معلومة

1.2A: Micelles و Bilayers - علم الأحياء

1.2A: Micelles و Bilayers - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أخبرني طبيب ما بعد الدكتوراه ذات مرة أنه لفهم الكيمياء الحيوية وعلم المناعة ، كان عليه أن يتظاهر بأنه جزيء. قبل أن تقرأ الإجابة ، انظر إلى الصورة أدناه واسأل نفسك السؤال: ماذا أفعل إذا كنت سلسلة واحدة من البرمائيات على استعداد للقفز في الماء؟

سلسلة واحدة من البرمائيات تقفز في الماء!

عند إضافتها إلى الماء ، تشكل البرمائيات أحادية السلسلة كلا الطبقات الأحادية على سطح الماء والمذيلات ، بينما يبقى بعض المونومر في المحلول. تشكل البرمائيات ذات السلسلة المزدوجة طبقات ثنائية بدلاً من المذيلات. (ملاحظة: يمكن أن تشكل البرمائيات أحادية السلسلة ومزدوجة السلسلة أيضًا هياكل تجميعية متعددة الجزيئات أخرى ، ولكن هذه هي الأكثر شيوعًا وهي الوحيدة التي سننظر فيها.)

الشكل: هياكل البرمائيات المفردة والمزدوجة السلسلة في الماء - Micelles و Bilayers


Jmol المحدث Micelle Jmol14 (جافا) | JSMol (HTML5)

جمول: تحديث ثنائي الطبقات غير مرطب Jmol14 (جافا) | JSMol (HTML5)

الجزء الداخلي من micelle غير قطبي تمامًا. تسمى الطبقات الثنائية الكروية التي تحيط بحيز مائي الحويصلات أو الجسيمات الشحمية. تمثل الميسيلات والطبقات الثنائية ، المكونة من أمفيفيل أحادية وسلسلة مزدوجة ، على التوالي ، مجاميع غير تساهمية ، وبالتالي تتشكل من خلال عملية فيزيائية بالكامل. لا توجد خطوات تساهمية مطلوبة. يمكن فهم تكوين هذه الهياكل من دراسة القوى بين الجزيئات (IMFs) المعنية وكذلك الديناميكا الحرارية. أولاً سنراجع صناديق النقد الدولي المعنية. ضع في اعتبارك القوى الجذابة. يمكن أن تتفاعل سلاسل الأسيل المدفونة وتستقر بواسطة قوى لندن. يتم عزلهم من الماء. هذا الرأي يناسب بديهيتنا البسيطة المتمثلة في "مثل يذوب مثل". يمكن تثبيت مجموعات الرأس القطبية بواسطة روابط أيونية ثنائية القطب بين مجموعات الرأس المشحونة والماء. وبالمثل ، فإن الروابط H بين الماء ومجموعة الرأس تعمل على استقرار مجموعات الرأس المكشوفة في الماء. قد تشارك أيضًا قوى النفور. يمكن أن تتنافر مجموعات الرأس مع بعضها البعض من خلال عوامل ستيريث ، أو تنافر أيون الأيونات من مجموعات الرأس المشحونة. يجب أن تكون قوى الجذب أكبر من قوى التنافر التي تؤدي إلى هذه المجاميع الجزيئية. تنشأ مشكلة واحدة مع هذا التفسير البسيط. من أجل تكوين مذيلة أو طبقة ثنائية ، يجب أن تتجمع العديد من المونومرات لتشكيل مذيلة أو حويصلة واحدة. هذا يشير إلى أن تكوين الميلي والحويصلات يجب أن يكون غير مرغوب فيه من الناحية الإنتروبية!

الأمفيفيلات أحادية السلسلة الشائعة التي تشكل المذيلات هي المنظفات (مثل كبريتات دوديسيل الصوديوم - SDS) وكذلك الأحماض الدهنية ، والتي تعتبر في حد ذاتها منظفات. يشعر هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) بزلقة على بشرتك لأن القاعدة تتحلل مائيًا الأحماض الدهنية المصقولة لدهون الجلد. ثم تتجمع الأحماض الدهنية الحرة تلقائيًا لتكوين مذيلات تعمل كمنظفات.


أسئلة الصف التمهيدي: بنية الدهون: ب. الدهون في الماء - سؤال


يمكن أن تكون الجسيمات الشحمية المنتجة في المختبر أحادية الطبقة ، تتكون من طبقة ثنائية واحدة تحيط بالحيز المائي الداخلي ، أو متعددة الطبقات ، تتكون من طبقات ثنائية متعددة تحيط بالمحلول المائي المغلق. يمكنك تصوير الحويصلات متعددة الطبقات التي تشبه البصل بطبقاته المتعددة. الرسوم الكاريكاتورية للجسيمات الشحمية أحادية الصفيح ومتعددة الطبقات موضحة أدناه ، حيث تمثل كل دائرة متحدة المركز طبقة ثنائية.

