معلومة

الفرق بين بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي الخاصة بالضفيرة وغير الخاصة بالضفيرة

الفرق بين بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي الخاصة بالضفيرة وغير الخاصة بالضفيرة


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أود أن أسأل الفرق بين مجموعة البيانات الخاصة بالضفيرة وغير المحددة.

بقدر ما أعرف ، تعني البيانات الخاصة بالسلاسل أننا نعرف أي خصلة من النص.

ليس لدي خلفية بيولوجية. يرجى تأكيد ما إذا كانت صحيحة. إذا كان لدينا نسخة ، والتي هي من خيط الحس ، عندما ينتج RNA-seq قراءات ، فهل يتم تصنيع cDNA أولاً. ثم يتم استخدام هذا (كدنا) ل PCR لتضخيم العينة؟ ثم يمكن أن تكون القراءات الناتجة من كلا خيوط الحمض النووي الأصلي؟

بالنسبة للبروتوكولات الخاصة بالخيوط ، ما هو الاختلاف؟

========================================================

متابعة.

يرجى تصحيح لي إذا كنت مخطئا. هناك عدة بروتوكولات لإنتاج مكتبات RNA-seq الخاصة بالسلاسل. العملية الأساسية مثل:

  1. الحصول على الحمض النووي الريبي.
  2. احصل على [كدنا] ؛
  3. بطريقة ما قم بتمييز (كدنا) على أنه حاسة أو عكسي عند التضخيم (PCR؟) (هنا تأتي الاختلافات بين البروتوكولات المختلفة) ؛
  4. ثم قم بإزالة جميع cDNAs المضادة للحساسية (أو الإحساس) ؛
  5. اقرأ القراءات من مكتبة cDNA النظيفة.

والنتيجة هي أنه يمكن استخدام القراءات من هذا الحمض النووي الريبي لتجميع المعنى (كدنا). وبالنسبة للمكتبات غير المخصصة للخيوط ، فإن استخدام القراءات سيكون قادرًا على تجميع كلاً من (كدنا) المضاد للحس والمعنى.

هل أنا محق في هذه المشكلة؟ شكرا.


قد يكون من المفيد التحقق من مقالة "التحليل المقارن الشامل لطرق تسلسل الحمض النووي الريبي الخاصة بالخيوط".

ترتبط التقنيات الأكثر شيوعًا بالتسلسل بربط محولات RNA المختلفة بنهايات 5 'و 3' لكل جزيء RNA قبل تخليق cDNA. سينتهي بك الأمر بجزيء RNA يبدو كالتالي (حيث A و B هما المهايئان):

5'-AAAAAA --------------- BBBBBB-3 '

ثم يتم استخدام هذه المحولات لتوليف (كدنا) وإعداد المكتبة. أخيرًا ، نظرًا لأن كل مهايئ مرتبط بنهاية معينة من RNA ، يمكن إنشاء المكتبة بطريقة خاصة بالحامل ؛ بمعنى آخر. القراءات المشتقة من حبلا مضاد المعنى يجب تتماشى مع الخيط المضاد للدلالة في الجينوم.

** لاحظ أن هناك أشكالًا أخرى لهذه التقنية ولكن بروتوكول Illumina هو الأكثر شيوعًا.


يوفر تحليل نسخ RNA-Seq الخاص بالأنماط الجينية مع وبدون تحمل منخفض للفوسفور رؤى جديدة حول كفاءة استخدام الفوسفور في الذرة

الإجهاد الفوسفوري (P) هو مشكلة عالمية في إنتاج الذرة. على الرغم من أن التقنيات الكلية / المصفوفة الدقيقة قد زادت بشكل كبير من معرفتنا العامة باستجابات الذرة للإجهاد P ، لا تزال هناك حاجة إلى فهم أكبر لتنوع الاستجابات في الأنماط الجينية للذرة.

نتائج

في هذه الدراسة ، قمنا أولاً بتقييم التسامح مع انخفاض P لـ 560 مدخلات في ظل الظروف الميدانية ، واخترنا الخط منخفض التسامح P CCM454 والخط منخفض الحساسية P 31778 لمزيد من البحث. ثم أنشأنا 24 مكتبة RNA خاصة بالضفائر من براعم وجذور CCM454 و 31778 التي تعرضت لضغط P لمدة 2 و 8 أيام. شاركت الجينات المستجيبة لنقص P الشائعة في CCM454 و 31778 في عمليات التمثيل الغذائي المختلفة ، بما في ذلك نشاط حمض الفوسفاتيز (APase). أظهر تحديد أنشطة APase الإفرازية الجذرية أن تحريض APase بواسطة إجهاد P حدث في وقت مبكر جدًا في CCM454 عن ذلك في 31778. تحليل الأنطولوجيا الجينية للجينات المعبر عنها تفاضليًا (DEGs) وأنشطة CAT / POD بين CCM454 و 31778 تحت P-كافية و - أظهرت الظروف القاصرة أن CCM454 لديه قدرة أكبر على القضاء على أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) من 31778. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد 16 miRNAs في الجذور و 12 miRNAs في البراعم ، بما في ذلك miRNA399s ، على أنها DEGs بين CCM454 و 31778.

الاستنتاجات

تشير النتائج إلى أن التسامح مع انخفاض P لـ CCM454 يرجع أساسًا إلى الاستجابة السريعة للإجهاد P والقضاء الفعال لـ ROS. تزيد النتائج التي توصلنا إليها من فهم الأحداث الجزيئية المتضمنة في تنوع الاستجابات للإجهاد P بين مدخلات الذرة.


الفرق بين بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي الخاصة بالضفيرة وغير المحددة بالضفيرة - علم الأحياء

برنامج لتخمين نوع مكتبة RNA-Seq لملفات القراءة المزدوجة والمفردة باستخدام الخرائط والتعليقات التوضيحية الجينية.

يحدد اختيار نوع مكتبة RNA-Seq اتجاه القراءة للتسلسل والترتيب الذي يتم فيه ترتيب سلاسل cDNA ، مما يعني أن قراءة RNA-Seq من أنواع مكتبة مختلفة يمكن أن تختلف اختلافًا كبيرًا. يمكن أن تكون المعلومات المتعلقة بنوع المكتبة مفيدة جدًا لتجميع القراءات في نسخة أو تعيينها إلى مجموعة مرجعية. وذلك لأن نوع المكتبة يمكن أن يساعد في تمييز المكان الذي تنتمي إليه القراءات الغامضة الأقصر في النسخة النصية باستخدام الاتجاه النسبي للقراءة ومن أي السلسلة تم تسلسلها. لسوء الحظ ، لا يتم تضمين هذه المعلومات المتعلقة بنوع المكتبة المستخدمة في تسلسل ملفات الإخراج وقد تُفقد قبل تجميع البيانات. حتى عند العمل مع بيانات RNA-Seq من المستودعات العامة ، لا يوجد ضمان بأن معلومات نوع المكتبة صحيحة أو أنها موجودة على الإطلاق. هذا هو ما يهدف GUESSmyLT إلى إصلاحه من خلال النظر في كيفية تعيين القراءات لمرجع ، بالإضافة إلى تخمين التعليقات التوضيحية الجينية للمكتبة التي تم استخدامها لإنشاء البيانات.

