معلومة

لماذا ينحرف محتوى gc عن 50٪ في بدائيات النوى

لماذا ينحرف محتوى gc عن 50٪ في بدائيات النوى


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد قرأت بعض المقالات ولكن لا يمكنني معرفة السبب الرئيسي لانحراف محتوى gc في بدائيات النوى. يمكنني فهم ذلك في حقيقيات النوى ، لأن الجينوم لا يتكون عشوائيًا ، مثل صناديق TATA وجزيرة CpG ، لأنها مهمة للعمل في إنتاج البروتينات.

ومع ذلك ، يوجد في بدائيات النوى مثل هذا التنوع ، تتراوح نسبة GC من 20٪ إلى 70٪. في معظم الأحيان تعتمد درجة الحرارة المرتفعة على البيئة ، تحتاج درجة الحرارة المرتفعة إلى جينوم مستقر (= محتوى عالٍ من gc).

قرأت أيضًا الإجابة على هذا السؤال: كيف يتطور محتوى GC؟ ومع ذلك ، لا يزال الأمر غير واضح بالنسبة لي. آمل أن يتمكن أحدهم من شرح الانحراف أكثر قليلاً.

سؤال

بدائيات النوى لها انجراف AT ، ولكن ما هي الآلية التي تجعل بعض هذه البكتيريا تزيد من نسبة GC الخاصة بها بدلاً من خفضها.


أتساءل عما إذا كان هذا مجرد نوع من الانجراف العاطل. لا أعرف شيئًا عن البكتيريا ، لكنني أعتقد أن مثال بعض الفيروسات البشرية قد يكون مفيدًا. يحتوي فيروس الهربس البسيط 1 البشري (الذي يسبب تقرحات البرد) على نسبة عالية جدًا من GC ، في حين أن فيروس الحماق النطاقي البشري المرتبط ارتباطًا وثيقًا (من حيث الذخيرة الجينية والتنظيم) (يسبب القوباء المنطقية) لديه تحيز تجاه AT. تعتمد هذه الفيروسات الآن بشكل كامل على الآلية الانتقالية للخلية المضيفة ، والتي ستكون متشابهة (على سبيل المثال توزيع أنواع الحمض النووي الريبي) في الخلايا التي يصيبها هذان الفيروسان (مثل درجة الحرارة والقوة الأيونية وما إلى ذلك) (تقوم الفيروسات بترميز إنزيمات تكرار الحمض النووي الخاصة بها ولكن ليست أنظمة النسخ أو الترجمة.)

لذلك إذا كان هناك سبب وظيفي للاختلافات في فيروسات الهربس ألفا ، فمن الصعب تمييزها ، وقد يفترض المرء أن الوضع في البكتيريا قد يكون مشابهًا.

من الواضح أنه يجب أن تكون هناك آليات للتشديد في تحيز GC بمجرد إنشائها. يتصور المرء أنه يمكن أن تكون هناك ميزة انتقائية في التكرار أو النسخ أو الترجمة ، لكن التفسيرات الجزيئية لا تقفز إلى الذهن (على الأقل ليس لي).


سؤال مهم. أعتقد أن تنوع محتوى GC البكتيري يتلخص في مزيج من التحيزات الطفرية ، مثل استخدام الأشكال الإسوية للجينات المختلفة للبوليميراز والتكرار / الإصلاح ، والضغوط البيئية ، مثل درجة الحرارة والملوحة ، التي وضعت ضغوط اختيار مختلفة على الميكروبات المختلفة.

كنت أقرأ الأوراق المرتبطة للحصول على معلومات أكثر تفصيلاً ، ولكن على الأقل بضربات عريضة ، أعتقد أن الآليتين المذكورتين أعلاه تمثلان معظم التباين الملحوظ.

ملحوظة: هذا ليس مجال تخصصي الرئيسي ، لذا قد تحصل على إجابة أكثر تفصيلاً إذا كان اختصاصي الأحياء الدقيقة يزن. :-)


لماذا ينحرف محتوى gc عن 50٪ في بدائيات النوى - علم الأحياء

قدم تسلسل الجينوم الكامل (WGS) لآلاف الجينومات الميكروبية نظرة ثاقبة للآليات التطورية في عالم الميكروبات. بينما يتوفر عدد أقل بكثير من جينومات حقيقيات النوى للتحليلات ، فإن العدد يتزايد بسرعة. تلخص هذه المراجعة المصغرة الديناميكيات التطورية على نطاق واسع للتكوين الأساسي في مجالات الحياة المختلفة من منظور بدائيات النوى. تمت مناقشة الآليات التطورية الشائعة والمختلفة التي تؤثر على تكوين القاعدة الجينومية في حقيقيات النوى وبدائيات النوى. تشير الاستنتاجات من البيانات المتاحة حاليًا إلى أنه على الرغم من وجود أوجه تشابه ، فهناك أيضًا اختلافات لافتة للنظر في كيفية تطور تكوين القاعدة الجينومية داخل بدائيات النوى وحقيقيات النوى. على سبيل المثال ، يبدو أن إعادة التركيب المتماثل يزيد محتوى GC محليًا في حقيقيات النوى بسبب عملية غير انتقائية تسمى التحويل الجيني المتحيز لـ GC (gBGC). من ناحية أخرى ، بالنسبة إلى بدائيات النوى ، يبدو أن زيادة محتوى GC الجيني مدفوعة بالبيئة والاختيار. وجدنا أن الظواهر المماثلة التي لوحظت لبعض الكائنات الحية في كل مجال قد تكون ناجمة عن آليات مختلفة تمامًا: بينما يبدو أن معدلات gBGC وإعادة التركيب تفسر الارتباط السلبي بين GC3 (محتوى GC على أساس نيوكليوتيدات الكودون الثالث) وحجم الجينوم في بعض حقيقيات النوى يعتبر امتصاص تسلسل الحمض النووي الغني بـ AT هو السبب الرئيسي لوجود ارتباط سلبي مماثل لوحظ في بدائيات النوى. نقدم المزيد من الأمثلة التي تشير إلى أن التركيب الأساسي في بدائيات النوى وحقيقيات النوى قد تطور في ظل قيود مختلفة للغاية.


لماذا ينحرف محتوى gc عن 50٪ في بدائيات النوى - علم الأحياء

بدائيات النوى مقابل حقيقيات النوى

  • بدائيات النوى: تفتقر إلى نواة وعضيات مرتبطة بالغشاء (وحيدة الخلية ، تشمل البكتيريا)
  • حقيقيات النوى: تحتوي على نواة وعضيات مرتبطة بالغشاء (نباتات ، حيوانات ، فطريات ، & # 133)
  1. تسمح المقصورات الداخلية المقيدة بالغشاء بالحفاظ على مجموعة متنوعة من البيئات الكيميائية داخل كل خلية
  2. تعيش معظم حقيقيات النوى ككائنات متعددة الخلايا مع كل نوع خلية له نمط مميز من التعبير الجيني على الرغم من أن كل خلية داخل الكائن الحي لها نفس مجموعة التعليمات الجينية
  3. القليل من القيود فيما يتعلق بحجم الجينومات حقيقية النواة ، لذلك فهي تعرض كمية هائلة من "الحمض النووي غير المرغوب فيه"

الربط: تزيل معالجة mRNA الإنترونات ، وتؤدي إلى لصق exons معًا

عادةً ، تبدأ الإنترونات في الحمض النووي بـ GT وتنتهي بـ AG ("قاعدة GT-AG")

يتم فحص حوالي 6 نيوكليوتيدات إضافية عند طرفي 5 'و 3' من الإنترونات.

يمكن أن يختلف التمحيص اعتمادًا على نوع الخلية ، على سبيل المثال ، نوع الأنسجة

التضفير في الجين البيضوي: الإنترونات الموصولة بالحروف ، الإكسونات بالأرقام.

مثال التضفير البديل: التعبير الجيني الخاص بالأنسجة عن التروبوميوسين

هيكل الجينات حقيقية النواة

  • وجود الإنترونات ليس كبيرًا من الناحية الإحصائية لإطارات القراءة المفتوحة
  • محفزات حقيقيات النوى أكثر انتشارًا وتقع بعيدًا عن كودون بدء الجين

أحد أكبر الأسئلة المفتوحة في المعلوماتية الحيوية لعدة عقود.

اعتمدت أفضل الأساليب على الشبكة العصبية وتقنيات البرمجة الديناميكية (Grail EXP ، GenScan ، إلخ.)

حاليًا ، أقل من 50٪ تنبؤ صحيح.

وضع آليات لتنظيم بدء النسخ.

كل جين حقيقي النواة له محفزه الخاص (على عكس الأوبراونات في بدائيات النوى).

تستخدم جميع الكائنات حقيقية النواة 3 أنواع مختلفة من بوليميريز RNA المصنوع من 8 إلى 12 بروتينًا على الأقل.

يتعرف كل بوليميريز RNA على مجموعة مختلفة من المحفزات ، ويستخدم كل منها لنسخ أنواع مختلفة من الجينات.

بوليميراز الحمض النووي الريبي موقع المروج المروج تعقيد الجينات المنسوخة
بوليميريز الحمض النووي الريبي أنا -45 إلى +20 بسيط RNAs الريبوسوم
بوليميريز الحمض النووي الريبي II بعيد المنبع إلى -25 معقد جدا جينات ترميز البروتين
بوليميراز الحمض النووي الريبي الثالث +50 إلى +100 بسيط الحمض الريبي النووي النقال ، رنا صغيرة أخرى

يصنع RNA Polymerase I و III جزيئات RNA التي يجب أن تكون عند مستويات ثابتة إلى حد ما في جميع الخلايا حقيقية النواة في جميع الأوقات.

يتعرف RNA polymerase II على مجموعة متنوعة من سلاسل المحفز التي تلعب دورًا في التمييز بين الجينات التي يجب ولا ينبغي التعبير عنها في أي وقت في أي نوع معين من الخلايا.

تحتوي محفزات RNA polymerase II على مجموعة من المتواليات تسمى المروج الأساسي حيث يتم تجميع معقد البدء ويبدأ النسخ.

تتضمن أيضًا محفزات معظم الجينات المنسوخة لـ RNA polymerase II العديد من عناصر المروج المنبع الإضافية. من المقدر أن هناك حاجة إلى خمسة عناصر معزز في المنبع على الأقل لتحديد تشفير البروتين بشكل فريد والتأكد من التعبير عنه بطريقة مناسبة.

لا يرتبط RNA polymerase II مباشرة بمحفزات التسلسل القاعدية ، ولكن عوامل النسخ القاعدية بما في ذلك بروتين ربط TATA (TBP) وما لا يقل عن 12 عاملًا مرتبطًا بـ TBP (TAFs) ترتبط بتسلسل النيوكليوتيدات للمروج بترتيب معين ثم تسهيل ربط الوحدة التحفيزية لبوليميراز الحمض النووي الريبي II. (الشكل 6.5)

  • في -25 إلى موقع بدء النسخ (+1)
  • 5'-TATAWAW-3 '، حيث W هو A أو T موجود بتردد متساوٍ
  • 5'-YYCARR-3 '، حيث Y تمثل C أو T ، و R هي G أو A
  • غالبًا ما يكون +1 نيوكليوتيد هو A شديد الحفظ ، ولكن يمكن استخدام النيوكليوتيدات الأخرى باستمرار لبعض الجينات

من المعروف وجود اختلافات طفيفة في عوامل النسخ القاعدية بين أنواع الخلايا المختلفة ومن المرجح أن تتعرف على تسلسلات مختلفة قليلاً كمحفزات. تلعب هذه الاختلافات دورًا مهمًا في التعبير الخاص بالنسيج لبعض الجينات.

مواقع ربط البروتين التنظيمية

في بدائيات النوى ، تمتلك بوليمرات الحمض النووي الريبي تقاربًا كبيرًا للمحفزات ، ويتم التركيز على التنظيم السلبي بواسطة البروتينات التي تمنع التعبير الجيني من الحدوث في أوقات غير مناسبة.

يختلف بدء النسخ في حقيقيات النوى اختلافًا جوهريًا لأن بوليميراز RNA II و III لا يتجمعان حول المروجين بكفاءة عالية ، ومعدل النسخ الأساسي منخفض جدًا بغض النظر عن مدى مطابقة المروج لتسلسلات الإجماع.

  • التكوينية - تروج للعديد من الجينات المختلفة ولا يبدو أنها تستجيب للإشارات الخارجية
  • تنظيمية - تروج لعدد محدود من الجينات وتستجيب للإشارات الخارجية
  • يتعرف عامل النسخ CAAT على تسلسل الإجماع 5'-GCCAATCT-3 '("مربع CAAT") الموجود عند حوالي -80 في معظم الجينات حقيقية النواة
  • تعمل المعززات الأخرى (وكواتم الصوت) على نطاق أوسع من موقع بدء النسخ (عادةً -500 إلى +500) وتعمل بشكل جيد في أي اتجاه ، على سبيل المثال ، يتعرف Sp1 على تسلسل الإجماع 5'-GGGCGG-3 '

يمكن ربط المعززات وكواتم الصوت عبر 10-20 كيلو قاعدة (آلاف الأزواج الأساسية) من الحمض النووي في أعلى المنبع. يمكن حتى أن تكون بعض الإشارات في اتجاه مجرى الجين المشفر ، أو حتى موجودة داخل الإنترونات! كيف يمكن أن يكون لعوامل النسخ البعيدة أي تأثير؟

عوامل نسخ المحسنات لها تأثيرها من خلال التسبب في حلقات طويلة من الحمض النووي لتمكين الاتصالات التنظيمية الأخرى.

  • تستجيب للمحفزات ، مثل التعرض للحرارة أو عوامل النمو
  • معبرا عنها فقط في أنسجة معينة
  • أعرب فقط في أوقات معينة أثناء التطوير

استنادًا إلى Robert Tjian، & quotMolecular Machines التي تتحكم في الجينات & quot؛ Scientific American.