تختلف الجسيمات الشحمية في القطر. يمكن تصنيفها عمومًا إلى صغيرة (S ، قطر <25 نانومتر) ، وسيطة (I ، قطرها حوالي 100 نانومتر) ، وكبيرة (L ، قطر من 250-1000 نانومتر). إذا كانت هذه الحويصلات أحادية الطبقة ، فيتم اختصارها كـ SUV و IUV و LUV ، على التوالي. يتم عرض أحجامها المختلفة أدناه ، مقارنة بالتركيبات البيولوجية الكبيرة الأخرى. في هذا المعمل ، سوف نصنع ونميز LUV.

يمكن أن يتنوع التركيب الكيميائي للجسيمات الشحمية على نطاق واسع. تحتوي معظمها على فوسفوليبيدات محايدة مثل فوسفاتيديل كولين (PC) ، أو فوسفاتيديل إيثانولامين (PE) ، أو سفينغوميلين (SM) ، مكمل ، إذا رغبت في ذلك ، مع فوسفوليبيدات سالبة الشحنة ، مثل فوسفاتيديل سيرين (PS) وفوسفاتيديل جلسرين (PG). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن دمج البرمائيات أحادية السلسلة مثل الكوليسترول (C) والمنظفات في الغشاء ثنائي الطبقة ، والذي يعدل السيولة ودرجة حرارة الانتقال (Tm) للطبقة الثنائية. إذا كانت موجودة بتركيز كبير جدًا ، فإن البرمائيات أحادية السلسلة مثل المنظفات ، التي تشكل المذيلات ، يمكن أن تعطل الغشاء تمامًا بحيث يتم دمج الأمفيفيلات المزدوجة السلسلة في مذيلات المنظف ، والتي تسمى الآن المذيلات المختلطة ، في عملية تدمر بشكل فعال طبقة الغشاء الثنائية.

في المختبر (لأولئك الذين يأخذونها) سوف تصنع الجسيمات الشحمية التي تحتوي فقط على جهاز كمبيوتر طبيعي من صفار البيض الطازج. تذكر أن الأحماض الدهنية الموجودة بشكل طبيعي في الفسفوليبيد يمكن أن تكون ذات أطوال ودرجات متعددة من عدم التشبع. يظهر متوسط ​​تكوين الأحماض الدهنية في صفار البيض PC (متوسط ​​الوزن الجزيئي = 750) في الجدول أدناه ، تم الحصول عليه من الجسيمات الشحمية: نهج عملي ، تم تحريره بواسطة R.R.C. جديد.

الجدول 1
حمض دهني٪ حمض دهني عند C1٪ حمض دهني عند C2
16:068.81.8
18:025.81.2
18:14.748.9
18:20.211.1
18:30.5-
20:4-2.1
20:5-7.1
22:5-2.6
22:6-25.2
  • Avanti Polar Lipids (حيث نحصل على جهاز الكمبيوتر الخاص بنا من البيض): توزيع الأحماض الدهنية على الأنسجة المختلفة

بالنظر إلى الدرجة الكبيرة من عدم التشبع عند C2 ، ماذا تتوقع أن تكون درجة حرارة التحول لجسيم شحمي مكون فقط من صفار البيض PC؟ (الحويصلات المصنوعة باستخدام أجهزة كمبيوتر أكثر تشبعًا من مصادر الثدييات لها (T_m ) حوالي 40 درجة مئوية.) هذه الدرجة العالية من عدم التشبع تجعل صفار البيض أكثر عرضة للأكسدة ، مما قد يغير خصائص الجسيم الشحمي بشكل كبير. يمكن للكمبيوتر الاصطناعي المصنوع من الأحماض الدهنية المشبعة أن يخفف من هذه المشكلة.

يتم تحديد خصائص الجسيمات الشحمية (كثافة الشحنة وسيولة الغشاء والنفاذية) من خلال تكوين الدهون وحجم الحويصلة. سيتم تحديد الخصائص المرغوبة ، بدورها ، عن طريق استخدام الجسيم الشحمي المعين. تقدم الحويصلات نماذج رائعة وبسيطة لدراسة الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية للأغشية الطبيعية. في الواقع ، يمكن دمج بروتينات الغشاء في الطبقة الدهنية الثنائية باستخدام الطريقة الدقيقة التي ستستخدمها. ولكن بصرف النظر عن هذه الأغراض ، يمكن استخدام الجسيمات الشحمية لتغليف الجزيئات القابلة للذوبان في الماء مثل الأحماض النووية والبروتينات والأدوية السامة. يمكن استهداف هذه الجسيمات الشحمية لخلايا معينة إذا كان من الممكن دمج الأجسام المضادة أو الجزيئات الأخرى التي ترتبط على وجه التحديد بالخلية المستهدفة في الطبقة الثنائية من الحويصلة. يمكن بعد ذلك نقل المادة داخل الحويصلة إلى الخلية إما عن طريق اندماج الحويصلة بالخلية ، أو عن طريق الالتقام الخلوي للحويصلة.


الحدود في الكيمياء

انتماءات المحرر والمراجعين هي الأحدث التي يتم توفيرها في ملفات تعريف بحث Loop وقد لا تعكس موقفهم في وقت المراجعة.