تم تطويره لأنظمة Unix. اعتمادًا على نهج التثبيت ، سيتم تثبيت تبعيات أكثر أو أقل تلقائيًا. تحقق من فقرة التثبيت.

  • Python & GT3
  • بيوبيثون (1.67)
  • bcbio-gff (0.6.4) - التعامل مع شرح gff التوضيحي
  • pysam (0.15.1) - التعامل مع القراءات المعينة
  • Snakemake (5.4.0) - إدارة سير العمل
  • BUSCO (3.0.2) - شرح الجينات
  • Bowtie2 (2.3.4.3) - رسم الخرائط
  • الثالوث (2.8.4) - التجمع المرجعي

باستخدام قناة Bioconda النشطة (انظر 2. إعداد القنوات) ، قم بالتثبيت باستخدام:

التثبيت باستخدام نقطة لن تقوم بتثبيت BUSCO و Bowtie2 و Trinity. يمكن تثبيت هذه البرامج الخارجية باستخدام conda.

التثبيت باستخدام شخص سخيف لن تقوم بتثبيت BUSCO و Bowtie2 و Trinity. يمكن تثبيت هذه البرامج الخارجية باستخدام conda.

استنساخ المستودع وانتقل إلى المجلد:

قم بتشغيل التثبيت إما:

أو إذا لم يكن لديك حقوق إدارية على جهازك:

هناك أيضًا مثال للجري يستغرق حوالي 5 دقائق. سيتم إنشاء مجلد يسمى GUESSmyLT_example_out في دليل العمل:

تتم طباعة النتائج على أنها stdout وإلى ملف نتيجة. أحد الأمثلة على النتيجة هو:

استنادًا إلى توجهات القراءات ، نفترض أن نوع المكتبة هو fr-unstranded حيث يوجد تقريبًا 50-50 تقسيم بين fr-first و fr-second.

قراءة الملفات:. fastq Mapping: .bam Reference: .fa

تم اختبار رؤوس وتنزيلات Illumina القديمة / الجديدة من SRA. يجب أن تعمل ، ولكن لم يتم اختبارها لجميع تنسيقات ترويسة fastq على: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/docs/submitformats/

التنسيقات المدعومة معشق

إذا كانت الرؤوس في Old / New Illumina أو إذا كانت القراءات متناوبة.

إلومينا القديمة: @ HWUSI-EAS100R: 6: 73: 941: 1973 # 0/1
Illumina الجديدة: @ EAS139: 136: FC706VJ: 2: 2104: 15343: 197393 1: Y: 18: ATCACG
بالتناوب:
@ read1 (أول رفيق)
..
@ read1 (زميله الثاني)
..
@ read2 (أول رفيق)
..
@ read2 (زميله الثاني)
..

في الجزء العلوي من fastq RNA-Seq ، اقرأ الملف (الملفات) (مضغوط أو غير مضغوط):

إذا لم يكن لديك معلومات أخرى ، فما عليك سوى القراءة

مثال مع قراءات مقترنة في حقيقيات النوى.

إذا كان لديك فقط جينوم مرجعي

مثال مع قراءات مقترنة في حقيقيات النوى.

إذا كان لديك مرجع الجينوم والشروح

مثال مع قراءات مقترنة في حقيقيات النوى.

إذا كان لديك مرجع الجينوم والقراءات المعينة

مثال مع قراءات مقترنة في حقيقيات النوى.

إذا كان لديك مرجع الجينوم والشروح والقراءات المعينة

مثال مع قراءات مقترنة في حقيقيات النوى.

إذا كان لديك تسلسلات نصية فقط

/! لم يتم تنفيذه بعد (استخدم وضع الجينوم بدلاً من ذلك يجب أن يعمل على أي حال) مثال مع قراءات مقترنة في حقيقيات النوى.

إذا كان لديك تسلسلات نصية وتعليقات توضيحية

/! لم يتم تنفيذه بعد (استخدم وضع الجينوم بدلاً من ذلك يجب أن يعمل على أي حال) مثال مع قراءات مقترنة في حقيقيات النوى. (يجب أن يكون التعليق التوضيحي هو التعليق التوضيحي داخل trascriptome وليس الجينوم)

تقرأ نهاية مقترنة ومرجع بقراءات فرعية محددة. الإخراج موجه إلى الدليل الموجود.

يقرأ طرف واحد وجينوم بدائيات النوى

سيقوم GUESSmyLT بطباعة النتيجة في سطر الأوامر وكذلك كتابتها في ملف:

يتم حفظ النتائج من الخطوات الوسيطة ، مثل رسم الخرائط من Bowtie2 أو التعليق التوضيحي من BUSCO بتنسيق

معامل مدخل وصف
- خيوط ملف (ملفات) fastq المسار (المسارات) الكاملة إلى ملف (ملفات) RNA-Seq قراءة. يمكن ضغطها أو فك ضغطها. الطلب ليس مهما. يمكنه التعامل مع ملفين مقروئين نهائيين ، ملف قراءة معشق وملف قراءة فردي.
- الكائن الحي euk أو pro حقيقيات النوى أو بدائيات النوى (euk / pro) هو خيار مطلوب من أجل شرح BUSCO.
معامل مدخل وصف
--عينة فرعية عدد زوجي عدد القراءات التي سيتم استخدامها لأخذ عينات فرعية.
--المرجعي ملف .fa المسارات الكاملة للإشارة إلى الجينوم / النسخ لرسم الخرائط تقرأ إلى (ملف النوكليوتيدات فاستا).
--الوضع الجينوم أو النسخ في حالة عدم تقديم تعليق توضيحي ، يخبر البرنامج ما إذا كان يجب اعتبار ملف fasta المرجعي بمثابة جينوم أو نسخة من أجل استخدام BUSCO بشكل صحيح.
--الخيوط عدد صحيح عدد الخيوط المراد استخدامها. (الافتراضي 2)
--ذاكرة عدد جيجا بايت على سبيل المثال: 10 جيجا بايت الحد الأقصى للذاكرة التي يمكن استخدامها بالجيجابايت. (الافتراضي 8G)
--حاشية. ملاحظة ملف gff المسار الكامل لملف التعليقات التوضيحية لتخطي خطوة BUSCO.
- التعيين تم فرز ملف .bam المسار الكامل لملف القراءة المعين لتخطي خطوة Bowtie2.
--انتاج مسار الملف المسار الكامل لملف النتيجة. إذا تركت الملفات ستتم كتابتها إلى دليل العمل.