  • ترتبط المنشطات بمواقع المحسنات التي تتحكم فيها الهرمونات أو الإشارات الأخرى. أنها تزيد من نسخ الجين المنظم.
  • ترتبط أجهزة الكابعات بمواقع كاتم الصوت ، التي تتحكم فيها الهرمونات أو الإشارات الأخرى. إنها تقلل من نسخ الجين المنظم ، ربما عن طريق التدخل في المنشطات.
  • ترتبط المُنشّطات بالمنشّطات و / أو المُثبِّطات (في أحد طرفيها) والعوامل القاعدية (في الطرف الآخر). تقوم المُنشطات بطريقة ما بتوصيل الإشارة من المنشطات و / أو المكثفات إلى بوليميراز الحمض النووي الريبي.
  • تعمل العوامل القاعدية بشكل مشابه لعوامل سيجما البكتيرية. أنها تمكن RNA polymerase لبدء النسخ. ومع ذلك ، فإنها تتطلب التفاعل مع المنشطات.

في بدائيات النوى ، تبدأ الريبوسومات عادةً في الترجمة بمجرد أن يبدأ بوليميريز الحمض النووي الريبي في صنع نسخة من الحمض النووي الريبي من منطقة الترميز.

  • السد - التعديلات الكيميائية (بما في ذلك المثيلة) في نهاية 5 'لجميع hnRNAs
  • الربط - الإزالة الدقيقة للإنترونات من داخل hnRNAs
  • تعدد الأدينيل - عملية استبدال 3 'نهاية hnRNA بامتداد حوالي 250 ألف (the & quotpoly-A tail & quot)

يمكن أن يحدث كل نوع من أنواع التعديلات الثلاثة بشكل مختلف في أنواع الخلايا المختلفة (على سبيل المثال ، الربط البديل)

(جانباً: الفيروسات القهقرية مثل فيروس نقص المناعة البشرية التي تستخدم جينوم الحمض النووي الريبي لديها & quotcap & quot و & quottail & quot ، وتمكينها من محاكاة RNA الرسول غير المؤذي.)

الملخص: لا يحتوي تسلسل الحمض النووي للجينات حقيقية الكبرياء على إطار ORF طويل إحصائيًا للقراءة المفتوحة.

  • أول نيوكليوتيدات في 5 'نهاية intron هما 5'-GU-3' ، و
  • النوكليوتيدات الأخيرتان في 3 'نهاية إنترون هما 5'-AG-3'
  • عادة ما ترتبط النيوكليوتيدات الإضافية بهذه الوصلات المنقسمة 5 'و 3'

(انظر الشكل 6.6 حول إنترونات الخميرة)

  • يتم أيضًا فحص موقع فرع داخلي يقع من 18 إلى 40 نقطة أساس قبل التقاطع 3 'بواسطة آلية الربط
  • يتم فحص التسلسلات التي يتم فحصها بواسطة آلية الربط داخل intron ولا تقيد بشكل وظيفي تسلسلات exon
  • يبلغ الحد الأدنى لطول الإنترونات حوالي 60 نقطة أساس لاستيعاب إشارات الربط
  • لا يوجد قيد على الطول العلوي للإنترونات ، يبلغ متوسط ​​إنترون الفقاريات حوالي 450 نقطة أساس ، ولكنه يتراوح من & لتر 100 نقطة أساس إلى 2000 نقطة أساس
  • تميل حقيقيات النوى الأبسط إلى امتلاك عدد أقل من الإنترونات ، على سبيل المثال ، تحتوي الخميرة التي تحتوي على 6000 جين فقط على 239 إنترون ، بينما تحتوي جينات معظم الفقاريات على إنترون (95٪ من جميع الجينات البشرية لها إنترون واحد على الأقل مع بعض الجينات التي تحتوي على أكثر من 100 إنترون - انظر الجدول 6.6)

يعد التباين في التضفير ميزة كبيرة في مساعدة الكائنات حقيقية النواة على تلبية متطلبات التعبير الجيني الخاص بالأنسجة دون دفع تكلفة باهظة في تعقيد الجينوم.

مثال التضفير البديل: التعبير الجيني الخاص بالأنسجة عن التروبوميوسين

الأساس الجزيئي للربط البديل هو سؤال مفتوح مهم في علم الأحياء الجزيئي.

يتكون جهاز الربط من مجموعة متنوعة من الحمض النووي الريبي الصغير (snRNAs) بالإضافة إلى العديد من البروتينات. قد يختلف كل منها من نوع خلية إلى آخر.

قد يعكس التباين في تسلسل الإجماع لتقاطعات الوصلات والمواقع الفرعية في الواقع التعرف المحدد على إشارات الربط المختلفة في الأنسجة حقيقية النواة المختلفة.

محتوى GC في جينومات حقيقية النواة

  • يعد قياس محتوى GC مفيدًا لتحديد الأنواع البكتيرية نظرًا لأن محتوى GC يختلف من 25٪ إلى 75٪ عبر الأنواع بدائية النواة.
  • يبدو أن محتوى كل نوع بكتيري GC يتشكل بشكل مستقل عن طريق التحيزات الطفرية لبوليميرات الحمض النووي وآليات إصلاح الحمض النووي التي تعمل على مدى فترات طويلة من الزمن.
  • مما يؤدي إلى أن تكون النسب النسبية لأزواج قاعدة G / C إلى A / T موحدة بشكل عام في جميع أنحاء جينوم أي بكتيريا.
  • لا يُظهر محتوى GC الكلي تباينًا كبيرًا عبر الأنواع حقيقية النواة
  • يكمن التباين الواسع النطاق لمحتوى GC داخل جينوم حقيقيات النوى في وجود ارتباطات مفيدة بين الجينات وتسلسلات محفز المنبع ، وخيارات الكودون ، وطول الجين ، وكثافة الجينات.

كان أحد التحليلات الأولى للمعلوماتية الحيوية التي أجريت على بيانات تسلسل الحمض النووي على الإطلاق هو التقييم الإحصائي للتردد الذي لوحظت فيه جميع أزواج النيوكليوتيدات في التسلسلات العامة من الجينوم البشري.

تم العثور على ثنائي النوكليوتيدات CG فقط (تسمى CpGs حيث تمثل 'p' رابطة الفوسفوديستر التي تربط بين النيوكليوتيدات) ممثلة تمثيلا ناقصا بنسبة 20 ٪ من التردد الذي يجب أن يحدث بالصدفة (الشكل 6.8).

ومع ذلك ، فإن جزر CpG التي تحتوي على CpG بالكثافة المتوقعة بالصدفة تحدث في نهاية 5 'للعديد من الجينات البشرية.

  • تمتد عادةً من 1500 إلى 500+
  • يبدو أنه متورط في مواقع الربط لمحسنات النسخ المعروفة مثل Sp1
  • حوالي 45000 جزيرة CpG في الجينوم البشري
  • يرتبط حوالي نصف جزر CpG بكل جين معروف للتدبير المنزلي (الجين المعبر عنه بمستويات عالية في جميع الأنسجة في جميع الأوقات أثناء التطور)
  • ترتبط العديد من جزر CpG المتبقية بمحفزات الجينات الخاصة بالأنسجة (انظر الشكل 6.8 أ الذي يُظهر a -globin البشري)
  • أقل من 40٪ من الجينات المعروفة الخاصة بالأنسجة لها جزر CpG
  • نادرًا ما توجد جزر CpG في المناطق الخالية من الجينات أو داخل الجينات التي تراكمت لديها طفرات معطلة

السيتوزينات الميثيلية معرضة بشكل خاص للطفرة (خاصة لـ TpGs و CpAs) والتي يبدو أنها تسبب ندرة CpGs في الجينوم بشكل عام.

ترتبط المستويات العالية من مثيلة الحمض النووي في منطقة ما بمستويات منخفضة من أستلة الهستونات (بروتينات تغليف الحمض النووي المهمة في حقيقيات النوى) والعكس صحيح.

ترتبط المستويات المنخفضة من مثيلة الحمض النووي والمستويات العالية من أسيتيل هيستون ارتباطًا وثيقًا بمستويات عالية من التعبير الجيني.

  • وجود مجموعات الميثيل في المنطقة -200 و +90 يمنع النسخ بشكل فعال
  • إزالة مجموعات الميثيل الثلاث الموجودة في الجزء العلوي من موقع بدء النسخ أو إزالة مجموعات الميثيل الثلاث الموجودة أسفل موقع بدء النسخ لا تسمح ببدء النسخ
  • إزالة جميع مجموعات الميثيل الست جميع المروج للعمل

يتطلب النسخ عادةً منطقة مروج خالية من الميثيل ، ولكن هناك استثناءات.

عادة ما تكون الهستونات عبارة عن بروتينات موجبة الشحنة ومحفوظة جيدًا توجد داخل حقيقيات النوى. لديهم انجذاب كبير لجزيئات الحمض النووي سالبة الشحنة

يُطلق على خليط متساوٍ تقريبًا (بالكتلة) من الحمض النووي والهستونات المرتبطة ارتباطًا وثيقًا داخل نوى حقيقية النواة بالكروماتين.

يؤدي التفاف الحمض النووي حول الهيستونات والتنظيم الإضافي للهيستونات إلى نسبة تغليف نهائية تقارب 1: 10000 للحمض النووي الجيني حقيقيات النواة.

المناطق النشطة نسبيًا هي بشكل عام مناطق يتم فيها تقليل الشحنة الإيجابية للهيستونات عن طريق إضافة مجموعات الأسيتيل والميثيل. يتسبب التقارب المنخفض الناتج لهذه الهستونات في الحمض النووي سالب الشحنة في جعل الكروماتين أقل حزمًا وأكثر سهولة في الوصول إلى بوليميراز الحمض النووي الريبي.

كروماتين حقيقي هو منطقة الكروماتين المفتوح

الهيتروكروماتين هو منطقة كروماتين الحزم غير النشطة نسبيًا

Isochores هو مستوى متوسط ​​من التنظيم داخل الفقاريات والنباتات (جميع حقيقيات النوى؟) بين الجينات والكروموسومات.

  • يزيد طول التتابعات الجينومية للأزواج المتساوية عن مليون زوج قاعدي
  • يكون محتوى GC في isochore منتظمًا نسبيًا طوال الوقت (أي أن النافذة المنزلقة البالغة 1000 نقطة أساس والتي تتحرك عبر طول isochore بالكامل سيكون لها محتوى GC الذي نادرًا ما يختلف عن محتوى GC الإجمالي لـ isochore بأكثر من 1 ٪)
  • يختلف محتوى GC بين متساوي الزوايا المختلفة داخل نفس النوع بشكل كبير

الجينوم البشري عبارة عن فسيفساء من 5 فئات مختلفة من متساويات القشرة. الكروموسومات البشرية هي في الأساس مجموعات عشوائية من شظايا طويلة من متماثلات مختلفة

ايسوكوريس متوسط ​​محتوى GC ٪ من الجينوم ملحوظات
L1 39% 66% 85٪ من الجينات المحددة للأنسجة
L2 42%
H1 46% ونبسب ونبسب
H2 49% ونبسب ونبسب
H3 54% 3٪ إلى 5٪ 80٪ من جميع جينات التدبير المنزلي لدينا

يعني تحيز استخدام الكودون أن الأنواع تفضل استخدام كودون محدد للحمض الأميني على الكودونات المكافئة.

على سبيل المثال ، في جينومات الخميرة ، يتم استخدام AGA بنسبة 48٪ من الوقت لترميز الأرجينين باستخدام الكودونات الخمسة المكافئة المتبقية (CGT ، CGC ، CGA ، CGG ، AGG) التي تستخدم حوالي 10٪ لكل منها.

تعكس exons الحقيقية عمومًا تحيز الكودون "في حين أن السلاسل المختارة عشوائيًا من ثلاثة توائم لا تفعل ذلك." (مناطق غير مشفرة؟)

  • تعرف على عناصر المروج ، أي مربعات TATA و CAAT
  • جزر سي بي جي
  • إشارات الربط المرتبطة بالإنترونات ، أي قاعدة GU-AG
  • تحيز استخدام الكودون في إطارات القراءة المفتوحة
  • التشابه مع تسلسل ESTs أو الجينات من الكائنات الحية الأخرى

لا يزال الاختبار الحقيقي لأي جهد للتنبؤ بالجينات إثباتًا معمليًا على أن الخلية الحية تقوم بالفعل بنسخ المنطقة إلى جزيء RNA.

النسخ هي مجموعة كاملة من تسلسل الحمض النووي الريبي للكائن الحي.يعد الحصول على بعض نسخ RNA للكائن الحي مفيدًا في التعرف على الجينات حيث يمكن مواءمتها مع المعلومات الجينية للأنواع الأخرى.

(كدنا) - يتكون الحمض النووي التكميلي من الرنا المرسال ويستخدم لعزل الجينوم حقيقيات النواة ومعالجته.

يوضح الشكل 6.11 عملية الاستنساخ.

المصفوفات الدقيقة المستخدمة لتوفير معلومات مفصلة حول أنماط التعبير الجيني.

يتم لصق متواليات النوكليوتيدات من 1000 إلى 10000 ثانية على مواضع فردية على سطح شريحة زجاجية صغيرة (تسمى مجموعة قليلة النوكليوتيد عالية الكثافة ، HDAs).

  • يتم غسل النسخ ذات العلامات الفلورية من نصوص الحمض النووي الريبي (cDNA) من كائن حي فوق الرقاقة مما يسمح لها بالتهجين إلى نيوكليوتيدات تكميلية على الرقاقة.
  • إن الحمض النووي الريبي غير المنضم يغسل.
  • يتم استخدام الليزر لإثارة علامات الفلورسنت وتحدد أجهزة الكشف الضوئي كمية الإشارة المرتبطة بكل بقعة من تسلسل معروف.

التحويل والعناصر المتكررة

تسمى هذه الأجزاء المتحركة من الحمض النووي أحيانًا & quoting الجينات & quot.

هناك ثلاثة أنواع متميزة:

  • تتكون الينقولات من الدرجة الثانية فقط من الحمض النووي الذي ينتقل مباشرة من مكان إلى آخر.
  • من الصنف الثالث الينقولات المعروفة أيضًا باسم Miniature Inverted-Replicable Elements أو MITEs.
  • Retrotransposons (الفئة الأولى) أن

o قم أولاً بنسخ الحمض النووي إلى RNA ثم

تتحرك العديد من الينقولات بواسطة عملية & quotcut & لصق & quot: يتم قطع الينقولة من موقعها (مثل command / control-X على جهاز الكمبيوتر الخاص بك) ويتم إدخالها في موقع جديد (الأمر / control-V).

