معلومة

لماذا تعتبر الثقافات البكتيرية ضرورية؟

لماذا تعتبر الثقافات البكتيرية ضرورية؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد لاحظت أنه في الكثير من إجراءات اختبار البكتيريا ، يجب زراعة العينة. تضع العينة في أجار أو وسط نمو آخر وتنتظر حتى تكاثر البكتيريا قبل فحصها.

لماذا هذا ضروري؟ إذا كانت البكتيريا موجودة في العينة ، ألا يمكنك فقط فحص العينة مباشرة بالمجهر للعثور عليها؟ هل هي ابرة في مشكلة كومة قش؟

على سبيل المثال ، يبلغ حجم بكتيريا الليستريا حوالي 1 ميكرومتر ولها صبغة جرام إيجابية. لذلك ، عند التكبير 1000x ، سيكون حجم الكائن الحي 1 مم في الهدف المرئي للغاية. حتى عند التكبير بمقدار 100 ضعف ، يجب أن تظل قادرًا على رؤية نقطة صغيرة وأن تكون قادرًا على تكبير النقطة.


باستخدام المجهر فقط ، قد تتمكن من العثور على البكتيريا ، ولكن كيف تعرف أي نوع من البكتيريا؟

مع الأخذ الليستيريا، تحت المجهر ، يبدو وكأنه قضيب صغير. حسنًا ، تفعل الكثير من البكتيريا الأخرى. إذا رأيت تلك البكتيريا فقط ، فلا يمكنك أخذها وإجراء أي اختبارات أخرى معها ، يمكنك فقط رؤيتها.

لذلك نحن نصنع الثقافات ، حيث تتكاثر البكتيريا وتشكل مستعمرات. ما إذا كانت تنمو حتى في ظل هذه الظروف يخبرك بالفعل الكثير - الكثير من الأنواع البكتيرية لن تنمو مستعمرات في نوع المستعمرة هو عامل آخر في تحديد البكتيريا التي ننظر إليها - هل لها حواف غامضة أو واضحة ، ما اللون هل هو "لامع"؟

وبعد ذلك ، باستخدام هذه الثقافة ، يمكن إجراء المزيد من الاختبارات ، مثل المواد الكيميائية التي يمكن أن تتحلل بها البكتيريا في هذه المستعمرة ، وما تنتجه ، وما إذا كان يمكن تلطيخها بأصباغ معينة ، وما إلى ذلك. على حد سواء (دائرية أو قضبان).

ل الليستيريا على وجه التحديد ، هناك لوحات خاصة تستخدم كوسيط نمو تحتوي على مواد كيميائية معينة مضافة تجعل مستعمراتها تبدو بنفسجية حمراء. لن تظهر الأنواع البكتيرية الأخرى هذا اللون حتى لو نمت على الألواح.


لا يمكن الاحتفاظ بخطوط الخلايا والكائنات الدقيقة في المزرعة إلى أجل غير مسمى بسبب الارتفاع التدريجي في المستقلبات السامة ، واستخدام العناصر الغذائية وزيادة عدد الخلايا بسبب النمو. بمجرد استنفاد العناصر الغذائية وزيادة مستويات المنتجات الثانوية السامة ، تدخل البكتيريا الموجودة في الثقافة الليلية إلى مرحلة ثابتة، حيث يتم تقليل أو توقف الانتشار بشكل كبير (ثبات قيمة كثافة الخلية). عندما يتم نقل الكائنات الحية الدقيقة من هذه الثقافة الليلية إلى وسط طازج ، تؤدي العناصر الغذائية إلى نمو الكائنات الحية الدقيقة ويمر من خلال مرحلة التأخر، وهي فترة من النمو البطيء والتكيف مع البيئة الجديدة ، ثم تسجيل المرحلة، وهي فترة تنمو فيها الخلايا أضعافا مضاعفة. [1]

لذلك تُستخدم الزراعة الفرعية لإنتاج مزرعة جديدة ذات كثافة خلايا أقل من الثقافة الأصلية ، ومغذيات طازجة ولا تحتوي على مستقلبات سامة تسمح باستمرار نمو الخلايا دون التعرض لخطر موت الخلايا. الثقافة الفرعية مهمة لكل من التكاثر (على سبيل المثال ، الكائنات الحية الدقيقة مثل بكتريا قولونية) وخلايا غير متكاثرة (مثل خلايا الدم البيضاء المتمايزة نهائياً). يمكن أيضًا استخدام الاستزراع الفرعي في حسابات منحنى النمو (مثل وقت التوليد) [2] والحصول على الكائنات الدقيقة في الطور اللوغاريتمي للتجارب (مثل التحول البكتيري). [3]

عادةً ما تكون الثقافة الفرعية من ثقافة بحجم معين إلى وسط نمو جديد بحجم متساوٍ ، وهذا يسمح بالحفاظ على خط الخلية على المدى الطويل. يتم استخدام الثقافة الفرعية في حجم أكبر من وسط النمو عند الرغبة في زيادة عدد الخلايا ، على سبيل المثال ، للاستخدام في عملية صناعية أو تجربة علمية.

غالبًا ما يكون من المهم تسجيل العدد التقريبي للانقسامات التي كانت للخلايا في المزرعة عن طريق تسجيل عدد المقاطع أو الثقافات الفرعية. في حالة خلايا الأنسجة النباتية ، قد ينشأ التباين الجسدي النسوني على مدى فترات طويلة في المزرعة. وبالمثل في خطوط خلايا الثدييات ، تميل الانحرافات الصبغية إلى الزيادة بمرور الوقت. بالنسبة للكائنات الحية الدقيقة ، هناك ميل للتكيف مع ظروف الاستزراع ، والتي نادرًا ما تكون مثل البيئة الطبيعية للكائنات الحية الدقيقة ، والتي يمكن أن تغير بيولوجيتها.

يعتمد بروتوكول زراعة الخلايا الفرعية بشكل كبير على خصائص الخلايا المعنية.

تحرير الخلايا غير الملتصقة

العديد من أنواع الخلايا ، على وجه الخصوص ، العديد من الكائنات الحية الدقيقة ، تنمو في المحلول ولا تلتصق بالسطح. يمكن زراعة أنواع الخلايا هذه عن طريق أخذ حجم صغير من الثقافة الأم وتخفيفها في وسط نمو جديد. تقاس كثافة الخلايا في هذه الثقافات عادةً بالخلايا لكل مليلتر للخلايا حقيقية النواة الكبيرة ، أو كثافتها الضوئية لضوء 600 نانومتر للخلايا الأصغر مثل البكتيريا. غالبًا ما يكون للخلايا نطاق مفضل من الكثافات لتحقيق النمو الأمثل وستحاول الثقافة الفرعية عادةً إبقاء الخلايا في هذا النطاق.