يستخدم GUESSmyLT Snakemake لبناء خط الأنابيب الذي يحتاجه للتنبؤ بنوع المكتبة. الوسيطات المطلوبة هي كائن حي (euk / pro) وتقرأ (اقرأ الملف (الملفات) بتنسيق fastq). المرجع (الجينوم أو النسخ بتنسيق .fasta) اختياري ، وإذا لم يتم توفيره ، فسيتم تنفيذ Trinity أولاً لإنشاء مجموعة De novo للقراءات. بعد ذلك ، يتم استخدام BUSCO للتعليق. هذه أيضًا خطوة لمراقبة الجودة لأن BUSCO تبحث عن الجينات الأساسية ، التي تسمى BUSCOs ، في المرجع. إذا تعذر العثور عليها ، فهذا يشير إلى أن المرجع ذو جودة سيئة وبالتالي سينتهي خط الأنابيب. إذا تم العثور على BUSCOs ، تستمر العملية مع تعيين القراءات إلى المرجع باستخدام Bowtie2. يتم إجراء التعيين باستخدام خيار غير محدد بحيث يمكن تعيين القراءات على كل من الخيوط وفي كلا الاتجاهين. أخيرًا ، يتم استخدام التعيين والتعليق التوضيحي للاستدلال ، والذي يتم باستخدام برنامج نصي بيثون ويتم إرجاع نوع المكتبة. علاوة على Snakemake ، لدينا نص Python ، GUESSmyLT.py. والغرض منه هو معالجة حجج المستخدم من خلال:

  1. التحقق من صحة الوسائط ، وجود الملفات وصحتها بالتنسيق الصحيح.
  2. إخبار Snakemake بالملفات الموجودة عن طريق تحديث ملف التكوين.
  3. تنفيذ الأفعى.

تتولى العينة الفرعية Snakefile تحضير ملفات القراءة:

  1. يتم قراءة العينات الفرعية في ملفات القراءة الجديدة المستخدمة في التحليل. هذا يجعل GUESSmyLT أسرع ويحمي الملفات الأصلية من التعديل.
  2. تعديل الملفات: أ. تقوم التغييرات بقراءة الملفات ذات التنسيق الخاطئ. يمكن لـ Trinity و Pysam التعامل مع تنسيق Illumina القديم فقط: @ read_ID / pair # ، حيث يكون الزوج # 1 أو 2. لا يعملان مع المسافات البيضاء ، أو علامات الترقيم ، أو عدم الترقيم. لذلك ، يتأكد البرنامج النصي من تحويل الرؤوس إلى التنسيق الصحيح. ب. إزالة الملفات المقترنة بنهاية القراءة إذا كانت مشذرة.

نظرة عامة على أنواع المكتبات المختلفة:

عدة وصف يقترن تقطعت ستراند حسب مرنا ستراند حسب الخصلة الأولى
مجموعة TruSeq RNA عينة الإعدادية نعم لا الاب unstranded
بروتوكول SMARTer ultralow RNA نعم لا الاب unstranded
جميع طرق dUTP ، NSR ، NNSR نعم نعم الترددات اللاسلكية الاب اولستراند
TruSeq الذين تقطعت بهم السبل مجموع RNA عينة الإعدادية كيت نعم نعم الترددات اللاسلكية الاب اولستراند
TruSeq الذين تقطعت بهم السبل مجموعة عينات مرنا الإعدادية نعم نعم الترددات اللاسلكية الاب اولستراند
NEB Ultra Directional RNA Library Prep Kit. مجموعة أدوات إعداد مكتبة الحمض النووي الريبي الفائق الاتجاه نعم نعم الترددات اللاسلكية الاب اولستراند
Agilent متأكد من تحديد حبلا محدد نعم نعم الترددات اللاسلكية الاب اولستراند
Illumina الاتجاهي (ربط) نعم نعم FR الاب ثانيستراند
معيار SOLiD نعم نعم FR الاب ثانيستراند
مجموعة أدوات إعداد مكتبة ScriptSeq v2 RNA-Seq نعم نعم FR الاب ثانيستراند
SMARTer مجموع الذين تقطعت بهم السبل RNA نعم نعم FR الاب ثانيستراند
Encore Complete RNA-Seq Library Systems نعم نعم FR الاب ثانيستراند
نوجين سولو نعم نعم FR الاب ثانيستراند
نص إلومينا نعم نعم FR الاب ثانيستراند
بروتوكول SOLiD الزوج المتزاوج وما يليها

- يتم إنتاج الاتجاه rf باستخدام بروتوكول Illumina الزوجي المتزاوج؟

  1. يشكو من كسر أنبوب gzip عند الاختزال مع ملفات مضغوطة (ولكنه يعمل على أي حال).
  2. تفقد BUSCO أحيانًا مسار التكوين. الإصلاح يدويًا في الجهاز:
  1. قد لا تجد BUSCO أي جينات أساسية. الإصلاح باستخدام المزيد من القراءات أو بتوفير المرجع.
  2. تم تخطي التخطيط أو التعليق التوضيحي أو التجميع أو خط الأنابيب بأكمله. هذا على الأرجح بسبب حقيقة أن Snakemake يتحقق من ملفات الإخراج التي يجب إنشاؤها ومن هناك يقوم فقط بتنفيذ الخطوات الضرورية لخط الأنابيب. والنتيجة هي أن لديك بالفعل ملف .bam ، أو مجلد إخراج BUSCO / Trinity أو ملف .txt نتيجة للقراءات ، سيتخطى Snakemake الخطوات
  3. يمنحك تثبيت Trinity لنظام التشغيل mac عبر Conda إصدارًا من 2011 لا يعمل. قم بالتثبيت باستخدام Homebrew بدلاً من ذلك.