تتطلب هذه العملية إنزيم & # 151 a transposase & # 151 المشفر داخل بعض هذه الينقولات.

  • كلا طرفي الترانسبوزون ، اللذان يتألفان من تكرارات مقلوبة أي متواليات متطابقة تقرأ في اتجاهين متعاكسين.
  • سلسلة من الحمض النووي التي تشكل الموقع المستهدف. تتطلب بعض الترانسبوزسات تسلسلًا محددًا حيث أن موقعها المستهدف يمكن للآخرين إدخال الينقولات في أي مكان في الجينوم.

يتم قطع الحمض النووي في الموقع المستهدف بطريقة الإزاحة (مثل & quotsticky end & quot التي تنتجها بعض إنزيمات التقييد).

بعد ربط الينقولات بالحمض النووي المضيف ، يتم ملء الفجوات عن طريق الاقتران بقاعدة Watson-Crick. هذا يخلق تكرارات مباشرة متطابقة في كل نهاية من الينقولات.

غالبًا ما تفقد الينقولات جيناتها من أجل الترانسبوزيز ، ولكن طالما يوجد في مكان ما في الخلية ينقّل يمكنه تصنيع الإنزيم ، يتم التعرف على تكراراتها المقلوبة ويمكن أيضًا نقلها إلى مكان جديد.

عناصر مصغرة مقلوبة قابلة للتبديل (MITEs)

كشف الانتهاء من تسلسل الجينوم للأرز و C. elegans أن جينوماتهم تحتوي على آلاف النسخ من فكرة متكررة تتكون من

  • متواليات متطابقة تقريبًا من حوالي 400 زوج أساسي تحيط بها
  • التكرارات المعكوسة المميزة لحوالي 15 زوجًا أساسيًا مثل

MITEs صغيرة جدًا لتشفير أي بروتين. كيف يتم نسخها ونقلها إلى مواقع جديدة لا يزال غير مؤكد. ربما أكبر ذلك الينقولات

* هل ترميز الإنزيم الضروري و

* التعرف على نفس التكرارات المقلوبة

يوجد أكثر من 100،000 MITEs في جينوم الأرز (تمثل حوالي 6٪ من إجمالي الجينوم). بعض الطفرات الموجودة في سلالات معينة من الأرز ناتجة عن إدخال MITE في الجين.

تم العثور على MITEs أيضًا في جينوم البشر ، Xenopus ، والتفاح.

تم اكتشاف أول الينقولات في الأربعينيات من قبل باربرا مكلينتوك التي عملت مع الذرة (Zea mays ، تسمى & quotcorn & quot في الولايات المتحدة). وجدت أنهم مسؤولون عن أنواع مختلفة من الطفرات الجينية ، عادة

بعض الطفرات (c ، bz) المستخدمة كأمثلة على كيفية تعيين مواقع الجينات على الكروموسوم كانت ناجمة عن الينقولات.

في تطوير الأنسجة الجسدية مثل حبات الذرة ، سوف تنتقل طفرة (على سبيل المثال ، ج) تغير اللون إلى جميع الخلايا السليفة. ينتج عن هذا النمط المتنوع الذي يحظى بتقدير كبير في & quot للذرة الهندية & quot.

تتحرك الينقولات العكسية بواسطة آلية & quotcopy & لصق & quot ولكن على عكس الينقولات الموصوفة أعلاه ، فإن النسخة مصنوعة من RNA وليس DNA.

  1. يتم نسخ نسخة RNA من الينقولات بواسطة RNA polymerase تمامًا مثل الجين العادي
  2. يتم نسخ نسخة الحمض النووي الريبي مرة أخرى إلى الحمض النووي بواسطة emzyme خاص يسمى النسخ العكسي ، و
  3. يقوم النسخ العكسي بإدراج نسخة الحمض النووي من الينقولات في مواقع جديدة في الجينوم.

(ملاحظة: لا يبدو أن النسخة العكسية المطلوبة لهذه العملية جزء من التكملة الطبيعية للجينات في جينوم حقيقيات النوى ، ولكنها تُكتسب من إصابة الفيروسات القهقرية.)

العديد من الينقولات العكسية لها تكرارات طرفية طويلة (LTRs) في نهاياتها والتي قد تحتوي على أكثر من 1000 زوج أساسي في كل منها.

مثل ترانسبوزونات الحمض النووي ، تولد الينقولات العكسية تكرارات مباشرة في مواقع إدخالها الجديدة. في الواقع ، إن وجود هذه التكرارات المباشرة غالبًا ما يكون دليلاً على أن الامتداد المتداخل للحمض النووي وصل إلى هناك عن طريق التحويل الرجعي.

يتكون حوالي 40٪ من الجينوم البشري بأكمله من الينقولات العكسية.

الأنواع الشائعة من الينقولات العكسية في الثدييات هي LINEs (العناصر النووية الطويلة المتناثرة) و SINES (العناصر النووية القصيرة المختلطة)

LINEs (العناصر النووية الطويلة المتناثرة)

يحتوي الجينوم البشري على حوالي 850 ألف خط (تمثل حوالي 21٪ من الجينوم).

ينتمي معظم هؤلاء إلى عائلة تسمى LINE-1 (L1).

عناصر L1 هذه هي تسلسلات DNA التي يتراوح طولها من بضع مئات إلى ما يصل إلى 9000 زوج قاعدي.

فقط حوالي 50 عنصر L1 وظيفية & quot ؛ أي يمكن نسخها وترجمتها.

  • نوكلياز داخلي يقطع الحمض النووي و a
  • إنزيم النسخ العكسي الذي يصنع نسخة DNA من نسخة RNA.
  • RNA polymerase II ينسخ L1 DNA إلى RNA.
  • يتم ترجمة الحمض النووي الريبي بواسطة الريبوسومات الموجودة في السيتوبلازم إلى البروتينات.
  • تتحد البروتينات والحمض النووي الريبي معًا وتدخل إلى النواة.
  • يقطع نوكلياز خيطًا من الحمض النووي & quottarget & quot ، غالبًا في إنترون الجين.
  • تنسخ النسخة العكسية الحمض النووي الريبي L1 إلى الحمض النووي L1 الذي يتم إدخاله في الحمض النووي المستهدف مكونًا عنصر L1 جديد هناك.

من خلال آلية النسخ واللصق هذه ، يمكن أن يزيد عدد LINEs في الجينوم.

إن تنوع الخطوط بين الجينوم البشري الفردي يجعلها علامات مفيدة للحمض النووي وبصمات الأصابع ومثل.

التباين في طول عناصر L1:

  • يستمر نسخ عنصر L1 النشط أحيانًا في اتجاه مجرى الدم إلى DNA إضافي ينتج عنه عنصر منقول أطول.
  • غالبًا ما ينتهي النسخ العكسي لـ L1 RNA قبل الأوان وينتج عنصرًا منقولا مختصرا.

SINEs (عناصر نووية قصيرة تتخللها)

SINEs عبارة عن تسلسلات قصيرة من الحمض النووي (100 & # 150400 زوج أساسي) تمثل جزيئات الحمض النووي الريبي المنسوخة عكسيًا والتي تم نسخها في الأصل بواسطة RNA polymerase III أي جزيئات الحمض النووي الريبي (tRNA) و 5S rRNA وبعض أنواع الحمض النووي الريبي الصغيرة الأخرى.

أكثر النظم الجيبية وفرة هي عناصر Alu. يوجد أكثر من مليون نسخة في الجينوم البشري (تمثل حوالي 11٪ من إجمالي الحمض النووي).

تتكون عناصر Alu من سلسلة من 300 زوج قاعدي تحتوي على موقع يتم التعرف عليه بواسطة إنزيم التقييد AluI. يبدو أنها نسخ عكسية لـ 7S RNA ، وهو جزء من جسيم التعرف على الإشارة.

لا تقوم معظم SINEs بتشفير أي جزيئات وظيفية وتعتمد على آلية عناصر L1 النشطة ليتم نقلها ونسخها ولصقها في مواقع جديدة.

لذلك يبدو من المحتمل أن عدم وجود ارتباط بين حجم الجينوم وعدد الجينات الوظيفية & # 151 ، ومفارقة القيمة C & # 151 ناتج جزئيًا عن كمية الحمض النووي الريبوزي المتراكم في الجينوم.

  • 3000 ميجا بايت
  • 90 ميجا بايت (3٪) يتوافق مع تسلسل الترميز
  • 810 ميجا بايت (27٪) يتوافق مع التسلسلات المرتبطة (إنترونات ، محفزات ، جينات خادعة)
  • 2100 ميجا بايت (70٪) DNA غير هام يخضع لقيود انتقائية قليلة
  • التسلسلات الفريدة (1680 ميجا بايت - 56٪)
  • الحمض النووي المتكرر (420 ميجا بايت - 14٪)

متوسط ​​المسافة بين الجينات البشرية هو 65000 نقطة أساس

تميل حقيقيات النوى الأقل تعقيدًا إلى الحصول على كثافة جينات أعلى على كروموسوماتها من الكائنات الحية الأكثر تعقيدًا مثل الفقاريات.


الحد من الجينوم وفقدان الجينات في الحرارة

جينومات بدائية النواة مضغوطة وتحتوي على القليل من الحمض النووي بين الجينات مقارنة مع حقيقيات النوى. تستفيد هذه الميزة الجينومية من وقت تقسيم قصير للتكاثر السريع وتقلل أيضًا من استهلاك الطاقة لتخليق النيوكليوتيدات. ومن المثير للاهتمام ، أن أحجام الجينوم الخاصة بالحرارة تكون عمومًا أصغر من تلك الموجودة في غير المحبين للحرارة ، نظرًا لأن جميع الأنواع التي تعيش في درجات حرارة تصل إلى 60 درجة مئوية تحتوي على جينومات أصغر من 4 ميجا بايت ، في حين أن جميع الأنواع التي يزيد حجم جينومها عن 6 ميجا بايت تعيش في درجات حرارة أقل من 45 درجة ج (79). كما هو متوقع ، يتم تقليل أطوال البروتين وعدد أفراد عائلة البروتين في المحاربات الحرارية مقارنة بنظرائهم المتجانسين في غير المحبين للحرارة نظرًا لصغر حجم جينومات المحاربات الحرارية. مقارنة بين جينومات ثيرموفيلوس و Deinococcus radiodurans كشف فقدان الجينات النظامي في T. ثيرموفيلوس، بما في ذلك مركب اليورياز ، ومسار استقلاب الرامنوز ، و acyl CoA: acetate / 3-ketoacid CoA transferase ، ونقل الفركتوز واستخدامه ، واستقلاب الجلسرين (61). مثال آخر مشابه هو Thermoanaerobacter tengcongensis، حيث تكون بعض الجينات المرتبطة بدورة TCA غائبة في الجينوم (5). أدت هذه الملاحظات إلى فرضية يُرجح أن يكون فيها تقليل التعقيد الوظيفي للجينوم آلية لخفض التكلفة بالنسبة لعشاق الحرارة للتكيف مع درجة حرارة البيئة (16 ، 23 ، 25 ، 70). ومع ذلك ، لا يزال الجدل حول ما إذا كان بإمكان عشاق الحرارة القضاء على تلك الجينات التي تشفر البروتينات ذات الثبات الحراري المنخفض أثناء التطور (37 ، 69).


نتائج

النظام الجيني لدراسة نقل DNA البلاستومي إلى Acinetobacter

الحمض النووي لنبات التبغ مع اعدا إدخال الجين في plastome في موقع قريب من rpl32(الشكل 1 أ كوب وآخرون. ، 1996) كدنا مانح في تجارب التحول من أجل توفير علامة انتقائية والاستفادة من العدد الكبير من جزيئات DNA البلاستيد لكل خلية. لقياس إمكانية نقل هذا الحمض النووي ، سلالات Acinetobacter ص. BD413 JV21 (يشار إليه فيما بعد Acinetobacter sp.) بالبلازميدات التي تحتوي على محذوف نهائيًا اعدا الجين (اعدا65 نقطة أساس محذوفة من الطرف 3 مما أدى إلى حساسية للمضادات الحيوية) تم بناؤها. إعادة التركيب اعداتم تسجيل الجين بمقاومة المضادات الحيوية. يحتوي البلازميد pTH10 (الشكل 1 أ) على تماثل متسلسل مع DNA البلاستيد على جانبي الحذف في اعدا′ (تجانس من جانبين). كما هو موضح في الشكل 1 ب ، حدثان متماثلان لإعادة التركيب في المنطقتين 1.1 و 1.3 كيلو بايت على جانبي اعدا′ يمكن أن يؤدي إلى ظهور محولات مقاومة للمضادات الحيوية. في المقابل ، فإن pTH20 (الشكل 1 أ) متماثل مع DNA البلاستومي على جانب واحد فقط من الحذف في اعدا′ (4.5 كيلو بايت تجانس أحادي الجانب). مع هذه السلالة المتلقية ، يمكن اكتشاف أحداث HFIR التي تنتج عن إعادة التركيب المتماثل الذي يشرك جانبًا واحدًا من جزيء الحمض النووي المحول مع اندماج DNA غير الشرعي المصاحب على الجانب الآخر من الجزيء (IR في الشكل 1C). أخيرًا ، واحد Acinetobacter ص. احتوت السلالة على ناقل البلازميد بدون أي DNA plastomic أو اعدا′. خدم هذا لاختبار نقل الحمض النووي المؤتلف في غياب أي تماثل.

ألف خريطة لجزء من plastome التبغ المؤتلف ، من pFaadAII المستخدمة في بنائه (Koop وآخرون. ، 1996) وإدخالات البلازميد المشتقة منه. يشار إلى الجينات بأشرطة سوداء. يتم تغليف شريط التحوير الجيني ويحتوي على جين العلامة اعدا مع مروج اصطناعي (سهم) والمنطقة 3 غير المترجمة من rbcL (تي يفقس). الجينات ndhF, rpl32 و trnL هي جينات بلاستيد في جوار كاسيت التحوير. يشار إلى DNA plastome الموجود في البلازميدات بخطوط عمودية. يُظهر مقاطعة الخط في pTH10 موضع حذف 76 نقطة أساس ، مما يؤدي إلى الاقتطاع اعدا′ الجين ويؤدي إلى حساسية الستربتومايسين والسبيكتينوميسين. دمج DNA plastome في pTH10 الموجود في Acinetobacter ص. ال اعدايمكن استعادة ′ من pTH10 عن طريق اثنين من عمليات التقاطع (المشار إليها بواسطة X). تكامل DNA plastome في pTH20 الموجود في Acinetobacter ص. استعادة اعدا′ في pTH20 يتطلب إعادة التركيب المتماثل (X) وحدث إعادة التركيب غير المشروع (IR) في اتجاه مجرى النهر. اعدا′. في (ب) و (ج) ، تشير الخطوط المتقطعة إلى ناقل الحمض النووي ، وهو متغاير للمنطقة المانحة المقابلة.