مشاركه فى

السيكلوتيدات هي عائلة من البروتينات الدائرية المشتقة من النبات مع تطبيقات علاجية محتملة ناشئة عن ثباتها الملحوظ وتنوع تسلسلها الواسع ومجموعة من الأنشطة الحيوية. يُعتقد أن نشاط ربط الغشاء الخاص بهم هو عنصر حاسم في آلية عملهم. باستخدام مقياس المسعر الحراري المتساوي الحرارة ، درسنا ارتباط السيكلوتيدات النموذجية cyclotides kalata B1 و kalata B2 (والعديد من المسوخات) بمذيلات dodecylphosphocholine و dodecylphosphocholine micelles و phosphoethanolamine biilayers. على الرغم من أن الارتباط هو في الغالب عملية مدفوعة بالانتروبيا ، مما يشير إلى أن القوى الكارهة للماء تساهم بشكل كبير في تكوين مركب السيكلوتيد الدهني ، إلا أن الارتباط المحدد بمجموعة رأس الفوسفويثانولامين - الشحوم مطلوب أيضًا ، وهو ما يتضح من التغيرات الحرارية في الطاقة الحرة للربط. بالإضافة إلى ذلك ، باستخدام مزيج من قياسات الموازنة الدقيقة لبلورة الكوارتز التبادلية وقياس انعكاس النيوترون ، أوضحنا العملية التي تتفاعل بها السيكلوتيدات مع الأغشية ثنائية الطبقة. في البداية ، يرتبط عدد صغير من السيكلوتيدات بسطح الغشاء ثم يتم إدخاله أولاً في نشرة الغشاء الخارجي متبوعًا بالاختراق من خلال تكوين الغشاء والمسام. في التركيزات العالية من السيكلوتيدات ، يحدث زعزعة استقرار الأغشية. توفر نتائجنا رؤية آلية مهمة حول كيفية ممارسة السيكلوتيدات لأنشطتها الحيوية.

تم دعم هذا العمل جزئيًا من قبل منحة مجلس البحوث الأسترالي DP0984390. تم دعم السفر من قبل منحة منظمة العلوم والتكنولوجيا النووية الأسترالية 04/08-N-40 لقياس الانعكاس النيوتروني.

كلا المؤلفين شارك بمساواة بهذا العمل.

زميل المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية.

العنوان الحالي: European Spallation Source ESS AB، P.O. ب 176 ، SE 22100 لوند ، السويد.


هيكل ووظيفة مجال التثبيت الغشائي للبروتين غير الإنشائي لفيروس التهاب الكبد C 5A

فيروس التهاب الكبد الوبائي سي (HCV) البروتين غير البنيوي 5A (NS5A) هو مكون أساسي مرتبط بالغشاء في مجمع التكاثر الفيروسي. هنا ، قمنا بالإبلاغ عن الهيكل ثلاثي الأبعاد لمجال مرساة الغشاء لـ NS5A كما هو محدد بواسطة التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي. لوحظ وجود حلزون ألفا يمتد من بقايا الأحماض الأمينية من 5 إلى 25 في وجود وسائط غشائية مقلدة مختلفة. أظهر هذا اللولب جانبًا كارهًا للماء من Trprich مضمنًا في مذيلات المنظف ، بينما تعرض الجانب القطبي المشحون للمذيب. وهكذا ، يشكل مجال المرساة الغشائية NS5A حلزوني ألفا أمفيباثي داخل الطائرة مضمن في نشرة العصارة الخلوية للطبقة ثنائية الغشاء. ومن المثير للاهتمام ، أن الطفرات التي تؤثر على وضع المخلفات المحفوظة بالكامل الموجودة على السطح العصاري الخلوي للحلزون تضعف تكرار HCV RNA دون التدخل في ارتباط الغشاء بـ NS5A. في الختام ، يشكل مجال مرساة الغشاء NS5A منصة فريدة من المحتمل أن تشارك في تفاعلات محددة ضرورية لتجميع مجمع تكرار HCV والتي قد تمثل هدفًا جديدًا للتدخل المضاد للفيروسات.

حقوق النشر 2004 American Society for Biochemistry and Molecular Biology، Inc.


