دوره في السيطرة على تكاثر الخلايا والسرطان أوسع بكثير.

داء السلائل الغدي العائلي:

الجين RB هو مثال على الجين الذي يحمل مخاطر عالية لسرطان الطفولة النادر عندما يتم توريثه في شكل متحور (أو محذوف). تخلق مجموعة أخرى من الجينات استعدادات وراثية لبعض أنواع السرطانات الشائعة لدى البالغين. على سبيل المثال ، يرتبط حوالي 5٪ من جميع حالات سرطان القولون ارتباطًا مباشرًا بطفرات وراثية في مجموعة صغيرة من الجينات التي تزيد من خطر الإصابة بسرطان القولون.

على الرغم من أن 5 ٪ ليست نسبة عالية جدًا ، إلا أنها تمثل عددًا كبيرًا من الأشخاص لأن سرطان القولون هو من بين أكثر أنواع السرطان شيوعًا عند البالغين. يتم تشخيص حوالي 150.000 حالة جديدة من سرطان القولون في الولايات المتحدة كل عام ، لذا فإن 5٪ من 150.000 حالة تساوي 7500 حالة سرطان القولون الجديدة الناتجة عن عوامل وراثية عالية الخطورة.

في حالة الورم الأرومي الشبكي ، تكون نسبة أكبر بكثير من الحالات وراثية (حوالي 40٪) ، لكن الورم الأرومي الشبكي نادر جدًا. يتم اكتشاف ما يقرب من 200 حالة جديدة من الورم الأرومي الشبكي كل عام ، لذا فإن معدل 40٪ يتوافق مع 80 حالة جديدة من ورم أرومي شبكي وراثي مقارنة بـ 7500 حالة جديدة من سرطان القولون الوراثي.

تم ربط الطفرات في العديد من الجينات المختلفة بسرطان القولون الوراثي. أحدهما هو الجين المسؤول عن داء البوليبات الغدي العائلي ، وهي حالة وراثية تتطور فيها العديد من الأورام الحميدة في القولون. يشير مصطلح البوليبات إلى كتلة صغيرة من الأنسجة تنشأ من البطانة الداخلية لعضو مجوف وتبرز في التجويف. معظم سلائل القولون هي أورام غدية صغيرة - أي أورام حميدة تتكون من خلايا غدية.

يفسر وجود الاورام الحميدة التي هي أورام غدية سبب تسمية المرض بداء السلائل الورمي الغدي العائلي. في الأشخاص الذين يرثون هذه الحالة ، يصبح السطح الداخلي للقولون مغطى بالسجاد بمئات أو حتى أنت وخجول من الاورام الحميدة (الشكل 4) ، ومن المحتمل أن يتحول أحد الأورام الحميدة على الأقل إلى أورام خبيثة بحلول الوقت الذي يبلغ فيه الشخص 40 عامًا.

ما لم تتم إزالة القولون بالكامل ، فإن كل شخص مصاب بداء السلائل الورمي الغدي العائلي تقريبًا سيصاب بسرطان القولون. هؤلاء الأفراد معرضون أيضًا لخطر متزايد للإصابة بسرطان القناة الصفراوية والأمعاء الدقيقة والمعدة. في اليابان ، حيث يكون سرطان المعدة أكثر شيوعًا منه في الولايات المتحدة ، قد يكون خطر الإصابة بسرطان المعدة أكبر من سرطان القولون.

تتواجد الطفرة الموروثة المسؤولة عن داء البوليبات الغدي العائلي في جين يسمى APC (لداء البوليبات الغدي القولوني). كما في حالة الجين RB ، ينطبق نموذج الضربتين على سلوك جين APC. الأفراد المصابون بداء السلائل الورمي العائلي يرثون نسخة واحدة معيبة أو مفقودة من APC من أحد الوالدين ، ثم تحدث طفرة معطلة في النسخة الثانية من الجين في الخلية الظهارية للقولون.

يؤدي الخسارة الناتجة في وظيفة APC إلى تكاثر الخلايا غير المنضبط والذي يمكن أن يمهد الطريق لتطور السرطان. لذلك ، فإن جين APC ، مثل جين RB ، هو مثال على الجين الكابت للورم - أي الجين الذي يرتبط فقدانه أو تعطيله بتطور السرطان.

عادةً ما يمارس جين APC تأثيراته المقيدة على تكاثر الخلايا عن طريق إنتاج بروتين ، يُسمى أيضًا APC ، يثبط مسار إشارات Wnt. (& # 8220Wnt & # 8221 هو اختصار لـ & # 8220 wingless-type ، & # 8221 الذي يشير إلى مصير ذباب الفاكهة مع طفرات في هذا المسار.) يلعب مسار Wnt دورًا بارزًا في تنظيم تكاثر الخلايا والخجل والتمايز ، خاصة أثناء التطور الجنيني.

عندما تظهر طفرات APC التي تتسبب في فقدان بروتين APC الوظيفي ، فإن النشاط الناتج غير المنضبط لمسار Wnt يؤدي إلى تكاثر الخلايا وخجلها. الخلايا الظهارية المبطنة للقولون حساسة بشكل خاص لمثل هذه التأثيرات. في الأشخاص الذين يرثون طفرة APC ، يؤدي الانتشار المفرط لظهارة القولون إلى تكوين العديد من الأورام الحميدة ، وسرطان القولون عاجلاً أم آجلاً.

هذا الارتباط بين APC muta & shytions وسرطان القولون لا يقتصر على طفرات سرطان القولون الوراثي في ​​APC تحدث أيضًا في حوالي ثلثي الأشكال الأكثر شيوعًا لسرطان القولون التي تظهر في الأشخاص الذين ليس لديهم تاريخ عائلي للمرض.

متلازمة Li-Fraumeni:

تتضمن المتلازمتان الوراثيتان الموصوفتان حتى الآن خطرًا وراثيًا للإصابة بنوع رئيسي واحد من السرطان ، إما الورم الأرومي الشبكي للأفراد الذين يرثون جين RB الطافر أو سرطان القولون لأولئك الذين يرثون جين APC الطافر. في الحالة الوراثية التي سيتم وصفها بعد ذلك ، والتي تسمى متلازمة Li-Fraumeni ، تنتقل القابلية للإصابة بالسرطان بشكل عام بدلاً من نوع معين من السرطان من الوالدين إلى الأبناء.

يوضح النسب العائلي الموضح في الشكل 5 مثل هذه الحالة. المرأة التي يميزها السهم هي نموذجية لشخص قد يطلب الاستشارة الوراثية بسبب الخوف من ذلك & # 8220 السرطان يسري في الأسرة. & # 8221

أصيب والدها بسرطان القولون عندما كان في الأربعين من عمره ، وساركوما في سن 45 ، وسرطان الرئة عندما كان عمره 53 عامًا ، أصيبت أختها بسرطان المخ عندما كان مراهقًا أصيب شقيقها بساركوما عظمية في سن 3 سنوات وساركوما عضلية مخططة (سرطان عضلي هيكلي) في سن 14 عامًا. أصيب ابن عمه بسرطان الدم عندما كان في سن المراهقة ، وتوفيت عمة بسرطان الثدي ، وكان عمها مصابًا بسرطان المعدة ، وتوفي جدها وزوجها بسبب سرطان الجلد.

ما يميز هذا السيناريو بوضوح عن المتلازمات الوراثية الأخرى هو تنوع السرطانات المعنية. الأفراد الذين يرثون الجين RB أو APC الطافر لديهم فرصة بنسبة 90 ٪ تقريبًا لتطوير نوع واحد من السرطان ، إما الورم الأرومي الشبكي في حالة سرطان القولون أو سرطان القولون في حالة APC.

تحمل الطفرة المسؤولة عن متلازمة Li-Fraumeni أيضًا حوالي 90 ٪ من خطر الإصابة بالسرطان ، ولكن لا يوجد سرطان واحد هو السائد. تشمل السرطانات المرتبطة بشكل شائع بـ Li-Fraumeni syn & shydrome الساركوما العظمية وسرطان الثدي وسرطان الدم وسرطان الغدة الكظرية وأورام المخ وساركوما الأنسجة الرخوة والأورام الميلانينية وسرطان المعدة والقولون والرئة.

تظهر هذه السرطانات عند البالغين وكذلك الأطفال ، ولكن سن ظهورها عادة ما يكون أبكر مما هو نموذجي لنوع معين من السرطان المعني. قد يصاب فرد واحد بعدة أنواع مختلفة من السرطان على التوالي ، وهو ما نادرًا ما يحدث مع السرطانات غير الوراثية.

كما قد تتوقع من تنوع السرطانات المعنية ، تنشأ متلازمة Li-Fraumeni من عيوب في جين مهم للتحكم في تكاثر الخلايا والبقاء على قيد الحياة في العديد من الأنسجة. الجين المعني هو الجين p53 (يسمى أيضًا TP53 في البشر). الجين p53 pro & shyduces البروتين p53 ، في عدة سياقات مختلفة.

يلعب البروتين p53 دورًا مهمًا للغاية في المسار الذي يتسبب في تدمير الخلايا ذات الحمض النووي التالف ذاتيًا عن طريق موت الخلايا المبرمج ، كما أن الطفرات التي يسببها ضوء الشمس في الجين p53 تؤدي إلى تطور سرطان الجلد وفيروس على البروتين المشترك الذي ينتجه فيروس الورم الحليمي البشري. يرتبط ويعزز تدمير البروتين p53 ، وبالتالي يساهم في تطور سرطان عنق الرحم. يشير تنوع هذه الأمثلة إلى أن بروتين p53 مهم على نطاق واسع في الحماية من تطور السرطان.

لذلك ليس من المستغرب أن يكون الأفراد المصابون بمتلازمة Li-Fraumeni ، الذين يرثون طفرة في نسخة واحدة من الجين p53 ، معرضين لخطر الإصابة بالسرطان. من المحتمل أن تظهر طفرة في النسخة الثانية من الجين p53 في حوالي واحد في المليون لكل خلية مقسمة.

نظرًا لأن بلايين الخلايا تنقسم في جميع أنحاء الجسم خلال عمر الشخص ، فإن الاحتمال مرتفع للغاية أن تظهر طفرة تعطل النسخة الثانية الجيدة من الجين p53 في خلية واحدة على الأقل في مكان ما من الجسم. نظرًا لأن السرطانات تتطور عند فقدان وظيفة p53 ، فإن الجين p53 هو مثال آخر (مثل RB و APC) لجين مثبط للورم.

متلازمة Li-Fraumeni هي حالة نادرة للغاية ، فقط بضع مئات من العائلات تم تشخيصها وإصابتها بهذه الحالة في جميع أنحاء العالم. لكن هذا لا يعني أن طفرات البروتين p53 نادرة الحدوث في السرطانات البشرية. على العكس من ذلك ، تم اكتشاف طفرات p53 في ما يقرب من نصف جميع السرطانات غير الوراثية ، مما يجعله الجين الأكثر شيوعًا في سرطان الإنسان.

في بعض الحالات ، ثبت بوضوح وجود صلة بين طفرات البروتين p53 ومسرطنات بيئية معينة ، على سبيل المثال ، دور طفرات البروتين p53 التي يسببها ضوء الشمس في سرطانات الجلد غير الميلانينية.

بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على حوالي نصف سرطانات الرئة تظهر طفرات p53 في قواعد الحمض النووي التي تهاجمها الهيدروكربونات متعددة الحلقات الموجودة في دخان التبغ. الطفرات التي يسببها المسرطن في p53 شائعة أيضًا في العديد من أنواع السرطان الأخرى ، بما في ذلك سرطانات القولون والبنكرياس والمبيض والمثانة والكبد والمعدة والثدي.

متلازمات السرطان الوراثية:

وصفت متلازمات السرطان الثلاث الموروثة حتى الآن:

أنا. الورم الأرومي الشبكي العائلي

ثانيا. داء البوليبات الغدي العائلي ، و

ثالثا. متلازمة Li-Fraumeni - تشترك في العديد من السمات.

(1) يحدث كل منها بسبب طفرة في جين واحد مثبط للورم (RB أو APC أو p53) موروث من أحد الوالدين.

(2) إن ارتفاع خطر الإصابة بالسرطان هو سمة سائدة لأن طفرة واحدة فقط يجب أن تُورث لنقل مخاطر عالية جدًا للإصابة بالسرطان ، عادة في حدود 90٪ إلى 100٪.

(3) لكي ينشأ السرطان ويظهر بخجل ، يجب أيضًا أن تصبح النسخة الثانية من الجين غير نشطة (& # 8220second hit & # 8221 من نموذج الضربة المزدوجة). احتمالية حدوث ذلك في خلية واحدة على الأقل عالية جدًا.

(4) إذا كان لدى الشخص المصاب بإحدى هذه المتلازمات الوراثية أطفال ، فسيكون لكل طفل فرصة بنسبة 50:50 في وراثة الخلل الجيني ومخاطر الإصابة بالسرطان المرتبطة به (انظر الشكل 3 ، على اليسار).

(5) الأطفال الذين هم من بين الـ 50٪ الذين لا يتلقون عيبًا جينيًا لن يكونوا في خطر متزايد للإصابة بالسرطان ولن ينقلوا الخطر إلى أطفالهم.

(6) الطفرات الجينية المسؤولة عن هذه المتلازمات السرطانية الوراثية تشمل تعطيل أو فقدان الجين الكابت للورم الذي يتمثل دوره الطبيعي في كبح تكاثر الخلايا.

(7) يمكن أن تسبب الطفرات التي يسببها المسرطن في نفس الجينات الكابتة للورم سرطانات غير وراثية.

بالإضافة إلى RB و APC و p53 ، تتصرف العديد من الجينات الأخرى المثبطة للورم وفقًا لنفس المبادئ (الجدول 1 ، أعلى). ومع ذلك ، على الرغم من أن هذه الجينات تشترك جميعها في خاصية تقييد تكاثر الخلايا وبقائها ، إلا أنها تختلف اختلافًا كبيرًا في الآليات الجزيئية المعنية.

2. مقال عن المخاطر الوراثية: الجينات التي تؤثر على إصلاح الحمض النووي والاستقرار الجيني:

إن متلازمات السرطان الوراثية التي نوقشت حتى الآن ناتجة عن طفرات فقدان الوظيفة في الجينات الكابتة للورم والتي يتمثل دورها الطبيعي في كبح تكاثر الخلايا والبقاء على قيد الحياة. تعمل مجموعة ثانية من الجينات الكابتة للورم من خلال مجموعة مختلفة جذريًا من الآليات التي تتضمن إصلاح الحمض النووي واستقرار الكروموسوم.

في حين أن المجموعة الأولى من مثبطات الأورام تنتج بروتينات تشارك في التحكم في تكاثر الخلايا ، وبالتالي يؤدي فقدانها مباشرة إلى تكوين الورم ، فإن فقدان الجينات المشاركة في إصلاح الحمض النووي أو الحفاظ على استقرار الكروموسوم والخداع يعمل بشكل غير مباشر عن طريق السماح بزيادة معدل الطفرة لجميع الجينات . يزيد معدل الطفرات المتزايد هذا من احتمالية أن تؤدي الطفرات العشوائية إلى تعطيل الجينات التي تؤثر على تكاثر الخلايا بشكل مباشر.

يتم استخدام المصطلحين حراس البوابة والقائمين على الرعاية للتمييز بين فئتي مثبطات الأورام. تعتبر الجينات مثل RB و APC و p53 ، التي يتمثل دورها الطبيعي في كبح تكاثر الخلايا ، & # 8220gatekeepers & # 8221 لأن فقدانها يفتح البوابات لتشكيل الورم مباشرة. من ناحية أخرى ، يُنظر إلى الجينات المشاركة في صيانة وإصلاح الحمض النووي على أنها & # 8220 Caretakers & # 8221 التي تحافظ على سلامة جينوم الخلية & # 8217s (إجمالي معلوماتها الجينية).

لا يؤثر فقدان الجين المسؤول بشكل مباشر على تكاثر الخلايا. بدلاً من ذلك ، يؤدي إلى اضطرابات في صيانة وإصلاح الحمض النووي مما يؤدي إلى زيادة معدل الطفرات لجميع الجينات (بما في ذلك حراس البوابة) ، ولا ينشأ السرطان إلا من خلال الطفرات اللاحقة لهذه الجينات الإضافية. سنقوم الآن بفحص بعض متلازمات السرطان الوراثية التي تسببها الطفرات في الجينات القائمة على الرعاية.

Xeroderma Pigmentosum هو حساسية موروثة لسرطان الجلد الناجم عن أشعة الشمس:

جاءت التقارير الأولى عن وجود علاقة بين إصلاح الحمض النووي وقابلية الإصابة بالسرطان من دراسة مرض وراثي نادر يعرف باسم جفاف الجلد المصطبغ. الأفراد الذين يعانون من هذه الحالة حساسون جدًا للأشعة فوق البنفسجية لدرجة أن أشعة الشمس يمكن أن تكون قاتلة. إن التعرض لدقائق قليلة من ضوء النهار يكفي لإحداث حرقة شديدة وأنواع مختلفة من سرطانات الجلد ، بما في ذلك سرطان الخلايا القاعدية وسرطان الخلايا الحرشفية وسرطان الجلد.