التحديد الكمي لـ اعدا نسخ الأرقام في DNA التبغ عبر البلاستومي عن طريق التحويل

تم تحويل الخلايا المتلقية مع pTH10 بالتوازي مع نوعين من DNA المتبرع ، البلازميد pFاعداالثاني المستخدمة في بناء التبغ transplastomic (الشكل 1A Koop وآخرون. ، 1996) والحمض النووي الكلي المستخرج من أوراق التبغ العابر للبلاستيك. مع DNA البلازميد ، زاد تردد التحول خطيًا مع تركيز الحمض النووي على مدى أكثر من 6 سجلات (الشكل 2). عند تركيزات الحمض النووي أعلى من حوالي 1 ميكروغرام مل -1 ، وصل المنحنى إلى هضبة. في الجزء الخطي من المنحنى ، كفاءة التحويل (المحولات لكل اعدا الجين) 1.1 (± 0.1) × 10 4 ، وهو مطابق تقريبًا للكفاءة التي تم الإبلاغ عنها سابقًا للتحول المتماثل مع nptII الجين (de Vries and Wackernagel ، 2002). باستخدام DNA التبغ ، تم الحصول على منحنى مشابه جدًا ، باستثناء أن تردد التحويل كان في المتوسط ​​90 ضعفًا أقل من التركيزات المقابلة لـ pFاعداالثاني DNA. تردد التحول المنخفض باستمرار مع DNA التبغ منه مع pFاعدايشير الحمض النووي الثاني إلى عدد أقل من اعدا الجينات في الحمض النووي للنبات ، كما أوضحت الدراسات السابقة أنه في النطاق الخطي ، يتناسب تردد التحويل مع عدد الجينات المحولة (de Vries and Wackernagel ، 1998). عدد ال اعدا الجينات في 100 نانوغرام من pFاعداالحمض النووي الثاني هو 1 × 10 10 (البلازميد 9025 نقطة أساس) وبالتالي في الحمض النووي للتبغ يبلغ حوالي 1.1 × 10 8. تتكون عينة من 100 نانوغرام من الحمض النووي للتبغ من 1.1 × 10 8 جزيئات DNA بلاستيد (المقابلة لـ 20 نانوغرام ، يحتوي DNA البلاستيد على 155939 زوجًا من جينوم بنك الجين رقم Z00044) و 8500 جينومات خلية ثنائية الصبغة (تقابل 80 نانوغرام واحد جينوم للتبغ ثنائي الصبغة لديها 8.8 × 10 9 بي بي فوستر وتويل ، 1996). من هذه العلاقة ، نحسب أن خلايا أوراق التبغ تحتوي في المتوسط ​​على 1.3 × 10 4 جزيئات DNA بلاستيد لكل خلية. هذا يتوافق بشكل ممتاز مع التحديدات السابقة لأوراق البازلاء وفول الصويا والسبانخ المزروعة بشكل خفيف ، والتي أعطت 1.0-1.3 × 10 4 (Bendich ، 1987).

تردد التحول Acinetobacter ص. JV21 pTH10 بواسطة اعدا الجينات في DNA البلازميد (دوائر pFaadAII) والحمض النووي الكلي من أوراق التبغ المعدلة وراثيًا (الماس) بتركيزات مختلفة من الحمض النووي. بدون DNA ، لم يتم الحصول على أي محولات (تردد التحويل ≤ 5 × 10 9). البيانات هي وسيلة من ثلاثة قرارات مستقلة مع الانحراف المعياري.

الحمض النووي البلاستيد موجود في الجذور ومواد الجذور

أعطى إجمالي الحمض النووي المعزول من أنسجة جذر التبغ العابر للذرات تردد تحويل 2.4 (± 0.5) × 10 5 لكل خلية متلقية (ن = 3) عند 100 نانوغرام من DNA ml -1 DNA (الشكل 2). يشير هذا إلى أن الحمض النووي من الجذور يحتوي فقط على سُبع كمية الحمض النووي البلاستيد الموجود في الخلايا الورقية ، أي حوالي 1.9 × 10 3 جزيء DNA بلاستيد لكل خلية. هذا يتفق مع الفكرة القائلة بأن عدد البلاستيدات لكل خلية وجينوم بلاستيد لكل بلاستيد يزيد في الأوراق المزروعة بالضوء أثناء التطور (Lamppa and Bendich، 1979 Lawrence and Possingham، 1986). مع المستخلصات المائية الخام التي تم الحصول عليها من مادة ريزوسفير للتبغ transplastomic (تم الحصول عليها بدون منظف أو إجراءات قاسية لتعطيل الخلايا مثل الصوتنة) ، تم تشكيل المحولات بتردد 2.8 ± (1.7) × 10 7 لكل خلية متلقية (ن = 3). لم يلاحظ أي محولات مع مستخلصات جذور الغلاف الجوي للنباتات الأبوية غير المعدلة وراثيا (≤8 × 10 −10 ن = 3). هذا يستثني البكتيريا الأصلية والتلوث البكتيري كمصدر لتحويل الحمض النووي في عينات transplastomic. مع عينات التربة الطازجة غير المعقمة التي تم فيها خلط 10 ٪ (وزن / وزن) من مادة أوراق التبغ المعدلة وراثيًا المطحونة في ملاط ​​، كان تردد التحويل 4.2 (± 2.1) × 10 8 (ن = 3). في هذه التجارب ، تمت إضافة 0.1 جم من مادة التربة مباشرة إلى 10 مل من مزرعة الخلية المختصة. لم ينخفض ​​تردد التحويل بعد تعرض المادة المختلطة من التربة والأوراق للتأثير المناخي في الحقل لمدة شهر واحد [9.4 (± 4.1) × 10 8 ن = 3]. لم تسفر عينات الضوابط التي تحتوي على مادة أوراق التبغ غير المعدلة وراثيًا مرة أخرى عن أي محولات (تردد ≤ 2.2 × 10 −10 ، ن = 3). تُظهر هذه البيانات أن DNA البلاستيد موجود في أنسجة الجذر ، على الرغم من أن تركيزه أقل من الأوراق ، يتم إطلاق هذا الحمض النووي البلاستيد من الجذور إلى منطقة الجذور أثناء النمو ، ويمكن أن تكون فضلات النباتات الطازجة مصدرًا لتحويل الحمض النووي في التربة حيث يمكن أن تستمر لفترات طويلة. تم إجراء ملاحظات مماثلة على ثبات الحمض النووي للنبات سابقًا باستخدام مادة الأنسجة والحمض النووي الكروموسومي المأخوذ من التبغ والبطاطس وبنجر السكر (Widmer) وآخرون. ، 1997 باجيت وآخرون.، 1998 Gebhard and Smalla، 1999 Ceccherini وآخرون.، 2003 Meier and Wackernagel، 2003b de Vries وآخرون., 2003 ).

نقل DNA البلاستيد إلى Acinetobacter ص. بمساعدة تسلسل المرساة

لقد حددنا مدى كفاءة منطقة متجانسة واحدة (تسلسل مرساة) في استخلاص تكامل DNA البلاستيد غير المتجانسة في Acinetobacter ص. استخدام الحمض النووي الكلي من أوراق التبغ عبر البلاستيك و Acinetobacter ص. pTH20 ، كان تردد التحويل 1.2 × 10 −7 لكل اعدا عند 100 نانوغرام من الحمض النووي مل -1 (الجدول 1). كان هذا حوالي 0.1 ٪ من التردد الذي تم الحصول عليه باستخدام DNA متماثل تمامًا (pTH10 في المستلم). كان التردد أعلى بحوالي 1000 ضعف من حد الكشف ، بينما كان أقل من حد الكشف في غياب التماثل (الجدول 1). لم يتم الحصول على المحولات أيضًا باستخدام DNA من نبات أبوي غير معدل وراثيًا (≤3.9 × 10 −9). توضح البيانات الواردة في الجدول 1 أن غياب التماثل أدى إلى انخفاض التحول بأكثر من 6 سجلات مقارنة بالسلالة المتجانسة تمامًا وأن التناظر أحادي الجانب يدعم بشدة نقل الجينات. احتوت جميع المحولات التي تم الحصول عليها باستخدام التناظر أحادي الجانب على الطول الكامل اعدا الجين كما تم التحقق منه بواسطة تحليل تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). كما أنها تحتوي على DNA البلاستيد في اتجاه مجرى النهر اعدا الجين المندمج عن طريق إعادة التركيب غير الشرعي للحمض النووي المقيم (انظر القسم التالي).

المستلم البلازميد نوع التنادد تردد التحول أ نسبيا
pTH10 ذو وجهين 1.4 (± 1.0) × 10 −4 1
pTH20 من جانب واحد 1.2 (± 0.14) × 10 −7 0.9 × 10 −3
pRK415 لا أحد ≤1.3 × 10 −10 ≤0.9 × 10 −6
  • أ. المحولات لكل اعدا في DNA المتبرع (تركيز 100 نانوغرام مل -1). البيانات من ثلاثة قرارات مستقلة مع الانحراف المعياري.

تتجمع أحداث إعادة التركيب غير المشروع في النقاط الساخنة

في 32 من المحولات التي تم اختيارها عشوائيًا والتي تم تشكيلها بمساعدة تسلسل المرساة ، تم تحديد موضع مواقع HFIR تقريبًا عن طريق تحليل PCR باستخدام بادئات أمامية من TF1 إلى TF5 والبادئات العكسية TR1 و TR2 (الشكل 3 أ). كشف التسلسل عن الموضع الدقيق لكل موقع اندماج غير شرعي في DNA المتبرع والمتلقي (الشكل 3 أ و 4) وأشار إلى أن المحولات قد اكتسبت متواليات نيوكليوتيدات أجنبية تتراوح من 113-2539 زوجًا قاعديًا. في 31 محولًا ، تم حذف الحمض النووي المقيم بين 40 و 501 نقطة أساس. لم يفقد أحد المحولات (f في الشكل 3) أي DNA ولكنه احتوى ، إلى جانب الحمض النووي الأجنبي ، تكرارًا قدره 280 نقطة أساس من اعدا′ الجين. يمكن تفسير التكوين التأشبي لهذا المحول بافتراض أنه تم استخدام جزء فقط من المنطقة 5 من تسلسل المرساة لإعادة التركيب المتماثل مما يسمح بإعادة التركيب غير المشروع في الجزء 3.

إعادة التركيب غير الشرعي الميسّر بالمثلث بين التبغ plastome و pTH20. أ يشار إلى المناطق المتجانسة (المظللة) وغير المتجانسة. تشير الخطوط الغامقة المسمى بالأحرف A إلى E والخطوط الرفيعة المسمى f إلى l إلى مواقع الاندماج غير الشرعي المستخدمة والفريدة من نوعها في المحولات المختلفة على التوالي. مواقع الربط الخاصة بالبادئات الأمامية في البلاستوم (TF1 ، TF2 ، TF3 ، TF4 ، TF5) ، البادئات العكسية في pTH20 (TR1 ، TR2) و trnL بادئات خاصة بالجينات trnL-F (F) و trnL-R (R) لـ RT-PCR (انظر الشكل 5) يشار إليها برؤوس سهام. تتوافق الرموز والتسميات الأخرى مع تلك المستخدمة في الشكل 1. ب. محتويات GC لجزيئات الحمض النووي (حجم النافذة 50 نيوكليوتيدات). يشار إلى مواقع إعادة التركيب غير المشروعة المستخدمة بشكل مضاعف ومواقع المحول f على النحو الوارد أعلاه.

متواليات النيوكليوتيدات في مواقع إعادة التركيب غير المشروعة. النوع المشار إليه من المحولات يتوافق مع ذلك الموضح في الشكل 3. يتألف تسلسل المؤتلفات من الأجزاء التي تحتها خط من متواليات المتبرعين (D) والمتلقين (R). يتم تعبئة المجهرية التي تحتوي على الانتقال بين D و R. 1 علم الأحياء الدقيقة الممتد (يُعرَّف على أنه مجهرية متجاورة من اثنين أو أكثر من الأزواج الأساسية مفصولة بأزواج أساسية مفردة غير متطابقة) تُعطى ككسر من عدد المطابقة بواسطة جميع الأزواج الأساسية المضمنة والمشار إليها بالتظليل. 2 تم حساب قيم ΔG لترابط الخيوط داخل علم الميكروية الممتدة باستخدام المعلمات التي قدمها SantaLucia (1998). 3 يحتوي المحول f على تكرار لـ 280 زوجًا من النيوكليوتيدات الطرفية اعدا′.

عرضت تتابعات مواقع HFIR (الشكل 4) ثلاث سمات محددة. أولاً ، احتوت جميع المواقع على امتداد صغير من 3 إلى 6 نقاط أساس متطابقة في جزيئي DNA المتفاعلين (الميكروهومولوجيات) التي حدث فيها الاندماج بين المتبرع والمتلقي. كان متوسط ​​محتوى GC في المجهرية (76 ٪) أعلى من محتوى المتبرع والمتلقي. تؤكد هذه النتيجة وجود علميات ميكروية غنية بالـ GC في مواقع HFIR التي شوهدت لأول مرة في العقدية الرئوية (برودوم وآخرون. ، 2002) وبالمثل أيضًا في Acinetobacter[بمجموعة مختلفة من جزيئات الحمض النووي المتفاعلة كما هو مستخدم هنا (de Vries and Wackernagel ، 2002)] و Pseudomonas stutzeri[حيث يحتوي حوالي ثلثي مواقع HFIR فقط على علم الميكروبات (Meier and Wackernagel ، 2003a)]. علاوة على ذلك ، يمكن النظر إلى معظم مواقع الاندماج على أنها مجهرية ممتدة من 7-13 نقطة أساس مع عدم تطابق واحد أو اثنين (الشكل 4).