إذا كنت تستخدم GUESSmyLT في عملك ، فيرجى الاستشهاد بنا:

بيرنر ويك إي * ، 1 ، أولين هـ. * ، 1 ، فيجتون هوغي سي * ، 1 ، ليزا كلاسون 1 ، جاك ديانات 2،3

* ساهم هؤلاء المؤلفين بالتساوي على هذا العمل.
1 التطور الجزيئي ، قسم الخلية والبيولوجيا الجزيئية ، جامعة أوبسالا ، 75124 السويد.
2 National Bioinformatics Infrastructure Sweden (NBIS) ، SciLifeLab ، Uppsala Biomedicinska Centrum (BMC) ، Husargatan 3 ، S-751 23 Uppsala ، السويد.
3 IMBIM - قسم الكيمياء الحيوية الطبية وعلم الأحياء الدقيقة ، صندوق 582 ، S-751 23 أوبسالا ، السويد.


تسلسل الحمض النووي الريبي

بالمقارنة مع المصفوفات الدقيقة ، تسلسل الحمض النووي الريبي (أو RNA-seq للاختصار) يمكّنك من النظر إلى التعبيرات التفاضلية في نطاق ديناميكي أوسع بكثير ، لفحص الاختلافات في الحمض النووي (SNPs ، والإدخال ، والحذف) وحتى اكتشاف جينات جديدة أو أشكال لصق بديلة باستخدام مجموعة بيانات واحدة فقط. ضع في اعتبارك أن RNA-seq لا يزال أغلى من المصفوفات الدقيقة ويمثل تحديًا أكبر في مرحلة التخطيط بالرغم من ذلك.

أولاً ، سيتعين عليك تحديد التكنولوجيا التي ستستخدمها (Illumina ، Solid ، IonTorrent ، PacBio ، إلخ & # 8211 أو مزيج من هذه) ، ما هو نوع إعداد المكتبة الذي تريده (خاص بحبال أم لا ، رمز شريطي أم لا ، تضخيمه بواسطة PCR أم لا ، قم بإزالة الرنا الريباسي أو استخدم خرز oligoT) ونوع التسلسل الذي تريده (طول القراءة ، نهاية فردية أو مقترنة). ولا يتوقف الأمر عند هذا الحد - عليك أن تقرر عدد القراءات التي تريد ترتيبها في تسلسل. هل تغطية النسخ 100x كافية؟ قد لا يكون الأمر كذلك إذا كنت ترغب في تحليل الجينات المعبر عنها بشكل ضعيف.

عندما تحصل على البيانات أخيرًا ، سيتعين عليك تحديد كيفية تحليلها - هناك بالفعل بعض الممارسات الجيدة المتاحة (بروتوكول Tuxedo لـ RNA-seq و GATK لاستدعاء SNP) ، ولكن نظرًا لأن ما يسمى بـ "المعمل الرطب" تقدم بسرعة سرعان ما تصبح خطوط الأنابيب قديمة أو بطيئة أو لا تعمل بعد الآن.

هل تريد إجراء المعلوماتية الحيوية RNA-seq بنفسك ولا تريد دفع كومة من المال لمجموعات البرامج مثل CLC Genomics؟ ثم استعد لتوديع واجهات رسومية لطيفة. كل البرامج والنصوص المستندة إلى Linux تأتي بلغات برمجة مختلفة ، وتنسيقات ملفات متنوعة تتطلب أكثر من أداة واحدة لفهمها لتحليل كامل. حتى عندما يكون كل ما ترغب في الحصول عليه عبارة عن تغييرات قابلة للطي من تسلسل RNA واحد ، فسيتعين عليك الاختيار من بين العديد من خيارات البرامج التي يدعي كل منها الأداء الأفضل لكل خطوة من الخطوات الخمس القياسية (اقتطاع المحول ، التصفية ، المحاذاة / التعيين والعد والتطبيع والتحليل الإحصائي) - راجع قائمة برامج محاذاة القراءة القصيرة. بناءً على القرارات التي تتخذها ، تتغير الطية وسيختلف عدد جينات DE وفقًا لذلك.

يؤدي تعيين خبير في المعلومات البيولوجية أو الإحصائي إلى زيادة التكاليف بالإضافة إلى نفقات إعداد المكتبة وتسلسلها. ضع في اعتبارك أيضًا أن الملفات التي تحصل عليها من أجهزة التسلسل ضخمة (عدد قليل من الجيجابايت لكل عينة) ، لذا تأكد من التحقق مما إذا كنت بحاجة إلى مساحة أكبر وقوة حاسوبية.

RNA-seq منطقي إذا كنت تريد ذلك العثور على جينات DE في جينوم ضخم غير متسلسل. إذا كنت تعمل مع جينومات صغيرة مثل البكتيريا على سبيل المثال ، فقم بتسلسل جينومها أولاً! يعني عدم وجود جينوم مرجعي أنه سيتعين عليك تجميع نسخة "de-novo" ، والتي ستحتاج من أجلها إلى الكثير من ذاكرة الوصول العشوائي وبعض القوة الحاسوبية الجادة إذا كنت لا ترغب في الانتظار لفترة طويلة.

مرة أخرى ، سيكون لديك ما لا يقل عن 5 من "أفضل البرامج" أو خطوط الأنابيب للقيام بذلك. هذا يعني أنه يمكنك الحصول على عدة إصدارات من مجموعة النسخ التي يتعين عليك من خلالها اختيار أفضل مرجع. توجد بالفعل بعض الإرشادات لتقييم جودة تجميع النسخ ، ولكنها قد لا تنطبق على جميع الكائنات الحية ومجموعات البيانات ، لذا كن حذرًا. تكمن المشكلة في أنه لا توجد معلمة تضمن حقًا تجميع النصوص التي تهتم بها بشكل صحيح. للتفسير الصحيح لنتائج RNA-seq ، تفتقر تجميعات النسخ إلى الثقة التي تحصل عليها من خلال تسلسل مرجعي جيد الجودة. على الرغم من أن RNA-seq هي أداة لا تقدر بثمن لدراسة التعبير الجيني والتنوع ، تأكد من تخطيط تجاربك بعناية وتقدير التكاليف قبل الغوص فيها.

هل هناك إجابة غير متوقعة للمقايسة التي يجب أن تختارها لتجربة التعبير الجيني التالية؟

على الأرجح لا. ولكن هناك بعض الأسئلة البسيطة التي يمكنك الإجابة عليها والتي ستساعد في توجيهك في الاتجاه الصحيح ، مثل "كم عدد الجينات التي أقوم بتحليلها؟" أو "ما هي ميزانية تجربتي؟" او حتى "هل أنا مدرب بشكل صحيح لإجراء هذا الفحص؟" أجب على أكبر عدد من هذه الأسئلة وارجع إلى هذا الدليل لتجد اختيارك المثالي!