يُشار أحيانًا إلى الأطفال المصابين بجفاف الجلد المصطبغ لأنه من الآمن لهم الخروج في الليل فقط & # 8220 أطفال القمر. & # 8221 حتى أن هناك معسكرًا خاصًا في شمال ولاية نيويورك ، يُطلق عليه Camp Sundown ، والذي يسمح للأطفال المتضررين بالمشاركة في الأنشطة الترفيهية العادية والخجولة ولكن في ساعة زمنية مختلفة: تبدأ الأنشطة في الهواء الطلق بعد غروب الشمس وتحدث أثناء الليل ، مما يسمح للأطفال بالعودة إلى منازلهم. وخلف ستائر مسحوبة بأمان مع شروق الشمس.

اهتم العلماء من ناسا بالمشكلة ، حيث عملوا على تصميم بدلة فضائية خاصة توفر حماية كافية من أشعة الشمس للسماح للأطفال المصابين بجفاف الجلد المصطبغ باللعب في الهواء الطلق من حين لآخر (الشكل 6).

لا يُظهر Xeroderma pigmentosum نفس نمط الوراثة ، والذي تضمن طفرة واحدة موروثة من الأم أو الأب. يتطلب Xeroderma pigmentosum نسختين متحورتين من نفس الجين لتكون موروثة وخجولة ، واحدة من كل والد.

نظرًا لأنه من غير المحتمل أن يحمل كلا الوالدين نسخة متحولة من نفس الجين ، فإن xero & shyderma pigmentosum هي حالة نادرة جدًا. ومع ذلك ، إذا حدث أن يحمل كل والد طفرة في نفس الجين المسؤول (جنبًا إلى جنب مع نسخة طبيعية ثانية) ، فسيكون لأطفالهم فرصة بنسبة 50٪ لوراثة النسخة الطافرة من والدهم وفرصة بنسبة 50٪ لوراثة نسخة متحولة من والدتهم. وبالتالي ، فإن الاحتمال الإجمالي أن يرث أي طفل كلاً من الطفرات وأن يكون مصابًا بجفاف الجلد المصطبغ هو 50٪ × 50٪ = 25٪.

نظرًا لأنه يجب توريث نسختين متحولة من نفس الجين لإحداث المرض ، فإن جفاف الجلد المصطبغ يُظهر نمطًا متنحيًا للوراثة. لذلك ، تبدو بيدي وخجول الأسرة من أجل جفاف الجلد المصطبغ مختلفة عن أنساب ورم الشبكية الأرومي العائلي ومتلازمة لي فراوميني.

في الورم الأرومي الشبكي العائلي ومتلازمة Li-Fraumeni ، اللذان يُظهران نمطًا سائدًا من الوراثة ، يكون الآباء الذين ينقلون السمة عالية الخطورة إلى أطفالهم خطرًا كبيرًا للإصابة بالسرطان لأن السمة هي السائدة ، وسيكتسب 50 ٪ من أطفالهم حالة عالية الخطورة (انظر الشكلين 2 و 5).

مع متلازمات السرطان التي تظهر نمطاً متنحيًا من الميراث ، مثل جفاف الجلد المصطبغ ، لا يكون الوالدان معرضين لخطر الإصابة بالسرطان لأن كل منهما يحمل جينًا متنحيًا واحدًا فقط ، ومع ذلك ، ستظهر الحالة عالية الخطورة في 25٪ من نسلهم (الشكل 7).

على الرغم من اختلاف أنماط الوراثة لديهم ، فإن السلوك الأساسي للجينات الكابتة للورم المشاركة في متلازمات السرطان المتنحية والمهيمنة لا يختلف كما يبدو أن هذه الفروق توحي. مع متلازمات السرطان المتنحية ، ينشأ خطر كبير للإصابة بالسرطان عندما يتم توريث نسختين معيبتين من الجين وبالتالي تُفقد وظيفة الجين الطبيعية (الشكل 8 أ).

مع متلازمات السرطان السائدة (الشكل 8 ب) ، فإن وراثة نسخة معيبة واحدة تضفي خطرًا كبيرًا للإصابة بالسرطان ، لكن السرطان لا يظهر إلا بعد تحور النسخة الثانية أو فقدانها (& # 8220second hit & # 8221 من نموذج الضربتين). وبالتالي فإن النتيجة النهائية متشابهة في كلتا الحالتين ، أي أن كلتا نسختين من الجين الكابت للورم تفقد وظيفتها.

Xeroderma Pigmentosum هو Cمستعمل عن طريق العيوب الموروثة في إصلاح الختان:

القابلية للإصابة بسرطان الجلد التي هي السمة المميزة لجفاف الجلد المصطبغ تُعزى إلى عيوب موروثة في إصلاح الحمض النووي. في الأشعة فوق البنفسجية التي تمتصها خلايا الجلد تؤدي إلى طفرات في الحمض النووي - وخاصة ثنائيات البيريميدين - التي يمكن أن تسبب السرطان إذا لم يتم إصلاح الطفرات.

تتمثل إحدى آليات إصلاح ثنائيات البيريميدين في إصلاح الختان ، وهو مسار يتعرف على التشوهات الرئيسية في الحلزون المزدوج للحمض النووي ويستخدم سلسلة من الإنزيمات لاستئصال المنطقة التالفة وملء الفجوة الناتجة بالتسلسل الصحيح للنيوكليوتيدات.

تم الإبلاغ لأول مرة في أواخر الستينيات من القرن الماضي أن الخلايا من الأفراد المصابين بجفاف الجلد المصطبغ غير قادرة على إجراء إصلاح الختان. ولذلك فإن طفرات الحمض النووي تتراكم وتنتشر ويظهر السرطان في النهاية. كشفت الدراسات اللاحقة أن الطفرات في سبعة جينات مختلفة يمكن أن تسبب جفاف الجلد المصطبغ من خلال تأثيرها على إصلاح الختان.

كل من هذه الجينات السبعة ، المعينة XPA من خلال XPG ، ترمز لإنزيم مشارك في خطوة مختلفة من مسار إصلاح الختان. إن وراثة نسختين من التبرز والبراز لأي من هذه الجينات السبعة يوقف إصلاح الختان ويخلق متلازمة الاستعداد للسرطان التي هي السمة المميزة لجفاف الجلد المصطبغ.

ينتج الجين الثامن ، المسمى XPV ، شكلاً مختلفًا من جفاف الجلد المصطبغ حيث لا يتأثر مسار إصلاح الختان ولكن الأفراد مع ذلك يرثون حساسية متزايدة للسرطانات التي يسببها ضوء الشمس. تؤثر هذه الطفرة الخاصة على إنزيم بوليميراز الدنا ƞ (إيتا) ، وهو شكل خاص من بوليميريز الدنا الذي يحفز تخليق الترانسليسين - أي تخليق امتدادات جديدة خالية من الأخطاء من الدنا عبر المناطق التي يتلف فيها خيط القالب.

إن بوليميريز DNA قادر على تكرار الحمض النووي بدقة في المناطق التي توجد بها ثنائيات بيريميدين ، وإدخال القواعد المناسبة بشكل صحيح. لذلك ، فإن العيوب الموروثة في DNA poly & shymerase n ، مثل العيوب الموروثة في إصلاح الختان ، تتداخل مع قدرة الخلايا على تصحيح ثنائيات البيريميدين الناتجة عن الأشعة فوق البنفسجية.

نظرًا لأن الأفراد المصابين بجفاف الجلد المصطبغ لا يمكنهم إصلاح ثنائيات البيريميدين ، فإنهم يظهرون معدلات سرطان الجلد أعلى بمقدار 2000 ضعف من المعدل الطبيعي. علاوة على ذلك ، فإن متوسط ​​أعمارهم للإصابة بسرطان الجلد هو 8 سنوات ، مقارنة بعمر 60 بالنسبة لعامة السكان. تتسبب العيوب في إصلاح الحمض النووي المرتبطة بجفاف الجلد المصطبغ أيضًا في زيادة سرطانات المخ والرئة والمعدة والثدي والرحم والخصيتين وسرطان الدم بمقدار 20 ضعفًا.

يحدث سرطان القولون الوراثي بسبب عيوب وراثية في إصلاح عدم التطابق:

متلازمة وراثية ثانية ، تسمى سرطان القولون الوراثي غير السلائل (HNPCC) ، تزيد أيضًا من خطر إصابة الشخص بسرطان القولون ، في هذه الحالة بسبب خلل وراثي في ​​إصلاح الحمض النووي.

يميل السرطان مرة أخرى إلى الظهور من زوائد القولون ، على الرغم من أن الأشخاص المصابين بـ HNPCC عادة ما يكون لديهم عدد قليل من السلائل بدلاً من مئات أو آلاف الأورام الحميدة التي لوحظت مع داء البوليبات الغدي العائلي. (داء البوليبات يعني حرفيًا & # 8220 عددًا من البوليبات & # 8221 ، لذا فإن وجود عدد قليل من السلائل في HNPCC يفسر سبب تضمين مصطلح غير السلائل كجزء من اسمه)

تؤدي الطفرات الموروثة المسؤولة عن HNPCC إلى تعطيل مسار إصلاح عدم التطابق ، وهو المسؤول عادةً عن تصحيح الأخطاء التي تتضمن القواعد التي يتم إقرانها بشكل غير صحيح بين خيطي الحلزون المزدوج للحمض النووي.يتطلب إصلاح عدم التطابق مشاركة العديد من البروتينات المختلفة ، وقد تم تورط العيوب في ترميز الجينات لثمانية على الأقل من هذه البروتينات في HNPCC.

يُظهر المرض نمطًا سائدًا للوراثة ، مما يعني أن وراثة نسخة متحولة واحدة من أي من الجينات الثمانية كافية لخلق قابلية متزايدة للإصابة بسرطان القولون.

ومع ذلك ، لا ينشأ السرطان إلا إذا تحورت النسخة الوظيفية الثانية من الجين المصاب في تكاثر الخلايا الظهارية المبطنة للقولون. إذا حدث ذلك ، تصبح الخلية المصابة ناقصة في إصلاح عدم التطابق وينتج تكاثرها خلايا تتراكم فيها الطفرات بمعدلات أعلى من المعتاد ، مما قد يؤدي بدوره إلى الإصابة بالسرطان.

حوالي 75 ٪ من الأفراد الذين يرثون واحدًا من الجينات الثمانية الطافرة المسؤولة عن HNPCC يصابون بسرطان القولون. كما لوحظت زيادات أقل في مخاطر الإصابة بسرطان الرحم والمبيض والمعدة والكلى.

الطفرات في ترتبط جينات BRCA1 و BRCA2 بالمخاطر الوراثية لسرطان الثدي والمبيض:

بين النساء في العالم الغربي ، يعد سرطان الثدي ثاني أكثر أنواع السرطانات شيوعًا (بجانب سرطان الجلد) وثاني أكثر الأسباب شيوعًا لوفيات السرطان (بجانب سرطان الرئة). تشير الإحصاءات الحالية إلى أن حوالي 1 من كل 8 نساء في الولايات المتحدة ستصاب بسرطان الثدي خلال حياتها.

يتضاعف خطر الإصابة بسرطان الثدي تقريبًا عند النساء اللاتي كان لديهن قريب دم مصاب بالمرض (أم ، أو أخت ، أو ابنة) ، ويزيد اثنان من الأقارب من خطر الإصابة بنحو خمسة أضعاف. يزداد الخطر أيضًا بسبب وجود تاريخ للإصابة بسرطان الثدي لدى أفراد الأسرة الأبعد (مثل العمة أو الجدة) ، والتي قد تكون إما على جانب الأم أو الأب أو الأب من الأسرة.

ومع ذلك ، فإن وجود قريب مصاب بسرطان الثدي لا يعني دائمًا أن المرض ينتشر في الأسرة. يعد سرطان الثدي مرضًا شائعًا ، وكثير من النساء يكون لديهن قريب مصاب بسرطان الثدي عن طريق الصدفة فقط.

يمكن إرجاع حوالي 10٪ من جميع حالات سرطان الثدي إلى قابلية وراثية عالية الخطورة ، تنشأ عادةً عن طريق طفرة موروثة في جين BRCA1 أو BRCA2 (BRCA هو اختصار لسرطان الثدي). العيوب الموروثة في هذه الجينات هي المسؤولة عن سرطان الثدي العائلي ، والذي يتميز بظهور سرطان الثدي في سن مبكرة ، وفي بعض الحالات ، سرطان الثدي أو سرطان الثدي والمبيض لدى نفس الفرد.

اعتمادًا على الطبيعة الدقيقة لطفرة BRCA1 أو BRCA2 الموروثة ، يقع الخطر عادةً في نطاق 40٪ إلى 80٪ لسرطان الثدي و 15٪ إلى 65٪ لسرطان المبيض.

ومن المثير للاهتمام ، أن النساء اللواتي ولدن بعد عام 1940 ويحملن طفرات في جينات BRCA1 أو BRCA2 معرضات بشكل أكبر للإصابة بسرطان الثدي (ولكن ليس المبيض) على أساس العمر المعدل مقارنة بالنساء اللائي لديهن نفس الطفرات اللواتي ولدن قبل عام 1940 (الشكل 9) . تشير هذه النتائج إلى أن العوامل غير الجينية تؤثر بشكل كبير على خطر الإصابة بسرطان الثدي ، حتى في الأفراد والخجولين الذين يرثون استعدادًا عالي الخطورة.

عندما تم اكتشاف جينات BRCA1 و BRCA2 لأول مرة ، كان يعتقد أنها تلعب دورًا في التحكم في تكاثر الخلايا. كشفت دراسات لاحقة ، مع ذلك ، أن البروتينات التي تنتجها هذه الجينات تشارك في إصلاح تلف الحمض النووي ، وخاصة فواصل الشريط المزدوج. لذلك تم استنتاج أن طفرات BRCA1 و BRCA2 لا تفتح البوابات بشكل مباشر للتكاثر المفرط للخلايا ، ولكنها بدلاً من ذلك تعيق عملية إصلاح الحمض النووي ، وبالتالي زيادة معدل الطفرات والطفرات اللاحقة التي يمكن أن تؤدي إلى الإصابة بالسرطان.

يتوافق هذا الاستنتاج مع اكتشاف أن الطفرات التي تنطوي على مثبطات الأورام الكلاسيكية & # 8220gatekeeper & # 8221 ، مثل RB ، و APC ، و p53 ، يتم ملاحظتها في كل من السرطانات الوراثية وغير الوراثية لأنها تعمل مباشرة على تكاثر الخلايا وتفتح البوابات مباشرة إلى الانتشار غير المنضبط والسرطان.

من ناحية أخرى ، نادرًا ما تُرى الطفرات التي تنطوي على BRCA1 و BRCA2 في السرطانات غير الوراثية ، ويفترض أنها & # 8220Careetaker & # 8221 الجينات التي لا تتحكم بشكل مباشر في تكاثر الخلايا وبالتالي فهي مرتبطة بشكل غير مباشر فقط بتطور السرطان.

العيوب الموروثة في إصلاح الحمض النووي تكمن وراء ترنح الشعيرات الدموية ومتلازمة بلوم وفقر الدم فانكوني:

تعتبر العيوب الموروثة في إصلاح الحمض النووي مسؤولة عن العديد من متلازمات السرطان الإضافية عالية الخطورة بالإضافة إلى المتلازمات الموصوفة حتى الآن. على الرغم من أنها تنشأ جميعًا من عيوب موروثة في إصلاح الحمض النووي ، فإن هذه المتلازمات تظهر تنوعًا ملحوظًا في الأعراض. أحد الأمثلة المدهشة هو حالة وراثية تُعرف باسم ترنح توسع الشعيرات (ataxia = & # 8220 نقص التنسيق ، & # 8221 توسع الشعيرات = & # 8220 تمدد الشعيرات الدموية & # 8221).

الشذوذ الأول الذي يُلاحظ عند الأطفال المصابين بتوسع الشعريات الرنح ، والذي يظهر عادةً بين 1 و 3 سنوات ، هو عدم القدرة على المشي بثبات بسبب انحلال وتلف المخيخ ، وهو جزء من الدماغ يتحكم في تناسق العضلات وتوازنها.

تشمل الأعراض الأخرى حركات غير طبيعية للعين ، وتداخل الكلام ، وتأخر النمو ، والالتهابات المتكررة الناتجة عن ضعف الجهاز المناعي ، وعلامات حمراء على الجلد والسطح الداخلي للجفون بسبب تمدد غير طبيعي للأوعية الدموية الصغيرة. تترافق الأعراض السابقة مع خطر الإصابة بالسرطان بنسبة 40٪ تقريبًا ، معظمها سرطان الغدد الليمفاوية وسرطان الدم ، ولكن أيضًا سرطانات الجلد والثدي والمعدة والبنكرياس والمبيض والدماغ.

يُظهر الجين المسؤول عن توسع الشعيرات الرنح ، المسمى جين ATM (لـ Ataxia Telangiectasia Mutated) ، نمطًا متنحيًا من الوراثة حيث يجب أن يورث اثنان من الجينات الطافرة ATM ، واحد من كل والد ، لإنشاء المتلازمة. من غير المحتمل أن يظهر أي من الوالدين أي أعراض مرضية لأن كل منهما يحمل جينًا واحدًا متحورًا من ATM تكون آثاره متنحية وبالتالي لا يتم التعبير عنها.

رموز الجينات ATM لبروتين متورط في استجابة تلف الحمض النووي ، وهي شبكة معقدة من المسارات الخلوية يتم استدعاؤها كاستجابة وقائية للاعتداءات على سلامة الحمض النووي. يلعب بروتين ATM دورًا مركزيًا في اكتشاف حدوث تلف الحمض النووي - وخاصة الانقطاعات المزدوجة - وفي تنشيط سلسلة من الاستجابات المناسبة.