المواد والأساليب

المواد

الدهون المستخدمة لتحضير NPs التي تم فحصها هي DOTAP و DOPC و DOPE-PEG2000 (يشار إليها هنا باسم PEG2K-lipid) ، والتي تم شراؤها كمحلول كلوروفورم من Avanti Polar Lipids (Alabaster ، AL). لتجارب الفلورة ، تم تحضير الجسيمات الشحمية باستخدام 0.2 ٪ بالوزن من تكساس الأحمر & # x000ae - 1،2-dihexadecanoyl- sn- الجلسرو -3 فوسفويثانولامين ، ملح ثلاثي إيثيل الأمونيوم (أحمر تكساس & # x000ae DHPE ، الإثارة / الانبعاث 595/615 نانومتر) من Invitrogen (كارلسباد ، كاليفورنيا). تم استخدام أربعة أنواع متميزة من الحمض النووي لتشكيل الجسيمات النانوية UltraPure Salmon Sperm DNA Solution (S-DNA) (Invitrogen (Carlsbad ، CA)) ، Lambda Phage DNA (& # x003bb-DNA) (Thermo Scientific (Waltham ، MA)) ، pGL3 Luciferase Reporter plasmid DNA (pGL3) (Promega (Fitchburg ، Wisconsin)) ، والذي تم نشره عبر Qiagen Plasmid Plus Mega Kit (Venlo ، Limburg) و 11 bp DNA (تم شراؤه كخيوط مفردة من Sigma-Genosys (Sigma-Aldrich (St. Louis ، MI) وتم تسليمها كغشاء مجفف بالتجميد). تم خلط الخيوط المفردة التكميلية بنسبة متساوية ، وتم تخفيفها إلى تركيز نهائي قدره 10 مجم / مل ، وتم تسخينها في حمام مائي وتم الاحتفاظ بها عند 90 & # x000b0C لمدة 15 دقيقة وببطء يتم تبريده إلى درجة حرارة الغرفة للسماح بالتهجين الكامل. بالنسبة لدراسات الفلورة ، تم تصنيف الحمض النووي باستخدام YOYO-1 (Invitrogen (Carlsbad ، CA)) وفقًا لجهة التصنيع وبروتوكول # x02019s.

تحضير الجسيمات الشحمية

تم تحضير الجسيمات الشحمية بخلط الدهون في محاليل الكلوروفورم عند النسبة المولية المرغوبة في قوارير زجاجية. تم بعد ذلك تبخير المذيب باستخدام تيار من النيتروجين متبوعًا بتفريغ التفريغ لمدة 12 ساعة. تمت إضافة المقدار المناسب من المقاومة العالية (18.2 M & # x02126 & # x000b7m & # x022121) إلى طبقة الدهون الجافة واحتضانها عند 37 & # x000b0C بين عشية وضحاها. تم بعد ذلك صوتنة محاليل الليبوزوم باستخدام جهاز صوتي ذي طرف لإنتاج حويصلات صغيرة أحادية الطبقة.

المجهر الإلكتروني بالتبريد

تم تحضير العينات عن طريق خلط محاليل الدهون والحمض النووي بتركيز نهائي قدره 3 مجم / مل أو 30 مجم / مل ، واحتضان محلول CL & # x02013DNA لمدة 20 دقيقة. تم تشكيل جميع عينات EM البرد في ماء عالي المقاومة باستثناء الشكل 2 أ والشكل 3 أ اللذان تم تشكيلهما عند 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم. بعد ذلك ، تمت إضافة 3 & # x000b5L من تعليق العينة إلى بلازما نظيفة نظيفة (Solarus plasma Cleaner (Gatan Inc. (Pleasanton ، CA) 25 ٪ O2 ، 75 ٪ Ar خليط) شبكة Cflat ذات 400 شبكة ، تم تنظيفها بورق الترشيح لمدة 9 ثوانٍ وتم تزجيجها على الفور في الإيثان السائل باستخدام Vitrobot (شركة FEI (هيلزبورو ، أور)). تم تخزين الشبكات تحت النيتروجين السائل حتى يتم نقلها إلى المجهر الإلكتروني للتصوير.تم نقل شبكات الجليد الزجاجي إلى المجهر الإلكتروني باستخدام جهاز التبريد. -المرحلة التي تحافظ على الشبكات عند درجة حرارة & # x02212170 & # x000b0C. تم التقاط الصور باستخدام Tecnai F20 TEM (شركة FEI) التي تعمل بسرعة 120 كيلو فولت ومزودة بكاميرا جاتان 4k x 4k CCD (Gatan Inc. (Pleasanton ، CA)) باستخدام نظام برنامج Leginon. تم الحصول على 46 صورة عالية التكبير باستخدام حجم بكسل يبلغ 0.22 نانومتر ، وكانت ظروف التصوير الاسمية عبارة عن تركيز أقل من

2.5 & # x000b5m ، وجرعة إلكترون من

20 e & # x02212 / & # x000c5 2. تم إنشاء تحويلات فورييه والتكامل السمتي باستخدام ImageJ.