المواد والأساليب

عينة الحمض النووي الريبي وإعداد مكتبة التسلسل

المطثية الحرارية تمت زراعة ATCC27405 على وسط MTC في التخمير الدفعي وتم قياس مستويات النسخ الخاصة به مسبقًا باستخدام ميكروأري لتعبير الحمض النووي (19). في تلك الدراسة ، تعرضت تخمرات المعالجة لصدمة إيثانول 3.9 جم / لتر (أو 0.5٪ [حجم / حجم]) في مرحلة نمو أسي متوسطة (كثافة بصرية 600نانومتر ∼0.5) بينما تم إجراء تخمير التحكم بدون معالجة بالإيثانول. لاشتقاق TUs المشفرة بتنسيق C. الحرارية ATCC27405 ، تم تحضير مكتبات Illumina ssRNA-seq من إجمالي الحمض النووي الريبي المستخرج من عينة تخمير تحكم غير معالجة لمدة 60 دقيقة وعينة صدمة إيثانول واحدة مدتها 60 دقيقة تم الحصول عليها من الدراسة أعلاه (19).

تم إعداد مكتبات ssRNA-seq الخاصة بنا وفقًا لدليل التعليمات المقدم من الشركة المصنعة (Illumina ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، باستثناء أنه تم حذف خطوة اختيار poly-A. باختصار ، تم تجزئة 300 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي لمكتبات تسلسل الحمض النووي الريبي الاتجاهية بعد تنقية وإضافة محولات خاصة بالضفيرة. تم بعد ذلك نسخ العينات وتضخيمها وإثراء شظايا الحمض النووي بخطوة تنظيف نهائية وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة (Illumina). تم تطبيع المكتبات باستخدام نوكلياز محدد على الوجهين (إيفروجين ، موسكو ، روسيا) باتباع التعليمات الواردة في مذكرة تطبيق تطبيع DSN (Illumina). تم فحص المكتبات النهائية لمراقبة الجودة باستخدام Agilent Bioanalyzer (Agilent ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم قياسها باستخدام Qubit (Invitrogen ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم بعد ذلك تخفيف المكتبات وتم إجراء التسلسل على خلية تدفق قراءة مفردة الإصدار 1.5 باستخدام كيمياء TruSeq على أداة Illumina HiSeq 2000 (20).

تم الحصول على أربع مجموعات بيانات ssRNA-seq من التخفيف من مكتبة التحكم 25 pM المستخرجة من عينة التحكم والتخفيفات من 25 و 33 و 41 pM من مكتبة العلاج المستخرجة من عينة العلاج. تم تصميم التركيزات الثلاثة لنفس مكتبة العلاج لاستكشاف كيفية تأثير التركيزات وأعماق التسلسل على تحديد TU. تم الحصول على أربع مجموعات بيانات ، تسمى مجموعات البيانات 1-4 واستخدامها في توقع TU الخاص بنا. تم إيداع جميع التسلسلات التي تم إنشاؤها في أرشيف قراءة تسلسل المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI) (SRA) برقم الانضمام SRP002548.

بالإضافة إلى بيانات ssRNA-seq الموضحة أعلاه ، تم أيضًا إنشاء مجموعات بيانات RNA-seq غير الخاصة بالشريط على العينات الأربع المذكورة أعلاه في نقاط زمنية متعددة باستخدام أداة 454 GS FLX (Roche ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، والتي أنتجت قراءات باستخدام أطوال أطول ، أي 225 نقطة أساس لمتوسط ​​الطول مقابل 50 نقطة أساس بواسطة أجهزة التسلسل من Illumina. تم إنشاء مكتبات 454 (كدنا) من إجمالي الحمض النووي الريبي باتباع إرشادات الشركة المصنعة ، باستثناء أنه لم يتم تطبيق خطوة إزالة الشظية الصغيرة ثم تم ترتيب المكتبات باستخدام كيمياء التيتانيوم (21). تم تنظيف مجموعات البيانات البالغ عددها 454 باستخدام SeqClean متبوعة برسم الخرائط باستخدام برنامج GSMapper (Roche). تم الجمع بين مجموعات البيانات البالغ عددها 454 التي تم جمعها على التكرارات البيولوجية.

فحص جودة وخصائص بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي

بيانات RNA-seq الخاصة بـ بكتريا قولونية

ثلاثة بكتريا قولونية تم استرجاع مجموعات بيانات RNA-seq ، التي تم إنشاؤها باستخدام قراءات Illumina ذات النهاية المزدوجة والمتخصصة ، من قاعدة بيانات NCBI SRA ، بأرقام انضمام SRA: SRX315217 و SRX315218 و SRX315219 ، وتستخدم لاختبار عمومية طريقة التنبؤ TU الخاصة بنا. تم جمع بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي الثلاثة على ثلاث نسخ من النوع البري الإشريكية القولونية K12 MG1655 التي نمت بشكل لاهوائي في وسائط الحد الأدنى من الجلوكوز (23). تم تعيين بيانات RNA-seq التي تم إنشاؤها على الجينوم كقراءات أحادية الطرف ونهاية مقترنة ، على التوالي ، باستخدام BWA مع المعلمات الافتراضية. تم استخدام نتائج رسم الخرائط أحادية الطرف لتقدير تغطية القراءة على مستوى النيوكليوتيدات ، واستخدمت نتائج رسم الخرائط ذات النهاية المزدوجة لتحديد المناطق الجينية المعبر عنها والتنبؤ بـ TUs ، حيث تشير المناطق الجينية المعبر عنها إلى المناطق غير المشفرة المعبر عنها بشكل مشترك مع جيناتها المرافقة. يبلغ متوسط ​​أطوال قراءات النهاية المزدوجة المعينة بما في ذلك المنطقة الجينومية بين كل طرف مزدوج 176 و 160 و 174 نقطة أساس لمجموعات البيانات الثلاث.

إعداد بيانات التدريب لتنبؤ TU

تتنبأ متنبئات TU الخاصة بنا بما إذا كان زوج الجينات المتتالي على نفس الشريط قد تم نسخه بشكل مشترك إلى TU واحد. ستكون بيانات التدريب المثالية هي بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي لـ TUs التي تم التحقق منها تجريبياً. ومع ذلك ، لا توجد حاليًا بيانات تجريبية كبيرة بما يكفي لتدريب تنبؤات TU. ومن ثم اتخذنا نهجًا بديلاً لإعداد بيانات التدريب. على وجه التحديد ، بالنسبة لبيانات التدريب السلبية ، اخترنا أزواجًا متتالية من الجينات التي تعتبر ليست في نفس TU بناءً على المعايير التالية: (1) نسبة الفجوة من المنطقة الجينية بين الجينين هي & gt50٪ و (ii) النسبة بين مستويات التعبير للجينين هي & gt10 أضعاف. بالنسبة لبيانات التدريب الإيجابية ، استخدمنا 454 قراءة ، والتي تحتوي على قراءات أطول من تلك التي كتبها متسلسلات Illumina ، للتعليق على أزواج الجينات المتتالية ليتم نسخها معًا في نفس TU بناءً على المعايير التالية: (1) المنطقة الجينية بين يتم تغطية زوج الجينات بالكامل بواسطة 454 قراءة واحدة على الأقل و (2) تكون النسبة بين مستويات التعبير للجينين أقل من وتساوي ضعفين. على الرغم من أن 454 قراءة قدمت بعض بيانات التدريب الإيجابية ، إلا أنها كانت تعاني من قيود في تغطية TUs التي تكون مناطقها بين الجينات & gt225 bps. لجعل بيانات التدريب الإيجابية الخاصة بنا تغطي طوس مع مناطق أطول بين الجينات ، أضفنا بيانات تدريب إيجابية إضافية ، كما هو موضح في القسم التالي.