ملتصقة الخلايا تحرير

تنمو الخلايا الملتصقة ، على سبيل المثال العديد من خطوط خلايا الثدييات ، متصلة بسطح مثل قاع قارورة الثقافة. يجب فصل أنواع الخلايا هذه عن السطح قبل أن تتم ثقافتها الفرعية. بالنسبة للخلايا الملتصقة ، تقاس كثافة الخلايا عادةً من حيث التقاء ، النسبة المئوية لسطح النمو الذي تغطيه الخلايا. غالبًا ما يكون للخلايا نطاق مفضل من التقاربات لتحقيق النمو الأمثل ، على سبيل المثال ، يفضل خط خلايا الثدييات مثل HeLa أو Raw 264.7 عمومًا التقاربات التي تزيد عن 10 ٪ ولكن أقل من 100 ٪ ، وستحاول الثقافة الفرعية عادةً الاحتفاظ بالخلايا في هذا النطاق. بالنسبة للثقافة الفرعية ، يمكن فصل الخلايا بإحدى الطرق العديدة بما في ذلك علاج التربسين لتحطيم البروتينات المسؤولة عن الالتصاق السطحي ، أو تخليب أيونات الكالسيوم باستخدام EDTA الذي يعطل بعض آليات الالتصاق بالبروتين ، أو الطرق الميكانيكية مثل الغسيل المتكرر أو استخدام مكشطة الخلية. ثم يتم إعادة تعليق الخلايا المنفصلة في وسط نمو جديد والسماح لها بالاستقرار مرة أخرى على سطح نموها.


أهمية البكتيريا للإنسان

يحتوي حليب البقرة السليمة في البداية على عدد قليل جدًا من البكتيريا ، والتي تأتي بشكل أساسي من جلد البقر وإجراءات التعامل مع الحليب. يعتبر الحليب وسيلة نمو ممتازة للعديد من البكتيريا ، ويمكن للبكتيريا أن تزداد بسرعة في الأعداد ما لم تتم معالجة الحليب بشكل صحيح. يمكن أن يفسد النمو البكتيري الحليب أو حتى يشكل خطرًا صحيًا خطيرًا في حالة وجود البكتيريا المسببة للأمراض. تشمل الأمراض التي يمكن أن تنتقل من بقرة مصابة السل (السل الفطري) ، حمى متموجة (البروسيلا أبورتس) ، وحمى كيو (كوكسيلا بورنيتي). بالإضافة إلى ذلك ، حمى التيفود (السالمونيلا التيفية) عن طريق الحليب من معالج الحليب المصاب. تزيد إجراءات البسترة من درجة حرارة الحليب إلى 63 درجة مئوية (145 درجة فهرنهايت) لمدة 30 دقيقة أو إلى 71 درجة مئوية (160 درجة فهرنهايت) لمدة 15 ثانية ، مما يقتل أي من البكتيريا المسببة للأمراض التي قد تكون موجودة ، على الرغم من أن هذه الإجراءات تفعل ذلك لا تقتل جميع الكائنات الحية الدقيقة.

تقوم بكتيريا معينة بتحويل الحليب إلى منتجات ألبان مفيدة ، مثل اللبن الرائب واللبن والجبن. يتم تحضير اللبن الخاثر المستزرع تجاريا من اللبن الملقح بمزرعة بادئة من المكورات اللبنية (عادة L. اللاكتيس أو L. lactis cremoris). يتم إنتاج الزبادي ومنتجات الألبان المخمرة الأخرى بطريقة مماثلة باستخدام مزارع مختلفة من البكتيريا. يتم أيضًا تصنيع العديد من أنواع الجبن من خلال عمل البكتيريا. نمو في اللبن من بكتيريا منتجة للحمض مثل L. اللاكتيس يتسبب في ترسب الكازين في شكل خثارة. بعد إزالة الرطوبة وإضافة الملح ، يُسمح للخثارة بالنضوج من خلال عمل الكائنات الحية الدقيقة الأخرى. تضفي البكتيريا المختلفة نكهات وخصائص مختلفة على الأطعمة على سبيل المثال ، خليط Lactobacillus casei, العقدية الحرارية، و Propionibacterium shermanii هي المسؤولة عن إنضاج الجبن السويسري وإنتاج طعمها المميز وفقاعات غازية كبيرة. بالإضافة الى، بياضات Brevibacterium مسئول عن نكهة جبن ليمبورجر والقوالب (بنسيليوم الأنواع) المستخدمة في تصنيع جبن الروكفور والكاممبير. لطالما استخدمت أنواع أخرى من البكتيريا في تحضير وحفظ الأطعمة المختلفة التي يتم إنتاجها من خلال التخمير البكتيري ، بما في ذلك المنتجات المخللة ومخلل الملفوف والزيتون.

يمكن أن تسبب سموم العديد من البكتيريا المسببة للأمراض التي تنتقل في الأطعمة تسممًا غذائيًا عند تناولها. وتشمل هذه السموم التي تنتجها المكورات العنقودية الذهبية، والذي يسبب ضائقة معدية معوية سريعة وشديدة ولكنها محدودة ، أو سموم كلوستريديوم البوتولينوم، والتي غالبا ما تكون قاتلة. يمكن أن يحدث إنتاج سم التسمم الغذائي في الأطعمة المعلبة غير الحمضية التي تم طهيها بشكل غير كامل قبل الختم. C. البوتولينوم تشكل جراثيم مقاومة للحرارة يمكن أن تنبت في خلايا بكتيرية نباتية تزدهر في البيئة اللاهوائية ، مما يؤدي إلى إنتاج سمومها القوية للغاية. تنتقل العدوى الأخرى التي تنقلها الأغذية فعليًا من معالج الطعام المصاب ، بما في ذلك حمى التيفود وداء السلمونيلات (السالمونيلا الأنواع) ، وداء الشيغيلات (الشيغيلة الزحارية).


حراس المجرة الميكروبية

في عام 1986 ، حدد Yiu-Kwok Chan من الزراعة الكندية نوعًا جديدًا من البكتيريا. باتباع البروتوكول القياسي ، قام بإيداعه في مجموعة الثقافة الأمريكية (ATCC) ، وهو مستودع حيث يخزن العلماء سلالات ميكروبية جديدة. بقيت هناك لعقود حتى عام 2020 عندما لاحظها رولاند فيلهلم ، باحث ما بعد الدكتوراه في جامعة كورنيل ، لتحملها تشابهًا مذهلاً مع مجموعة مختلفة من البكتيريا. حصل فيلهلم على قنينة من سلالة Chan & rsquos من ATCC واستخدم تقنية تسلسل الحمض النووي الأحدث لتأكيد أن سلالة 1986 كانت في الواقع نوعًا من بارابوركولديريا البكتيريا التي كان يدرسها حاليًا. كان هذا الوحي ممكنًا فقط بسبب الأرشيف البكتيري ، الذي كان بمثابة صلة محورية بين هذين الباحثين عبر عصور مختلفة من العلم.