تتعايش CL & # x02013DNA NPs الزائدة مع الجسيمات الشحمية والمذيلات ذات الخيوط & # x003c1التغيير & # x0003e 1 (نسبة الشحنة المولية للدهون الموجبة إلى الحمض النووي الأنيوني) (أ ، ب) صورة مجهرية Cryo-EM لـ CL & # x02013DNA NPs تشكلت بنسبة مولارية 80/15/5 DOTAP / DOPC / PEG2K-lipid عند & # x003c1التغيير = 3 مع S-DNA. في (أ) تم تحضير العينة عند 30 مجم / مل وهو التركيز الشائع الاستخدام في تجارب الأشعة السينية ذات الزاوية الصغيرة. تم الطرد المركزي للعينة في (A) على نطاق واسع لتشكيل بيليه ، وتعليقها وتصويرها ، ولكنها تظهر NPs فرعية محددة جيدًا. في & # x003c1التغيير= 3 ، CL & # x02013DNA NPs (الأسهم الصلبة) ، الجسيمات الشحمية الموجبة (الأسهم المتقطعة) والمذيلات الصغيرة المتفرعة (الأسهم المنقطة) تتعايش عند التوازن. يبدو أن بعض الميسيلات التي تشبه الخيوط هي نتوءات من CL & # x02013DNA NPs (الأسهم الحمراء). في (ب) تم تحضير العينة عند 3 مجم / مل. (ج) نموذج مُعد في & # x003c1التغيير = 10 و 3 مجم / مل (نسبة الضرس الشحمي 80/15/5 DOTAP / DOPC / PEG2K-lipid). تزداد نسبة الجسيمات الشحمية (الأسهم المتقطعة) إلى CL & # x02013DNA NPs (الأسهم الصلبة) مع & # x003c1التغيير كما هو متوقع. كما لوحظت مذيلات كروية صغيرة (أسهم منقطة). (د) إمكانات زيتا لـ CL & # x02013DNA NPs في جزيئات مختلفة من جزيئات PEG2K-lipid بالقرب من & # x003c1التغيير& # x02248 5. تشير الخطوط الرمادية المتقطعة الأفقية والعمودية إلى & # x003b6 = 0 mV و & # x003c1التغيير = 1 على التوالي. (ه) قطعة أرض من الحد الأقصى والحد الأدنى من إمكانات زيتا لـ CL & # x02013DNA NPs. تعتمد هذه الإمكانات بشدة على نسبة المول٪ للدهون الموجبة. (F) عينة ضابطة تحتوي فقط على الجسيمات الشحمية (بدون DNA). حتى عند أقل من 5 جزيء جرامي من PEG2K-lipid ، تتعايش الجسيمات الشحمية أحادية الطبقة (السهم الصلب) مع المذيلات الكروية (الأسهم المنقطة). (جي ، ح) المناطق التي تم اقتصاصها (مربعات متقطعة) من C ، F). شوهدت مذيلات صغيرة تحت 5 نانومتر (أسهم منقطة) تم استخدام DNA السلمون في جميع النتائج الموضحة.

تتعايش CL & # x02013DNA NPs مع micelleslike بتركيزات عالية. (أ) تم تشكيل NPs في & # x003c1التغيير = 3 مع DOTAP / DOPC / PEG2K- دهن بنسبة مولارية 80/15/5. مع الحمض النووي السلمون. بالقرب من حافة ثقب الكربون ، تتعايش CL & # x02013DNA NPs (السهم الصلب) ، والجسيمات الشحمية (السهم المتقطع) ، والمذيلات (الأسهم المنقطة). تشير الجسيمات الشحمية المشوهة (الأسهم الحمراء) إلى أن سمك غشاء الماء المعلق يمكن مقارنته بقطر الجسيمات الشحمية. يتم إثبات ذلك من خلال التنظيم المكاني لجميع الكائنات بناءً على الحجم. يُظهر وسط فيلم الماء مذيلات شبيهة بالخيوط مرتبة بدرجة عالية مع تباعد منتظم. نهايات المذيلات التي تشبه الخيط مرئية بوضوح (الأسهم الصفراء). تتميز بعض المناطق بما يبدو أنه أكوام من micelles مرتبة ثنائية الأبعاد (أسهم برتقالية). (ب) تحويل فورييه ثنائي الأبعاد للمنطقة المعبأة في (أ) ، يظهر حلقتين. (ج) يُظهر التكامل الشعاعي لتحويل فورييه في (ب) قمتي عامل هيكل متراكبتين على عامل شكل ضعيف. مواضع الذروة تتوافق مع qتشغيل= n (2 & # x003c0 / d) حيث d = 14.3 نانومتر (متوسط ​​التباعد بين مركز اثنين من المذيلات). التغيير في المنحدر عند qم = 1.672 نانومتر & # x022121 يمثل عامل الشكل الأدنى المقابل لسمك المذيلات (& # x003b4م= 3.727 نانومتر).

تفكك الضوء الديناميكي

تم إجراء قياسات الحجم والشحنة الفعالة لمجمعات CL & # x02013DNA والجسيمات النانوية (NPs) باستخدام Malvern Nanosizer ZS (Malvern Worcestershire ، المملكة المتحدة). تم خلط ما مجموعه 2 & # x000b5g من الحمض النووي والكمية المناسبة من الجسيم الشحمي (لتحقيق نسبة شحنة الدهون / الحمض النووي المرغوبة) في 1 مل من المخزن المؤقت المناسب (ماء عالي المقاومة أو DMEM كما هو موضح في الأشكال) وحضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. ثم تم نقل المحلول إلى كوفيتات للقياس اللاحق. تظهر المخططات قطر متوسط ​​z دض والذي يعرف بأنه دض = & # x02329د 6 & # x0232a / & # x02329د 5 & ​​# x0232a. تم إجراء جميع قياسات جهد زيتا في ماء عالي المقاومة. جميع نقاط البيانات لتشتت الضوء الديناميكي وإمكانات زيتا هي متوسط ​​قياسين تم إجراؤهما على نفس العينة. تظهر أشرطة الخطأ الانحراف المعياري.