توليد طوس مبني (cTUs)

قمنا ببناء مجموعة من مناطق الترميز المزدوجة المتتالية التي تشبه أنماط التعبير الخاصة بها إلى جانب تلك الموجودة في المناطق البينية أنماط التعبير الخاصة بـ TUs الحقيقية ، لتوفير بيانات تدريب إضافية. يُطلق على كل منطقة تشفير مقترنة ، جنبًا إلى جنب مع المنطقة البينية بين الجينات ، اسم TU (cTU) المركب. نحن نفترض هنا أن جميع جزيئات الحمض النووي الريبي المعيبة بسبب الإطلاق المبكر لبوليميرات الحمض النووي الريبي من الحمض النووي أو الاقتطاع سوف تتحلل بسرعة بواسطة الريبونوكلياز (24) وبالتالي لن تساهم في مستويات التعبير المرصودة. لذلك ، يجب أن يكون لـ TU المعبر عنه نظريًا مستوى تعبير ثابت عبر جزيء RNA كامل (10). ومع ذلك ، نظرًا لأسباب فنية ، قد لا تُظهر بيانات RNA-seq التي تم الحصول عليها بالضرورة مثل هذا الاتساق على مستوى التعبير عبر TU بأكمله ، مما يؤدي إلى تقلبات في المستوى المرصود عبر TU.

لبناء cTUs ، استخدمنا جينات C. الحرارية، التي تنقسم مناطق الترميز الخاصة بها بشكل طبيعي إلى ثلاثة أقسام ، وتشبه تلك الخاصة بـ TUs الحقيقية كما هو محدد في القسم السابق. لتحقيق ذلك ، قمنا برسم توزيع طول المناطق الجينية المشروحة لـ C. الحرارية. بعد ذلك ، بالنسبة لكل جين ، اخترنا على الأرجح طولًا لكل منطقة جينية مكونة وفقًا لتوزيع الطول هذا. بعد ذلك ، قمنا بتعيين المنطقة الجينية المركبة داخل الجين الذي يمتد لمنطقة ذات محتوى منخفض من GC ، مع العلم أن المناطق الجينية الحقيقية تميل إلى الحصول على نسب GC أقل (0.33) من مناطق ترميز البروتين (نسبة GC = 0.4) في C. الحرارية الجينوم. يتم إعطاء عملية إنشاء مناطق بين الجينات المركبة على النحو التالي.

دلالة على الكل C. الحرارية الجينوم (NC_009012.1) مثل جي، والتي يبلغ طولها 3268 038 نقطة أساس وتحتوي على 1683 و 1680 جينًا على السلاسل الأمامية والخلفية ، ممثلة على أنها جي + و جي - ، على التوالي ، حيث | $ G ^ + = ^ + > $ | و | $ G ^ - = ^ - > $ | ⁠ والمناطق الجينية المقابلة ممثلة | $ IR ^ + = ^ + > $ | و | $ IR ^ - = ^ - > $ | ⁠. نستخدم الخيط الأمامي كمثال لشرح كيفية إنشاء المناطق الجينية المركبة. نفس الإجراء ينطبق على الشريط العكسي.

الخطوة 1: حدد د(IR +) كدالة كثافة لـ | $ frac << | ir_i ^ + | >> << | ir_i ^ + | + | g_i ^ + | + | ز_^ + | >> $ | القيم وتحديد بالمثل د(جي دي +) كدالة كثافة لـ | $ frac << || g_i ^ + | - | g_^ + || >> << | ir_i ^ + | + | g_i ^ + | + | ز_^ + | >> $ | القيم ، لجميع أزواج الجينات المتتالية (25) بوصة جي + بدون جينات على الشريط المقابل بينهما.

الخطوة 2: لكل جين | $ g_i ^ + في G ^ + $ | ⁠ ، قم بما يلي لإنشاء cTU من خلال التقسيم | $ g_i ^ + $ | إلى ثلاث مناطق ، وهي منطقتا ترميز ومنطقة جينية مركبة (cIR):

الخطوة 2.1: حدد احتمالية صأنا و فأنا من عند د(IR +) و د(جي دي +) ، على التوالي ، وفقًا لتوزيعات كثافتها. قم بتعيين cIR في | $ g_i ^ + $ | إلى | $ p_i times | g_i ^ + | $ | ⁠.

ثم نستبعد تلك التي تم توقعها cTU التي تنتهك متطلبات الاستمرارية والتباين لـ TU ، والتي هي الاستمرارية والتباين. لكل وحدة cTU متوقعة ، نقوم بإزالتها من مزيد من الدراسة إذا كانت (1) نسبة الفجوة في المنطقة الجينية بين الجينين هي & gt50٪ (ii) النسبة بين مستويات التعبير للجينين هي & gt10 أضعاف و (iii) بالإضافة إلى أن طول كل منطقة جينية متوقعة لا يقل طولها عن 225 نقطة أساس.

اختيار ميزة لتنبؤات TU

استخدمنا ميزتين مستخلصتين من أنماط التعبير الجيني ، وهما مستوى التعبير "الاستمرارية" و "التباين" ، اقترحهما غويل في الأصل وآخرون. (26) وطليطلة أرانا وآخرون. (27) ، وكلاهما استخدم ميزة تباين مماثلة للكشف عن TUs من بيانات تعبير RNA التي تم إنشاؤها باستخدام صفائف التبليط وتوقع 139 و 517 عامل متعدد الكتل في الميكوبلازما الرئوية و الليسترية المستوحدة، على التوالى. بالإضافة إلى ذلك ، أوليفر وآخرون. استخدم أيضًا التعبيرات المستمرة عبر المناطق الجينية لاكتشاف 355 عاملًا في L. monocytogenes استنادًا إلى بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي غير الخيطية (14).