يعد تتبع التطور الميكروبي العالمي مهمة صعبة. تشكل الميكروبات أنواعًا جديدة أسرع من البشر والعديد من الحيوانات الأخرى التي تتكاثر جنسيًا ، وعدد الأنواع الميكروبية التي اكتشفها العلماء يتزايد باطراد على مر السنين. ومع ذلك ، تشير بعض التقديرات إلى أن معدلات الانقراض البكتيري قريبة جدًا من معدل تكوين الأنواع الجديدة بحيث انقرضت الآن معظم السلالات البكتيرية التي كانت موجودة على الإطلاق. من المعروف أن الميكروبات ضرورية لتدوير المغذيات والإنتاجية الزراعية وصحة التربة وإنتاج المضادات الحيوية ومركبات مضادة للسرطان وحماية صحة الأمعاء والجهاز المناعي. ومع ذلك ، ما زلنا نستكشف عالم الميكروبات ونتعلم عنه ، مما يجعل التفكير في الحفاظ على الميكروبات أكثر أهمية.

تحافظ المجموعات المستنبتة على التنوع الميكروبي ، تمامًا كما يحافظ بنك البذور على التنوع الوراثي للنبات. أفاد مركز البيانات العالمي للكائنات الدقيقة عن مجموعة مستنبتات ميكروبية في كل جزء من العالم تقريبًا ، وتحتوي معًا على أكثر من مليوني مزرعة بكتيرية وفطرية وفيروسية. هذا الرقم ليس سوى جزء صغير من التنوع الجرثومي غزير إنتاج الأرض و rsquos.

يمكن لمجموعات المستنبتات الجرثومية استقبال عينات من أي مكان في العالم ، لكن بعض المواقع تنتج ميكروبات أكثر من غيرها. تستقبل مجموعة موارد Jena Microbial Resource Collection ثقافات من جميع أنحاء العالم ولكن بشكل خاص من الدول الآسيوية ، وفقًا لمايكل رام ، عضو فريق العمل في JMRC. تعتبر بعض البلدان أو المؤسسات من النقاط الساخنة الحالية لاكتشاف الميكروبات وهي موطن لجهود العزل واسعة النطاق. غالبًا ما نسمع عن النقاط الساخنة للتنوع البيولوجي وقصص الانقراض التحذيرية مثل طائر الدودو و rsquos ، لكن الحفاظ على الميكروبات نادرًا ما يكون جزءًا من المحادثة العامة.

أحد الأسباب التي تجعلنا لا نفكر في الحفاظ على الميكروبات هو أن معظم الميكروبات غير مرئية بالعين المجردة ويصعب نموها خارج موائلها الطبيعية ، حيث يمكن زراعة أقل من 2 في المائة من البكتيريا البيئية في المختبر. هذا يجعل تخزين واستزراع الميكروبات عملية صعبة تتطلب إيجاد مزيج بعيد المنال من العناصر الغذائية والأملاح والظروف الجوية. قد يستغرق العلماء شهورًا أو حتى سنوات لإخراج الميكروب من موطنه.

يحتاج الباحثون إلى مستودعات مثل مجموعات الثقافة العالمية لضمان الحفاظ على المدى الطويل للثقافات الثمينة التي يمكن زراعتها. كيرك برودرز ، أمين مجموعة NRRL Culture Collection في بيوريا ، إلينوي ، متحمس لإمكانيات مثل هذه المجموعات. & ldquo التواصل مع الباحثين من جميع أنحاء العالم الذين يجرون أبحاثًا رائعة وتوفير الموارد لهم. هو الجزء الأكثر إثارة في عملي. هناك أيضًا متعة بسيطة تتمثل في الزراعة والنمو والإعجاب بالحيوان الملون للفطريات والبكتيريا الجميلة. & rdquo

ظاهريًا ، قد يبدو أن هذه المجموعات تقوم بفهرسة الثقافات مثل متحف الميكروبات. ومع ذلك ، فإن القيمة الحقيقية لهذه المستودعات تكمن في قدرتها العلمية على المضاد الحيوي الجديد التالي ، وهو مركب يعالج السرطان ، أو ميكروب يقلل من انبعاثات غازات الاحتباس الحراري يمكن أن يختبئ في تلك القوارير. & ldquo في العلم ، قد يكون من الصعب التنبؤ بالسلالات البيولوجية التي قد تصبح مهمة سريريًا ، كما تقول سارة ألكسندر ، أمينة المجموعة الوطنية للثقافات النوعية (NCTC). & ldquo عندما يقوم عالم بترسيب سلالات ، تكون هذه المادة متاحة للجيل القادم من العلماء وستكون دائمًا قابلة للاسترجاع. & rdquo

تسمح المجموعات للعلماء بالتأكد من أن السلالة التي يعملون معها اليوم هي نفسها التي تم استخدامها في دراسة قبل 30 عامًا ، كما في قصة Wilhelm & rsquos. هذا هو السبب في أن العديد من المجموعات الثقافية بدأت في تشديد القيود على سلالة مقدمة ليتم الاعتراف بها كعضو رسمي في المجموعة. في الماضي ، كان الفحص المجهري للثقافة قد أثبت أنه كافٍ ، لكن المستودعات مثل NRRL بدأت الآن تتطلب تدبيرًا أمنيًا إضافيًا يمنع التلوث: يجب أن يتطابق التسلسل الجيني للسلالة المقدمة مع ما وجده العالم في المختبر. يمكن أيضًا أن تتطور العديد من الميكروبات بسرعة كبيرة ، وحتى بضعة أشهر من العيش في المختبر يمكن أن تجعل السلالة تبدو مختلفة عما كانت عليه عندما تم التعرف عليها لأول مرة. بمجرد أن يتحقق عالم الأحياء المجهرية من تطابق تسلسل الجينات ، يتم تخزين السلالات عن طريق الحفظ بالتبريد ، أو عملية التخزين طويلة المدى باستخدام درجات حرارة شديدة البرودة أو التجميد السريع مع النيتروجين السائل.