تحدث أوجه القصور في استجابة تلف الحمض النووي أيضًا في العديد من المتلازمات الوراثية الأخرى ، كل منها يُظهر نمطًا مميزًا من الأعراض ومخاطر الإصابة بالسرطان. على سبيل المثال ، يتميز الأفراد المصابون بمتلازمة بلوم بقصر القامة ، والطفح الجلدي الناتج عن أشعة الشمس ، ونقص المناعة ، وانخفاض الخصوبة ، وارتفاع خطر الإصابة بالسرطان قبل سن العشرين ، والأكثر شيوعًا من الأورام اللمفاوية ، وسرطان الدم ، وسرطانات الفم والمعدة والحنجرة والرئة والمريء والقولون والجلد والثدي وعنق الرحم.

يُظهر جين BLM ، الذي تسبب طفرة في متلازمة بلوم ، نمطًا متنحيًا من الميراث ورموزًا لهليكاز الحمض النووي ، وهو بروتين يعمل على فك حلزون الحمض النووي المزدوج أثناء إصلاح الانكسارات المزدوجة وأنواع أخرى من تلف الحمض النووي.

في فقر الدم فانكوني ، يتمثل العرض الرئيسي في عدم قدرة نخاع العظم على إنتاج عدد كافٍ من خلايا الدم ، مصحوبًا بتشوهات هيكلية وتشوهات في الأعضاء وانخفاض الخصوبة واستعداد واضح للإصابة بسرطان الدم وسرطان الخلايا الحرشفية. يُظهر فقر الدم في فانكوني نمطًا متنحيًا للوراثة وينتج عن تعطيل الطفرات في أي من 11 جينًا مختلفًا على الأقل.

تتفاعل البروتينات التي تنتجها هذه الجينات مع بعضها البعض ومع المكونات المختلفة لمسارات الاستجابة لتلف الحمض النووي ، بما في ذلك البروتينات التي تنتجها جينات ATM و BRCA1. أحد الجينات الـ 11 التي يمكن أن تسبب فقر الدم في فانكوني هو جين BRCA2 ، وهو نفس الجين الذي يسبب سرطان الثدي العائلي.

يُظهر BRCA2 نمطًا سائدًا للوراثة لسرطان الثدي العائلي ونمطًا متنحيًا للوراثة لفقر الدم فانكوني. بعبارة أخرى ، تنشأ متلازمة سرطان الثدي العائلي من وراثة أليل متحور واحد من BRCA2 ، وينشأ فقر دم فانكوني من وراثة أليلين متحولين.

3. مقال عن الجينات الأخرى والقضايا التي تسبب مخاطر الوراثة:

إن متلازمات السرطان عالية الخطورة التي نوقشت حتى الآن تنبع جميعها من طفرات في الجينات الكابتة للورم ، إما جينات البوابة والجينات المسؤولة عن التحكم في تكاثر الخلايا والبقاء على قيد الحياة أو الجينات المسؤولة عن صيانة وإصلاح الحمض النووي. ومع ذلك ، فإن مثبطات الورم ليست الجينات الوحيدة التي تؤثر على مخاطر الإصابة بالسرطان الوراثي.

الورم الصماوي المتعدد من النوع الثاني:

إن متلازمات السرطان الوراثية التي اعتبرناها ونخجلها حتى الآن تنطوي على طفرات فقدان الوظيفة - أي الطفرات التي تعطل الجينات أو تحذفها ، أو تجعلها تنتج منتجات غير وظيفية. بحكم التعريف ، فإن الجينات المصابة هي جينات مثبطة للورم لأن الجين الكابت للورم يُعرَّف بأنه الجين الذي يؤدي فقدان وظيفته إلى الإصابة بالسرطان.

يمكن أن تؤثر طفرات اكتساب الوظيفة ، التي تجعل الجين ينتج بروتينًا يظهر نشاطًا جديدًا أو مفرطًا ، في خطر الإصابة بالسرطان الوراثي. ولعل أفضل متلازمة تعمل بهذه الطريقة هي الأورام الصماء المتعددة من النوع الثاني ، وهي حالة وراثية مرتبطة بتطور أورام الغدد الصماء الحميدة والخبيثة.

يبدأ المرض عادة في مرحلة الطفولة ويخجل بسبب تشوهات النمو الناجمة عن فرط إنتاج هرمونات معينة. حوالي 70 ٪ من الأفراد المصابين يصابون بالسرطان في سن 70 ، عادة سرطان الغدة الدرقية.

ينتج الورم الصماوي المتعدد من النوع الثاني عن وراثة جين واحد متحور RET ، والذي يرمز لبروتين مستقبلات Ret. يقع مستقبل Retreat على سطح خلايا الغدد الصماء ، حيث يرتبط بعوامل النمو الخارجية وينقل إشارة تحفز تكاثر الخلايا.

عادةً ما يكون مستقبل Retinet نشطًا فقط عندما يتم تحفيزه بواسطة عامل نمو مناسب ، ولكن الجين RET الطافر ينتج مستقبل Ret غير طبيعي يكون نشطًا بشكل أساسي بمعنى آخر ، يقوم المستقبل بنقل إشارة تحفز تكاثر الخلايا سواء كان عامل النمو موجودًا أم لا .

الوظيفة الجديدة التي تم إنشاؤها في هذا & # 8220 كسب وظيفة & # 8221 وبالتالي ، فإن الطفرة هي إنتاج بروتين يسمح هيكله غير الطبيعي له ، على عكس النسخة العادية من البروتين ، بتحفيز تكاثر الخلايا بشكل مستقل عن وجود عامل النمو.

وبالتالي فإن الشكل المتحور لجين RET هو أحد الجينات الورمية لأن وجوده يمكن أن يؤدي إلى الإصابة بالسرطان ، وجين RET الطبيعي هو أحد الأورام السرطانية لأنه يرتبط ارتباطًا وثيقًا بجين سرطاني ويمكن تحويله إلى.

يلخص الشكل 10 الاختلاف الأساسي في سلوك الطفرات التي تشمل الجينات الورمية الأولية والجينات الكابتة للورم. في الأساس ، الجينات الكابتة للورم هي الجينات التي تؤدي فيها طفرات فقدان الوظيفة إلى الإصابة بالسرطان ، والجينات الورمية الأولية هي جينات تؤدي فيها طفرات اكتساب الوظيفة إلى الإصابة بالسرطان.

لفقد وظيفة الجين الكابت للورم ، يجب أن تخضع كلتا النسختين عادةً لطفرة معطلة (أو حذف). على النقيض من ذلك ، يمكن أن يكون تحور نسخة واحدة من الجين الورمي الأولي كافياً لتكوين الجين الورمي الذي يساهم وجوده في تطور السرطان.

الاختلافات الموروثة في وظائف المناعة والإنزيمات الأيضية:

لقد رأينا أن خطر الإصابة بالسرطان يزداد عندما تتعطل وظيفة المناعة إما من خلال عدوى فيروس نقص المناعة البشرية أو في متلقي زراعة الأعضاء الذين يستخدمون الأدوية المثبطة للمناعة.

لذلك ليس من المستغرب أن النقص الوراثي في ​​وظيفة المناعة يمكن أن يزيد من خطر الإصابة بالسرطان أيضًا. في بعض الحالات ، تكون الاضطرابات في الوظيفة المناعية نتيجة غير مباشرة للطفرات والفطريات الموروثة التي لا يكون تأثيرها الأساسي على الجهاز المناعي نفسه. تشمل الأمثلة ترنح الشعيرات الدموية ومتلازمة بلوم ، والتي تنشأ من عيوب وراثية في إصلاح الحمض النووي التي تؤدي إلى زيادة معدلات الطفرات ولكنها أيضًا تضعف قدرة الخلايا الليمفاوية على أداء وظائفها المناعية الطبيعية.

قد يساهم الخسارة الناتجة في النشاط المناعي في ارتفاع معدلات الإصابة بالسرطان في مثل هذه المتلازمات ، جنبًا إلى جنب مع الدور الأساسي الذي يلعبه التبرز وإصلاح الحمض النووي في زيادة معدلات الطفرات في الخلايا المقدر لها بالفعل أن تصبح سرطانية.

أمراض نقص المناعة الأولية ، التي تسببها الطفرات الوراثية والخجولة التي تعطل الجهاز المناعي بشكل مباشر ، ترتبط أيضًا بزيادات متواضعة في مخاطر الإصابة بالسرطان ، على الرغم من أن زيادة التعرض للعدوى هي عادةً الأعراض الرئيسية.

السرطانات الأكثر شيوعًا هي الأورام اللمفاوية ، وغالبًا ما تنجم عن عدوى EBV التي تستمر دون قيود في غياب استجابة مناعية فعالة. ترتبط المناعة وأوجه القصور التي تسببها الملاريا أو فيروس نقص المناعة البشرية بالمثل بزيادة حدوث الأورام اللمفاوية التي يسببها EBV.

للعيوب الموروثة في وظائف المناعة تأثير غير مباشر على مخاطر الإصابة بالسرطان بدلاً من الاستهداف المباشر للخلايا المقدر لها تكوين الأورام. نوع آخر من التأثير غير المباشر ينبع من الاختلافات الوراثية في إنزيمات الكبد التي تستقلب المواد الكيميائية الغريبة. يجب تنشيط بعض أنواع الكارسينو والشيغين بشكل استقلابي بواسطة إنزيمات السيتوكروم P450 في الكبد قبل أن تتسبب في حدوث الطفرات والسرطان.

بسبب هذا المطلب ، قد تؤثر الاختلافات الموروثة في إنزيمات الكبد على قابلية الشخص للإصابة بالسرطان. على سبيل المثال ، وجد أن مدخني السجائر الذين يرثون أشكالًا معينة من السيتوكروم P450 يُظهرون معدلات أعلى من سرطان الرئة مقارنة بتلك التي أظهرها مدخنون آخرون.

القابلية للإصابة بالسرطان:

الطفرات عالية الخطورة - أي الطفرات المسؤولة عن التجمع الواضح للسرطان داخل العائلات - لا تمثل أكثر من 5٪ من حالات السرطان بشكل عام. ومع ذلك ، فإن دور الوراثة في تحديد مخاطر الإصابة بالسرطان لا يقتصر على الطفرات عالية الخطورة ، بل يشمل أيضًا المساهمات الأصغر والتغييرات في العديد من الجينات الأخرى. التأثيرات الفردية لهذه الجينات الصغيرة المخاطر ليست قوية بما يكفي لخلق أنماط واضحة من وراثة السرطان ، ولكن كمجموعة ، يمكن أن تكون آثارها على قابلية الإصابة بالسرطان كبيرة.

يصعب تحديد الجينات الصغيرة الخطورة لأنها لا تخلق أنماطًا عائلية واضحة من وراثة السرطان. إن تحديد مثل هذه الجينات معقد أيضًا بسبب حقيقة أن السرطان ينشأ من خلال تفاعل بين الوراثة والبيئة. مع الطفرات الوراثية عالية الخطورة ، يكون التأثير على معدلات الإصابة بالسرطان كبيرًا لدرجة أنه يطغى على العوامل البيئية.

من ناحية أخرى ، فإن تأثيرات الجينات ذات الخطورة الصغيرة يتم حجبها بسهولة عن طريق الظروف البيئية أو ظروف نمط الحياة. على سبيل المثال ، لنفترض وجود شكل مختلف من الجين يضاعف خطر إصابة الشخص بسرطان الرئة.

من الناحية العملية ، سيكون من الصعب اكتشاف وجود مثل هذه الزيادة لأن الاختلافات في سلوك التدخين (أو التعرض للرادون أو الأسبستوس) لها تأثير أكبر بكثير على معدلات سرطان الرئة ، وبالتالي فإنها تميل إلى حجب تأثيرات العوامل الوراثية الأقل خطورة. عامل.

توضح الفروق التي لوحظت في معدلات الإصابة بالسرطان لمختلف المجموعات العرقية والإثنية مدى صعوبة تحديد الدور الدقيق الذي تلعبه الوراثة. ضع في اعتبارك ، على سبيل المثال ، السكان السود والبيض في الولايات المتحدة ، الذين يظهرون العديد من الاختلافات المميزة في أنماط السرطان.

أحد الأنماط التي يسهل تفسيرها هو الورم الميلانيني ، وهو شكل من أشكال سرطان الجلد يزيد معدل حدوثه بين البيض بنحو 15 مرة عن السود. تفسير هذا الاختلاف واضح تمامًا. ينتج الأشخاص ذوو البشرة الداكنة كميات كبيرة من الميلانين ، وهو صبغة تمتص الأشعة فوق البنفسجية وبالتالي تقلل معدلات الطفرات التي يسببها ضوء الشمس في الجلد.

لا يمكن تفسير الاختلافات العرقية الأخرى في معدلات الإصابة بالسرطان بسهولة. على سبيل المثال ، السود الذين يعيشون في الولايات المتحدة لديهم معدلات سرطان أعلى من البيض بالنسبة لمعظم أنواع السرطان الشائعة ، بما في ذلك سرطان القولون والرئة والبروستاتا ، على الرغم من أنه ليس سرطان الثدي (الشكل 11 ، يسار). من الناحية النظرية ، قد تكون هذه الاختلافات ناتجة عن اختلافات طفيفة في جينات السرطان ذات الخطورة الصغيرة ، لكن الآليات غير الوراثية معقولة بنفس القدر.

أحد الاحتمالات التي حظيت باهتمام جاد هو الوضع الاجتماعي والاقتصادي. يوضح الشكل 11 (يمين) نتائج دراسة قارنت معدلات الإصابة بالسرطان حسب العرق للأفراد من مستويات تعليمية مختلفة ، وهو مؤشر على البيئة الاجتماعية والاقتصادية العامة للشخص.

تظهر البيانات أنه عند مقارنة معدلات الإصابة بالسرطان بين الأفراد ذوي المستويات التعليمية المعادلة ، فإن معدلات الإصابة بالسرطان لدى السود مماثلة (أو حتى أقل) من معدلات الإصابة بالسرطان لدى البيض. لذا بدلاً من الارتباط بالاختلافات الجينية بين المجموعات العرقية ، فإن العديد من التباينات في الإصابة بالسرطان التي لوحظت بين السود والبيض قد تكون مرتبطة بالمتغيرات الاجتماعية والاقتصادية. تشمل عوامل الخطر المرتبطة بالحالة الاجتماعية الاقتصادية المنخفضة التي من المرجح أن تؤثر على معدلات الإصابة بالسرطان ، التعرض للتبغ والكحول ، وسوء التغذية ، وقلة النشاط البدني ، والسمنة.

الاختبارات الجينية للتأهب للسرطان:

كان التركيز الرئيسي لهذا المقال على الأوتار والخداع السرطاني الذي ينتشر في العائلات. بالطبع ، إذا أصيب العديد من الأشخاص في نفس العائلة بالسرطان ، فهذا لا يعني بالضرورة أن الوراثة مسؤولة. السرطان مرض شائع ، ووجود عدة حالات من السرطان في عائلة واحدة قد يكون مصادفة.

قد يكون نمط الحياة المشترك أو العوامل البيئية مسؤولة أيضًا عن تجميع حالات السرطان داخل الأسرة. ومع ذلك ، عندما يشك الناس في احتمال وجود استعداد وراثي لأن معدلات الإصابة بالسرطان في عائلاتهم مرتفعة بشكل غير عادي.

يمكن أن توفر الإجابات على العديد من الأسئلة أدلة حول ما إذا كان من المحتمل أن تكون الحالة وراثية:

(1) هل أصيب العديد من أفراد الأسرة بنفس النوع من السرطان دون تفسير واضح بشأن البيئة أو نمط الحياة ، مثل تدخين السجائر؟

(2) هل يصاب أفراد الأسرة بالسرطان أثناء الطفولة أم في مرحلة مبكرة من البلوغ أكثر من المعتاد؟

(3) هل طور أفراد الأسرة سرطانات أولية متعددة من نفس النوع أو أنواع مختلفة من السرطان على التوالي؟

في حالة وجود الأنماط السابقة ، يمكن إجراء مجموعة متنوعة من الاختبارات المعملية لتحليل DNA الشخص & # 8217s للطفرات الموروثة. يتوفر هذا الاختبار الجيني حاليًا لجميع جينات القابلية للسرطان المدرجة في الجدول 1 تقريبًا ، ويتم تطوير اختبارات إضافية بوتيرة سريعة.

قبل اتخاذ قرار بمتابعة الاختبارات الجينية ، من المهم للغاية فهم المخاطر المحتملة وكذلك فوائد الاختبار (الجدول 2). بادئ ذي بدء ، فإن الفشل في العثور على طفرة خطر الإصابة بالسرطان يخبرك فقط عن الجين الذي صُمم الاختبار من أجله ، وبالتالي يمكن أن توجد طفرة مختلفة لم يتم اكتشافها من خلال الإجراءات المستخدمة. أو قد يكتشف الاختبار نوعًا من الطفرات لم يُشاهد من قبل وبالتالي فهو غير مؤكد الأهمية. لذلك من المهم أن تكون مستعدًا لاحتمال حدوث نتائج غامضة.

إذا كان الاختبار الجيني يشير إلى وجود طفرة عالية الخطورة ، فقد ينتج عن هذا الاكتشاف خوف وقلق كبيرين ، وقد يزيد أيضًا من احتمال التمييز من قبل شركات التأمين أو أرباب العمل.

من الممكن حدوث توتر في العلاقات الأسرية لأن أفراد الأسرة الآخرين قد لا يرحبون بالأنباء التي تفيد بوجود جين سرطاني عالي الخطورة في الأسرة. علاوة على ذلك ، فإن القدرة على اكتشاف الطفرات عالية الخطورة لا تكون مصحوبة دائمًا باستراتيجيات طبية فعالة للعلاج والوقاية. لذلك يخاطر بعض الناس بإخبارهم أن لديهم احتمالية عالية للإصابة بالسرطان وأنه لا يمكن فعل الكثير حيال ذلك.