بالنسبة لميزة "الاستمرارية" ، استخدمنا الإحصائيات التالية لتقييم فجوة التعبير في منطقة جينية في cTU مرشح: عدد النيوكليوتيدات مع RAPSN = 0 في المنطقة والنسبة المئوية من طول المنطقة. بالنسبة إلى فرق الميزة ، استخدمنا الإحصائيات التالية لوصف التباين في أنماط التعبير عبر منطقتي الترميز التركيبي المتتاليين في كل cTU مرشح: (1) أضعاف التغيير في مستويات التعبير بين الجينات المتتالية والمنطقة بين الجينات بين و (2) تباين مستويات التعبير عبر منطقة cTU المرشحة بأكملها. تم تحديد عمليات القطع لهذه الميزات لتقديم أفضل نتائج التحقق من الصحة.


الاستنتاجات

في هذا العمل ، نقوم بتطوير طرق تسلسل من الجيل التالي غير محددة بـ polyA خاصة بحبال وحساسة لمحتوى AT المتطرف لـ المتصورة المنجلية. ثم نطبق هذه الطرق على التجميع على مستوى النسخ وتوصيف المتصورة المنجلية بين الجينات lncRNA وخصائص الحمض النووي الريبي المضادة المعنى. تدعم نتائجنا القدرة التنظيمية المحفوظة للعناصر غير المشفرة في المتصورة المنجلية، مع نصوص مختلفة توضح التوقيعات التنظيمية المتميزة ، مثل التعبير الخاص بالمرحلة ، والإطلاق السريع ، وزعزعة الاستقرار السريع ، والتداخل النسخي ، والتعميم. بالإضافة إلى كتالوج نسخ lncRNA عالي التنظيم ، نقدم التحقق الهيكلي من ثلاثة lncRNAs استثنائية متعددة exonic وستة دوائر. اقترن هذا العمل بالتطورات الأخيرة في المتصورة المنجلية سيسهل تحرير الجينوم إلى حد كبير مزيدًا من الأفكار حول وظيفة هذه lncRNAs في المتصورة المنجلية [99, 100].


خيارات الوصول

احصل على حق الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

جميع الأسعار أسعار صافي.
سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

جميع الأسعار أسعار صافي.


Hisat2: أي خيار يجب أن يذكر لقراءة مكتبة محددة حبلا

كنت أحاول hisat2 وأصبحت في حيرة من أمري من خيارات حبلا. لقد تم طرح السؤال بالفعل على github هنا ولكن لم يتم الحصول على أي إجابة مرضية. أنا مندهش من مقدار هذه المعلومات الخيطية التي يمكن أن تكون مربكة في أدوات مختلفة.

بالنظر إلى دليل hisat2 ، أشعر بالارتباك بسبب الخيارين المختلفين:

حدد المعلومات الخاصة بالخيوط: الافتراضي هو غير محدد. بالنسبة للقراءات أحادية النهاية ، استخدم F أو R. تعني "F" القراءة التي تتوافق مع نص. تعني "R" أن القراءة تقابل النظير التكميلي العكسي للنسخة. للقراءات ذات النهاية المزدوجة ، استخدم إما FR أو RF. مع استخدام هذا الخيار ، ستحتوي كل محاذاة قراءة على علامة سمة XS: تعني "+" أن القراءة تنتمي إلى نسخة على شريط الجينوم "+". "-" تعني أن القراءة تنتمي إلى نسخة من "-" خيط الجينوم.

اتجاهات رفيعة المنبع / المصب لمحاذاة نهائية زوجية صالحة مقابل حبلا المرجع الأمامي. على سبيل المثال ، إذا تم تحديد --fr وكان هناك محاذاة نهائية مقترنة مرشحة حيث يظهر زميل 1 في اتجاه المنبع للمكمل العكسي لـ mate 2 وتم استيفاء قيود طول الجزء (-I و -X) ، تكون هذه المحاذاة صالحة. أيضًا ، إذا ظهر mate 2 في بداية المنبع من التكملة العكسية للرفيق 1 وتم استيفاء جميع القيود الأخرى ، فهذا أيضًا صالح. - rf بالمثل يتطلب أن يكون التكملة العكسية لميت 1 في المنبع وأن يكون زميل المصب 2 موجهًا للأمام. --ff يتطلب كلاً من رفيق المنبع 1 وزميل المصب 2 ليكونا موجهين للأمام. الافتراضي: --fr (مناسب لمقايسة التسلسل المزدوج الطرف من Illumina).

يجب أن كلاهما بحاجة إلى التحديد؟ هل هم زائدة عن الحاجة؟ لم أجد الكثير من الأشخاص الذين يعانون من ذلك ، لذا أعتقد أن هناك شيئًا واضحًا لم أفهمه. آمل أن ينورني أحد حول ذلك!


تحليل GRO-Seq: تحديد نسخة de novo

للعثور على النصوص مباشرة من GRO-Seq ، استخدم الأمر findPeaks:

findPeaks & lttag directory & gt -style groseq -o auto

أي findPeaks Macrophage-GroSeq -style groseq -o auto

الفكرة الأساسية وراء تحديد نسخة GRO-Seq

العثور على النصوص باستخدام بيانات GRO-Seq الخاصة بالسلاسل ليس بالأمر السهل. يقيس GRO-Seq إنتاج الحمض النووي الريبي الناشئ ، وهو قادر على الكشف عن نصوص ترميز البروتين ، والنصوص المضادة للحس المعزز ، والنصوص المعززة المعززة ، والنصوص الوظيفية الطويلة والقصيرة غير المشفرة و miRNA ، ونصوص Pol III و Pol I ، وأي شيء آخر يتم نسخه في نواة الخلية. يعد تحديد هذه النصوص وتحديدها كميًا أمرًا مهمًا لتحليل المصب. تركز أدوات RNA-Seq التقليدية بشكل أساسي على mRNA ، والتي لها ميزات مختلفة عن GRO-Seq ، وهي غير مفيدة بشكل عام لتحديد نسخ GRO-Seq.

Important NOTE : Just as with ChIP-Seq, not all GRO-Seq data was created equally. Data created by different labs can have features that make it difficult to have an single analysis technique that works perfectly for each one. As such, there are many parameters to play with the help get the desired results.