من الواضح أن المجموعات الثقافية هي كيانات حاسمة تساعد في جعل العلم أكثر انفتاحًا وتعاونًا وقابلية للتكرار. إنها تحافظ على التنوع الميكروبي الحالي لـ Earth & rsquos وقد تحمل المفاتيح المجهرية لحل العديد من التحديات العالمية الملحة. إنها أيضًا مكتبات العالم الميكروبي وكل سلالة لها قصة فريدة ، حيث تم عزل أول بكتيري معزول في NCTC عن جندي في الحرب العالمية الأولى ويتم استخدامه لمحاربة الزحار. الإسكندر مدرك للتاريخ ووعد السلالات. & ldquo يعد الحفاظ على المجموعة التي تحتوي على أكثر من 6000 سلالة من أكثر من 900 نوعًا مختلفًا من البكتيريا والحفاظ عليها وتنميتها امتيازًا. مجموعة الثقافة هي مستودع بيولوجي. حيث يمكننا الحفاظ على هذه المعروضات الحية للتأكد من أنها متاحة للبحث. & rdquo


إنه عامل بيئي أساسي يمكن أن يؤثر على نمو الكائنات الحية. تنمو معظم مسببات الأمراض عند 37 درجة مئوية (درجة حرارة الجسم). يتم تصنيف البكتيريا تحت ثلاث مجموعات على أساس نطاق درجة الحرارة المثلى

  • Mesophile: نطاق درجة الحرارة المثلى للميسوفيل هو 25 درجة مئوية إلى 40 0 ​​معظم البكتيريا المسببة للأمراض تندرج تحت هذه المجموعة.
  • سيكروفيل: درجة الحرارة المثلى لمن هم أقل من 20 0
  • ثرموفيل: نطاق درجة الحرارة المثلى لعشاق الحرارة هو 55 درجة مئوية إلى 80 0 على سبيل المثال: Bacillus stearothermophilus.

الأس الهيدروجيني عامل أساسي لنمو الميكروبات. قد تكون البكتيريا قادرة على إنتاج العديد من الأحماض العضوية التي تقلل درجة الحموضة في الوسط وتحد أيضًا من نمو البكتيريا الأخرى. بصرف النظر عن ذلك ، يمكن أن تتأثر بعض مكونات الوسائط بانخفاض درجة الحموضة. لذلك ، من المهم للغاية الحفاظ على الرقم الهيدروجيني الأمثل للحصول على النمو الكافي للكائنات الحية. تتطلب مسببات الأمراض في الغالب درجة حموضة متعادلة (7.2). ومع ذلك ، فإن البكتيريا ذات الأهمية الصناعية مثل اكتوباكيللوس لاكتيس يتطلب درجة حموضة أقل للنمو الأمثل.


ما هي الثقافة؟

الزراعة الميكروبية هي طريقة لتربية الكائنات الحية الدقيقة والحفاظ عليها في ظروف معملية لأغراض مختلفة. تزرع الثقافات في أوساط صلبة وشبه صلبة وسائلة بناءً على نوع والغرض من زراعة الكائنات الحية الدقيقة. يتم تزويد الثقافات بالمغذيات اللازمة وظروف النمو التي تتطلبها الكائنات الحية الدقيقة. هناك مكونات مختلفة لوسط الاستزراع مثل مصدر الطاقة ، ومصدر الكربون ، ومصدر النيتروجين ، والمعادن ، والمغذيات الدقيقة ، والماء ، وعامل التصلب ، وما إلى ذلك. يجب ضبط درجة الحرارة المثلى والأكسجين ودرجة الحموضة وفقًا لنوع الكائن الدقيق المزروع.

هناك أنواع مختلفة من الثقافات الميكروبية على سبيل المثال ، المزرعة الدفعية ، والثقافة المستمرة ، وثقافة الطعنات ، وثقافة لوحة الآجار ، وثقافة المرق ، وما إلى ذلك. - الوسائط الاصطناعية والوسائط الطبيعية. يتم تحضير المزارع الميكروبية تحت ظروف معقمة داخل غرفة خاصة تسمى تدفق الهواء الصفحي. يتم تعقيم وسط النمو والأواني الزجاجية قبل تلقيح الكائنات الحية الدقيقة المرغوبة. في ظل ظروف معقمة مناسبة ، يتم نقل الكائنات الحية الدقيقة المستهدفة إلى وسط المغذيات المعقمة وتحضينها عند درجة الحرارة المثلى. داخل الوسط ، سوف تنمو الكائنات الحية الدقيقة وتتكاثر باستخدام العناصر الغذائية المتوفرة.

الشكل 3: ثقافة بكتيرية على اللوحة


عالم الخلق التركيز 3.1.2 تحديث

كارل Fliermans وأبحاثه الليجيونيلا

الدكتور كارل ب. حاصل على درجة الدكتوراه. في علم الأحياء الدقيقة من جامعة إنديانا ، وزمالة ما بعد الدكتوراه في المعاهد الوطنية للصحة. الدكتور Fliermans هو العالم الذي عزل بكتيريا "مرض Legionnaires" لأول مرة. نشر أكثر من 60 عملاً ، وهو عضو في الجمعية الأمريكية لتقدم العلوم ، والمعهد الأمريكي للعلوم البيولوجية ، والجمعية الأمريكية لعلم الأحياء الدقيقة ، من بين آخرين. الدكتور Fliermans هو مسيحي يعتقد أن الخالق قد قاده في اكتشافه الليجيونيلا.

أغسطس 1976 العنوان الرئيسي للصحيفة: "المرض الغامض يضرب المحاربين"

في واحدة من أكثر المداخل دراماتيكية لأي مرض في ساحة الصحة العامة ، ظهر مرض Legionnaires في مؤتمر الولايات المتحدة بمرور مائتي عام على الفيلق الأمريكي ، 21-23 يوليو ، 1976 ، في فيلادلفيا. وقد حضر الاجتماع الذي استمر ثلاثة أيام ما يقرب من 5000 جندي ، مع أكثر من 600 شخص يقيمون في فندق بلفيو ستراتفورد الأنيق ولكن القديم. حتى قبل مغادرة الفندق ، بدأ العديد من المحاربين في الشعور بالمرض بسبب أعراض تشبه أعراض الأنفلونزا. يوم الثلاثاء ، 27 يوليو ، بعد أربعة أيام فقط من مغادرته فيلادلفيا ، توفي أحد قدامى المحاربين في سلاح الجو الذي أقام في بلفيو ستراتفورد خلال المؤتمر في مستشفى في ساير ، بنسلفانيا. كان الأول من بين أكثر من 30 جنديًا فيلقين استسلموا في النهاية للالتهاب الرئوي المميت الذي أطلقت عليه وسائل الإعلام بسرعة اسم "مرض Legionnaires". ما هو سبب هذا المرض الجديد؟

  • هل كانت بيولوجية أم كيميائية؟
  • من أين أتى العامل الممرض ، إن وجد؟
  • كيف انتشر المرض؟
  • كيف يمكن منع المرض؟

أصبحت هذه الأسئلة الرئيسية والمزيد محور تحقيق مكثف أدى إلى اكتشاف في يناير 1977 أن بكتيريا سالبة الجرام على شكل قضيب تسببت في المرض. تم تسمية البكتيريا البكتيريا المستروحة. اعتبر علماء الأحياء المجهرية الجيدون مثل الدكتور جوزيف مكديد ولاحقًا الدكتور فليرمان المصادر المسببة للأمراض في الطبيعة ، وطرق الانتقال إلى الأشخاص المعرضين للإصابة ، ووسائل منع انتشار مسببات الأمراض. توضح عمليتهم كيفية استخدام التقنيات الكلاسيكية لإثبات سبب مرض معين.