على الجانب الإيجابي ، تتمثل فائدة الاختبار الجيني في أنه ينهي عدم اليقين بشأن حالة الشخص ، خاصة إذا كان الفرد قلقًا بالفعل لأن السرطان يبدو أنه يسري في العائلة. سيكون الاختبار الذي يشير إلى عدم وجود طفرات عالية الخطورة أخبارًا جيدة بشكل خاص.

وبالنسبة للأشخاص الذين يكتشفون أنهم يحملون طفرة عالية الخطورة ، فإن الفحص الطبي المتكرر والصارم للتشخيص المبكر ، وعند الاقتضاء ، قد تؤدي العلاجات الوقائية أو التغييرات السلوكية إلى تحسين فرصهم في البقاء على قيد الحياة.

قد تساعد نتائج الاختبار الجيني أيضًا في توضيح المخاطر التي يتعرض لها أفراد الأسرة الآخرون ويمكن أن تكشف ما إذا كانت هناك إمكانية لنقل جين سرطاني شديد الخطورة إلى طفل واحد & # 8217.

في النهاية ، فإن اتخاذ قرار بشأن إجراء الاختبارات الجينية من عدمه هو اختيار شخصي يتطلب اهتمامًا شديدًا بالمنزل وخجلًا وفهمًا جيدًا لطبيعتك النفسية. إذا واجه شخصان نفس مجموعة الظروف بالضبط ، فإن استخدام الاختبارات الجينية لإلقاء نظرة خاطفة على الكرة البلورية والتنبؤ بالمستقبل قد يكون اختيارًا مناسبًا لشخص واحد وليس للآخر.


ستراتون ، M.R. استكشاف جينومات الخلايا السرطانية: التقدم والوعد. علم 331, 1553–1558 (2011).

الكسندروف ، ل. وآخرون. بصمات العمليات الطفرية في سرطان الإنسان. طبيعة سجية 500, 415–421 (2013).

بيرنز ، إم بي ، تيميز ، إن إيه وأمب هاريس ، آر إس. دليل على حدوث طفرات APOBEC3B في العديد من السرطانات البشرية. نات. جينيه. 45, 977–983 (2013).

روبرتس ، إس إيه وآخرون. ينتشر نمط الطفرات APOBEC cytidine deaminase على نطاق واسع في السرطانات البشرية. نات. جينيه. 45, 970–976 (2013).

بيرنز ، إم بي ، ليونارد ، بي & أمبير هاريس ، آر إس. APOBEC3B: العواقب المرضية لطفرة دنا مناعية فطرية. بيوميد. ج. 38, 102–110 (2015).

هاريس ، ر. الآلية الجزيئية والتأثير السريري للطفرات المحفزة بـ APOBEC3B في سرطان الثدي. الدقة سرطان الثدي. 17, 8 (2015).

تشان ، ك وآخرون. يكمن الضرر الأساسي داخل الحمض النووي أحادي السلسلة في الجسم الحي فرط التحول الناجم عن عامل بيئي في كل مكان. بلوس جينيت. 8، e1003149 (2012).

يمكن لـ Landry، S.، Narvaiza، I.، Linfesty، DC & amp Weitzman، M.D. APOBEC3A تنشيط استجابة تلف الحمض النووي والتسبب في توقف الدورة الخلوية. ممثل EMBO. 12, 444–450 (2011).

بيرنز ، م. وآخرون. APOBEC3B هو مصدر إنزيمي للطفرة في سرطان الثدي. طبيعة سجية 494, 366–370 (2013).

موسيل ، ب. وآخرون. تنتقل الأشكال الإسوية APOBEC3A البشرية إلى النواة وتحث على حدوث فواصل مزدوجة في الحمض النووي تؤدي إلى إجهاد الخلية وموتها. بلوس واحد 8، e73641 (2013).

نيك زينال ، إس وآخرون. عمليات الطفرات تشكيل جينومات 21 سرطان الثدي. زنزانة 149, 979–993 (2012).

روبرتس ، إس إيه وآخرون. يمكن أن تنشأ الطفرات العنقودية في الخميرة وفي السرطانات البشرية من مناطق دنا طويلة وحيدة الخيط التالفة. مول. زنزانة 46, 424–435 (2012).

بيشوب ، ك. وآخرون. نزع أمين السيتيدين للحمض النووي الفيروسي عن طريق بروتينات APOBEC المتنوعة. بالعملة. بيول. 14, 1392–1396 (2004).

Dang ، Y. ، Wang ، X. ، Esselman ، W.J. & amp Zheng ، Y.-H. تحديد APOBEC3DE كعامل آخر مضاد للفيروسات العكوسة من عائلة APOBEC البشرية. J. فيرول. 80, 10522–10533 (2006).

Harris، RS، Petersen-Mahrt، S.K. & amp Neuberger ، إم. يمكن أن يعمل إنزيم تحرير الحمض النووي الريبي APOBEC1 وبعض متماثلاته كطفرات للحمض النووي. مول. زنزانة 10, 1247–1253 (2002).

هنري ، م وآخرون. التحرير الجيني للحمض النووي HBV عن طريق ديامينازات السيتدين APOBEC3 البشرية أحادية المجال والطبيعة المؤتلفة لـ APOBEC3G. بلوس واحد 4، e4277 (2009).

يو ، كيو وآخرون. APOBEC3B و APOBEC3C مثبطات قوية لتكرار فيروس نقص المناعة القرد. J. بيول. تشيم. 279, 53379–53386 (2004).

سيسكون ، دي دبليو ، هايب-كينز ، بي & أمبير ماك ، تي دبليو يعكس تعبير APOBEC3B في سرطان الثدي التكاثر الخلوي ، بينما يرتبط تعدد الأشكال الحذف بتنشيط المناعة. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 112, 2841–2846 (2015).

ووترز ، CE ، Saldivar ، J.C. ، Amin ، Z.A. ، Schrock ، MS & amp Huebner، K. FHIT الناجم عن تلف الحمض النووي الناجم عن فقدان FHIT يخلق ركائز APOBEC المثلى: نظرة ثاقبة على الطفرات بوساطة APOBEC. Oncotarget 6, 3409–3419 (2015)

ساساكي ، هـ وآخرون. APOBEC3B الإفراط في التعبير الجيني في سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة. بيوميد. اعادة عد. 2, 392–395 (2014).

ليونارد ، ب. وآخرون. أنماط التحور الجينومي والانتفاخ APOBEC3B في سرطان المبيض المصلي. الدقة السرطان. 73, 7222–7231 (2013).

دي بروين ، إي سي وآخرون. يحدد التنوع المكاني والزماني في عمليات عدم الاستقرار الجينومي تطور سرطان الرئة. علم 346, 251–256 (2014).

كافال ، ف. ، سوسبين ، ر. ، فارتانيان ، ج. & amp Wain-Hobson، S. ثدييات متعامدة APOBEC3A cytidine deaminases hypermutate DNA. مول. بيول. Evol. 31, 330–340 (2014).

شي ، سي وآخرون. تكتشف البروتينات المهندسة تكسير الحمض النووي العفوي في الخلايا البشرية والبكتيرية. eLife 2، e01222 (2013).

نيك زينال ، إس وآخرون. رابطة تعدد الأشكال نسخة سلالة جرثومية APOBEC3A و APOBEC3B مع عبء الطفرات المفترضة المعتمدة على APOBEC في سرطان الثدي. نات. جينيه. 46, 487–491 (2014).

كافال ، ف. ، سوسرين ، ر. ، شابيرا ، م ، فارتانيان ، ج. & amp Wain-Hobson، S. قابلية منتشرة للسرطان APOBEC3A محمل أليل هجين APOBEC3B 3 ′ UTR يعزز تلف الحمض النووي الصبغي. نات. كومون. 5, 5129 (2014).

Roberts، S.A. & amp Gordenin، D.A. فرط التحولات في جينومات السرطان البشري: آثار الأقدام والآليات. نات. القس السرطان 14, 786–800 (2014).

Poon، S.L.، McPherson، J.R.، Tan، P.، Teh، B. & amp Rozen، S.G. التوقيعات الطفرية للتعرض لمواد مسرطنة: الكشف على نطاق الجينوم والفرص الجديدة للوقاية من السرطان. جينوم ميد. 6, 24 (2014).

ديجاريفا ، ن. وآخرون. تحدث الطفرات التي يسببها الإجهاد التأكسدي في الحمض النووي أحادي الخيط بشكل أساسي في السيتوزينات وهي بوليميريز DNA تعتمد فقط على الأدينين والجوانين. الدقة الأحماض النووية. 41, 8995–9005 (2013).

أوشيا ، جي بي وآخرون. pLogo: نهج احتمالي لتصور أشكال التسلسل. نات. أساليب 10, 1211–1212 (2013).

تايلور ، بي جيه وآخرون. تحفز إنزيمات نزع الأمين من الحمض النووي الاستحمام الطفري المرتبط بالكسر مع تضمين APOBEC3B و 3A في كاتاجيس سرطان الثدي. eLife 2، e00534 (2013).

فريدريكسون ، نيو جيرسي ، نيويورك ، L. ، نيلسون ، ج. & amp Larsson، E. التحليل المنهجي للطفرات الجسدية غير المشفرة وتغييرات التعبير الجيني عبر 14 نوعًا من الأورام. نات. جينيه. 46, 1258–1263 (2014).

ووكر ، ب. وآخرون. ترتبط التواقيع الطفرية لعائلة APOBEC بتحولات سيئة للتشخيص في المايلوما المتعددة. نات. كومون. 6, 6997 (2015).

لونج ، جيه وآخرون. حذف شائع في APOBEC3 الجينات وخطر الاصابة بسرطان الثدي. ج. ناتل. معهد السرطان. 105, 573–579 (2013).

شوان ، د. وآخرون. APOBEC3 يرتبط تعدد الأشكال الحذف بخطر الإصابة بسرطان الثدي بين النساء من أصل أوروبي. التسرطن 34, 2240–2243 (2013).

تشان ، ك ، ريسنيك ، ماجستير وأمبير جوردينين ، د. يكشف اختيار النوكليوتيدات المُدخلة في المواقع اللاأساسية المتشكلة داخل الحمض النووي الكروموسومي عن أنشطة البوليميراز التي تشارك في تخليق DNA translesion. إصلاح الحمض النووي (أمست.) 12, 878–889 (2013).

درير ، واي وآخرون. تكشف عمليات إعادة الترتيب الجسدية عبر السرطان عن فئات من العينات ذات أنماط مميزة لانكسار الحمض النووي وقابلية التغيير المفرط الناتجة عن إعادة الترتيب. الدقة الجينوم. 23, 228–235 (2013).

ميميتو ، إ. & amp Symington، L.S. استئصال نهاية الحمض النووي - فك الذيل. إصلاح الحمض النووي (أمست.) 10, 344–348 (2011).

ساكوفسكي ، سي جيه وآخرون. يعد التكرار الناجم عن الكسر مصدرًا لمجموعات الطفرات الكامنة وراء الكاتايجيس. مندوب الخلية. 7, 1640–1648 (2014).

شبكة أبحاث أطلس جينوم السرطان. التوصيف الجزيئي الشامل لسرطان المثانة البولية. طبيعة سجية 507, 315–322 (2014).

ديفيس ، سي. وآخرون. المشهد الجينومي الجسدي لسرطان الخلايا الكلوية الكروموفوبيا. الخلايا السرطانية 26, 319–330 (2014).

معهد واسع TCGA مركز تحليل بيانات الجينوم. تحليل الطفرات بواسطة APOBEC Cytidine Deaminases (P-MACD) (معهد برود لمعهد ماساتشوستس للتكنولوجيا وجامعة هارفارد ، 2014).

Rooney، MS، Shukla، SA، Wu، CJ، Getz، G. & amp Hacohen، N. الخصائص الجزيئية والوراثية للأورام المرتبطة بالنشاط الخلوي المناعي المحلي. زنزانة 160, 48–61 (2015).

سنايدر ، إيه وآخرون. الأساس الجيني للاستجابة السريرية لحصار CTLA-4 في سرطان الجلد. إنجل. جيه ميد. 371, 2189–2199 (2014).

كيسي ، R.G. وآخرون. تشخيص وعلاج سرطان الظهارة البولية فى الموقع من المسالك البولية السفلية: مراجعة منهجية. يورو. أورول. 67, 876–888 (2015).

باولز ، ت. وآخرون. يؤدي العلاج MPDL3280A (المضاد لـ PD-L1) إلى النشاط السريري في سرطان المثانة النقيلي. طبيعة سجية 515, 558–562 (2014).

Bellí، G.، Garí، E.، Piedrafita، L.، Aldea، M. & amp Herrero، E. يسمح نظام المنشط / المثبط المزدوج بالتعبير الجيني المحكم الذي ينظم التتراسيكلين في الخميرة الناشئة. الدقة الأحماض النووية. 26, 942–947 (1998).

Storici، F. & amp Resnick، M.A. in طرق الانزيم المجلد. 409 (محرران. Judith، L.C & amp Paul، M.) 329-345 (Academic Press، 2006).

موريسون ، أ ، بيل ، ج.ب. ، كونكيل ، ت. & amp Sugino ، A. تسلسل الأحماض الأمينية لبوليميراز DNA حقيقية النواة المطلوبة لنشاط نوكلياز خارجي 3 → 5. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 88, 9473–9477 (1991).

ساكاموتو ، أ. وآخرون. الأليلات المتحولة لبوليميراز DNA الخميرة ζ. إصلاح الحمض النووي (أمست.) 6, 1829–1838 (2007).

ماتسودا ، T. ، بيبينيك ، K. ، Masutani ، C. ، Hanaoka ، F. & amp Kunkel ، T.A. توليف منخفض الدقة للحمض النووي بواسطة بوليميراز DNA البشري. طبيعة سجية 404, 1011–1013 (2000).

هالدين ، ج. على طريقة تقدير الترددات. بيوميتريكا 33, 222–225 (1945).

لورانس ، إم. وآخرون. التغايرية الطفرية في السرطان والبحث عن جينات جديدة مرتبطة بالسرطان. طبيعة سجية 499, 214–218 (2013).

Benjamini، Y. & amp Hochberg، Y. التحكم في معدل الاكتشاف الخاطئ: نهج عملي وقوي للاختبارات المتعددة. J.R Stat. شركة ب 57, 289–300 (1995).

مايوروف ، ف. & أمبير كريبن ، ج. أهمية انحراف الجذر التربيعي في مقارنة الهياكل ثلاثية الأبعاد للبروتينات الكروية. جيه مول. بيول. 235, 625–634 (1994).


شكر وتقدير

تم تنفيذ هذا العمل على البيانات التي تم نشرها سابقًا تحت رعاية الاتحاد الدولي لجينوم السرطان ودراسة علم الوراثة الجسدية لسرطان الثدي (BASIS) ، وهو مشروع بحثي ممول من البرنامج الإطاري السابع للمجتمع الأوروبي (FP7 / 2010-2014) في إطار اتفاقية المنحة رقم 242006.

يتم دعم MH من خلال منحة Wellcome Trust Sanger الأساسية. كان SN-Z زميلًا في Wellcome-Beit ومُول شخصيًا من منحة Wellcome Trust Intermediate Clinical Research Grant (WT100183MA) في بداية كتابة هذه المخطوطة ، وتم تمويله لاحقًا من قبل CRUK Advanced Clinician Award (C60100 / A23916).


I. مقدمة

الأساس المنطقي العلمي والسريري لاستهداف & # x0201cCT-و IR-resistant و # x0201d MMR التي تعاني من السرطان البشري الناقص

إصلاح عدم تطابق الحمض النووي (MMR) هو نظام إصلاح الحمض النووي شديد الحفظ ولكنه معقد يضمن الاستقرار الجيني على عدة مستويات بما في ذلك: تصحيح عدم التطابق الناتج أثناء تكرار الحمض النووي الذي يحجب أحداث إعادة التركيب الجيني بين تسلسلات الحمض النووي المتباينة والتوسط في موت الخلايا استجابةً لبعض العوامل الضارة بالحمض النووي ( جيريكني ، 2006). يرتبط نقص MMR بشكل أساسي بمتلازمة سرطان القولون والمستقيم الوراثي السائد وراثيًا (HNPCC) ، الناتج عن طفرات جينية MMR بما في ذلك hMLH1, hmsh2, hmsh6، و hPMS2 الجينات (Lynch and de la Chapelle ، 2003). يرتبط نقص MMR أيضًا بعدد متزايد من الأورام الصلبة المتقطعة ذات عدم الاستقرار العالي (MSI-H) ، والتي ترتبط بشكل أساسي بالمثيلة المحفزة لـ hMLH1 أو hmsh2 الجينات (بيلتوماكي ، 2003). تشمل سرطانات MSI-H المتفرقة عدة أنواع من سرطانات الجهاز الهضمي (المعدة والبنكرياس والمريء والقولون والمستقيم) وسرطانات GYN (بطانة الرحم والمبيض) وسرطانات GU (المثانة والحالب) وكذلك سرطانات الرئة ذات الخلايا غير الصغيرة (NSCL) ، وأورام الدماغ الأولية عالية الدرجة ، حيث يوجد نقص في MMR (النمط الظاهري MSI-H) في ما يصل إلى 10 & # x0201320٪ من هذه السرطانات الشائعة (بيلتوماكي ، 2003). الأهم من ذلك ، يرتبط نقص MMR بـ في المختبر / في الجسم الحي & # x0201c Damageability & # x0201d (المقاومة) لفئات مختلفة من أدوية العلاج الكيميائي النشطة سريريًا (Stojic et al.، 2004 Jiricny، 2006 Modrich، 2006 Kinsella، 2009) بالإضافة إلى أنواع أخرى من تلف الحمض النووي (الإجهاد) بما في ذلك الإشعاع المؤين (IR Yan et al.، 2001، 2009 Brown et al.، 2003 Cejka et al.، 2004) and hypoxia (Kondo et al.، 2001 Mihaylova et al.، 2003 Koshiji et al.، 2005 Klein and Glazer، 2010) . ومن المثير للاهتمام ، أن المروج hypermethylation من hMLH1 و hmsh2 تم العثور على الجينات والفقدان اللاحق لتعبير بروتين MMR في ما يقرب من 50 ٪ من سرطانات NSCL التي تحدث لدى غير المدخنين وكانت مرتبطة بسوء التشخيص حتى في سرطانات الرئة في المراحل المبكرة (Hsu et al. ، 2005). ومع ذلك ، يبدو أن سرطانات القولون الموضعية MSI-H لديها تشخيص أفضل من أورام MMR (MMR +) بعد الجراحة (Lynch and de la Chapelle، 2003 Peltomaki، 2003). تؤكد هذه البيانات السريرية المتضاربة على التعقيد البيولوجي لـ MMR وأهميتها الانتقالية في علاجات السرطان.