ثانيًا ، حدث 14 اندماجًا من 32 اندماجًا في نفس الجسيمات الدقيقة (الشكل 4). نظرًا لأنه تم استرداد جميع المحولات من تجارب التحويل المنفصلة ، يجب أن يكون السبب في العدد الكبير من المحولات من النوع A هو نقطة ساخنة لإعادة التركيب غير الشرعي. لم يتم رؤية بقعة ساخنة بين أحداث HFIR الـ 44 التي تم تحليلها مسبقًا بعد تحول Acinetobacter ص. و P. stutzeri. في الرئوية الرئوية، تم العثور على عدد من مواقع الاندماج مرتين إلى سبع مرات بين 52 محولًا (Prudhomme وآخرون. ، 2002). النقطة الساخنة من المحولات من النوع A هي التشريح الميكروي الممتد الذي يوفر أعلى تقارب بين المتبرع والمتلقي DNA (ΔG37 0 = −13.5 كيلو كالوري مول −1 الشكل 4).

ثالثًا ، يتجمع 31 من 32 موقعًا من مواقع الاندماج في ثلاث مناطق من DNA المتبرع. كما هو مبين في الشكل 3 ب ، كانت هذه المناطق ذات محتوى GC عالي (جزر GC عالية). كانت مواقع الانصهار تقع بالقرب من نهايات الجزر مشيرةً بعيدًا عن المرساة. أظهر الموقع المفرد للمحول f نفس الخصائص. لم يكن اندماجًا واحدًا موجودًا في إحدى مناطق GC المنخفضة من DNA المتبرع. في الحمض النووي المتلقي أيضًا ، تم استخدام مناطق GC العالية بشكل تفضيلي للاندماج. كما هو مذكور أعلاه ، تنعكس هذه الملاحظات أيضًا في محتوى GC العالي في الميكروهومولوجيات.

التعبير عن الجين البلاستيد trnL في Acinetobacter ص.

في أحد المحولات من النوع C (الشكل 3) التي تحتوي على التبغ trnL الجين ، تم فحص تعبير الجين. لهذا ، فإن إجمالي الحمض النووي الريبي المستخرج من المحول ومن واحد بدونه trnL (النوع A) تم نسخه عكسيًا باستخدام M-MLV polymerase و trnL-R التمهيدي (الشكل 3) متبوعًا بتضخيم PCR باستخدام الاشعال trnL-F و trnL-R. بهذه الطريقة ، فقط النصوص ذات الاتجاه الصحيح بالنسبة إلى trnL تم اعتبار الجين. أعطى (كدنا) للمحول من النوع C ناتج تضخيم قدره 90 نقطة أساس ، والذي تم الحصول عليه أيضًا باستخدام DNA من المحول ولكن ليس باستخدام RNA المنقى (الشكل 5). في المقابل ، لم يتم الحصول على إشارات باستخدام DNA و RNA و RNA المعكوس من النوع A المتحولة. تظهر النتائج أن ملف trnL يتم التعبير عن الجين في Acinetobacter ص. باستخدام البادئات TF3 و TF2 (الشكل 3) جنبًا إلى جنب مع trnL-R ، تم الحصول على نواتج التضخيم المتوقعة البالغة 333 نقطة أساس و 937 نقطة أساس ، على التوالي ، باستخدام DNA من المحولات من النوع C ولكن ليس باستخدام RNA أو cDNA (الشكل 5) . يوضح هذا أن إجمالي الحمض النووي الريبي من المحول من النوع C لم يحتوي على نسخ طويلة المدى من اعدا المروج ويقترح ذلك trnL تم التعبير عنه من المروج البلاستيد الخاص به. يوجد تسلسلان محفزان من النوع eubacterial المفترض عالي الدرجات أمامهما trnL في تسلسل البلاستيد (المدخل رقم Z00044) مع مواقع بدء النسخ 55 و 45 نقطة أساس في أعلى تسلسل الحمض الريبي النووي النقال الناضج على التوالي. تدعم النتائج الواردة في الشكل 5 افتراض استخدام أحد هذين المعززين أو كليهما Acinetobacter ص.

الكشف عن التعبير عن الجين البلاستيد trnL في Acinetobacter بواسطة RT-PCR. كانت القوالب عبارة عن DNA و RNA و cDNA كما هو موضح في السطر الأول ومشتقة من محولات HFIR من النوع A و C (السطر الثاني). يتم إعطاء أزواج التمهيدي المستخدمة في السطر الثالث (s = trnL-F/trnL-R م = TF3 /trnL-R l = TF2 /trnL-R قارن الشكل 3). كانت علامة الحجم (M) φX174 /هايIII (500 نانوغرام لكل حارة). يشير رأس السهم إلى منتج PCR الذي تم تضخيمه من trnL- (كدنا) محدد من المحولات من النوع C. يتم إعطاء حجم المنتجات المحددة (في bp) في العمود الأيسر (باستخدام DNA كقالب وزوج تمهيدي ، تم الحصول على منتج أضعف إضافي بمقدار ≈ 280 نقطة أساس والتي ربما نشأت عن طريق تمهيد غير محدد للحمض النووي الجيني).


البكتيريا الشعاعية: بكتيريا G + C عالية الجرام إيجابية الجرام

يأتي اسم Actinobacteria من الكلمات اليونانية لـ أشعة و قضيب صغير، لكن البكتيريا الشعاعية متنوعة للغاية. يمكن أن يتراوح مظهرها المجهري من قضبان متفرعة خيطية رفيعة إلى العصيات. بعض البكتيريا الشعاعية كبيرة جدًا ومعقدة ، في حين أن البعض الآخر من بين أصغر الكائنات الحية المستقلة. تعيش معظم البكتيريا الشعاعية في التربة ، لكن بعضها مائي. الغالبية العظمى من التمارين الهوائية. إحدى السمات المميزة لهذه المجموعة هي وجود عدة ببتيدوغليكانات مختلفة في جدار الخلية.

الجنس الشعيات هو ممثل تمت دراسته كثيرًا من البكتيريا الشعاعية. الشعيات النيابة. تلعب دورًا مهمًا في بيئة التربة ، وبعض الأنواع من مسببات الأمراض البشرية. عدد من الشعيات النيابة. تسكن فم الإنسان وهي من مسببات الأمراض الانتهازية التي تسبب الأمراض المعدية مثل التهاب اللثة (التهاب اللثة) وخراجات الفم. الانواع أ. إسرائيلي هو اللاهوائية سيئة السمعة للتسبب التهاب داخلى بالقلب (التهاب البطانة الداخلية للقلب) (الشكل 1).

الشكل 1. (أ) الشعيات الإسرائيلية (صورة مجهرية إلكترونية مسح ضوئي بالألوان الكاذبة [SEM]) لها بنية متفرعة. (ب) الخناق الوتدية يسبب مرض الدفتيريا الفتاك. لاحظ الحواجز المميزة. (ج) البكتيريا المتغيرة الجرام Gardnerella vaginalis يسبب التهاب المهبل الجرثومي عند النساء. تُظهر هذه الصورة المجهرية مسحة عنق الرحم لامرأة مصابة بالتهاب المهبل. (الائتمان أ: تعديل العمل بواسطة & # 8220GrahamColm & # 8221 / رصيد ويكيميديا ​​كومنز ب: تعديل العمل بواسطة رصيد مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها ج: تعديل العمل بواسطة Mwakigonja AR ، Torres LM ، Mwakyoma HA ، Kaaya EE)

الجنس المتفطرة يتم تمثيله بواسطة عصيات مغطاة بطبقة حمض الميكوليك. يحمي هذا الغلاف الشمعي البكتيريا من بعض المضادات الحيوية ، ويمنعها من الجفاف ، ويمنع اختراق كواشف صبغة الجرام (انظر تلطيخ العينات المجهرية). لهذا السبب ، يتم استخدام إجراء خاص للتلوين السريع للحمض لتصور هذه البكتيريا. الجنس المتفطرة هو سبب مهم لمجموعة متنوعة من الأمراض المعدية. مرض السل هو العامل المسبب ل مرض السل، وهو مرض يصيب الرئتين بشكل أساسي ولكنه يمكن أن يصيب أجزاء أخرى من الجسم أيضًا. تشير التقديرات إلى أن ثلث سكان العالم قد أصيبوا بالعدوى مرض السل وتحدث ملايين الإصابات الجديدة كل عام. علاج مرض السل يمثل تحديًا ويتطلب من المرضى تناول مجموعة من الأدوية لفترة طويلة. ومما يزيد من تعقيد العلاج تطوير وانتشار سلالات مقاومة للأدوية المتعددة من هذا العامل الممرض.

أنواع مسببة للأمراض أخرى ، M. الجذام، هو سبب مرض هانسن (الجذام)وهو مرض مزمن يؤثر على الأعصاب الطرفية وسلامة الجلد والسطح المخاطي للقناة التنفسية. يزيد فقدان الإحساس بالألم ووجود الآفات الجلدية من قابلية الإصابة بالإصابات الثانوية والالتهابات بمسببات الأمراض الأخرى.

البكتيريا في الجنس الوتدية تحتوي على حمض ديامينوبيمليك في جدرانها الخلوية ، وغالبًا ما تتشكل مجهريًا الحواجز، أو أزواج من الخلايا على شكل قضيب تشبه الحرف V. قد تحتوي الخلايا على متبدل اللون حبيبات، التخزين داخل الخلايا للفوسفات غير العضوي الذي يفيد في التعرف على الوتدية. الاغلبية العظمى من الوتدية النيابة. غير مسببة للأمراض ومع ذلك ، C. الدفتيريا هو العامل المسبب ل الخناق، وهو مرض يمكن أن يكون قاتلاً ، خاصة عند الأطفال (الشكل 1 ب). C. الدفتيريا ينتج مادة سامة تشكل غشاءً كاذبًا في حلق المريض ، مما يتسبب في حدوث تورم وصعوبة في التنفس وأعراض أخرى يمكن أن تصبح خطيرة إذا لم يتم علاجها.

الجنس Bifidobacterium يتكون من اللاهوائيات الخيطية ، وكثير منها يوجد عادة في الجهاز الهضمي والمهبل والفم. حقيقة، Bifidobacterium النيابة. تشكل جزءًا كبيرًا من ميكروبيوتا الأمعاء البشرية وغالبًا ما تستخدم كبروبيوتيك وإنتاج الزبادي.

الجنس غاردنريلايحتوي على نوع واحد فقط ، G. vaginalis. يتم تعريف هذا النوع على أنه & # 8220 جرام متغير & # 8221 لأن العصيات الصغيرة لا تظهر نتائج متسقة عند صبغ الجرام (الشكل 1 ج). بناءً على الجينوم الخاص به ، يتم وضعه في المجموعة الموجبة للجرام G + C العالية. G. vaginalis يمكن أن يسبب التهاب المهبل الجرثومي لدى النساء ، وعادة ما تكون الأعراض خفيفة أو حتى لا يمكن اكتشافها ، ولكن يمكن أن تؤدي إلى مضاعفات أثناء الحمل.

يلخص الجدول 1 خصائص بعض الأجناس المهمة من البكتيريا الشعاعية. تظهر معلومات إضافية عن البكتيريا الشعاعية في تصنيف الكائنات الدقيقة ذات الصلة سريريًا.

الجدول 1. البكتيريا الشعاعية: ارتفاع G + C موجب الجرام
مثال جنس علم الصرف المجهري مميزات خاصة
الشعيات عصيات إيجابية الجرام في المستعمرات ، تظهر خيوط تشبه الفطريات (خيوط) اللاهوائية الاختيارية في التربة ، تتحلل المواد العضوية في فم الإنسان ، قد تسبب أمراض اللثة
مفصليات عصيات موجبة الجرام (في المرحلة الأسية من النمو) أو العصعص (في المرحلة الثابتة) تنقسم الأكياس الهوائية الملزمة عن طريق & # 8220snapping ، & # 8221 تشكيل أزواج تشبه V من الخلايا الوليدة تحلل الفينول ، ويمكن استخدامها في المعالجة الحيوية
Bifidobacterium البكتيريا الشعاعية الخيطية موجبة الجرام توجد اللاهوائية بشكل شائع في ميكروبات الأمعاء البشرية
الوتدية عصية إيجابية الجرام الأيروبس أو اللاهوائيات الاختيارية من الحواجز تنمو ببطء وتتطلب وسائط غنية في الثقافة C. الخناق يسبب الخناق
فرانكيا عصية موجبة الجرام تشبه الفطريات (الخيطية) تعيش البكتيريا المثبتة للنيتروجين في تعايش مع البقوليات
غاردنريلا متغير الجرام كوكوباسيلوس استعمار المهبل البشري ، قد يغير البيئة الميكروبية ، مما يؤدي إلى التهاب المهبل
المكورات الدقيقة كوكوس موجب الجرام ، تشكل عناقيد مجهرية موجود في كل مكان في البيئة وعلى جلد الإنسان أوكسيديز إيجابي (على عكس التشابه شكليًا بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية) بعضها من مسببات الأمراض الانتهازية
المتفطرة عصية موجبة الجرام ، سريعة الحمض بطيئة النمو ، هوائية ، مقاومة للجفاف والبلعمة مغطاة بطبقة شمعية مصنوعة من حمض الميكوليك مرض السل يسبب مرض السل M. الجذام يسبب الجذام
نوكارديا تشكل العصيات الضعيفة الموجبة للجرام فروعًا سريعة الحموضة قد يتسبب استعمار اللثة البشرية في حدوث التهاب رئوي شديد والتهاب في الجلد
Propionibacterium عصية إيجابية الجرام اللاهوائية بطيئة النمو P. حب الشباب يتكاثر في الغدد الدهنية للإنسان ويمكن أن يسبب أو يساهم في ظهور حب الشباب
رودوكوكس عصية إيجابية الجرام هوائي صارم يستخدم في الصناعة للتحلل البيولوجي للملوثات ص. الفاشيين هو أحد مسببات الأمراض النباتية ، و ص يسبب الالتهاب الرئوي في المهور
ستربتوميسيس عصية موجبة الجرام تشبه الفطريات (الخيطية) جنس متنوع للغاية (و GT500 نوع) هوائي ، كاسحات للبكتيريا المكونة للجراثيم ، محللات موجودة في التربة (تعطي التربة رائحة & # 8220 الأرض & # 8221) المستخدمة في صناعة المستحضرات الصيدلانية كمنتجين للمضادات الحيوية (أكثر من ثلثي المضادات الحيوية المفيدة سريريًا)

فكر في الأمر


إعادة بناء شبكة الحياة الجذرية

تعاني إعادة البناء الوراثي من أخطاء عشوائية أقل عند توفر المزيد من البيانات لمعظم سيناريوهات طول الفروع [59]. عند إعادة بناء نموذج شبكة الحياة الجذرية المقترح هنا ، فإن مجموعات بيانات الجينوم الكامل مطلوبة لتوفير سقالة الريبوسوم الشبيهة بالأشجار والشبكات المحتملة من أشجار الجينات الأخرى. قد يكون أحد الأساليب المتطرفة لتخفيف الخطأ العشوائي هو محاذاة متعددة للجينوم الكامل ، لكن هذا لن يكون واقعيًا (أو حتى ممكنًا نظرًا للتماثل غير الكامل لعائلات الجينات عبر الحياة الباقية) لأن التواريخ التطورية المنفصلة داخل الكائنات الحية لن يتم وصفها. حيث من المحتمل أن يكون لمناطق الجينوم نفس التواريخ ، فإن الجمع بين التسلسلات لتحسين الدقة هو نهج مفيد ويتم مناقشته بالتفصيل أدناه. من المهم أن نلاحظ أنه حتى السلالات التي تم حلها جيدًا قد تكون خادعة ، حيث تخفي القطع الأثرية لإعادة البناء الأحداث التطورية المعقدة إذا كان نموذج إعادة البناء غير كافٍ لوصف العملية التطورية [60]. يكون هذا مرجحًا بشكل خاص عند دمج متواليات متجانسة متنوعة كما هو ضروري في إعادة بناء شبكة الحياة.