التحقيق في مسببات مرض Legionnaires ويلخص افتراضات كوخ.

يتتبع الرسم التوضيحي أعلاه التحقيق في مسببات مرض Legionnaires ويلخص افتراضات Koch. تم التعرف على مرض Legionnaires لأول مرة في أغسطس 1976. وقد مر أكثر من ستة أشهر قبل أن تتحقق افتراضات Koch و البكتيريا المستروحة وضوحا العامل المسبب للمرض. أولاً ، إذا كان العامل المسبب للمرض بيولوجيًا ، فيجب العثور على العامل المرتبط بانتظام بالمرض. تم فحص الأنسجة المأخوذة من خزعات الرئة وعينات البلغم بحثًا عن الكائنات الحية الدقيقة المتكررة. تم اكتشاف قضيب سالب الجرام يميل إلى تكوين خيوط طويلة متعرجة باستمرار في العينات. ثانيًا ، تم عزل البكتيريا المكتشفة حديثًا في مزرعة نقية في المختبر. هذا استلزم التعلم المستروحةالاحتياجات الغذائية وتصميم وسائط نمو خاصة تلبي هذه المتطلبات ، وتدعم نمو البكتيريا. ثالثًا ، كان هناك حاجة إلى حيوان حساس لإثبات ذلك المستروحة يمكن أن تسبب المرض ، وخاصة أمراض الجهاز التنفسي المشابهة لمرض Legionnaire في البشر. أثبت خنزير غينيا أنه النموذج الحيواني المفضل. أخيرا، المستروحة من خنازير غينيا المصابة للتحقق من وجود عدوى بها.

العزل الأولي للعامل المسبب

من خلال سلسلة من التجارب ، اكتشف الدكتور مكديد وفريقه لأول مرة من العينات السريرية في يناير 1977 الدليل على وجود البكتيريا المسببة لمرض الفيالقة وتسببها. كانت الخطوة الأولى هي إزالة عينات الرئة من Legionnaire المتوفى. تم طحن هذه الخلايا وحقنها في بيض الدجاج وحضنتها. بعد فترة الحضانة ، تم تكسير البيض واستخراج أكياس الصفار وحقنها في وسادات أقدام خنازير غينيا. ثم ظهرت على هذه الحيوانات الأعراض النموذجية لمرض الفيالقة. ثم قام مكديد بسحب عينات دم من الناجين من المرض ، على افتراض أنهم يحتويون على أجسام مضادة ضد العامل المسبب. ثم قام بخلط العينات مع عزلات الكيس المحي ، فتفاعلوا ، مؤكدين أن العامل الموجود في أكياس الصفار هو نفس العامل المسبب للمرض لدى 33 شخصًا.

أوضح مكديد أن فريقه قد تعثر لعدة أشهر بسبب العديد من الخصائص غير العادية للبكتيريا: البكتيريا لم تنمو في ظل ظروف نموذجية. حاول العلماء استنبات البكتيريا من عينات دم وأنسجة الفيلق في محلول مملوء بسائل الوسائط القياسي المستخدم في زراعة أنواع بكتيرية أخرى. ومع ذلك ، لم ينمو شيء. قاد هذا النقص في النمو الفريق إلى الاعتقاد بأن العامل كان فيروسًا أو "سلالة أندروميدا" لم يسبق له مثيل من قبل. لم يتم تحديد دليل النشاط البيولوجي إلا بعد حقن العينات التي لم يتم علاجها بالمضادات الحيوية في البيض.

حدث تأخير آخر بسبب استخدام الفئران في التجارب. لم يكن حتى تحول الفريق إلى خنازير غينيا حيث كانت جهودهم مثمرة. على الرغم من أن الفئران غالبًا ما تستخدم كنماذج حيوانية ، فقد اتضح أن الليجيونيلا تتكاثر بشكل أساسي داخل البلاعم. الضامة الفئران غير فعالة للغاية في ابتلاع هذه البكتيريا ، لذلك لم تصاب بالعدوى من عينات من Legionnaires. في المقابل ، كانت خنازير غينيا عرضة للإصابة الليجيونيلا وأصيبت.

كانت الخطوة التالية لـ McDade هي تحديد سبب صعوبة استنبات هذه البكتيريا. سرعان ما اكتشفوا أن الليجيونيلا البكتيريا لها احتياجات فسيولوجية. لا تعزز وسائط الاستزراع القياسية النمو لأنها تتطلب مستويات عالية من سيستين الأحماض الأمينية ومكملات الحديد غير العضوية وتركيزات منخفضة من الصوديوم والفحم المنشط ودرجات حرارة مرتفعة. كان الدكتور Fliermans أول من أدرك أن الدهون الليجيونيلا كانت مشابهة جدًا للبكتيريا المحبة للحرارة التي اكتشفها في المناطق الحرارية في حديقة يلوستون الوطنية. أيضًا ، تميل البكتيريا إلى العيش في بيئة مظلمة غنية بالمغذيات مثل غشاء حيوي (حثالة) مرتبط بأنواع مختارة من الطحالب. ساهمت هذه الظروف في صعوبة مشاهدة الكائن الحي في بيئته باستخدام الفحص المجهري القياسي وتقنيات أخرى.

طلب McDade من Fliermans المساعدة في إكمال افتراضات Koch لمرض Legionnaires. منذ عام 1969 ، أجرى Fliermans أبحاثًا على الكائنات الحية الدقيقة المرتبطة بالموائل الحرارية الطبيعية مثل تلك الموجودة في يلوستون والموائل من صنع الإنسان القادمة من التيارات الحرارية بالقرب من المنشآت الكهربائية والنووية. غالبًا ما كانت الكائنات الحية الدقيقة المرتبطة بهذه الموائل محبة للحرارة في استجابتها الفسيولوجية حيث كانت درجة حرارة نموها المثلى بين 30 درجة و 90 درجة مئوية (86 درجة مئوية و 194 درجة فهرنهايت). كانت السمة الثانية غير المعتادة بالنسبة لعشاق الحرارة هي العدد الكبير من الأحماض الدهنية ذات السلاسل المتفرعة التي احتوتها ، تمامًا مثل العزلات السريرية لـ الليجيونيلا. مسلحًا بهذه المعلومات ، بدأ Fliermans في البحث في الموائل المائية ، الطبيعية منها والتي من صنع الإنسان ، سواء المحيطة والحرارية ، عن وجود الليجيونيلا. أظهر عمل Fliermans الأساسي ذلك الليجيونيلا يمكن عزلها عن الموائل الطبيعية غير المرتبطة بتفشي المرض. فتحت هذه النتائج مجالًا جديدًا للتفكير والتجريب والفهم. بالنسبة إلى Fliermans ، أصبح السؤال الآن: كيف وأين يحدث الليجيونيلا تناسب البيئة البيئية؟