مسار MMR هو نظام متعدد البروتينات له ثلاث عمليات فرعية (Lynch and de la Chapelle، 2003 Jiricny، 2006 Kinsella، 2009). تتضمن هذه العمليات الفرعية: أولاً ، التعرف على عدم التطابق بواسطة MutS & # x003b1 (a MSH2 / MSH6 dimer) أو MutS & # x003b2 (a MSH2 / MSH3 dimer) ثانيًا ، استئصال عدم التطابق ، والذي يبدأ بربط MutL & # x003b1 (MLH1) / PMS2 dimer) أو MutL & # x003b2 (a MLH1 / MLH3 dimer) إلى MutS & # x003b1 والتجنيد اللاحق للنوكلياز الخارجي (EXO1) الذي يزيل بالتسلسل النيوكليوتيدات بين فاصل أحادي الخيط المجاور (SSB) يصل إلى ما بعد عدم التطابق على خيط DNA الابنة والثالث ، إعادة التركيب والربط التي بدأها DNA polymerase & # x003b4 جنبًا إلى جنب مع ما لا يقل عن بروتينين آخرين ، مستضد الخلية النووية المتكاثر (PCNA) وبروتين النسخ A (RPA) ، متبوعًا بإغلاق النك الموجود في حبلا الابنة بواسطة DNA ligase.

& # x0201c تم إثبات تحمل الضرر & # x0201d (مقاومة الأدوية) في نقص MMR (MMR & # x02212) الخلايا البشرية والفأرية إلى عوامل ميثلة مثل temozolomide و dacarbazine و procarbazine نظائر البلاتين بما في ذلك cisplatinum و carboplatinum anthracycline مثل الأدوكرياميد. نظائرها مثل 6-ثيوجوانين (6-TG) ، و iododeoxyuridine (IUdR) ، وفلورووبيريميدين [كلاهما 5-فلورويوراسيل (5-FU) و 5-فلوروديوكسيوريدين (FUdR)] (بيري وآخرون ، 1999 ، 2000 ، 2003 مايرز وآخرون ، 2001 ، 2003 Yan et al. ، 2003 Jiricny ، 2006 Modrich ، 2006 Kinsella ، 2009). تم العثور أيضًا على مقاومة الأشعة تحت الحمراء في خلايا MMR & # x02212 ، خاصة باستخدام معدل الجرعة المنخفضة (LDR) & # x02013IR (Yan et al. ، 2009). استنادًا إلى التحليلات الكيميائية الحيوية والجزيئية ، تم إثبات أن بروتينات MMR (بشكل أساسي مركب MutS & # x003b1) تتعرف على غالبية هذه العناصر المعدلة كيميائيًا & # x0201cmispairs. & # x0201d ومع ذلك ، لن تتم إزالة قواعد الحمض النووي المعدلة كيميائيًا أو الأشعة تحت الحمراء أثناء خطوة تحلل الحمض النووي لـ MMR ما لم تكن موجودة في الخيط الذي يحتوي على الانقطاع (أي ، حبلا الابنة). في غياب MMR الوظيفي ، لا ترى الخلايا & # x0201c & # x0201d هذه القواعد المعدلة كيميائيًا أو بالأشعة تحت الحمراء في الحمض النووي الخاص بها وتستمر في تكرار الطفرات المتراكمة في الحمض النووي نتيجة لذلك.

بعد التعرف على عقار أو مقاربة مستحثة بالأشعة تحت الحمراء في الحمض النووي ، قد تخضع خلايا MMR + لاستجابة سامة للخلايا (موت الخلية). لا يزال من غير الواضح ما إذا كانت هذه الاستجابة ناتجة بشكل مباشر عن آلية MMR التي تبدأ سلسلة إشارات توجه الخلايا إما لإصلاح عدم التطابق أو الخضوع لموت الخلية (نموذج مستشعر الضرر العام لـ MMR) ، أو ما إذا كانت هذه السمية غير مباشرة بسبب محاولات غير مجدية من قبل MMR لإصلاح الحمض النووي الذي يحتوي على عقار أو تقارب هيكلي مستحث بالأشعة تحت الحمراء في القالب (الخيط الرئيسي) بما يتوافق مع نموذج إصلاح الدورة غير المجدي لـ MMR (Stojic et al. ، 2004 Jiricny ، 2006 Modrich ، 2006). عادةً ما تعرض خلايا MMR + G المطول2 توقف دورة الخلية والاستجابة السامة للخلايا اللاحقة بعد جولتين أو أكثر من تكرار الحمض النووي بعد التعرض لأدوية مثل temozolomide ، 6-TG ، والفلوروبيريميدين (5-FU ، FdUrd Meyers et al. ، 2001 ، 2003 Yan et al. ، 2003 Stojic وآخرون ، 2004 Jiricny ، 2006 Kinsella ، 2009). قد تشير هذه الملاحظات الزمنية إلى أن بروتينات MMR تتعرف على عدم التطابق المتغير الناتج عن الجولات اللاحقة (& # x0003e2) لتكرار الحمض النووي المحتوي على المقاربات ، بدلاً من التقريب الأولي الذي يتكون من دمج أو تفاعل هذه الأدوية والأشعة تحت الحمراء مع الحمض النووي.

بغض النظر عن الآلية التي تتوسط من خلالها MMR الاستجابة السامة للخلايا في الخلايا لأنواع مختلفة من الأدوية أو مقاربات الحمض النووي المستحثة بالأشعة تحت الحمراء ، فإن النقص في MMR (MMR & # x02212) يؤدي إلى & # x0201c تحمل الضرر & # x0201d أو & # x0201cdrug و مقاومة الأشعة تحت الحمراء & # x0201d النمط الظاهري ، والتي قد يكون لها آثار مباشرة على نجاح العلاج الكيميائي وكذلك التحسس الإشعاعي القائم على الفلوروبيريميدين و / أو البلاتين في العيادة. هناك عدد متزايد من الأمثلة في أدبيات العلاج الكيميائي أو العلاج الإشعاعي أو العلاج الكيميائي + العلاج الإشعاعي ذي الصلة سريريًا & # x0201cresistance & # x0201d في MMR & # x02212 في السرطانات البشرية. على سبيل المثال ، في نموذج طعم أجنبي للورم الأرومي الدبقي متعدد الأشكال البشري ، وجد أن فقدان MMR بعد العلاج بالبروكاربازين يمنح مقاومة للتيموزولوميد ، MNNG ، والبوسولفان ، بالإضافة إلى البروكاربازين (فريدمان وآخرون ، 1997). اقترحت دراسة سريرية للمتابعة من قبل نفس الباحثين أن تحليل مستويات تعبير MLH1 و MSH2 قبل العلاج الكيميائي باستخدام temozolomide قد يساعد في التنبؤ بردود العلاج في المرضى الذين يعانون من الأورام الدبقية الخبيثة المشخصة حديثًا (فريدمان وآخرون ، 1998). في هذه الدراسة السريرية ، أظهر المرضى الذين يعانون من الأورام الدبقية الخبيثة MMR & # x02212 انخفاضًا ملحوظًا في معدل الاستجابة والبقاء على قيد الحياة مقارنةً بالمرضى المصابين بأورام MMR + الدبقية. الأهم من ذلك ، أن استخدام العلاج الإشعاعي وما يصاحب ذلك من temozolomide (TMZ) متبوعًا بالصيانة الشهرية TMZ هو الآن معيار الرعاية في المرضى الذين يعانون من الورم الأرومي الدبقي (Stupp et al. ، 2005). في الواقع ، طفرات نقطة جسدية في hmsh6 توجد في ما يصل إلى 30٪ من الورم الأرومي الدبقي المتكرر / التدريجي ، والذي لم يكن موجودًا في عينات ما قبل العلاج. تعطيل hmsh6 كان مرتبطًا بالتعرض السابق أو المستمر لـ TMZ وأدى إلى تعزيز نمو الورم وقصر البقاء على قيد الحياة (Cahill et al. ، 2007).

تشير الدراسات السابقة في خطوط خلايا سرطان المبيض إلى أن العلاج بمركبات البلاتين & # x0201cselect & # x0201d للخلايا الباقية على قيد الحياة مع تعبير أقل لبروتين MMR أو فقدان MMR Brown et al. (1997). تم العثور على انخفاض كبير في التعبير عن كل من البروتينات MSH2 و MLH1 بعد العلاج الكيميائي سيسبلاتيني في المرضى الذين يعانون من أورام المبيض التي تنشأ بشكل متقطع (Samimi وآخرون ، 2000). تم الإبلاغ أيضًا عن انخفاض التعبير البروتيني لـ MLH1 بعد العلاج الكيميائي القائم على الأدرياميسين في مرضى سرطان الثدي بشكل كبير مع انخفاض معدل البقاء على قيد الحياة الخالية من الأمراض (ص& # x02009 = & # x020090.0025) ، (Mackay وآخرون ، 2000) تشير إلى أن المقاومة التي يضفيها نقص MMR على العديد من عوامل العلاج الكيميائي للسرطان ذات صلة سريريًا.أظهرت تحليلات استخدام العلاج الكيميائي المعتمد على الفلوروبيريميدين في المرضى الذين يعانون من MMR & # x02212 (عدم استقرار الأقمار الصناعية الدقيقة ، MSI-H) سرطان القولون والمريء فائدة أقل بكثير في البقاء على قيد الحياة الخالية من الأمراض مقارنة بفائدة كبيرة في المرضى الذين يعانون من MMR + سرطانات القولون والمريء. (Kishi et al.، 2003 Ribic et al.، 2003 Sargent et al.، 2010) بالإضافة إلى ذلك ، تُظهر سرطانات MMR & # x02212 سرطان بطانة الرحم والمستقيم انخفاضًا في التحكم المحلي ومعدلات الاستجابة المرضية بعد العلاج الإشعاعي وحده (بيلباو وآخرون ، 2010) أو مع 5-فلورويوراسيل-العلاج الإشعاعي طريقة العلاج المركب ، (تشوي وآخرون ، 2007) على التوالي. في المقابل ، لقد أظهرنا أن هذه MMR & # x02212 & # x0201cdrug و IR المقاومة & # x0201d السرطانات البشرية تُظهر دمج IUdR & # x02013DNA المحسن وزيادة التحسس الإشعاعي بوساطة IUdR (IPdR) باستخدام التجريبية في المختبر / في الجسم الحي (Berry and Kinsella، 2001 Seo et al.، 2004، 2005 Kinsella et al.، 2007، 2008) سيتم مراجعة نتائج هذه البيانات التجريبية أدناه.

الأساس المنطقي العلمي والسريري لاستخدام IUdR وعقارها الأولي عن طريق الفم ، IPdR ، كمحسّسات إشعاعية في السرطانات البشرية التي تعاني من نقص MMR

IUdR هو نظير الثيميدين المهلجن وقد تم التعرف عليه على أنه في المختبر/في الجسم الحي والمحسس الإشعاعي السريري المحتمل لعدة عقود (Kinsella ، 1996). بعد نقل النوكليوزيد النشط عبر أغشية الخلايا ، يتم فسفرة IUdR بالتسلسل إلى IdUTP ودمجها في الحمض النووي في منافسة مع ثيميدين ثلاثي الفوسفات (dTTP Kinsella ، 1996). ترتبط الآليات الكيميائية الحيوية للتحسس الإشعاعي الخلوي بتوليد الجذور الحرة عالية التفاعل بواسطة الأشعة تحت الحمراء من دمج IUdR & # x02013DNA مما أدى إلى حدوث فواصل حبلا معززة بالحمض النووي المستحث بالأشعة تحت الحمراء [كلاهما فردي (SSB) ومزدوج حبلا (DSB)] مع تغيير تلف الأشعة تحت الحمراء أيضًا إصلاح (Kinsella ، 1996). من المعترف به عمومًا أن مدى (٪) استبدال الثيميدين بـ IUdR في الحمض النووي يرتبط ارتباطًا مباشرًا بمدى (٪) من التحسس الإشعاعي. تم اختبار التحسس الإشعاعي المستهدف بواسطة IUdR لبعض أنواع السرطان البشرية بناءً على معدل الانتشار الأعلى في هذه السرطانات مقارنة بالأنسجة الطبيعية المجاورة. في أعمالنا السابقة في الجسم الحي دراسات ما قبل السريرية باستخدام الحقن الوريدي الفمي أو المستمر في الوريد لـ 4 & # x0201310 & # x02009 أيام قبل الدورة القصيرة IR (أربعة كسور / 4 & # x02009 أيام) ، لاحظنا التحسس الإشعاعي المحسن (1.3 & # x020131.5 & # x000d7 مقارنة بالأشعة تحت الحمراء وحدها ) ولكن أيضًا زاد من دمج٪ IUdR & # x02013DNA في كل من نخاع العظام والأمعاء (Kinsella et al. ، 1996). من الناحية السريرية ، حدت السمية الحادة الجهازية لنخاع العظام والأمعاء من المدة والجرعة الإجمالية من الحقن الوريدي المستمر من IUdR أثناء العلاج الإشعاعي الخارجي المجزأ (Epstein et al.، 1994 Schulz et al.، 2004).

IPdR هو نيوكليوسيد بيريميدينون ، الذي تم تصنيعه في الأصل كعامل مضاد للفيروسات ، بناءً على فرضية أن النيوكليوسيدات التي لا تحتوي على مجموعة أمينية أو كيتو في الموضع الرابع من حلقة بيريميدين ستستخدم كركيزة من ثيميدين كيناز الفيروسي (TK) ولكن لا ثدييات TK (سيف وآخرون ، 2007). ومع ذلك ، وجد هؤلاء المحققون أنفسهم لاحقًا أنه يمكن تحويل IPdR بكفاءة إلى IUdR بواسطة أكسيد الألدهيد الذي تمركز بشكل أساسي في كبد القوارض (Saif et al. ، 2007). بعد ذلك ، أثبتنا أن الألدهيد أوكسيديز في أنسجة الكبد الطبيعية في القوارض (الفئران والجرذان) والحيوانات غير القوارض (القوارض ، القرود) يحول IPdR بسرعة إلى IUdR في الجسم الحي بالإضافة إلى إظهار استقلاب IPdR مماثل باستخدام مقتطفات خلوية من الكبد البشري الطبيعي في المختبر (كينسيلا وآخرون ، 1994 ، 1998). لقد أبلغنا أيضًا أن IPdR عن طريق الفم يمكن أن يحسن بشكل كبير المؤشر العلاجي للتحسس الإشعاعي بوساطة IUdR ، مقارنةً بالتسريب المستمر IUdR باستخدام نماذج طعم xenograft لورم القولون والمستقيم البشري (Kinsella وآخرون ، 1994 ، 1998 ، 2000a ، ب). تم تقليل مدى (٪) دمج IUdR & # x02013DNA في الأمعاء الدقيقة ونخاع العظام بشكل ملحوظ مع دمج٪ IUdR & # x02013DNA المتماثل أو المتفوق في xenografts للورم البشري باستخدام IPdR عن طريق الفم يعطى مرة واحدة يوميًا & # x000d7 14 & # x02009days مقارنة بالحد الأقصى المسموح به جرعة IUdR كتسريب مستمر (Kinsella et al. ، 1994 ، 1998 ، 2000a ، b).

كجزء من تحقيقات ICBP الخاصة بنا ، أظهرنا أن السمية الخلوية IUdR (و IPdR) تتأثر بكل من MMR وإصلاح استئصال القاعدة ، مع كل من أنظمة إصلاح الحمض النووي قادرة على التعرف على أخطاء G: IU (Kinsella ، 2009). لقد أظهرنا أيضًا أن خلايا MMR & # x02212 تحتفظ بمستويات أعلى من دمج IUdR & # x02013DNA باستخدام isogenic في المختبر و في الجسم الحي النماذج ، مما يؤدي إلى تحسين التحسس الإشعاعي في سرطانات MMR & # x02212 مقابل MMR + السرطانات (Kinsella ، 2008). على هذا النحو ، نقوم الآن بتطوير IPdR كمحسس إشعاعي سريري محتمل لـ MMR & # x02212 وأنواع السرطان الأخرى & # x0201cIR-resistant & # x0201d بالتعاون مع المعهد الوطني للسرطان. أحد أهداف تطوير في السيليكو النماذج (الحسابية) لمعالجة MMR لكل من IUdR و IR (كما هو مفصل أدناه) هي توفير رؤى لتصميم التجارب السريرية لتحسين جدول الجرعات لـ IPdR المدار عن طريق الفم من أجل التحسس الإشعاعي بوساطة IUdR في MMR & # x02212 وغيرها من البشر المقاومين للأشعة تحت الحمراء السرطانات (كينسيلا ، 2008 ، 2009).