التخفيف من الخطأ العشوائي: الجمع بين التسلسلات لتحسين الدقة

لحل السلالات الصعبة ، يكون من المفيد أحيانًا استخدام المعلومات من العديد من الجينات لاستخراج إشارات النشوء والتطور التي قد تكون مخففة جدًا إذا تم أخذها من جينات فردية. كما ذكرنا سابقًا ، هناك طريقتان مستخدمتان على نطاق واسع تتكونان من تسلسل جينات متعددة (supermatrix) [17] وبناء سلالات متفق عليها باستخدام عدة أشجار محسوبة من جينات فردية (نباتات فائقة) [18]. يُعتقد أن هذه الأساليب التطورية قادرة على الحصول على إجماع متعدد لمجموعة البيانات مع تقليل وجود القطع الأثرية في البيانات مثل وجود عمليات نقل الجينات أو إشارات النشوء والتطور المنخفضة. ومع ذلك ، إذا كان هناك عدد كبير جدًا من التعارضات في مجموعات البيانات أو كانت إشارة النشوء والتطور ضعيفة جدًا ، فقد لا تكون شجرة الإجماع الناتجة مفيدة ، حيث قد لا تعكس بدقة تاريخ أي من مجموعات البيانات المكونة لها [61]. يمكن توضيح ذلك باستخدام عمليات محاكاة الجينوم البسيطة التي تتضمن طريقًا سريعًا واحدًا لمشاركة الجينات بين سلالتين غير مرتبطين (الشكل 1) حيث تفوقت الأشجار العالية القائمة على التحلل الرباعي المضمّن على سلاسل الجينات (الشكل 2). عندما تم نقل الجينات إلى سلالة تم فصل فرعها المجاور بمقدار 0.05 بدائل لكل موقع (الشكل 2 أ) ، كان نهج المصفوفة الفائقة (تسلسل الجينات) قادرًا على استعادة طوبولوجيا الشجرة الصحيحة فقط عندما خضع أقل من 25٪ من الجينات لاستبدال متماثل . في المقابل ، استعاد التحلل الرباعي المدمج متبوعًا بإعادة الإعمار الفائقة الهيكل الصحيح ، حتى عندما خضع 45 ٪ من الجينات لاستبدال HGT (الشكل 2 أ). عند أكثر من 50٪ من HGT ، تم استرداد الجينوم F كمجموعة شقيقة لـ B ، مما يعكس حالة تكون فيها الإشارة الناتجة عن السلالة غارقة في طريق مشاركة الجينات السريعة. عندما يتم وضع سلالة المستلم بالقرب من مجموعته الشقيقة ، كان نهج المصفوفة الفائقة أكثر عرضة لـ HGT (الشكل 2 ب). كان وجود 10 إلى 15٪ من الإشارات المضللة في مجموعة البيانات المتسلسلة كافياً للحث على استعادة الهيكل الخاطئ في معظم الحالات. في نفس الموقف ، فشل النهج الثلاثي القائم على الرباعية في وجود 35٪ أو أكثر من الإشارات المتضاربة. على النقيض من ذلك ، عندما لم يتم محاكاة عمليات نقل الجينات وتفاوت مقدار إشارة النشوء والتطور فقط بين مجموعات البيانات ، كانت طرق المصفوفة الفائقة أفضل في استخراج إشارة النشوء والتطور الصحيحة مقارنة بالأشجار الفائقة (البيانات غير معروضة).

شجرة النشوء والتطور تستخدم لمحاكاة تطور الجينوم بما في ذلك طريق سريع موجه لمشاركة الجينات. تم اختبار شجرتين مختلفتين ، إحداهما لها فرع داخلي أطول قليلاً من 0.05 بدائل لكل موقع مقارنة بالشجرة الأخرى مع استبدالات 0.01 فقط لكل موقع. تم استخدام الجينوم B كمانح للجينات المنقولة إلى السلالة المؤدية إلى الجينوم F. مع زيادة كمية النقل من الجينوم B 'إلى F. تم إنشاء تسلسل الجينوم باستخدام Evolver من حزمة PAML [113]. احتوى كل جينوم تمت محاكاته على ما مجموعه 100 جين ، كل 300 حمض أميني طويل.

مقارنة بين نهج supermatrix و supertree لاستعادة الشجرة الصحيحة بعد النقل الجيني الأفقي. تمت محاكاة النقل الجيني الأفقي بين النسب B 'و F (الشكل 1) بفرع داخلي من 0.05 (A) أو 0.01 من البدائل لكل موقع (B). تم اختبار التردد الذي يتم به استعادة الشجرة الصحيحة من المصفوفات الفائقة والأساليب الفائقة من البيانات التي تتضمن كميات متزايدة من الجينات المنقولة على طول طريق سريع واحد لمشاركة الجينات. احتوى كل جينوم تمت محاكاته على ما مجموعه 100 جين ، يبلغ طول كل منها 300 حمض أميني. تم تجميع الجينات في تسلسل واحد من كل جينوم تمت محاكاته لحساب شجرة المصفوفة الفائقة أو بدلاً من ذلك ، تم حساب أشجار الجينات بشكل فردي من كل جين للنهج العالي. لم يتم إعادة تنظيم التسلسلات لتجنب أي قطعة أثرية إضافية يُحتمل تقديمها من خوارزميات المحاذاة. تم حساب أشجار الانضمام المجاورة باستخدام تصحيح Kimura في ClustalW الإصدار 2.0.12 [114]. تم حساب أشجار الاحتمالية القصوى باستخدام PhyML V.3.0 [115] باستخدام نموذج Pinvar و JTT وتوزيع جاما المقدر تحت 4 فئات. تم حساب الأشجار الرباعية المضمنة [116] بالإضافة إلى أشجار التعددية الناتجة (الثلاثية الفائقة) من أشجار عائلة الجينات الفردية باستخدام Quartet Suite v.1.0 [117]. تم تكرار عمليات المحاكاة 100 مرة لقياس إمكانية تكرار طرق إعادة بناء الأشجار المختلفة في استعادة طوبولوجيا الشجرة الأصلية.

تشير هذه النتائج إلى أنه عند استخدام مجموعات من الجينات التي يُعرف أنها أقل نقلًا ، كما هو الحال بالنسبة لبروتينات الريبوسوم ، يُفضل اتباع نهج المصفوفة الفائقة ، بينما بالنسبة لمجموعات البيانات حيث قد تربط الطرق السريعة الخفية لمشاركة الجينات بين الكائنات الحية المتباعدة ، فإن الأساليب الفائقة مثل قد يكون التحلل الرباعي أكثر دقة. يمكن أن ينتج عن مصدر إضافي للخطأ ناتج عن الطريقة العشوائية التي يتم فيها فرز الأنساب أثناء الانتواع ، وجود أشجار جينية شاذة في الاستدلال الوراثي [59]. يمكن أن يحدث هذا خلال فترات التنويع السريع حيث توجد حواف قصيرة في أشجار الجينات ولا يتم تخفيفها عن طريق الجمع بين المزيد من الجينات في تحليل واحد.

تفسير العمليات التطورية غير المتجانسة

تعتمد إعادة بناء أشجار النشوء والتطور من التسلسلات البيولوجية على تقدير المسافة التطورية بين تسلسل الاهتمام. تم الحصول على هذا التقدير من النماذج التطورية التي تصف احتمالية بدائل مختلفة من النوكليوتيدات أو الأحماض الأمينية [62]. تستند النماذج التطورية التقليدية إلى مجموعة من الافتراضات المبسطة ، وعندما تنتهك مجموعة البيانات التي تم فحصها هذه الافتراضات ، يمكن استعادة الأشجار غير الصحيحة [62 ، 63]. في إعادة بناء النشوء والتطور على مقياس RNoL ، حيث يتم تضمين درجة كبيرة من تنوع التسلسل ، فإن هذه الافتراضات المبسطة تتعرض لخطر أكبر لانتهاك الحقائق البيولوجية المرصودة غير الموصوفة صراحة في نموذج إعادة الإعمار. بعض هذه التحديات التي تواجه النماذج التطورية موصوفة أدناه ، جنبًا إلى جنب مع العمل الجاري للتغلب عليها.

يمكن أن تختلف السلالات الموجودة اختلافًا جوهريًا في تكوين القاعدة والأحماض الأمينية ، وهي ظاهرة تُعرف باسم عدم التجانس التركيبي [62 ، 64]. في كثير من الحالات ، يكون هذا مدفوعًا بالتكيف الفسيولوجي مع البيئات ذات المتطلبات المتميزة على الكيمياء الفيزيائية للبروتين (على سبيل المثال، ملحي بالحرارة ، ملوحة). التغييرات في تكوين النيوكليوتيدات للجينوم (على سبيل المثال، ارتفاع أو انخفاض محتوى G + C) داخل سلالات معينة ، مما يؤثر بشكل غير مباشر على تكوين الأحماض الأمينية. تميل النماذج التي تفترض التجانس التركيبي (تكوين تسلسل ثابت في جميع أنحاء الشجرة) إلى تجميع السلالات ذات التركيبات المتشابهة معًا ، بغض النظر عن تاريخها التطوري الفعلي ، وإنتاج قيم تمهيد عالية لهذه الهياكل غير الصحيحة [62]. حل مشكلة وصف مجموعات البيانات غير المتجانسة من الناحية التركيبية هو تنفيذ النماذج التي تسمح بترددات توازن مختلفة (معلمات لوصف تكوين التسلسل) على أجزاء مختلفة من الشجرة [62 ، 64].

التحدي الآخر للنماذج التطورية هو التغاير ، والتباين في معدل التطور في موقع على فروع مختلفة من الشجرة [63]. يمكن أن يتسبب التغاير في أن تقوم النماذج التطورية بتجميع الأصناف على فروع طويلة معًا ، مما يؤثر على كل من طرق البخل القصوى والاحتمالية القصوى [65] ، وإنتاج أشجار غير صحيحة مع دعم عالٍ للتمهيد [63]. يمكن التخفيف من التأثير الضار للتغلغل في إعادة بناء النشوء والتطور باستخدام نماذج احتمالية ذات معلمات كافية لوصف هذه الظاهرة بشكل صحيح [63 ، 65].

معظم النماذج التطورية الحالية تجهل أيضًا البنية الثانوية والثالثية - أي أنها تفترض أن الاستبدالات في موقع ما مستقلة تمامًا عن البدائل في موقع آخر ، وهو افتراض ينتهكه التطور المتسلسل لجينات ترميز البروتين والريبوزيم (بما في ذلك الحمض النووي الريبي الريبوزومي) ). يتم تطوير نماذج استبدال النوكليوتيدات التي تزن معدل بدائل النوكليوتيدات غير المرادفة من خلال تأثيرها على البنية الثلاثية للبروتين [66] ، أو التي تقدر التباين في معدل الاستبدال غير المرادف في تسلسل [67]. تظهر هذه النماذج واعدة ، لا سيما فيما يتعلق باكتشاف الاختيار الإيجابي ، ولكنها تظل باهظة التكلفة من الناحية الحسابية وتتفوق في الأداء في إعادة بناء النشوء والتطور من خلال النماذج المستقلة عن الموقع [68]. من المعروف أيضًا أن محاسبة المعلومات الهيكلية تعمل على تحسين محاذاة الحمض النووي الريبي ، خاصة في التسلسلات المتباينة [69] ، والنماذج التي تمثل البنية الثانوية عند إجراء إعادة بناء النشوء والتطور قيد التطوير. تعمل هذه النماذج على تحسين أشجار النشوء والتطور في بعض المواقف [70] ، ولكنها تنتج نتائج غير صحيحة في حالات أخرى [69]. ومع ذلك ، فهي واعدة وتستحق المزيد من التحقيق.

يتم إجراء تحسينات باستمرار على النماذج التطورية ، مما يؤدي إلى تحسين القدرة على التمييز بين معلومات النشوء والتطور والضوضاء. تزيد هذه النماذج الجديدة من عدد المعلمات المستخدمة لوصف البيانات ، وتستحق هذه الاستراتيجية في كثير من الحالات. ومع ذلك ، من المهم إدراك أن إضافة معلمات غير مهمة يقلل من القدرة على استخلاص النتائج [64] ، وأنه لن يتم وصف جميع مجموعات البيانات بشكل أفضل من خلال نفس النموذج. لا يؤدي تضمين المزيد من المعلمات بالضرورة إلى تحسين إعادة الإعمار - على سبيل المثال ، غالبًا ما تتفوق النماذج التطورية التي تستخدم معلمات مختلفة لكل فرع من فروع الشجرة عن طريق النماذج التي تسمح فقط بمجموعتين مختلفتين من المعلمات ، واحدة لكل كليد رئيسي على شجرة [64 ، 71]. نظرًا لأن النماذج التطورية يتم تطويرها وتحسينها ، فمن المهم أيضًا استكشاف طرق اختيار أفضل نموذج لمجموعة البيانات [71] ، كما حدث في بعض الحالات [64] ، وتطويرها للاستخدام من قبل جمهور أوسع.