على الرغم من أن الكثيرين في مراكز السيطرة على الأمراض كانوا في حيرة من أصل الليجيونيلا، أدت البيانات الوبائية Fliermans إلى التركيز على المنافذ المائية باعتبارها الموائل الطبيعية للبكتيريا. جاءت هذه الفرضية من فحص حقيقة أن العروض السريرية الأولية أظهرت موسمية للعدوى. كان مثل هذا النمط الدوري مشابهًا جدًا للنمط الذي لوحظ لنمو البكتيريا المائية. تراوحت النظريات حول سبب الأمراض من تسمم بكربونيل النيكل والالتهاب الرئوي الفيروسي إلى مؤامرة صيدلانية ضد قدامى المحاربين الأمريكيين. في مركز السيطرة على الأمراض ، افترض الكثيرون ذلك الليجيونيلا ربما تم تصميمها وراثيًا كـ "سلالة أندروميدا" من قبل السوفييت أو مثل مؤامرة شيوعية أخرى. بعد كل شيء ، أثرت في المقام الأول على قدامى المحاربين. عندما قرأ الدكتور فليرمان كتابه المقدس يومًا ما ، لاحظ جامعة 1: 9: "الشيء الذي كان ، هو ما يجب أن يكون وما يتم فعله ، هو ما يجب عمله: ولا يوجد شيء جديد تحت الشمس. . " اعتقد الدكتور Fliermans أن هذا صحيح ، وسرعان ما غيّر الطريقة التي يبحث بها مختبره عن الكائن الحي ، لأن البكتيريا ربما لم تكن جديدة تحت أشعة الشمس. بعد الصلاة والتخطيط والاستكشاف ، وجد الدكتور Fliermans البكتيريا في المياه الحرارية (المعزولة مبدئيًا عند 45 درجة مئوية [113 درجة فهرنهايت] في مختبر نهر سافانا) التي تم تفريغها من مفاعل نووي ومن ثم من الينابيع الساخنة الطبيعية في كل من شرق وغرب الولايات المتحدة. تنص على. بمجرد العزلة عن البيئة ، كانت المهمة التالية هي ثقافتها. في البداية ، نمت فقط في خنازير غينيا. تم تحقيق افتراضات كوخ في البداية في خنزير غينيا لابنة الدكتور فليرمان في صيف عام 1977 باستخدام عينات مأخوذة من أبراج التبريد. كان قادرًا على تطوير ونشر اختبار الأجسام المضادة الفلورية للكشف الليجيونيلا.

يصور هذا المجهر الإلكتروني الأميبا ، Hartmannella vermiformis (أسفل اليسار) لأنها تحاصر أ البكتيريا المستروحة بكتيريا (أعلى اليمين) ذات أرجل كاذبة ممتدة

الليجيونيلا تم التعرف عليه الآن بسهولة في الموقع وفي الجسم الحي وفي المختبر. تساعد معرفة الأساس الجزيئي والبيئي للمرض على تطوير طرق جديدة للوقاية من الأمراض وعلاجها. لسبب واحد ، يمكن للمرء أن يتنبأ بالظروف التي من المحتمل أن تزدهر فيها مسببات الأمراض وتنتشر وتسبب المرض. مع التقنيات المحسنة والأدوات الجزيئية ، تساعد الأجسام المضادة الفلورية في التشخيص. قصة تحري طبية مماثلة صحيحة أيضًا لاكتشاف وتشخيص العامل المسبب لمرض لايم. (ارى الجسم حسب التصميم، 2002 ، ص. 145 ، لمزيد من التفاصيل.) كونك طبيباً شيرلوك هولمز يساعد المرء على تجميع تنوع الحقائق في وحدة.


تعريف الثقافة المتزامنة

تشير الثقافة المتزامنة إلى عملية نمو السكان الميكروبيين ، حيث تظهر الخلايا الفردية التزامن مع الخلايا الأخرى في نفس وسط الثقافة من خلال النمو في نفس مرحلة النمو لوقت معين للجيل.

السمة الرئيسية للنمو المتزامن هي أن جميع الخلايا الميكروبية متطابقة من الناحية الفسيولوجية من خلال النمو في نفس دورة الانقسام ووقت الجيل نفسه. لذلك ، يمكننا القول أن السكان الميكروبيين بالكامل يظلون متماثلين فيما يتعلق بنمو الخلايا وانقسامها.

غرض

  • باستخدام الثقافة المتزامنة ، يمكننا الحصول على فكرة محصول الخلية بالكامل في مرحلة معينة من دورة حياتهم وعلاقاتهم المتبادلة.
  • قياس نمو الميكروبات في ثقافة التزامن هو أكثر يسرا من تقنيات زراعة النمو الأخرى ، حيث أن النتائج التي يتم إجراؤها على هذه الثقافة الجماعية مماثلة للقياسات التي أجريت على خلية بكتيرية واحدة.
  • في الثقافة المتزامنة ، يمكننا توضيح ملف سلوك النمو الخلايا البكتيرية في نفس مرحلة النمو.

النقاط الرئيسية

  1. يميل السكان الميكروبيون بالكامل إلى إظهار التزامن عن طريق تغيير الظروف الفيزيائية والمكونات الكيميائية لوسائل الاستزراع.
  2. إنه نوع من نظام الزراعة المفتوحة.
  3. في الثقافة المتزامنة ، تكون الخلايا الميكروبية متشابهة من الناحية الفسيولوجية.
  4. تنمو جميع الخلايا الميكروبية في الثقافة المتزامنة في نفس وقت الجيل ونفس دورة الانقسام.

كفاءة الثقافة المتزامنة

تظهر الخلايا البكتيرية نموًا غير متزامن في وسط الثقافة العشوائية. ومع ذلك ، فإن الخلايا الميكروبية تظهر التزامن من خلال طرق الاختيار والحث. يمكننا تحديد كفاءة النمو المتزامن من خلال مقارنة المعلمتين التاليتين:

دعونا نرى نمط نمو الخلايا من خلال رسم رسم بياني بين مضاعفة الوقت مقابل عدد لوغاريتمي للخلايا والوقت مقابل مؤشرات الانقسام الفتيلي المقابلة لنمو متزامن وعشوائي ، على التوالي.


اختيار الكائنات الدقيقة

لاختيار الكائنات الحية الدقيقة والحفاظ عليها متزامنة ، كان هناك طريقتان مستخدمتان بناءً على طرق الاختيار الميكانيكية والحثية.

الاختيار بالطريقة الميكانيكية

يشير إلى أ الانفصال الجسدي الطريقة ، التي يتم فيها اختيار السكان المتزامن وفقًا لـ سن و بحجم.

لتنفيذ هذه الطريقة ، تحتاج إلى تصفية الخلايا الميكروبية لفصل الخلايا الصغيرة والشابة النشطة في التمثيل الغذائي. يحتفظ المرشح بالخلايا الكبيرة الجاهزة للتقسيم.