شكر وتقدير

نشكر الدكتورة كارولين كيسكر والدكتور يوخن كوبر لمشاركة بياناتهما قبل النشر ، والدكتور ماسايوشي هوندا وشيامال سوبرامانيام لقراءتهما النقدية للمخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل HHMI جائزة العالم الوظيفي المبكر لمرض التصلب العصبي المتعدد. CGW هو عالم ما بعد الدكتوراه في جمعية السرطان الأمريكية.

الكاتب الاشتراكات: صممت RAP و CGW و MS الدراسة التي قام بها RAP و CGW بإجراء التجارب وتحليل البيانات قام RAP و CGW و MS بتفسير البيانات وكتب المخطوطة.


مقدمة

الشكل 1. التراكيب الكيميائية للنيوكليوتيدات الوظيفية وأزواج القاعدة غير الطبيعية والسكريات. 1، الحمض النووي 2، Ds: Px 3، dZ: dP 4، dNaM: d5SICS 5، αS-DNA 6، γ- فوسفات- O- رابط- dabcyl 7، N7 موقف البيورين 8، C5 بيريميدين موقف 9تريبتامينو 10، البنزيل 11النفتيل 12، إيثيليندول 13، CeNA 14، HNA 15فانا 16، السلطة الوطنية الفلسطينية 17، 2 درجة فهرنهايت 18، ANA 19، LNA 20، TNA 212 م 223 م 23، 2′ ديوكسي 24، 2′SeMe.


قد يكون الاختبار الجديد المستند إلى PCR قادرًا على اكتشاف المستويات المنخفضة من CML المستمر ، وتوجيه خيارات علاج TKI

قد يكون الاختبار الجديد المستند إلى PCR قادرًا على اكتشاف المستويات المنخفضة من CML المستمر ، وتوجيه خيارات علاج TKI

من CancerNetwork.com: الفحص الجديد يمكن أن يساعد في توجيه قرارات وقف العلاج في CML

المراسل: ستيفن ج. وليامز ، دكتوراه.

أخبار | 15 فبراير 2016 | اللوكيميا النخاعية المزمنة ، الأورام الخبيثة الدموية ، اللوكيميا والأورام اللمفاوية
بقلم ديف ليفيتان
كشفت دراسة جديدة أن فحصًا شخصيًا جديدًا يعتمد على الحمض النووي يمكن أن يكتشف مستويات منخفضة جدًا من المرض المستمر في مرضى سرطان الدم النخاعي المزمن (CML) الذين يُعتقد أنهم في حالة هدوء عميق. يمكن أن يساعد الاختبار في خيارات العلاج فيما يتعلق بوقف العلاج بمثبطات التيروزين كيناز (TKI) في هؤلاء المرضى.
قام عدد من الدراسات الحديثة بفحص احتمال أن يتمكن بعض المرضى من إيقاف علاج TKI بعد تحقيق مغفرة جزيئية عميقة. كتب مؤلفو الدراسة بقيادة أليستير ج. جامعة لندن الامبرياليه.

نظرًا لأن احتمال الانتكاس بعد الانسحاب من العلاج ربما يكون مرتبطًا باستمرار المرض المتبقي ، فإن اختبار المستويات المنخفضة من المرض الإيجابي BCR-ABL1 هو المفتاح. في الدراسة الجديدة ، اختبر الباحثون اختبارًا باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل المعتمد على الحمض النووي (dPCR) الذي يتضمن تحديد تقاطعات الاندماج t (922). تم نشر النتائج في مجلة التشخيص الجزيئي.

لقد نجحوا في تعيين نقاط توقف الجينوم في 32 عينة من 32 عينة من مرضى سرطان الدم النخاعي المزمن الذين يعانون من مرض في مرحلة مبكرة. بعد ذلك ، قاموا باختبار 46 عينة من 6 مرضى بعد العلاج باستخدام TKI وقارنوا النتائج مع طرق PCR الكمية الأخرى ، تم استخدام 10 من العينات كعناصر تحكم إيجابية ، في حين تم اعتبار الآخرين في حالة مغفرة جزيئية عميقة.

من بين 36 عينة ، اكتشف dPCR مرضًا مستديمًا في 81 ٪. كان هذا أكثر حساسية من نهجين آخرين قائم على PCR ، بما في ذلك RT-dPCR (25 ٪) و PCR الكمي القائم على الحمض النووي (19 ٪).

"التقنيات الموصوفة تسمح بتخصيص كميات مطلقة لكليهما BCR-ABL1 أهداف الحمض النووي والحمض النووي الريبي ، مما يسهل المقارنة المباشرة لأول مرة بين التعبير المتوسط ​​مقابل عبء المرض الخلوي "، كتب المؤلفون. وأضافوا أنه لا يزال يتعين استكشاف ما إذا كان خطر الانتكاس بعد الانسحاب من العلاج مرتبطًا فقط بعدد خلايا سرطان الدم النخاعي المزمن أو أيضًا بدرجة نشاط النسخ في تلك الخلايا.

"إذا تم التحقق من صحتها في التجارب السريرية لإيقاف TKIs ، فإن هذه التقنية ستسمح بنهج أكثر تخصيصًا للتوصيات الخاصة بخفض الجرعة أو التوقف عن تناول الأدوية في المرضى الفرديين ، مما يضمن عدم سحب العلاج إلا من المرضى الذين لديهم أعلى فرصة للشفاء على المدى الطويل ،" مؤلفة الدراسة جين إف أبيرلي ، دكتوراه في الطب ، دكتوراه ، أيضًا من إمبريال كوليدج لندن ، في بيان صحفي. "الأسلوب الذي نصفه ، والذي نجحنا في رسم خريطة تقاطع خاص بمرض معين في جميع المرضى الذين تم اختبارهم ، هو أسلوب بسيط نسبيًا ، وفعال من حيث التكلفة ، ومناسب لمختبر عالي الإنتاجية."


أساليب

زراعة الخلايا

تمت زراعة خلايا الفئران ES كما هو موضح سابقًا [15]. باختصار ، تم بذر 1.0 × 10 5 خلايا على طبق 60 مم مغطى بالجيلاتين (0.1٪). تم الحفاظ على الخلايا في وسط قائم على GMEM يحتوي على 10 ٪ FBS و 1000 وحدة / مل من العامل المثبط لسرطان الدم (Millipore ESGRO). كان الخط الخلوي المستخدم في هذه الدراسة هو G6GRGFP ، والذي تم إنشاؤه في دراسة سابقة [23]. تم الإبلاغ عن أن جميع G6GRGFP تقريبًا تمايزت إلى خلايا تشبه الأديم الباطن البدائي عند العلاج بالديكساميثازون [15 ، 23]. لتمييز الخلايا الجذعية الجنينية إلى خلايا شبيهة بالأديم الباطن البدائي ، تم زرع خلايا 1.0 × 10 5 على طبق 60 مم مغطى بالجيلاتين وزُرعت في وسط قائم على GMEM يحتوي على 10٪ FBS و 1000 وحدة / مل LIF و 100 ملي ديكساميثازون من أجل 72 ساعة لقد أكدنا أن جميع خلايا G6GR ES المعالجة بـ Dex تقريبًا متباينة إلى خلايا تشبه الأديم الباطن البدائي. علاوة على ذلك ، قمنا بتربية خلايا J1 ES وفقًا للإجراء الموصوف في تقرير سابق [21].

تلطيخ الخلية

لتحديد الخلايا الميتة أو التالفة ، تمت إضافة يوديد البروبيديوم (PI) إلى معلق الخلية (التركيز النهائي 1 - 2 ميكروغرام / مل). كمؤشر على حالة غير متمايزة في تعليق يحتوي على خليط من الخلايا ، تم استخدام Calcein-AM. تم تحضير معلقات الخلايا المستزرعة تحت ظروف الصيانة والتمايز بشكل مستقل ، وعولجت الخلايا في حالة الصيانة بـ 1 ميكروغرام / مل من Calcein-AM لمدة 10 دقائق على الجليد. بعد الغسل باستخدام PBS ، تم خلط المعلقات الخلوية للخلايا الجذعية الجنينية وخلايا PrE بنفس التركيز. تم استخدام Hoechst 33342 كمؤشر لمحتوى الحمض النووي في الخلية. تم تنفيذ الإجراءات كما هو موضح سابقًا [15].

إعداد خلية واحدة لكسر الأوعية الدموية اللحمية

تم إجراء هذه التجارب وفقًا للبروتوكول المعتمد من قبل لجنة أبحاث الحيوانات في معهد نارا للعلوم والتكنولوجيا ولجنة التجارب على الحيوانات RIKEN. الأنسجة الدهنية تحت الجلد من فئران ذكور ICR عمرها ثلاثة إلى أربعة أشهر (ن = 3 لكل عينة ، عينتان بيولوجيتان مكررتان) تم تقطيعهما إلى قطع صغيرة واحتضانهما بـ 0.4 وحدة / مل من كولاجيناز NB4G (سيرفا) عند 37 درجة مئوية لمدة 35 دقيقة في حمام مائي مهتز. تم ترشيح المحلول المهضوم بالتسلسل من خلال مصافي خلايا 100 و 40 ميكرومتر (Corning) ، متبوعًا بالطرد المركزي عند 250 ×ز لمدة 5 دقائق لإزالة الخلايا الشحمية الناضجة. تمت معالجة الحبيبات بمحلول تحلل كريات الدم الحمراء (BD Biosciences) وطردها عند 180 ×ز لمدة 5 دقائق. تم تعليق الخلايا المنواة في HBSS بنسبة 0.1 ٪ BSA ، وتم ترشيحها من خلال مصفاة خلية 20 ميكرومتر (pluriSelect) ، ثم الاحتفاظ بها على الجليد (محلول الخلية A). تمت معالجة مجاميع الخلايا التي لم تمر عبر مصفاة 20 ميكرون باستخدام Accutase (Thermo Fisher Scientific) عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لفصلها إلى خلايا مفردة ، وطردها عند 180 ×ز لمدة 5 دقائق ، وعلقت في HBSS مع 0.1٪ BSA (محلول الخلية B). تم خلط المحاليل الخلوية A و B ثم تمت تصفيتها مرة أخرى من خلال مصفاة الخلية 20 ميكرومتر ، متبوعة بالطرد المركزي عند 180 ×ز لمدة 5 دقائق. تم إعادة تعليق الحبيبات باستخدام HBSS بنسبة 0.1 ٪ من مساحة سطح الجسم ، ملطخة بـ PI ، وتستخدم لتحليل الخلية الواحدة.

إعداد الحمض النووي الريبي

تمت تنقية إجمالي الحمض النووي الريبي من الخلايا المستزرعة باستخدام مجموعة Direct-zol RNA MiniPrep (أبحاث Zymo) مع كواشف عزل TRIzol RNA (Thermo). قمنا بقياس تركيز إجمالي الحمض النووي الريبي المنقى باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop 1000 (Thermo). لقد أكدنا أن رقم تكامل الحمض النووي الريبي لإجمالي الحمض النووي الريبي كان أكثر من 9.5 باستخدام مجموعة Agilent RNA 6000 Nano Kit (Agilent). تم إجراء تقدير متوسط ​​كمية إجمالي الحمض النووي الريبي لكل خلية مفردة للعينات المعنية وفقًا لدراستنا السابقة [15]. بالنسبة إلى تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية عالي الإنتاجية ، قمنا بإعداد إجمالي الحمض النووي الريبي من خلية واحدة مع ارتفاع الحمض النووي الريبي ERCC. أولاً ، قمنا بتخفيف ارتفاعات الحمض النووي الريبي ERCC بعشرة أضعاف. أضفنا بعد ذلك 6 ميكرولتر من 1: 10 من الحمض النووي الريبي ERCC المخفف لكل 10 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي. استخدمنا 10 بيكوغرام مخفف من الحمض النووي الريبي الكلي مع ERCC spike-in RNA للتحقق الفني من Quartz-Seq2. بالنسبة للخلايا المفردة ، استخدمنا نفس تركيز الحمض النووي الريبي (RNA) المرتفع ERCC.

طرق تسلسل الحمض النووي الريبي بالجملة لمجموعات الخلايا

قمنا بإعداد مكتبة تسلسل DNA مع 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام وحدة العزل المغناطيسي NEBNext Poly (A) mRNA ومجموعة أدوات إعداد مكتبة الحمض النووي الريبي الفائق الاتجاه NEBNext. لم يحتوي إجمالي الحمض النووي الريبي على مزيج الدوران في ERCC I. بالإضافة إلى ذلك ، استخدمنا SuperScript III بدلاً من ProtoScript في خطوة RT و KAPA HiFi DNA polymerase بدلاً من NEBNext High-Fidelity PCR DNA polymerase في خطوة PCR. تم تحليل DNA مكتبة التسلسل الناتج بواسطة HiSeq2500.

تصميم الباركود الخلوي

تم اختيار 384 أو 1536 تسلسلًا لمجموعات بادئات الباركود v3.1 و v3.2 كما هو موضح أدناه. أولاً ، تم إنشاء 1582 أو 4714 تسلسلًا مرشحًا باستخدام حزمة DNABarcodes من R Bioconductor لمجموعة v3.1 مع 14-mer ومجموعة v3.2 مع 15-mer ، على التوالي (الإصدار 1.0.0). لتقليل فقد القراءات المحولة إلى تعداد UMI ، قمنا بتطبيق مسافة Sequence – Levenshtein كمسافة تحرير من أجل تعظيم القدرة على تصحيح الأخطاء التي تحدث أثناء تخليق قليل النوكليوتيدات أو التسلسل [22]. تم التحكم في الحد الأدنى للمسافة بين أي تسلسلين حتى 5 ، مما أدى إلى تصحيح خطأين كحد أقصى في الاستبدال أو الإدراج أو الحذف. نظرًا لأن التكوين الأساسي للتسلسلات التي تم إنشاؤها لم يكن موحدًا ، فقد اخترنا 384 أو 1536 تسلسلاً من بين 1582 أو 4714 تسلسلًا تم إنشاؤه بحيث انخفض التباين في التكوين الأساسي. يتم سرد هذه التسلسلات في ملف إضافي 5: الجدول S4.

جمع وحيدة الخلية باستخدام قياس التدفق الخلوي

تم تحليل الخلايا الملطخة باستخدام قياس التدفق الخلوي SH800 (سوني) أو MoFlo Astrios EQ (بيكمان كولتر). بالنسبة لـ SH800 ، استخدمنا رقائق فرز موائع جزيئية 130 ميكرومتر. بالنسبة إلى MoFlo Astrios EQ ، استخدمنا أحجام فوهة 100 ميكرومتر. تم تجهيز كل فارز خلية بواقي رشاش مصنوع خصيصًا لمنع التلوث من القطرات غير المتوقعة بين البئر المستهدف والآبار المجاورة. استخدمنا مجموعتين من RT التمهيدي لـ Quartz-Seq2. تحتوي مجموعة البادئات v3.1 RT على 384 نوعًا من الرموز الشريطية الخلوية الفريدة ، بطول 14 نيوكليوتيد (تنقية OPC ، FASMAC). تحتوي مجموعة البادئات v3.2 RT على 1536 نوعًا من الرموز الشريطية الخلوية الفريدة ، بطول 15 نيوكليوتيد (تنقية OPC ، Sigma). تتوافق مجموعة البادئات v3.1 RT مع مجموعة واحدة من لوحة PCR ذات 384 بئرًا مع محلول تحلل ، تحتوي آبارها على رموز شريطية فريدة. تتوافق مجموعة البادئات v3.2 RT مع أربع مجموعات من لوحة PCR ذات 384 بئر مع مخزن مؤقت للتحلل. تم وصف موضع التمهيدي RT في لوحة 384 جيدًا والتسلسل كما هو موضح في الملف الإضافي 5: الجدول S4. تم عزل الخلايا المفردة في لوحة PCR ذات 384 بئر مع 1 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل (0.1111 ميكرومتر من الاشعال RT لكل منها ، 0.12 ملي مولار من مزيج dNTP ، 0.3 ٪ NP-40 ، 1 وحدة / ميكرولتر RNasin plus) التي تحتوي على ERCC سبايك في RNA. أثناء الفرز أحادي الخلية ، تم الاحتفاظ بلوحة PCR المكونة من 384 بئرًا على حامل من الألومنيوم 384 عند 4 درجات مئوية. بالنسبة لـ Moflo Astrios EQ ، استخدمنا G5498B-060 Insert 384 Eppendorf twin.tec PCR كحامل ألومنيوم 384 (Agilent). بالنسبة إلى SH800 ، استخدمنا حامل ألومنيوم SH800 384 (سوني). مباشرة بعد جمع الخلايا ، تم إغلاق اللوحة مؤقتًا برقائق إحكام إغلاق LightCycler 480 (Roche) وتم طرد لوحة PCR المختومة 384 جيدًا عند 10000 جم و 4 درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة باستخدام TOMY MX307 ، المجهزة بحامل في- رف دوار وطرد مركزي PCR96-02. كانت هذه الخطوات مهمة جدًا لجمع القطرة بخلية واحدة في محلول تحلل بطريقة فعالة. عن طريق تغيير حجم المخزن المؤقت للتحلل من 0.4 ميكرولتر (كما هو موصوف في ورق Quartz-Seq الأصلي) إلى 1 ميكرولتر (Quartz-Seq2) ، لم يكن فقاقيع المخزن المؤقت للتحلل مطلوبًا قبل الفرز أحادي الخلية ويمكن بسهولة التعامل مع المخزن المؤقت للتحلل . ثم قمنا بعد ذلك بتقشير الختم المؤقت وإعادة إحكام غلقه باستخدام Agilent PlateLoc Thermal Microplate Sealer (Agilent). قمنا بتحريك اللوحة عند 2600 دورة في الدقيقة و 4 درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة باستخدام ThermoMixer C (Eppendorf) ، وبعد ذلك قمنا بطرد اللوحة مرة أخرى. تم بعد ذلك حفظ الصفيحة المكونة من 384 بئر على الفور عند درجة حرارة -80 درجة مئوية والحفاظ عليها في ظل هذه الظروف حتى RT اللاحق للترميز الشريطي للخلية. بعد الحفظ بالتبريد ، أجرينا تضخيمًا كاملاً للنسخة اللاحقة باستخدام لوحة PCR ذات 384 بئرًا محفوظة بالتبريد في غضون بضعة أشهر.