يمكن أيضًا أن تكون المصنوعات اليدوية الأخرى موجودة داخل عمليات إعادة البناء ، بغض النظر عن معلمات نموذج المعدل والتكوين. تميل الفروع الأطول إلى التجمع معًا بغض النظر عن علاقاتها الحقيقية [72] ، وهي ظاهرة تُرى في الموضع المصطنع للميكروسبوريديا على أنها سلالة حقيقية النواة متفرعة عميقة [73 ، 74]. إن فترات التنويع السريع التي تتسبب في وجود فروع أقصر ستجعل إعادة الإعمار عرضة لتأثير كثافة العقدة حيث قد يتم المبالغة في تقدير أطوال الفروع في مناطق الشجرة التي تحتوي على عدد أكبر من العقد [75]. على الرغم من أن أخذ عينات الأصناف المتوازنة قد يخفف من بعض هذه القطع الأثرية ، فإن مسار التطور ليس ملزمًا بتوفير توزيعات نسجية يمكن إعادة بنائها بسهولة عبر شبكة الحياة بأكملها [73] ، وبالتالي فإن تطوير خوارزميات محسنة يعد مجالًا مهمًا للبحث.

الاعتراف بالتنوع داخل شبكة الحياة الجذرية

تجلى التطور البيولوجي في مجموعة رائعة من التنوع. يختلف تاريخ الحياة بين الكائنات الحية اختلافًا كبيرًا مع الاختلافات المقابلة في ديناميكيات السكان وأنماط التنويع ("الانتواع") ، وربما يكون الأهم بين الأنساب أحادية الخلية ومتعددة الخلايا. تختلف هاتان المجموعتان اختلافًا كبيرًا في ميلهما إلى النقل الجيني الأفقي مع الآثار المترتبة على تفسير صراعات شجرة الجينات. بالنسبة للكائنات متعددة الخلايا ذات خطوط الخلايا الجسدية ، فإن احتمالية نسخ المادة الجينية المنقولة أفقياً إلى ذرية المضيف أقل بكثير من احتمالية الكائنات أحادية الخلية. ومع ذلك ، توجد أمثلة على السابق. كما هو مذكور أعلاه ، غالبًا ما تكون هذه عمليات نقل من المتعايش البكتيري إلى الجينوم المضيف. وبالتالي ، يجب أن يكون تفسير أشجار الجينات المتعارضة مع الشجرة المرجعية للعمود الفقري مستوحى من تاريخ الحياة والمعرفة البيولوجية السابقة للأنساب المعنية: من المرجح أن تكون الطوبولوجيا المتضاربة بين الأصناف أحادية الخلية ناتجة عن HGT أكثر من التعارض بين الأصناف متعددة الخلايا حيث قد يُفضل الفرضية البديلة لفقدان الجينات التفاضلية أو الفرز غير الكامل للنسب.

عند التفكير في العلاقات التطورية الكبيرة ، فإن الطوبولوجيا المتضاربة داخل المجموعات ذات الصلة الوثيقة ، والتي من المحتمل أن تكون أكثر حتى بالنسبة للجينات الريبوزومية ، لن تغير العلاقات الأعمق. من بين 568 نوعًا من البكتيريا والأركيا ممثلة في قاعدة بيانات NCBI Complete Microbial Genomes في أواخر عام 2009 [76] ، كان لدى 235 نوعًا تنوعًا بين نسخ الرنا الريباسي 16S المتعددة [77]. في معظم الحالات ، يكون تنوع التسلسل داخل الجينوم أقل من ذلك المحدد تقليديًا للتنوع بين الأنواع [78]. من 2.5٪ من الأنواع ذات الممثلين المتسلسلين الذين تجاوزوا الحد بين الأنواع [77] Thermoanaerobacter tengcongensis مع 6.7٪ تنوع وبعض السلالات من الهالوبكتيريا بما في ذلك هالواركولا كارلسبادنس [79] و هالوميكروبوم موكوهاتاي JCM 9738 (T) [80] ذات أهمية خاصة. في حين أن القرار على مستويات أعمق لن يتأثر ، هناك تباعد كاف في هذه الأقلية الصغيرة من المحتمل أن يسبب مشاكل في الحل على مستوى الجنس. إن استخدام المصفوفة الفائقة بما في ذلك بروتينات الريبوسوم ، وهي جينات نسخة واحدة [77] ، من شأنه أن يخفف من ذلك. وبالتالي فإن استخدام المتواليات الريبوزومية (البروتين والرنا الريباسي) كسقالة ذات نزول عمودي في الغالب يمكن الاستدلال عليها من خلال شبكة الحياة المتجذرة. ومع ذلك ، فإن الارتباط بين السقالة والميراث الرأسي ليس حرمًا أو ضروريًا لبناء مثل هذه الشبكة المتجذرة: يمكن الاستدلال على نقل الريبوسوم بأكمله من خلال التناقض الطوبولوجي بين السقالة الأولية والأغلبية العظمى من سلالات الجينات الأخرى المرتبطة بهذا النسب.

التوفيق بين التواريخ الجينية

تم اقتراح طرق مختلفة للحصول على شجرة كبيرة واحدة من عدة أشجار جينية ضمن نفس مجموعة الجينومات (يشار إليها أحيانًا باسم "شجرة الأنواع" في الأدبيات) [81-83]. كما تم التأكيد أعلاه ، فإن مثل هذه الأساليب مناسبة فقط للحالات التي يكون فيها HGT بين سلالات متباعدة غير مرجح - إما بسبب طبيعة السلالات المعتبرة (متعددة الخلايا) أو طبيعة التسلسلات المستخدمة (على سبيل المثال، الريبوسوم). بدلاً من استنتاج طوبولوجيا جديدة تمثل شجرة "الأنواع" ، تم تطوير الخوارزميات ذات الصلة بواسطة Beiko و Hamilton [84] و Lawrence and Alm [85] باستخدام طوبولوجيا مرجعية محددة مسبقًا مع أوجه التشابه مع النموذج المقترح هنا. في الأخير ، من خلال عملية تسمى "التوفيق" ، يتم اختيار طوبولوجيا شجرة الجينات التي تدعم بيانات التسلسل وتقليل وظيفة التكلفة التي يتم تحديدها من خلال فقدان الجينات ، وكسبها ونقلها بالنسبة إلى سلالة مرجعية. لذلك يتم استيعاب الشبكات التي تمثل HGT ، على الرغم من أنه على عكس النموذج المقترح هنا ، فإن الهيكل الأولي يمثل حصريًا وصريحًا تاريخًا من النسب العمودي. لهذا السبب ، حتى لو تم اختيار الهيكل المرجعي الأولي بعناية ، فإن التطبيق البسيط لهذا النهج له قدرة محدودة على عكس التاريخ التطوري الشامل للحياة. ومع ذلك ، يمكن استيعاب هذه الأساليب في نموذج RNoL عن طريق إزالة الافتراضات التي تساوي الشجرة المرجعية مع الوراثة الرأسية ، وتوسيع التحليلات اللاحقة لأخذ أحداث أكثر تعقيدًا في الاعتبار ، مثل تلك الموضحة سابقًا (على سبيل المثال، التعايش الداخلي ، الاتجاهات الخاصة بالنسب لـ HGT ضد. الازدواجية). في هذه النماذج كما في RNoL ، سيكون هناك "ترقق" حتمي للحواف باتجاه الجذر بسبب الضياع الوراثي (الجينات والبلازميدات والعضيات إلخ). لن يكون تعيين هذه الخسائر لأحداث HGT أو إلى سلالات من النسب الرأسي ممكنًا في المناطق ذات الدقة المنخفضة للتطور حيث توجد أوجه غموض مرتبطة بـ HGT ولكن من حيث المبدأ يوفر هذا النموذج تمثيلًا رجعيًا للتطور البيولوجي


الاستنتاجات

في حين أنه من المتوقع أن تحتوي ميكروبات التربة الناجحة على جينومات كبيرة 29،30 (الشكل 3) ، كاليفورنيا. يحتوي U. copiosus على جينوم صغير ، مما يشير إلى أنه ، على غرار بعض الميكروبات المائية ، يمكن أن يمثل تقليل البنية الخلوية إلى الحد الأدنى أيضًا استراتيجية ناجحة لميكروبات التربة. لا نعرف ما إذا كانت أصناف التربة الوفيرة الأخرى غير المزروعة تحتوي أيضًا على جينومات منخفضة ، لأن قواعد بيانات الجينوم الموجودة مسبقًا متحيزة بشكل تفضيلي تجاه العزلات المزروعة. على سبيل المثال ، 4.5٪ فقط من الجينومات البكتيرية في IMG هي من الأصناف غير المزروعة (تم الوصول إليها في أبريل 2016). يحتوي ترميز البكتيريا من أجل تنوع استقلابي أكبر على جينومات أكبر وبالتالي قد يكون من الأسهل زراعتها في المختبر 31. من ناحية أخرى ، متطلبات المغذيات المحددة والتوافقية مثل تلك الموصوفة ل كاليفورنيا. يمثل U. copiosus مشكلة معقدة للباحثين الذين يحاولون زراعة ميكروبات ذات جينومات منخفضة 50. بالرغم ان كاليفورنيا. U. copiosus لم تتم زراعته بعد في المختبر ، ومن الواضح أن الزراعة هي الخطوة التالية الحاسمة لوصف هذا الكائن الحي ، باستخدام المعلومات الموضحة هنا "لتخصيص" وسيط نمو خصيصًا من أجل كاليفورنيا. U. copiosus والميكروبات ذات الصلة. يمكن لمثل هذا النهج أن يحسن قدرتنا على وصف ودراسة غالبية ميكروبات التربة ، حتى ميكروبات التربة السائدة مثل كاليفورنيا. U. copiosus ، والتي لا تزال صعبة الزراعة في ظل ظروف معملية.


الاثنين 25 ديسمبر 2017

علم النبات - هل هناك ثمار تعتمد على نثر بذورها بالفضلات؟

هل هناك أي ثمار لها بذور يمكنها البقاء على قيد الحياة في الجهاز الهضمي بأكمله للحيوان وتبقى قابلة للإنبات بمجرد تناقلها في فضلات الحيوانات؟

ربما تكون هذه هي الوظيفة الأساسية لجميع الثمار المصنّعة وأنا غير مدرك تمامًا للعمليات البيولوجية المقصودة. إذا كان الأمر كذلك ، فلماذا توجد ثمار البذور السامة؟

بيولوجيا الحفظ - ما الذي من المتوقع أن ينقرض أولاً؟

على الرغم من انقراض عدد من الحيوانات بمعدلات أسرع بشكل مثير للقلق (ما يسمى انقراض الأنثروبوسين) ، لا يزال عدد من الحيوانات المهددة بـ "النجوم" على قيد الحياة. أي من الأنواع الجذابة المهددة بالانقراض تم تصميمها أو من المتوقع أن تموت قريبًا: الدب القطبي ، الباندا ، وحيد القرن الأسود ، الفيل الأفريقي ، الغوريلا الجبلية ، نمر البنغال / نمر.

أين يمكنني أن أجد نماذج الإسقاط السكاني لكل نوع من هذه الأنواع؟

تمتلك الغوريلا الجبلية أصغر عدد من السكان حاليًا ، ولكن من الواضح أن الدببة القطبية تعاني من الكثير من المشاكل (وتتسع بسرعة) بسبب ذوبان الجليد. تشهد الأفيال الأفريقية خسارة في الأنواع بسبب الصيد الجائر وظروف التجفيف مما يجعل الغذاء / الماء شحيحًا ، مما قد يؤدي أيضًا إلى تسريع تدهورها ، لكن لديها أكبر عدد من السكان.

نظرًا لأن WWF ومنظمات الحفظ الأخرى تستخدم هذه الأنواع الكاريزمية "لبيع" الحفظ وزيادة الاهتمام والوعي والتمويل ، فإن فقدان واحد (أو أكثر) من هذه الأنواع يمكن أن يؤثر على الحفظ بشكل كبير. سيكون هذا إما إيجابيًا من خلال خيبة أمل رجعية من قبل الجمهور أو سلبًا بفقدان "نوع الملصق".

البيولوجيا الجزيئية - كيف تربط تفاعلات نموذج التمثيل الغذائي البشري مع أهداف عقار السرطان / العناصر المتفاعلة؟

محاولة إيجاد طريقة لأخذ دواء السرطان (من CancerDR ، على سبيل المثال) واستنتاج التفاعلات الأيضية التي تتأثر به في نموذج التمثيل الغذائي البشري.

بشكل أساسي ، أود أن أعرف أي تفاعلات HMM تتأثر بعقار معين لعلاج السرطان ، خاصة تلك الموجودة في موسوعة خط الخلايا السرطانية.

البحث عن التفاعلات المرتبطة ببروتين HSP90 ، الذي يستهدفه (إلى حد ما) عامل 17-AAG. بهذه الطريقة ، يمكنني تتبع القسم ذي الصلة من HMM ووضع علامة عليه باعتباره "متأثرًا" بهذا الوكيل.

قد يكون هذا سؤالًا واسعًا جدًا أو ساذجًا ، لكنني أخشى أنني لا أعرف ما يكفي لأتمكن من تحديد ذلك.

إذا كان بإمكان شخص ما تقديم بعض النصائح أو الإرشادات فقط ، فسيكون ذلك موضع تقدير كبير أيضًا.