بهذه الطريقة ، يتم جمع الخلايا الكبيرة من الفلتر للحصول على نمو متزامن باستخدام تقنية قياسية تُعرف باسم "تقنية هيلمستتر كومينغ”.

في هذه الطريقة ، تحتاج إلى تمرير مجموعة الخلايا بأكملها من خلال مرشح يكون حجم جزيئاته صغيرًا ، بما يكفي لاحتجاز البكتيريا. هذه الطريقة تجعل استخدام مرشح غشاء نترات السليلوز.

ثم اقلب ورق الترشيح وقم بتمرير وسط المغذيات الطازج فوقه. من خلال القيام بذلك ، ستغسل البكتيريا المرتبطة بشكل فضفاض من خلال الفلتر. ستبقى البكتيريا كبيرة الحجم على ورق الترشيح وتميل إلى الانقسام.

بعد ذلك ، اجمع عينة من هذا الدفق ، والذي يحتوي على جميع الأشكال التي تم تشكيلها حديثًا و تقسيم الخلايا بشكل متزامن. الطريقة لها قيود واحدة على حجم السكان صغيرتي.

في الوقت الحاضر ، يتم استخدام الطرد المركزي المتدرج الكثافة أيضًا بدلاً من الترشيح ، لاختيار الخلايا الميكروبية من نفس الحجم والكثافة والتي يمكن أن تنقسم في نفس المرحلة من دورة حياتها.

الاختيار حسب طريقة الاستقراء

الطريقة الأخرى ، أي علاج بالصدمة الكهربائية can also maintain cell synchrony and it includes temperature variation, starvation, light exposure, lethal doses of radiation etc.

All these factors can maintain synchrony in the cell population for several generations. Let us discuss some of the factors that can induce synchrony in the cell culture.

Temperature variation: It is the most common factor that induces the cell maturation to the same point of fission.

We could observe the change in culture medium by growing the microbial culture under 37 degrees Celsius and later subjecting the culture medium to 20 degrees Celsius for about 30 minutes.

During this interval, the cells go through إنضاج to undergo cell division. At 20 degrees Celsius temperature, no bacteria will undergo fission.

But, if you transfer the culture at a temperature of 37 degrees Celsius, all the cells start dividing synchronously. Therefore, the repeated temperature variation can maintain synchrony for a few generations.

Alternations in the media composition: Other than shock treatment, the synchrony can also be induced by changing the media composition of the culture medium.

The microorganisms grown in the culture medium deficient or containing the essential growth factor may either promote or inhibit the cell division, which eventually withheld the fission.

Let us suppose, the bacterial cells are grown in a culture medium that lacks الثايمين (an essential element). As a result, the process of fission halts for some time. However, the bacterial cells will divide once you transfer the cells to a complete nutrient medium.

بصورة مماثلة، colchicine is a growth factor inhibiting the cell division in culture medium for a certain period. But the effect can be reversed once you transfer the cells to the culture medium free of colchicine.

استنتاج

Therefore, we can conclude that the synchronous culture are of two kinds, namely induction and selection synchrony. ال induction synchrony induces the bacterial cell population to undergo fission synchronously via physical or chemical treatment.

Oppositely, the selection synchrony selects cells at a particular stage of the cycle, and later the fractions of bacterial cells grow through their natural cycle.


Why are bacterial cultures necessary? - مادة الاحياء

In many distinct areas of microbiology, the ability to identify microorganisms has important application. For example, in food microbiology it is important to be able to accurately identify food spoilage contaminants. In microbial ecology, the identification of microorganisms helps us characterize biodiversity. In the field of medical microbiology, a branch of microbiology that investigates pathogenic microorganisms, the primary focus is to isolate, identify, and study microorganisms responsible for infectious disease.

Many microorganisms are permanent residents, or normal flora, of the human body. Bacteria that are normal flora are important symbionts of the human body, most of which cause no ill effects and some, which are actually beneficial to human health. Only a small percentage, less than 10%, of all known bacteria are pathogenic, or able to cause disease in a susceptible host. In order to identify an unknown in the clinical laboratory, a sample must be collected from the patient. This could be a sample of urine, feces, saliva, or a swab of the throat or skin. Because the clinical samples will most likely contain many microorganisms, both normal flora and pathogens, it is important to isolate the pathogen in a ثقافه نقية using various types of selective and differential media. Following isolation, one of the first steps in identifying a bacterial isolate is the غرام وصمة عار, which allows for the determination of the Gram reaction, morphology, and arrangement of the organism. Although this information provides a few good clues, it does not allow us to determine the species or even genus of the organism with certainty. Thus, microbiologists use characteristic البيوكيميائيةأنشطة to more specifically identify bacterial species. A Few Biochemical/Physiological Properties Used for identification of bacteria include: nutrient utilization (carbohydrate utilization, amino acid degradation, lipid degradation), resistance to inhibitory substances (high salt, antibiotics, etc.), enzyme production (catalase, coagulase, hemolysins, etc.) and motility.

This series of lab exercises will introduce many of the physiological characteristics/biochemical activities of bacteria commonly encountered in a clinical microbiology laboratory. Knowledge of these key characteristics will enable the identification of unknown bacterial isolates. It is important to thoroughly understand the basis for each biochemical test and know the key physiological characteristics of the bacterial genera and species presented in these labs.

ملحوظة: Labs 15-17 will utilize a number of different media and tests that are described in the ATLAS and on the course web page (Summary of Biochemical Tests). Please use these as references for all of these labs and for the investigation of unknowns in Labs 18-21.


Supporting information

S1 Fig. Impaired metabolism leads to an increase in antibiotics survival.

(أ) ه. القولونية MG1655 WT, ΔaceA, and Δicd strains were grown 2 hours to 2.5 hours in LB at 37°C to exponential phase and challenged with ciprofloxacin (1 μg/mL). Survival has been assessed by culture plating and CFU counting. Data are the average results from 3 independent experiments performed with 3 biological replicates (ن = 8 or 9). Error bars represent standard deviations. (B) Distribution of the iATPSnFr 1.0 488ex/405ex ratio per single cell measured by microscopy in exponential cultures of MG1655, ΔaceA, and Δicd strains grown in LB at 37°C. Thick lanes represent the median, and secondary lanes the quartiles. Significance was determined using Kruskal–Wallis and Dunn’s multiple comparison tests. Observations were performed with a confocal microscope. (C) Bulk ATP levels were measured in MG1655, ΔaceA, and Δicd strains grown in LB 37°C with firefly luciferase assay and normalized with OD600. Data are the average results from 3 independent experiments performed with 3 biological replicates (ن = 9). Error bars represent standard deviations. Significance was determined using one-way ANOVA and Tukey’s multiple comparison tests. The underlying data for this figure can be found in S1 Data.