المجهر مضان

تم تحضير عينات للفحص المجهري الفلوري باستخدام الأصباغ الموصوفة في المواد. تم تحضير ما مجموعه 50 & # x000b5L من العينة بنفس تركيز DLS (0.1 & # x000b5g من الحمض النووي والكمية المناسبة من الدهون بناءً على نسبة الشحن المرغوبة) ، وتم وضع 2 & # x000b5l من هذا المحلول بينهما غطاء زجاجي وشريحة ومختومة بشحم مفرغ. تم تصوير الحل بكاميرا نيكون ديافوت 300 (نيكون (طوكيو ، اليابان)) مزودة بكاميرا نيكون 1.4 NA 60x خطة Apo DIC و Sensicam QE CCD (PCO (Kelheim ، ألماني)).


الملخص

توفر تفاعلات الدوران متباينة الخواص المقاسة لبروتينات الغشاء في المذيلات ذات الاتجاه الضعيف وفي الطبقات الثنائية الدهنية الموجهة قيودًا عالية الدقة مستقلة ومكملة بشكل محتمل لتحديد الهيكل. نوضح هنا أن بروتين الغشاء CHIF يتبنى هيكلًا مشابهًا في المذيلات الدهنية والطبقات الثنائية ، مما يسمح بدمج القيود من عينات micelle و bilayer بطريقة تكميلية لتعزيز المعلومات الهيكلية. يوفر الحساب الخلفي وتخصيص طيف الرنين المغناطيسي النووي لـ CHIF في طبقات ثنائية الدهون الموجهة ، من الهيكل المحدد في المذيلات ، قيودًا إضافية لتحديد الهيكل بالإضافة إلى التوجه العالمي للبروتين في الغشاء. يتيح الاستخدام المشترك للحل وقيود الرنين المغناطيسي النووي ذات الحالة الصلبة أيضًا التحقق من صحة التحليل الهيكلي.

في الأوراق التي تحتوي على أكثر من مؤلف واحد ، تشير العلامة النجمية إلى اسم المؤلف الذي يجب توجيه الاستفسارات إليه حول الورقة.


6. نشر دراسات على bicelles

يعد الانتشار الجزيئي ، ولا سيما الانتشار متعدية ، عملية النقل الأساسية في الطبيعة. الأهم من ذلك ، أن الحركة البراونية في طبقات الدهون الثنائية تحكم مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية المهمة التي تتراوح من نقل الإشارة إلى نقل العناصر الغذائية عبر أغشية الخلايا بحيث يتم تخصيص جزء كبير من الأدبيات لهذا الموضوع. ومع ذلك ، يمكن أن تكون الحركة البراونية في الأغشية الدهنية معقدة للغاية بسبب عدم تجانس معظم الأنظمة البيولوجية ، إلا أن هناك حاجة إلى معامل واحد أنيق ، أي معامل الانتشار الجانبي ، أي مكون موتر الانتشار المتعامد مع الطبقة الثنائية العادية ، لوصف هذه العملية المعقدة. تكمن أناقة هذا المعامل في عمق المعلومات التي يحملها ، ولا سيما العلاقة بين المشتت وبيئته. تختلف معاملات الانتشار الجانبي في غشاء الخلية حسب الحجم: من الفسفوليبيدات سريعة الانتشار إلى بروتينات الغشاء متعدد الحلزون التي تتحرك ببطء. بالنسبة للأنواع التي تكون أحجامها قابلة للمقارنة مع حجم الدهون ، يبدو أن معاملات انتشارها تتبع نموذج الحجم الحر بينما تنتشر الأنواع الأكبر وفقًا للنموذج الهيدروديناميكي. حاليًا ، يتم الحصول على معظم معاملات الانتشار عن طريق استعادة التألق بعد التبييض الضوئي (FRAP) بينما يتم استخدام تتبع الجزيء الفردي بشكل متزايد لدراسة انتشار الجزيئات فى الموقع. تعتبر هذه التقنيات الضوئية ذات قيمة في توفير معلومات مفصلة عن الانتشار الجزيئي ، ومع ذلك ، فإن هذه التقنيات تعمل فقط إذا كانت الجزيئات متألقة بطبيعتها. لذلك ، هناك حاجة إلى نهج بديل للجزيئات التي تفتقر إلى هذه الخاصية البصرية وحيث لا يكون إدخال علامة الفلورسنت خيارًا.