تضخيم النص الكامل لـ Quartz-Seq2

تم الطرد المركزي لـ 384 لوحة محفوظة بالتبريد مع محللة أحادية الخلية عند 10000 جم و 4 درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، قمنا بتحريف إجمالي الحمض النووي الريبي في كل لوحة 384 عند 70 درجة مئوية لمدة 90 ثانية وتهجين التمهيدي RT إلى الحمض النووي الريبي متعدد الأدينات عند 35 درجة مئوية لمدة 15 ثانية باستخدام جهاز التدوير الحراري C1000 / S1000. تم طرد الألواح الناتجة مرة أخرى عند 10000 جم و 4 درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، تم وضع الألواح على لوح الألمنيوم 384 عند 0 درجة مئوية. أزلنا الختم وأضفنا 1 ميكرولتر من الخلطة الجاهزة RT (2 × عازلة Thermopol ، 5 وحدات / ميكرولتر SuperScript III ، 0.55 وحدة / ميكرولتر RNasin plus) إلى 1 ميكرولتر من محلول التحلل لكل بئر باستخدام نظام صرف مانتيس ميكروفلويديك (Formulatrix) أو نظام لوحة النقل 384 (1859-384S ، واتسون). تم استخدام محلول RT أعلاه لشرط RT25. بالنسبة لشرط RT100 ، استخدمنا حل RT التالي: 2 × Thermopol buffer ، 20 وحدة / ميكرولتر SuperScript III ، و 2.2 وحدة / ميكرولتر RNasin plus. أغلقنا الألواح مرة أخرى وقمنا بتحريكها عند 2600 دورة في الدقيقة و 4 درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. تم بعد ذلك طرد الألواح عند 10000 جم و 4 درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة.ثم أجرينا RT عند 35 درجة مئوية لمدة 5 دقائق و 50 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة. تم إيقاف RT عند 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، تم وضع الألواح على قالب من الألومنيوم مُجهز مسبقًا ، وبعد ذلك قمنا بتقشير الأختام الخاصة بهم. بعد ذلك ، قلبنا الألواح رأسًا على عقب على المجمع المجمّع من النوع A أو النوع B (ملف إضافي 1: الشكل S4). لقد استخدمنا النوع A بشكل أساسي ، وقمنا بطرد الألواح بمجمع مجمع عند 3010 جم و 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق مع دوارات دلو متأرجح. بعد ذلك ، قمنا بجمع محلول (كدنا) في خزان يمكن التخلص منه. عادة ، حصلنا على 650-700 ميكرولتر من محلول (كدنا) من لوحة PCR 384 بئر. قمنا بتنقية وتركيز محلول cDNA باستخدام مجموعة DNA Clean & amp Concentrator ™ -5 (Zymo Research). استخدمنا ثلاثة أعمدة تنقية للوحة PCR ذات 384 بئرًا في حالة نظام التمهيدي v3.1 RT (كود شريطي مكون من 384 خلية). تم استخراج (كدنا) المنقى إلى 20 ميكرولتر من الماء الخالي من نوكلياز من تنقية عمود واحد ونقله إلى أنبوب PCR ثماني متصل (TaKaRa). تم وضع أنابيب PCR على حامل PCR من الألومنيوم عند 0 درجة مئوية. أضفنا 25 ميكرولتر من محلول TdT (1 × عازلة Thermopol ، 2.4 ملي dATP ، 0.0384 وحدة / ميكرولتر RNase H (Invitrogen) ، 26.88 وحدة / ميكرولتر ترانسفيراز (روش)) إلى 20 ميكرولتر من cDNA المستخرج باستخدام ماصة عند 0 درجة مئوية . تم خلط 45 ميكرولتر الناتج من محلول TdT مع ماصة عند 0 درجة مئوية أو ThermoMixer عند 2000 جم و 0 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك مباشرة ، تم طرد أنابيب PCR عند 10000 جم و 0 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. استخدمنا جهاز تدوير حراري C1000 / S1000 مجهز بوحدة تفاعل 96 بئر عميق للخطوات التالية. تم وضع أنابيب PCR على كتلة الدورة الحرارية ، والتي تم تحضيرها مسبقًا إلى 0 درجة مئوية. ثم أجرينا تفاعل ذيل بولي (A) عند 37 درجة مئوية لمدة 75 ثانية. تم تعطيل المحلول عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تم وضع أنابيب PCR على حامل PCR من الألومنيوم عند 0 درجة مئوية. ثم قمنا بتوزيع ما يقرب من 11 ميكرولتر من المحلول في أربعة آبار من 45 ميكرولتر من محلول TdT. أضفنا 46.16 ميكرولتر من مزيج PCR I premix (1.08492 × MightyAmp Buffer الإصدار 2 ، 0.06932 ميكرومتر للتمهيدي ، 0.05415 وحدة / ميكرولتر MightyAmp DNA polymerase) إلى 11 ميكرولتر من محلول TdT للآبار الخاصة بأنبوب PCR. يتم تسويق بوليميراز الحمض النووي MightyAmp ، والذي تم استخدامه في Quartz-Seq و Quartz-Seq2 ، باسم Terra PCR Direct polymerase [15]. أجرينا خلطًا انقلابًا لطيفًا على المحلول الناتج في أنبوب PCR. تم بعد ذلك طرد الأنابيب عند 10000 جم و 4 درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، تم خلط المحلول مع ThermoMixer عند 2000 دورة في الدقيقة و 4 درجات مئوية لمدة دقيقتين. ثم قمنا بتدوير الأنبوب مرة أخرى. بعد ذلك ، قمنا بتحريف المحلول عند 98 درجة مئوية لمدة 130 ثانية وتمهيدي وضع العلامات التمهيدي إلى بولي (A) - الذيل كدنا عند 40 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، أجرينا خطوة الزيادة عن طريق التسخين إلى 68 درجة مئوية عند 0.2 درجة مئوية كل ثانية وأجرينا تخليق الشريطة الثانية عند 68 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تم وضع الأنابيب على حامل PCR من الألومنيوم عند 0 درجة مئوية. أضفنا 50.232 ميكرولتر من مزيج PCR II (0.99697 × MightyAmp Buffer version.2 ، 1.8952 ميكرومتر جم من التمهيدي) إلى 56.16 ميكرولتر من محلول PCR I. أجرينا خلطًا انقلابًا لطيفًا على المحلول الناتج في أنبوب PCR. تم بعد ذلك طرد الأنابيب عند 10000 جم و 4 درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، تم خلط المحلول مع ThermoMixer عند 2000 دورة في الدقيقة و 4 درجات مئوية لمدة دقيقتين ، وبعد ذلك قمنا بتدوير الأنبوب مرة أخرى. ثم وضعناها على كتلة الدورة الحرارية عند 68 درجة مئوية. بعد ذلك ، قمنا بتضخيم cDNA لمدة 11 دورة في ظل الظروف التالية: 98 درجة مئوية لمدة 10 ثوانٍ ، و 65 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 68 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ثم قمنا بحضانة الأنبوب عند 68 درجة مئوية لمدة 5 دقائق إضافية. أخيرًا ، قمنا بنقل كل محلول PCR ، المشتق من لوحة PCR واحدة 384 جيدًا ، إلى أنبوب طرد مركزي من البولي بروبيلين سعة 50 مل (Watson). عادة ، حصلنا على ما يقرب من 1.2 مل من محلول PCR لكل 384 لوحة PCR. أضفنا 32 ميكرولتر من 3 M أسيتات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.2) و 6420 ميكرولتر PB-Buffer (Qiagen) إلى محلول PCR. ينقى الخليط بعد ذلك باستخدام MinElute Spin Column (Qiagen). تم استخراج (كدنا) المنقى إلى 40 ميكرولتر من الماء الخالي من نوكلياز. قمنا أيضًا بتنقية (كدنا) باستخدام 32 ميكرولتر من حبات Ampure XP. أخيرًا ، حصلنا على 32 ميكرولتر من (كدنا) المنقى. قمنا بفحص توزيع طول (كدنا) المضخم باستخدام مجموعة الحمض النووي عالية الحساسية (Agilent). كان متوسط ​​الحجم النموذجي لـ cDNA المضخم في Quartz-Seq2 حوالي 1400 نقطة أساس (ملف إضافي 1: الشكل S2c). يتم سرد تسلسلات التمهيدي في ملف إضافي 5: الجدول S4.

في حالة استخدام v3.2 RT التمهيدي في Quartz-Seq2 ، قمنا بتعديل الخطوات المذكورة أعلاه على النحو التالي. بعد RT ، قمنا بجمع محلول cDNA في خزان يمكن التخلص منه من أربع مجموعات من 384 لوحة جيدة ، والتي تتوافق مع 1536 بئراً. قمنا بتنقية وتركيز محلول cDNA باستخدام ثمانية أعمدة تنقية لأربعة ألواح PCR ذات 384 بئرًا في حالة نظام التمهيدي v3.2 RT. في خطوة PCR ، قمنا بتضخيم cDNA لمدة تسع دورات بالشروط التالية: 98 درجة مئوية لمدة 10 ثوانٍ ، و 65 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 68 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أخيرًا ، قمنا بنقل كل محلول PCR المشتق من أربعة ألواح ذات 384 بئرًا إلى أنبوب طرد مركزي من البولي بروبيلين سعة 50 مل (واتسون). عادة ، حصلنا على ما يقرب من 3.5 مل من محلول PCR لكل أربعة ألواح PCR ذات 384 بئر. أضفنا 88 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم 3 م (الرقم الهيدروجيني 5.2) و 17.6 مل من PB-Buffer (Qiagen) إلى محلول PCR. ينقى الخليط باستخدام MinElute Spin Column (Qiagen). بعد ذلك ، تمت تنقية (كدنا) مرة أخرى باستخدام حبات مغناطيسية Ampure XP.

بالنسبة للتفاعل الشبيه بـ Quartz-Seq1 ، أجرينا الإجراء التالي وفقًا لدراستنا السابقة. أضفنا 1 ميكرولتر من الخلطة الأولية RT (2 × PCR عازلة ، 5 وحدات / ميكرولتر SuperScript III ، 0.55 وحدة / ميكرولتر RNasin plus) إلى 1 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل. ثم أجرينا RT عند 35 درجة مئوية لمدة 5 دقائق و 45 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تم إيقاف RT هذا عند 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. أضفنا 5 ميكرولتر من محلول ExoIB (المخزن المؤقت 1.6 × Exonuclease I ، 3.2 × PCR المخزن المؤقت ، 16 ملي DTT) و 20 ميكرولتر من محلول TdT (1 × PCR عازلة ، 3 مم dATP ، 0.0384 وحدة / ميكرولتر RNase H (Invitrogen) ، 33.6 وحدات / ميكرولتر ترانسفيراز نهائي (روش)) إلى 20 ميكرولتر من (كدنا) المستخرج باستخدام ماصة عند 0 درجة مئوية. تم وضع أنابيب PCR على كتلة الدورة الحرارية التي تم تجهيزها مسبقًا إلى 0 درجة مئوية. أجرينا تفاعل ذيل بولي (A) عند 37 درجة مئوية لمدة 75 ثانية. قمنا بعد ذلك بتغيير طبيعة المحلول عند 98 درجة مئوية لمدة 130 ثانية وتمهيدي وضع العلامات التمهيدي إلى بولي (A) - الذيل كدنا عند 40 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، أجرينا توليف الشريطة الثانية عند 68 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بعد ذلك ، قمنا بتضخيم (كدنا) عبر تفاعل PCR لمدة 12 دورة.

تحضير محول التسلسل المقطوع

يتكون مهايئ التسلسل المقطوع من برايمر rYshapeP5 (منقى بواسطة HPLC) وأشعال rYshapeP7LT (منقى بواسطة HPLC) ، والذي يحتوي على رمز باركود متوافق مع TruSeqLT. لقد أعددنا 100 ميكرومتر من البادئات ذات الصلة مع المحول المؤقت (10 مم Tris-HCl pH 7.8 ، 0.1 ملي مولار EDTA درجة الحموضة 8.0 ، 50 ملي كلوريد الصوديوم). أضفنا 5 ميكرولتر من 100 ميكرومتر rYshapeP5 التمهيدي و rYshapeP7LTxx التمهيدي في أنبوب PCR واحد. قمنا بتحريف المحلول عند 90 درجة مئوية لمدة 90 ثانية. بعد ذلك ، حققنا التلدين بالتبريد إلى 10 درجات مئوية بمقدار 0.5 درجة مئوية كل 30 ثانية ثم الحفاظ على العينة عند 4 درجات مئوية. ثم وضعنا الأنبوب على حامل PCR من الألومنيوم عند 0 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضفنا المخزن المؤقت للمحول ، الذي تم تجهيزه مسبقًا عند 0 درجة مئوية ، إلى 10 ميكرولتر من محول مقطوع 50 ميكرومتر. أخيرًا ، حصلنا على حوالي 50 ميكرولتر من 10 ميكرومتر محول مبتور. قمنا بحفظ 1 ميكرولتر من المحول المقطوع 10 ميكرومتر في أنبوب PCR عند درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام في خطوة ربط المحول. يتم سرد تسلسلات التمهيدي في ملف إضافي 5: الجدول S4.

إعداد مكتبة تسلسل الكوارتز- Seq2

أضفنا 130 ميكرولتر من الماء الخالي من نوكلياز بما في ذلك 5-10 نانوغرام من (كدنا) تضخيم في أنبوب مكروي Crimp-Cap مع ألياف AFA. ثم أجرينا تجزئة (كدنا) باستخدام الموجات فوق الصوتية المركزة 220 جنيهًا مصريًا (Covaris) في ظل الظروف التالية: عامل التشغيل 15٪ ، وقوة الحادث القصوى 450 واط ، والدورات لكل انفجار 200 ، ووقت المعالجة 80 ثانية. قمنا بتنقية وتركيز محلول cDNA باستخدام مجموعة DNA Clean & amp Concentrator ™ -5. تم استخراج (كدنا) المنقى إلى 10 ميكرولتر من الماء الخالي من نوكلياز من تنقية عمود واحد ونقله إلى أنبوب PCR ثماني متصل (TaKaRa).

ثم أضفنا 2 ميكرولتر من End-Repair premix (1.4 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإصلاح النهاية و أمبير ذيل A و 0.6 ميكرولتر من إنزيم إصلاح النهاية وإنزيم A-tailing (KAPA Biosystems)) إلى 10 ميكرولتر من محلول cDNA المجزأ. بعد ذلك ، قمنا بخلط المحلول عن طريق الماصات على حامل PCR من الألومنيوم عند 0 درجة مئوية. تم وضع أنابيب PCR على كتلة الدورة الحرارية ، والتي تم تجهيزها مسبقًا إلى 20 درجة مئوية. ثم قمنا بحضانة الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة و 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، أضفنا 2 ميكرولتر من المخزن المؤقت للمحول (1.5 ميكرومتر محول مبتور ، 10 ملي مولار Tris-HCl pH 7.8 ، 0.1 ملي مولار EDTA درجة الحموضة 8.0 ، 50 ملي كلوريد الصوديوم) و 8 ميكرولتر من الخلط المسبق للربط (6 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط ، 2 ميكرولتر من DNA ligase (KAPA Biosystems)) عند 4 درجات مئوية. تم خلط 22 ميكرولتر من محلول الربط جيدًا عن طريق الأنابيب عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، أجرينا ربط المحول عند 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد الربط ، أضفنا 18 ميكرولتر من حبات Ampure XP إلى 22 ميكرولتر من محلول ربط المحول وخلطناها جيدًا. تم استخراج (كدنا) المرتبط بالمحول إلى 20 ميكرولتر من الماء الخالي من نوكلياز. أضفنا 32 ميكرولتر من مزيج PCR premix (25 ميكرولتر من 2 × KAPA HiFi جاهز ، 1.75 ميكرولتر من 10 ميكرومتر TPC2 التمهيدي (HPLC المنقى) ، 10 ميكرومتر P5-gMac الهجين التمهيدي (المنقى HPLC)) إلى 18 ميكرولتر من المحول- [كدنا] مرتبطة. قمنا بتشويه المحلول عند 98 درجة مئوية لمدة 45 ثانية. بعد ذلك ، قمنا بتضخيم cDNA لمدة ثماني دورات في ظل الظروف التالية: 98 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. أخيرًا ، قمنا أيضًا بحضانة الأنبوب عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.