A large number of assumptions go into the analysis. In a nutshell, findPeaks tracks along each strand of each chromosome, searching for regions of continous GRO-Seq signal. Once it encounters high numbers of GRO-Seq reads, it starts a transcript. If the signal decreases significantly or disappears, the putative transcript is stopped. If the signal increases significantly (and sustainably), then a new transcript is considered from that point on. If the signal spikes, but overall does not increase over a large distance, it is considered an artifact or pause site and not considered in the analysis. Below is a chart that helps explain how the transcript detection works:


By default, new transcripts are created when the tssFold exceeds 4 and bodyFold exceed 3 (" -tssFold <#> ", " -bodyFold <#> "). A small pseudo-count is added to the tag count from region a above to avoid dividing by zero and helps serve to set a minimum threshold for transcript detection ( "-pseudoCount <#>" , default: 1). Most transcripts show robust signal at the start of the transcript, and the tssFold helps select for these regions with high accuracy. The bodyFold is important for distinguishing between "spikes" in signal and real start sites if a transcript is real, it's likely that increased levels of transcription follow behind the putative TSS. If the signal is roughly equal before and after the putative TSS, it is more likely to be an artifact.

To increase senstivity, HOMER tries to adjust the size of the bodySize parameter above since it essentially defines the resolution of the detected transcript. If there are a large number of GRO-Seq tags in a region, the bodySize can be small since there is adequate data to estimate the location of the transcript. However, if the data is relatively sparse, the bodySize needs to be large to get a reliable estimate of the level of the transcript. The minimum and maximum bodySizes are 600 and 10000 bp (" -minBodySize <#> ", " -maxBodySize <#> "). HOMER uses the smallest bodySize that contains at least x number of tags, where x is determined as the number of tags where the chance of detecting a bodyFold change is less than 0.00001 assuming the read depth varies according to the poisson distribution (adjustable with " -confPvalue <#> ", or directly with " -minReadDepth <#> "). The basic idea is that the threshold for tag counts must be high enough that we don't expect it to vary too much by chance.

Using uniquely mappable regions to improve results

Since some transcripts cover very large regions, there are many places where genomic repeats interrupt the GRO-Seq signal of continous transcripts. To help deal with this problem, HOMER can take advantage of mappability information to help estimate transcript levels where uniquely mapping sequencing reads is not possible. In general this information is not really that helpful for ChIP-Seq analysis, but in this case it can make an important difference. For now, HOMER only take specially formatted binary files available below. To use them, download the appropriate version and unzip the archive:

To use the uniq-map information, specify the location of the unzipped directory on the command line with " -uniqmap <directory> ":

The uniqmap files above were generated assuming a 50nt read length. In reality, this will work reasonably well over a range of different nucleotide lengths.

  1. Place the genome FASTA files for the genome of interest in a directory. There MUST be only one entry per file (i.e. chr1.fa, chr2.fa, chr3.fa). Unfortunately, the programs will not accept a single FASTA file will all of the chromosomes.
  2. Next, run the getMappableRegions command. This will eat up a ton of memory, which can be scaled by adjusting the first argument which sets the number of sequences that are analyzed in parallel. The program takes a while on mammalian genomes (

GRO-Seq analysis output

Running findPeaks in groseq mode will produce a file much like the one produced for traditional peak finding, complete with a header section listing the parameters and statistics from the analysis. HOMER can also produce a GTF (gene transfer format) file for use with various programs. If " -o auto " is used to specify output, a "transcripts.gtf" file will be created in the tag directory. Otherwise, you can specify the name of the GTF output file by use " -gtf <filename> ". The GTF file can also be easily uploaded to the UCSC Genome Browser to visualize your transcripts.


The GRO-Seq transcript detection works pretty well, but is likely to get some face-lifts in the near future.


Integrated supplementary information

Supplementary Figure 1. Sequences captured by DRIPc-seq show no correlation with S9.6 intrinsic binding preferences.

6-mers found to be poorly or tightly bound by S9.6 were curated from Konig وآخرون. (2017) and grouped as low and high binding. We evaluated each 6-mer frequency in the R-loop forming sequence space identified by DRIPc-seq (Sanz وآخرون., 2016), resulting in observed frequencies. As a comparison, we retrieved non-R-loop forming genic regions derived from loci that were matched for expression, length and location and measured6-mer frequencies over this control set. For each R-loop peak, 25 random, matched peaks were extracted and the average frequency determined for each 6-mer. This resulted in expected frequencies. أ. The graph shows the log2 fold ratio of observed (R-loop forming) over expected (matched non-R-loop forming) frequencies for each 6-mer.Some 6-mers are clearly more or less represented than others in DRIPc-seq data compared to expectations from control non-R-loop loci. This could reflect the intrinsic sequence preference of R-loop formation and/or the intrinsic preference of S9.6 antibody. If the latter is true, we expected S9.6-highly bound epitopes (red) to be over-represented and S9.6-poorly bound epitopes (blue) to be under-represented. This was not observed, however. Instead, S9.6 tightly or poorly bound 6-mers were equally likely to be under- or over-represented. This suggests that DRIPc-seq data does not suffer from systematic biases caused by S9.6 sequence preference. ب. To account for what could be driving the over- or under-representation of certain 6-mers, we simply calculated the GA content of the motifs. As shown, depleted motifs tend to be GA-poor (CT-rich), while enriched motifs tend to be GA-rich irrespective of whether they are tightly or poorly bound by S9.6 (the dashed grey line represents 50% GA content). Given that GA-rich regions are favorable for R-loop formation, the observed trends are most likely to reflect the intrinsic sequence biases underlying R-loop formation, not S9.6 binding. Similar results were observed when 8-mers were considered.

Supplementary Figure 2 Genomic DNA digestion profiles.

DNA digestion profiles after Step 10 were visualized after agarose gel electrophoresis through a 0.8% agarose gel run in 1x TAE buffer. DNA was extracted from human NTERA-2 cells and digested with restriction enzyme cocktail indicated in Step 10. Lanes 1 and 2 show an example of incomplete digestion, as evidenced by the high molecular weight bands above 20 kilobases. Lanes 3 and 4 show an example of fully digested DNA as judged from the disappearance of the top band. The leftmost lane (M) corresponds to a1kb plus GeneRuler ladder from Thermo Fisher.


شاهد الفيديو: جزيء hnRNA. Cap u0026 Tail. نسخ الحمض النووي في حقيقيات النواه. الجزء الثاني (قد 2022).


تعليقات:

  1. Reynolds

    في رأيي لم تكن على حق. يمكنني ان ادافع عن هذا المنصب. اكتب لي في PM.

  2. Severin

    أتفق معها تمامًا. فكرة عظيمة ، أوافق.

  3. Tomi

    المزاح جانبا!

  4. Bolaji

    رأي رائع ومضحك للغاية

  5. Manuel

    أنا آسف ، لكن في رأيي ، أنت مخطئ. أقترح مناقشته.



اكتب رسالة