يوفر التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي وسيلة بديلة لقياس معاملات الانتشار في نظام غشاء نموذجي. على وجه الخصوص ، تطورت تقنية التدرج النبضي للمجال النبضي (PFG) التي قدمها Stejskal و Tanner [66] إلى أداة قوية قادرة على تحديد معاملات الانتشار لمجموعة واسعة من الأنظمة الجزيئية الكبيرة. يسمح PFG NMR بالتحديد السريع والمتزامن لمعاملات الانتشار المتعددة من الأنواع المختلفة ، بشرط أن تكون رنيناتها قابلة للحل. وجد لاحقًا أن استخدام الصدى المحفز (STE) مفيد لقياس معاملات الانتشار [170]. توفر المنشورات الأساسية [66،170] الإطار النظري الأساسي لقياسات انتشار PFG NMR. لذلك ، سيتم تقديم وصف موجز فقط هنا. معامل الانتشار للأنواع ، د، في ظل حالة الخواص ، يمكن استخلاصها من تجربة STE-PFG NMR عن طريق قياس توهين الإشارة كدالة لمدة التدرج (& # x003b4) ، سعة التدرج (ز) ووقت الانتشار (& # x00394) كما هو مبين في تسلسل النبض في الشكل 9. يتم تخفيف شدة الرنين المغناطيسي النووي الملحوظ وفقًا لـ

يتكون تسلسل النبضات STE-PFG NMR من ثلاث نبضات تردد راديوي 90 & # x000b0 ونبضتين متدرجتين ذات سعة ومدة متطابقة. يتم ترتيب تجربة STE-PFG NMR بحيث تتلاشى شدة الصدى ، كدالة لـ & # x003b4, ز أو & # x00394، يتناسب مع معامل الانتشار للأنواع محل الاهتمام.

أين & # x003b3 هي النسبة الجيرومغناطيسية للنواة المرصودة و أنا و أنا0 هي شدة الإشارة المرصودة والأولية ، على التوالي [66170].

الانتشار الجانبي في بيئة طبقة ثنائية الدهون متباين الخواص بحيث يتم تمثيل معامل الانتشار على أنه موتر انتشار وفقًا لـ

هناك تناسق أحادي المحور حول الطبقة الثنائية العادية ولذلك يلزم وجود مكونين رئيسيين فقط لتمثيل النظام. يتوافق هذان المكونان مع الانتشار الجزيئي على طول عمودي (د& # x022a5) ومتوازي (د||) الاتجاهات إلى الطبقة الثنائية العادية كما هو موضح في الشكل 8.

في نظام طبقة ثنائية الدهون ، هناك حاجة لمكونين فقط لوصف موتر الانتشار. يتم وصف الاتجاه النسبي للطبقة الثنائية العادية وبالتالي المكونات الرئيسية للانتشار فيما يتعلق بالمجال المغناطيسي الخارجي بالزاوية & # x003b8. يحدد المكون D z z lab لموتر الانتشار الذي يصطف مع المجال المغناطيسي ويمكن قياسه.

إذا تم تطبيق التدرج على طول المختبر ض-المحور المختار على طول اتجاه المجال المغناطيسي الخارجي ب0 (انظر الشكل 8) ، ثم فقط دض يتم قياس مكون موتر الانتشار في إطار المختبر. العلاقة بين دض والمكونات الرئيسية في الإطار الجزيئي ، والتي تحاذي بشكل متوازٍ ومتعامد فيما يتعلق بالطبقة الثنائية العادية كما هو موضح أعلاه ، يتم إعطاؤها بواسطة

إذا كانت الجزيئات المكونة للمرحلة تحتوي على تركيز مذيل حرج منخفض (CMC) ، كما هو الحال بالنسبة للدهون بشكل عام ، فلا يوجد انتشار قابل للاكتشاف موازٍ للطبقة الثنائية العادية ، د|| = 0. هكذا فقط المصطلح دض = د& # x022a5الخطيئة 2 & # x003b8 يبقى في المعادلة. (3). ومن المثير للاهتمام ، بالنسبة للحالة التي تكون فيها الطبقة الثنائية العادية متعامدة مع التدرج المطبق ، فإن معامل الانتشار الملحوظ في إطار المختبر (دض) يساوي انتشار الانتشار الجانبي (د& # x022a5) في طبقة ثنائية الدهون. لذلك ، من أجل قياس معامل الانتشار للجزيء في نظام طبقة ثنائية الدهون ، يلزم وجود عينة متوائمة وتوفر bicelles وسطًا مناسبًا لهذا الغرض. في الآونة الأخيرة ، أظهر Soong و Macdonald [171] جدوى قياس انتشار الدهون المطعمة بالبوليمر ، وبالتحديد DMPEPEG2000 ، في bicelles المحاذاة مغناطيسيًا باستخدام تقنية STE-PFG NMR ، يظهر تسلسل النبض في الشكل 9.