أساليب

السلالات البكتيرية والبلازميدات وظروف الاستزراع

تمت زراعة جميع السلالات البكتيرية في مرق LB عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر (225 دورة في الدقيقة) وعلى ألواح أجار LB عند 37 درجة مئوية (Fisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إمداد البلازميدات بالكهرباء في PAO1 وتم اختيار المستعمرات الحاملة للبلازميد كما هو موضح سابقًا. لا ينتمي البلازميد الصغير pNUK73 إلى أي مجموعة عدم توافق محددة 21. ينتمي Rms149 إلى مجموعة عدم التوافق IncP-6 ، بينما ينتمي pAKD1 إلى مجموعة IncP-1β 30،31. لا تتوفر التسلسلات الكاملة PAMBL-1 و PAMBL-2 ولم يتم تحديد مجموعات عدم التوافق الخاصة بها باستخدام نظام الكتابة المتماثل PCR 42. استخدمنا Biolog EcoPlates (Biolog ، الولايات المتحدة الأمريكية) لتقييم نمو البكتيريا في بيئات مختلفة وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة باستخدام قارئ الألواح BioTek Synergy H4 (BioTek Instruments ، المملكة المتحدة). تم إجراء تجارب لياقة تنافسية وتحليلها كما هو موضح في سان ميلان وآخرون. 20: باختصار ، قمنا بتربية السلالات مسبقًا عند 37 درجة مئوية مع 225 دورة في الدقيقة. رج بين عشية وضحاها في 3 مل من مرق LB (فيشر العلمية ، الولايات المتحدة الأمريكية). قمنا بتخفيف 10 ميكرولتر من الثقافات السابقة في 190 ميكرولتر من LB الطازج واحتضانها في نفس الظروف في 96 طبقًا جيدًا حتى تصل إلى المرحلة الأسية المتوسطة (OD600 من 0.5). قمنا بخلط هذه الثقافات بنسبة تقارب 50٪ استنساخ قيد الدراسة إلى 50٪ PAO1 - GFP. أكدنا النسب الأولية باستخدام قياس التدفق الخلوي باستخدام أداة مقياس التدفق الخلوي Accuri C6 (BD Accuri ، الولايات المتحدة الأمريكية). قمنا بتخفيف المخاليط 400 ضعف في LB طازج وزرعناها لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 225 دورة في الدقيقة. تهتز (∼ 8 أجيال). قمنا بقياس النسبة النهائية باستخدام قياس التدفق الخلوي مرة أخرى. تم إجراء قياس التدفق الخلوي باستخدام أداة Accuri C6 (BD Accuri ، الولايات المتحدة الأمريكية) مع المعلمات التالية: معدل التدفق: 66 ميكرولتر دقيقة -1 ، الحجم الأساسي: 22 ميكرومتر ، الأحداث المسجلة لكل عينة: 10000-20000.

استخراج الحمض النووي الريبي والنسخ العكسي

تم تلقيح كل سلالة بكتيرية (الجدول التكميلي 2) في وسط LB باستخدام تحريض IPTG (Sigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكية) حيث يلزم ونمت طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر (225 دورة في الدقيقة). تم تخفيف الثقافات الليلية بنسبة 1: 100 في LB طازج بنفس تركيز IPTG وحضنت حتى وصلت إلى OD600 0.5 تحت نفس الظروف التجريبية. تم خلط الثقافات البكتيرية مع RNAprotect Bacteria Reagent (Qiagen ، هولندا) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم إجراء استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام نظام عزل الحمض النووي الريبي المجموع SV (Promega ، الولايات المتحدة الأمريكية).للقضاء على الحمض النووي الجينومي ، تم إجراء هضم DNase I على العمود (Promega ، الولايات المتحدة الأمريكية) وعلاج DNase إضافي باستخدام مجموعة Ambion Turbo الخالية من الحمض النووي (Life Technologies ، الولايات المتحدة الأمريكية) أثناء وبعد إجراء عزل الحمض النووي الريبي ، على التوالي ، وفقًا لـ تعليمات الشركات المصنعة. للنسخ العكسي ، تم تصنيع عينات cDNA الأولى من 2.0 ميكروغرام من إجمالي قوالب الحمض النووي الريبي باستخدام نظام النسخ العكسي GoScript مع بادئات سداسية عشوائية (Promega ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء تفاعلات التحكم السلبية ، والتي تحتوي على جميع مكونات النسخ العكسي باستثناء إنزيم النسخ العكسي ، للتحقق من عدم وجود الحمض النووي الجيني في عينات الحمض النووي الريبي.

تحليل RNA-Seq

تم إجراء تحليل RNA-Seq على البيانات النصية لستة سلالات: PAO1 من النوع البري ، PAO1 الأبوي / pNUK73 ، واثنان من المسوخات المعوضة تحمل كلا من البلازميد والشفاء: استنساخ متحولة هيليكس (PA1372 ، كودون توقف سابق لأوانه في الموضع 378) و استنساخ متحولة للكيناز (PA4673.15 ، كودون إيقاف سابق لأوانه في الموضع 95). لم تحمل السلالات المتحولة أي طفرات أخرى في الجينوم مقارنة مع PAO1 الأبوي باستثناء تلك المحددة أعلاه ، كما يتضح من تسلسل الجينوم الكامل 20. تم تسلسل نسختين بيولوجيتين من عينات الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها في أيام مختلفة لكل سلالة كما هو موضح أعلاه. تم إجراء إعداد المكتبة (مكتبة ذات نهايات ثنائية الاتجاه) والتسلسل (باستخدام Illumina MiSeq) في مركز Wellcome Trust للوراثة البشرية بجامعة أكسفورد. تم تقييم جودة المكتبة باستخدام 2200 TapeStation Software (Agilent Technologies ، الولايات المتحدة الأمريكية) ومنصة Qubit Fluorometric Quantitation (تقنيات الحياة ، الولايات المتحدة الأمريكية). تمت تصفية القراءات الأولية مبدئيًا باستخدام NGS QC Toolkit 43 ، مع تجاهل 7.8 ٪ في المتوسط ​​من القراءات لكل عينة. تم قطع نهايتي القراءات 3 و 5 إذا كانت درجة جودة Phred هي & lt20 ، وتم تجاهل أي قراءات أقصر من 75 نقطة أساس بعد خطوة التشذيب. بعد ذلك ، تم الاحتفاظ بالقراءات بدرجة جودة Phred لا تقل عن 20 في جميع أنحاء 80 ٪ من أطوالها. أخيرًا ، تم تجاهل القراءات التي قدمت قيمًا غامضة في & gt2٪ من قواعدها.

سلالة الأجداد PAO1 المستخدمة في هذه الدراسة لها ميزتان إضافيتان مقارنة مع P. الزنجارية الجينوم المرجعي PAO1 (NC_002516.2) ، أي إدخال الملتهمة RGP42 (GQ141978.1) والبلازميد pNUK73 (AB084167). تم تعيين القراءات المصفاة إلى P. الزنجارية الجينوم المرجعي PAO1 والتسلسلات المرجعية للبلازميد pNUK73 والعاثية RGP42 باستخدام BWA 44. كان متوسط ​​التغطية 43.5 × ، وحصلت 98.2٪ من القواعد على درجة جودة Phred 20 أو أعلى. تم الحصول على تعداد الجينات من ملفات BAM باستخدام HTSeq 45 (خيارات: —m (وضع للتعامل مع القراءات المتداخلة) ، تقاطع صارم ، —a (محاذاة جودة القراءة الدنيا) ، 20). تم إجراء تحليل التعبير الجيني التفاضلي مع التصحيح للتأثير الدفعي باستخدام تصميم 2 46 (وظيفة DESeqDataSetFromHTSeqCount). تم استخدام تصميم صيغة التصميم = ∼ الدُفعة + الشرط لاختبار تأثيرات كل حالة (تحور الهليكاز ، وتحور كيناز ، وتحمل البلازميد ، وسلالة الأجداد) ، والتحكم في مصادر التباين المفترضة بسبب تحضير العينة في أيام مختلفة (تأثير الدُفعة ). تم إيداع ملفات FASTQ التي تم إنشاؤها في هذا العمل في قاعدة بيانات أرشيف النوكليوتيدات الأوروبية تحت رمز الانضمام PRJEB8227.

الوقت الحقيقي الكمي PCR

تم تعديل الإجراءات التجريبية للوقت الحقيقي الكمي PCR (rt-qPCR) من تلك الموصوفة في دراسة من قبل Qi وآخرون. 47. تم إجراء فحوصات rt-qPCR باستخدام طريقة القياس الكمي النسبي. تم تضخيم كل جين موضح في الجدول التكميلي 3 باستخدام Fast SYBR Green Master Mix (النظم الحيوية التطبيقية ، الولايات المتحدة الأمريكية) و 100 نانومتر من البادئات قليلة النوكليوتيد على منصة StepOnePlus Real-time PCR (Applied Biosystems ، الولايات المتحدة الأمريكية) في ثلاث مكررات بيولوجية واثنين من التكرارات التقنية. تم التحقق من كفاءة التضخيم والخطية وخصوصية كل زوج تمهيدي qPCR ثلاث مرات باستخدام مجموعة مخففة تسلسليًا من عينات (كدنا) التجريبية (الجدول التكميلي 3). مستويات النص (المعبر عنها في السجل2 أضعاف التغيير) للجينات المستهدفة ليكسا, recA و اعادة عد في جميع سلالات الاختبار تم تحديدها بالنسبة إلى سلالات التحكم ذات الصلة ، أي PAO1 ::صسلالة التحكم في LAC ليكسا و recA التعبير عن PAO1 :: pLAC-اعادة عد سلالة بدون تحريض IPTG لـ اعادة عد التعبير. تم حساب عوامل التطبيع من المتوسط ​​الهندسي لمستويات النسخ لثلاثة جينات مرجعية داخلية معبر عنها بثبات (acpP, ATPA و rpoD). تم تحديد مستويات نسخ الجينات المستهدفة من خلال تطبيع مستويات النسخ لكل جينات مستهدفة لعوامل التطبيع. أخيرًا ، تم حساب مستويات النسخ النسبية لكل جين مستهدف في كل مجموعة عينة بعد تصحيح تأثير الدُفعة.

لتحديد مدى تسرب التعبير عن اعادة عد من عند صLAC ، قمنا بقياس عدد نسخ اعادة عد و rpoD النصوص في عينات (كدنا) المستمدة من PAO1 غير المستحث:صأمريكا اللاتينية والكاريبياعادة عد سلالة باستخدام طريقة القياس الكمي المطلق بواسطة qPCR. تم إنشاء منحنيات المعايرة المعيارية لكلا الجينين باستخدام الحمض النووي الجيني المستخرج من PAO1 ::صأمريكا اللاتينية والكاريبياعادة عد السلالة ، التي تم تحديد تركيزها باستخدام نظام QuantiFluor dsDNA (Promega ، الولايات المتحدة الأمريكية). رقم نسخة اعادة عد و rpoD تم حسابها بناءً على المنحنيات القياسية لمعاير جدنا وكتلة جدنا لكل جينوم.

الاستنساخ الجزيئي وطفرات الترانسبوزون

ال اعادة عد تم تضخيم الجين مع موقع الارتباط الريبوزومي المفترض (5′-CGGAGG-3 ′) 5 نقاط أساس في المنبع من كودون البدء (GTG) بواسطة PCR من الحمض النووي البلازمي pNUK73 باستخدام التمهيدي الأمامي 5′-TAAGGATCCTGGCGGAGGCGGCT-3 والعكس التمهيدي 5 ′ - GCCAAGCTTTAACGTCCCCTAACTT-3 ′. تم استنساخ منتج PCR في اتجاه مجرى النهر صLAC بين مواقع تقييد BamHI و HindIII في موقع الاستنساخ المتعدد في بلازميد التسليم pUC18-mini-Tn7T-Gm-LAC (المُدخل رقم AY599234). لدمج تحفيز IPTG اعادة عد بناء في موقع mini-Tn7 لسلالة الوالدين PAO1 الخالية من البلازميد المستخدمة في هذه الدراسة ، تم تحويل PAO1 المعالج بالسكروز مع pUC18-mini-Tn7-صناقل توصيل LAC-rep ومساعد ترميز ترميز Tn7 للبلازميد pUX-BF13 48 عبر التثقيب الكهربائي لتوليد PAO1 ::صLAC-اعادة عد أضنى. سلالة التحكم السلبية ، PAO1 ::صLAC ، وهو متساوي المنشأ لـ PAO1 ::صLAC-اعادة عد سلالة باستثناء عدم وجود اعادة عد المصب من صتم إنشاء LAC باستخدام نفس الإجراء.

GO مصطلح ومسار تخصيب

تم استخدام أداة GOEAST 49 عبر الإنترنت (مخصصة - GOEAST ، إعدادات المعلمة الافتراضية) لاختبار إثراء علم الجينات بين مجموعة الجينات المعبر عنها تفاضليًا. تم استخدام أداة DAVID 50 عبر الإنترنت لاختبار الإثراء في العديد من التعليقات التوضيحية الوظيفية.

عمليات البحث عن التشابه

لدراسة نقل الجينات الأفقي ، استخدمنا العديد من مناهج المعلومات الحيوية التي تعتمد على عمليات البحث عن التشابه. أولاً ، أجرينا عمليات بحث عن تشابه BLASTP ضد جينومات 48 نوعًا من Pseudomonas في قاعدة بيانات Pseudomonas Genome وجميع أنواع Pseudomonas ذات الجينوم الكامل المودعة في NCBI 51. ثانيًا ، أجرينا عمليات بحث عبر الإنترنت لـ BLASTP 52 مقابل قاعدة البيانات غير الزائدة في NCBI. أخيرًا ، أجرينا عمليات بحث عبر الإنترنت باستخدام أرشيف النيوكليوتيد الأوروبي 53 ، الذي يصل إلى جميع جينومات Ensembl.


شاهد الفيديو: أنواع RNA في الخلايا الحية. أحياء. التحصيلي علمي. 1441-1442 (قد 2022).


تعليقات:

  1. Dailar

    يا لها من رسالة جميلة

  2. Laertes

    ما هي الكلمات ... سوبر ، فكر رائع

  3. Grosar

    إذا كانت نتائج جيدة

  4. Notus

    أعتذر عن التدخل ... لكن هذا الموضوع قريب جدًا مني. يمكنني المساعدة في الإجابة. اكتب إلى PM.

  5. Goltikazahn

    إنه لأمر مؤسف أنني لا أستطيع التحدث الآن - أنا في عجلة من أمري للذهاب إلى العمل. لكنني سأعود - سأكتب بالتأكيد ما أفكر فيه.



اكتب رسالة