أضفنا 40 ميكرولتر من حبات Ampure XP إلى 50 ميكرولتر من محلول PCR. تمت تصفية DNA مكتبة التسلسل المنقى في 20-30 ميكرولتر من الماء الخالي من نوكلياز. قمنا بفحص تركيز الحمض النووي وحجم الحمض النووي لمكتبة تسلسل الحمض النووي باستخدام مجموعة Agilent عالية الحساسية للحمض النووي (Agilent) ونظام QuantiFluor® dsDNA (Promega). قمنا أيضًا بإعداد مكتبة تسلسل الحمض النووي باستخدام ترانسبوزيز Tn5 ، وفقًا لنسخة معدلة من الإجراء المستخدم في دراسة سابقة [6]. على وجه التحديد ، كانت التعديلات على النحو التالي. استخدمنا 0.75 نانوغرام من (كدنا) المضخم لمجموعة إعداد مكتبة Nextera XT. قمنا بتضخيم الحمض النووي لمكتبة التسلسل باستخدام التمهيدي الهجين P5-gMac وبادئ Nextera XT ، الذي يحتوي على تسلسل P7.

التسلسل العميق لـ Quartz-Seq2

قمنا بتحليل DNA مكتبة التسلسل من Quartz-Seq2 باستخدام NextSeq500 (Illumina) و HiSeq2500 (Illumina). بالنسبة لتسلسل Read1 ، استخدمنا أساس تسلسل مخصص تمهيدي يسمى Read1DropQuartz primer (منقى بواسطة HPLC). في حالة التمهيدي v3.1 RT ، كانت مواصفات التسلسل كما يلي (قراءة 1 ، 22 دورة فهرس 1 ، 6 دورات قراءة 2 ، 64-118 دورة). في حالة التمهيدي v3.2 RT ، كانت مواصفات التسلسل على النحو التالي (قراءة 1 ، 23 دورة فهرس 1 ، 6 دورات قراءة 2 ، 63 دورة). عندما كان طول Read1 ضمن 64 نيوكليوتيد ، استخدمنا بشكل أساسي مجموعة NextSeq 500/550 High Output v2 Kit (75 دورة) ، والتي يمكن استخدامها لتسلسل ما يصل إلى 92 نيوكليوتيد. بالنسبة للتسلسلات الطويلة (أكثر من 64 نيوكليوتيد) ، قمنا بتحليل الحمض النووي لمكتبة التسلسل باستخدام HiSeq Rapid SBS Kit v2.0. تم دعم تحليل التسلسل باستخدام HiSeq2500 من خلال مرفق دعم تحليل شبكة الجينوم (GeNAS) في وحدة RIKEN و Phyloinformatics في مركز RIKEN لتقنيات علوم الحياة (GRAS سابقًا) في RIKEN.

تحليل qPCR أحادي الخلية الخالي من التضخيم

تم إجراء qPCR أحادية الخلية الخالية من التضخيم وفقًا لدراستنا السابقة مع التعديلات التالية [15]. قمنا بتجميع خلية واحدة في 1 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل (2.5 ميكرومتر عشوائي hexamer ، 1 ملي مولار مزيج dNTP ، 0.3 ٪ NP40 ، 2 وحدة / ميكرولتر RNasin plus) من 384 لوحة PCR (إيبندورف) باستخدام SH800. تم حفظ لوحة PCR الناتجة 384 جيدًا عند درجة حرارة -80 درجة مئوية. قمنا بتحريف إجمالي الحمض النووي الريبي في لوحة PCR ذات 384 بئر عند 70 درجة مئوية لمدة 1.5 دقيقة باستخدام دورة Cycler الحرارية C1000 / S1000 وتهجين التمهيدي العشوائي إلى RNA عند 0 درجة مئوية لمدة دقيقتين. أضفنا 1 ميكرولتر من محلول RT (2 × SSIV المخزن المؤقت ، 10 ملي DTT ، 2 وحدة / ميكرولتر RNasin plus ، 20 وحدة / ميكرولتر SuperScript IV) إلى المخزن المؤقت للتحلل. بعد ذلك ، أجرينا RT عند 23 درجة مئوية لمدة 10 دقائق و 50 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تم إيقاف RT عند 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تم تخفيف المحلول الناتج بمحلول qPCR (10 ملي مولار Tris-HCl pH 8.0 ، 0.05٪ Tween-20). ثم تم استخدام المحلول المخفف الذي تم الحصول عليه للكشف عن qPCR باستخدام QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix ونظام LightCycler480. لمجموعات التمهيدي لكل جين ، انظر الملف الإضافي 5: الجدول S4.

تجارب التسلسل المتسلسل وتحليل البيانات

تم تنفيذ Drop-seq كما ورد سابقًا [6] وبما يتماشى مع بروتوكول عبر الإنترنت (http://mccarrolllab.com/dropseq/) ، ولكن مع التعديلات التالية: كانت معدلات التدفق للزيت والمعلقات المائية 14000 ميكرولتر / ساعة و 4000 ميكرولتر / ساعة على التوالي. كان قطر القطرات 95-100 ميكرومتر. تم تصنيع أجهزة ميكروفلويديك بواسطة Fluidware Technologies (اليابان). كان عدد الدفعة من الخرزات المشفرة 051415 (ChemGenes). تم إجراء تحليل البيانات لـ Drop-seq كما هو موضح عبر الإنترنت (//mccarrolllab.com/dropseq/). كانت إصدارات البرامج وقواعد البيانات كالتالي: STAR: v2.5.1b Mouse genome، GRCm38 / mm10 Genome Annotation Annotation، gencode GRCm38.p4 vM9 and Drop-seq tools، v1.11.

يقوم Quartz-Seq2 بقراءة المحاذاة وإنشاء بيانات التعبير الرقمي

تم تصميم هيكل مكتبة التسلسل ومعالجة البيانات بناءً على تلك الخاصة بـ Drop-seq ([6] وعبر الإنترنت كما هو مشار إليه أعلاه). تم تحويل ملفات BCL التي تم إنشاؤها بواسطة Illumina NextSeq500 إلى ملفات fastq بواسطة bcl2fastq2 (v2.17.1.14) باستخدام الرموز الشريطية لمجمع فك تعدد الإرسال. تم ضبط المعلمة --mask-short-adaptor-reads على 20. إذا لزم الأمر ، تم اختزال عينات fastq بشكل عشوائي بواسطة برنامج seqtk (الإصدار sgdp). لقد قمنا بشكل أساسي بقص طول read2 إلى 62 نيوكليوتيد لـ Quartz-Seq2 باستخدام FASTX-Toolkit (الإصدار 0.0.14). تم تحويل ملفات Fastq لـ Read1 و Read2 إلى ملف bam بواسطة FastqToSam من أدوات Picard (الإصدار 1.134). تم إجراء استخراج الرموز الشريطية للخلايا و UMI (يُطلق عليه أيضًا الرمز الشريطي الجزيئي) وتصفية القراءات بجودة منخفضة للباركود باستخدام أدوات Drop-seq (الإصدار 1.11). تم إعادة تحويل ملفات bam الناتجة إلى ملفات fastq بواسطة SamToFastq من أدوات Picard ، وتم تعيينها إلى جينوم الماوس (GRCm38 / mm10) باستخدام STAR (الإصدار 2.5.1b). بعد فرز ملفات bam الناتجة باستخدام أدوات SortSam of Picard ، تم دمج bam غير المحاذاة و bam المحاذاة بواسطة MergeBamAlignment من أدوات Picard. بعد ذلك ، تم تعيين أسماء الجينات لكل سجل باستخدام أدوات TagReadWithGeneExon من Drop-seq وملف gtf (الإصدار gencode GRCm38.p4 vM9). لتصحيح أخطاء الباركود الخلوي مع الأخذ في الاعتبار مسافة التسلسل - ليفينشتاين ، تم استخدام برنامج Python المصمم خصيصًا (true_bacode.py) ، والذي مكّن من تصحيح ما يصل إلى خطأين نيوكليوتيدات في الاستبدال أو الإدراج أو الحذف. استخدم هذا البرنامج Python2 (الإصدار 2.7.11+) و PypeR (الإصدار 1.1.2) و R (الإصدار 3.2.3) والموصل الحيوي (الإصدار 3.2) وحزمة DNABarcodes (الإصدار 1.0.0). أخيرًا ، تم حساب UMI لكل جين لكل خلية باستخدام أدوات DigitalExpression of Drop-seq ، والتي ولّدت مصفوفة التعبير الرقمي. لإنشاء مصفوفة غير مفلترة من UMI ، تم استخدام برنامج Python المصمم خصيصًا والذي يقوم بحساب عدد القراءات لكل جين لكل خلية. لمقارنة الأداء الكمي بين Quartz-Seq2 والبيانات المبلغ عنها في الشكل 4 ، استخدمنا Ensembl75 كنسخة مرجعية. علاوة على ذلك ، قمنا بقص طول read2 إلى 45 نيوكليوتيد للمقارنة.

تقليل الأبعاد والتكتل وتحليل المصطلح

تمت إزالة الخلايا ذات التعداد الجيني المنخفض المكتشف لإجراء مزيد من التحليل (Quartz-Seq2 على خليط ES / PrE ، 4000 جين Quartz-Seq2 على SVF ، 500 جين). تم تطبيع الأعداد الإجمالية لكل خلية إلى 10000 أو متوسط ​​إجمالي عدد UMI للخلايا. تمت إضافة 1 تعدادات UMI إليها ثم تم تحويلها إلى لوغاريتم (لوغاريتم طبيعي) ، وبعد ذلك تم تحجيمها بحيث يكون لها متوسط ​​وتباين لكل جين من 0 و 1 ، على التوالي. بالنسبة لـ PCA ، تم استخدام تعداد UMI لجميع الجينات المكتشفة (لمزيج ES / PrE) أو الجينات ذات التعبير المتغير للغاية (لـ SVF). بالنسبة لـ t-SNE ، تم استخدام أعلى 10 إلى 40 مكونًا رئيسيًا من المصفوفات التي تنتجها PCA. للتجميع ، تم استخدام خوارزمية DBSCAN. كانت قيم المعلمة epsilon 0.69 لـ Quartz-Seq2 على خليط 4500 فأر ES / PrE ، و 5 لـ Quartz-Seq2 على خليط 384 فأر ES / PrE ، و 3 لـ Drop-seq على خليط 500 فأر ES / PrE ، و 2.2 لتحليل SVF. تم حساب مصطلحات علم الوجود الجيني المخصب بشكل كبير (GO) مع المكونات الرئيسية العليا باستخدام حزمة GO-PCA [45].

تحديد الجينات المعبر عنها تفاضليًا لكل مجموعة

تم تحديد جينات العلامة لكل مجموعة بناءً على نموذج خطي معمم. تم حساب الفرق في الانحراف بين نموذجين ، حيث تم التعبير عن الجين أو لم يتم التعبير عنه بشكل تفاضلي بين مجموعتين ، للجينات. لتصفية الضوضاء ، تمت إضافة العد الكاذب 1 إلى متوسط ​​التعبير الجيني في مجموعات وتم تحليل الجينات التي تغيرت أضعاف 2 أو أكثر بين مجموعتين فقط. ص تم حساب القيم على أنها 1 - دالة الكثافة التراكمية لمتغير عشوائي مستمر كاي تربيع للاختلاف في الانحراف. بعد التصحيحات للاختبارات المتعددة ، تم تحديد الجينات التي تحتوي على FDR أقل من 0.05 كجينات معبر عنها تفاضليًا للمجموعة. للمقارنة بين الجينات المعبر عنها تفاضليًا التي تم تحديدها بواسطة طرق scRNA-seq وتلك التي تم تحديدها بواسطة RNA-seq السائبة ، لم تتم إضافة هذا العدد الزائف.

تحديد الجينات المتغيرة في نفس نوع الخلية

لتحديد الجينات التي يتغير التعبير لها اعتمادًا على مرحلة دورة الخلية ، استخدمنا كثافة تلطيخ Hoechst 33342 المقاسة باستخدام فارز الخلية. أولاً ، تم تقسيم الخلايا إلى 40 دلوًا متساوي الحجم بناءً على درجة كثافة تلطيخ Hoechst 33342. بعد ذلك ، تم حساب السيرة الذاتية لمتوسط ​​عدد UMI لجين في كل سلة. بعد قياس z لهذا ، تم تحديد الجينات ذات درجات z العالية. لتحديد الجينات التي يتقلب تعبيرها بطريقة لا تتعلق بمرحلة دورة الخلية ، قمنا بحساب السيرة الذاتية لتعداد UMI للجين في كل خلية والسيرة الذاتية لمتوسط ​​عدد UMI للجين في كل سلة. بعد قياس z لهذه البيانات ، تم تحديد الجينات التي كان الفرق بين سيرة ذاتية متدرجة كبيرة على أنها "جينات متغيرة يكون التعبير عنها أقل ارتباطًا بمرحلة دورة الخلية".

تحليل الإثراء على مسار وشروط GO

تم حساب المسارات التي تم تخصيبها بشكل خاص للجينات المعبر عنها تفاضليًا باستخدام حزمة ReactomePA من R Bioconductor (الإصدار 1.14.4) [46] و Metascape (http://metascape.org/) [47]. كانت معلمة القطع للقيمة q 0.05. تم حساب المصطلحات التي تم إثرائها للجينات ذات التعبير المتغير للغاية باستخدام DAVID ، وقاعدة البيانات للتعليقات التوضيحية والتصور والاكتشاف المتكامل (الإصدار 6.8) [48 ، 49]. علم الوجود المستخدم في الحساب كان GOTERM_BP_FAT و GOTERM_MF_FAT و GOTERM_CC_FAT.تم تحديد المصطلحات مع FDR & lt 0.05 كمصطلحات غنية.

التحليل الكمي لجزيئات الحمض النووي الريبي الخارجية

لحساب كفاءة التقاط ERCC ، حددنا منحدر الانحدار بين جزيئات إدخال ERCC واكتشفنا تعداد UMI لكل ERCC. اختبرنا حساباتنا باستخدام مصفوفة التعبير الرقمي (GSM1599501) لطريقة تسلسل الخلية المفردة inDrop كعنصر تحكم ، وأكدنا أن كفاءة التقاط ERCC المحسوبة (7.2٪) تطابق تقريبًا كفاءة التقاط ERCC المبلغ عنها (7.1٪). لحساب عدد نسخ ERCC spike-in RNA عند احتمال الكشف بنسبة 50٪ ، طريقة Svensson et al. تم استخدامه [50]. لقد أكدنا أن نتائجنا المحسوبة وتلك الواردة في الورقة بواسطة Svensson et al. كانت متشابهة تقريبًا. لحساب كفاءة التقاط ERCC وعدد نسخ ERCC spike-in RNA عند احتمال اكتشاف 50 ٪ للبيانات السابقة ، استخدمنا تركيز ERCC spike-in RNA ، والذي أبلغ عنه المؤلفون الأصليون. للورقة التي كتبها Ziegenhain et al. [21] ، أكدنا التركيز عن طريق الاتصال الشخصي.

تحليل القوة القائم على المحاكاة

تم استخدام PowsimR لإجراء تحليل القوة [51]. تم تقدير معلمات التوزيع ذي الحدين السالب ، أي المتوسط ​​، والتشتت ، واحتمال التسرب ، من خلال تقدير الوظيفة بارام بالمعلمات التالية: سيجما = 1.96 ، والتوزيع = "NB" ، RNAseq = "خلية واحدة" ، والتطبيع = "سكران ". لمحاكاة التعبير التفاضلي بين مجموعتين باستخدام هذه المعلمات ، يتم تمثيل عدد الجينات بعدد الجينات المكتشفة (count & gt 0) في كل طريقة. أعدت الجينات المعبر عنها تفاضليًا عمليات محاكاة بعدد الجينات المكتشفة ، 23.6٪ من الجينات يتم التعبير عنها تفاضليًا ، عينة تغيير أضعاف السجل من توزيع جاما الضيق (الشكل 1.02 ، المعدل 0.78). تم اشتقاق هذه المعلمة من تقديرات المعلمات بناءً على بيانات RNA-seq المجمعة من خلايا الماوس ES و PE (ن = 3). تم استخدام الوظيفة simulateDE لتشغيل تحليل الطاقة باستخدام المعلمات التالية: DEmethod = MAST والتطبيع = scran. تم رسم نتائج محاكاة القدرة باستخدام R مع حزم ggplot2.


شاهد الفيديو: تركيب DNA الجزء الأول. البيولوجيا الجزيئية. الصف الثالث الثانوي 2020 (قد 2022).


تعليقات:

  1. Baladi

    أعتقد أنك ترتكب خطأ. دعونا نناقش هذا. أرسل لي بريدًا إلكترونيًا إلى PM ، سنتحدث.

  2. Cass

    موضوع مفيد جدا

  3. Jerrad

    انت لست على حق. يمكنني إثبات ذلك. اكتب لي في رئيس الوزراء ، سوف نتحدث.

  4. Drake

    أهنئ ، هذه الفكرة الجيدة إلى حد ما ضرورية فقط بالمناسبة

  5. Disida

    يا لها من عبارة ... فكرة رائعة ورائعة

  6. Zioniah

    مثيرة للاهتمام حقا. أود شيء آخر عن نفس الشيء.



اكتب رسالة