S2 Fig. Growth of the fluorescent reporter strains.

MG1655 Krebs cycle KO strains and W3110D Krebs cycle mVenus fusion strains were grown in LB (A), in MOPS minimum medium with 0.4% sodium pyruvate (B), or 0.4% sodium acetate (C) as sole carbon source at 37°C. (D) MG1655-SB1 strains expressing or not iATPSnFr 1.0 were grown in LB at 37°C. In (A), (B), (C), and (D), each lane represents a biological replicate coming from experiments performed 3 times (ن > 6). The underlying data for this figure can be found in S1 Data.

S3 Fig. Fluorescence analysis of the mVenus fusions.

Representative histogram of fluorescence of the mVenus fusions before (A) and after (B) ciprofloxacin treatment of W3110D: black lane, aceA-mVenus: red-lane, icd-mVenus: blue lane, gltA-mVenus: green lane, sucA-mVenus: orange lane. For each of those fusions, (C), (D), (E), (F), respectively, show the histogram of fluorescence before (black lane) and after (red lane) ciprofloxacin treatment for each fusion (left panel), and the post-sorting purity analysis of the Dim (light grey), Middle (grey), and Bright (dark grey) sorted fractions (right panel). The number of events represented in the ذ axis is normalized for each graph. The underlying data for this figure can be found in S1 Data.

S4 Fig. Reporting ATP in exponential and stationary phase cultures at the single-cell level.

(A) Representative images of exponential (upper panel) and stationary (lower panel) phase cultures of MG1655_iATPSnFr 1.0 cultured in LB at 37°C. The fluorescent signals 405ex and 488ex are false colored in magenta and green, respectively. In the ratiometric 488ex/405ex panel, orange/yellow cells correspond to cells with higher ATP, and blue cells with lower ATP. Scale bar, 5 μm. White arrow shows the presence of a low 488ex/405ex ratio cell within exponential culture. Observations were performed with a confocal microscope. (B) Distribution of the iATPSnFr 1.0 488ex/405ex ratio in exponential and stationary phase cultures. Thick lanes represent the median, and secondary lanes the quartiles. Significance was determined using two-tailed unpaired Mann–Whitney يو اختبار. Data are representative of experiments made twice giving similar results. (C) Bulk ATP levels were measured in MG1655 strain grown in the same conditions as in (A) with firefly luciferase assay and normalized with OD600. Data are the average results from 2 independent experiments performed with 3 biological replicates (ن = 6). Error bars represent standard deviations. Significance was determined by using two-tailed unpaired Student ر اختبار. The underlying data for this figure can be found in S1 Data.

S5 Fig. Kymographs of the different phenotypes observed.

The fluorescent panels represent the addition of iATPSnFr 1.0 405ex and 488ex intensities. Observations were performed with a time-lapse epifluorescence microscope.

S6 Fig. Kymographs of the persisters analyzed.

(A) Left panel: ATP value at the beginning of the experiment in persisters. Data represent the single-cell 488ex/405ex ratio values analyzed for each of the 16 persisters at the first time frame in Fig 3D histogram. The black horizontal dashed line represents the mean 488ex/405ex ratio of the normal cells (0.6303). Right panel: Kymographs of the 16 persisters analyzed in Fig 3C. The iATPSnFr 1.0 ratiometric 488ex/405ex panels represent ATP level. The color code has been scaled individually for each of the 16 kymographs. Persister number 2 harbors a slow growth pattern different than the others which don’t grow in presence of ampicillin. The white rectangles indicate the time frame where the first septal invagination of each persister is observed (time before first division). Observations were performed with a time-lapse epifluorescence microscope. (B) For each persister, time before first division is plotted over the iATPSnFr 1.0 488ex/405ex ratio at the first time frame of the time lapse (t = 1). Correlation was examined by Pearson’s correlation. The underlying data for this figure can be found in S1 Data.

S7 Fig. iATPSnFr 1.0 488ex/405ex ratio in the mother machine.

(A) Each data point represents the iATPSnFr 1.0 488ex/405ex ratio per single cell over time frames (frames interval is 30 minutes) for normal cells (in black) and persister cells (in red). (B) Distribution of the iATPSnFr 1.0 488ex/405ex ratio per single cell for normal cells (in black) and persister cells (in red) according to their position in the mother machine, at the first time frame of the time lapse (t = 1), and (C) immediately before the antibiotic is added (t = 5). Observations were performed with a time-lapse epifluorescence microscope. The underlying data for this figure can be found in S1 Data.

S8 Fig. Persisters, cell size, and ATP.

(A) Distribution of cell size area. (B) Distribution of the iATPSnFr 1.0 488ex/405ex ratio. A mother machine experiment using the same setup as in Fig 3 was performed. The light grey bars represent all non-persister cells (23,766 cells) at the first time frame, immediately after loading in the mother machine from a stationary phase culture. Dark grey corresponds to non-persister cells with sizes smaller than the average persister cells (5,596 cells). The 5 persisters found in this experiment are plotted in red. Observations were performed with a time-lapse epifluorescence microscope. The underlying data for this figure can be found in S1 Data.

S9 Fig. General schematic of the construction of in-frame chromosomal mVenus fusions.

Schematic of the construction of the translational mVenus fusions. Two-round PCRs were performed. The template used was the pKDN31 plasmid (a gift from Barry Wanner), and the polymerase used was the KOD. Final PCRs were precipitated with ethanol, dried up, then dissolved in H2O, before to be used to electrotransform W3110D/pKD46. Electrocompetent cells of W3110D/pKD46 were prepared according to the standard protocol for λ Red recombination with a higher concentration of L-arabinose (10 mM) [59,60]. The double selection was done using resistance to chloramphenicol (25 μg/mL) and sensitivity to ampicillin (100 μg/mL at 30°C), and clones were PCR checked using Left and Down primers (S3 Table). Finally, bar code sequencing was performed after amplification with Left and NYP244 primers (S3 Table).

S10 Fig. Evaluation of photobleaching and photoactivation effects for the iATPSnFr 1.0 sensor.

Stationary phase cells were concentrated and loaded in the device, and fresh EZRDM was flowed until cells are in balanced growth (from time frame 7 to the end of the experiment). Frames were taken 30 minutes apart. Changes in the 405ex and 488ex signals of the iATPSnFr 1.0 sensor (on the right ذ axis) and in the 488ex/405ex ratio (on the left ذ axis) were monitored over time. Data represented are the mean of the iATPSnFr 1.0 488ex, 405ex, and 488ex/405ex ratio per single cell over time frames (ن = 2,670). Error bars represent standard errors. Observations were performed with a time-lapse epifluorescence microscope. The underlying data for this figure can be found in S1 Data.


شاهد الفيديو: #بصراحة.. إلى أي مدى تقرب الفنون و الثقافات بين الشعوب (قد 2022).