يُقاس معامل الانتشار من خلال مراقبة انحلال شدة إشارة 1 H للدهون المطعمة بالبوليمر كدالة لمدة التدرج. تنتج الحركة الداخلية السريعة لـ PEG رنينًا ضيقًا قدره 1 H ، مما يجعل القياس ممكنًا. تم العثور على معامل الانتشار المقاس ليكون مشابهًا في الحجم لقياسات FRAP لـ DMPC في المرحلة البلورية السائلة [171]. لذلك ، يوضح هذا جدوى bicelles كوسيلة لدراسات الانتشار الجانبي للأمفيوفيل المرتبطة بالغشاء في بيئة ثنائية الطبقة. توضح النتائج أيضًا إمكانية استخلاص معامل الانتشار لبروتين غشائي عبر STE-PFG NMR ، وهو أمر مهم لفهمنا لتهريب البروتين في طبقات الدهون الثنائية. لذلك ، يوضح هذا أن bicelles هي أكثر من مجرد وسيلة إعادة تشكيل لبروتينات الغشاء في الواقع ، يمكن استخدامها كمنصة لدراسات الانتشار الجانبي عبر NMR. تم الحصول على نتيجة مثيرة للاهتمام فيما يتعلق بمورفولوجيا bicelle أيضًا في قياسات الانتشار هذه: تظهر المكونات الجزيئية انتشارًا مجانيًا على مسافات ميكرون. تتوافق هذه الملاحظة مع مورفولوجيا الصفائح المثقبة في bicelles [172] وتؤيد أيضًا بيانات SANS [159] ودراسات انتشار tetramethylsilane في محاليل bicelle المخففة [156].

يمكن أيضًا إجراء دراسات الانتشار على bicelles ذات المستوى المنخفض ف النسب (0.5 & # x02264 ف & # x02264 1). نظرًا لصغر حجمها ، فإن هذه bicelles تتقلب بشكل متناحي ، وبالتالي فهي مناسبة للدراسات عالية الدقة لبروتينات الغشاء. ومن المثير للاهتمام أن bicelles منخفضة ف توجد النسبة كمجموعات شبيهة بالقرص وتكون أحادية النسبي نسبيًا في قطرها وسمكها. في ف = 0.5 ، قطرها المقدر حوالي 8 نانومتر ، ضعف سمك الطبقة الثنائية المفترض [152]. يتغير قطر هذه bicelles سريعة الانقلاب في وجود الببتيدات المرتبطة بالغشاء. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام هذه bicelles لقياس معاملات الانتشار الجانبي للببتيدات المرتبطة بالغشاء والنتائج قابلة للمقارنة مع قيم الأدبيات. بينما توضح هذه التجارب جدوى استخدام bicelles لدراسات الانتشار ، يجب توخي الحذر حيث يتم قياس معامل الانتشار الجانبي بالمعنى النسبي حيث تنتشر جميع المكونات في العينة بمعدلات مختلفة. على وجه الخصوص ، لا توفر bicelle الدهنية ككل إطارًا مرجعيًا ثابتًا ، نظرًا لأنها نفسها تخضع لانتشار جانبي كبير. ومع ذلك ، فإن هذه bicelles هي أنظمة غشاء نموذجية ممتازة للتحقيق في حركية الربط من الببتيدات والأرواح المرتبطة بالغشاء.

تم استخدام قياسات الانتشار بواسطة PFG NMR للتحقيق في مورفولوجيا ثلاث وسائط شائعة الاستخدام في دراسة أدوات التوصيل ثنائية القطب المتبقية ، وهي bicelles الدهنية الموجهة ، وبروميد cetylpyridinium ، ومزيج من PEG و ن-هكسانول [156]. تم قياس نصف القطر الهيدروديناميكي للمذيلات و bicelles الخواص بواسطة التدرجات النبضية ثنائية القطب [173]. في هذه القياسات ، تم استخدام الليزوزيم كمركب مرجعي لتصحيح الاختلافات في الحجم الهيدروديناميكي بين البروتين الجاف والمرطب ، البيسيل ، أو الميلي. تمت دراسة حركة الدهون المكونة في bicelles الخواص بواسطة 13 C الاسترخاء ، PFG NMR ، و EPR [174]. وجد أن التنقل المحلي يعتمد بشدة على المنظف المستخدم أكثر من اعتماده على حجم الباسيل. تم العثور على الببتيدات المختلفة ليكون لها تأثير على الديناميات الظاهرة. في دراسة لاحقة ، تم استخدام قياسات الانتشار لدراسة حجم وشكل bicelles المنخفضة ف النسبة التي تتعثر بشكل متناحي الخواص [175]. تم استخدام ثلاثة مكونات دهنية مختلفة طويلة السلسلة ، وهي ديالوروويل فوسفاتيديل كولين (DLPC) و DMPC و DPPC ، لدراسة ديناميات الدهون كدالة لسمك الطبقة الثنائية [176].

يتعلق الانتشار الدوراني بجزيء ودرجات دوران للحرية في الجزيء على عكس الحركة الانتقالية التي تمت مناقشتها حتى الآن. تعاني الدهون والبروتينات في عينة ثنائية الطبقة من الانتشار الدوراني ، والذي يحدث بحرية أكبر حول الطبقة الثنائية العادية. عادة ما يكون سريعًا على مقياس الوقت NMR ، طالما تمت دراسة البروتينات والببتيدات ذات الحجم الجزيئي المعتدل. في أطياف الرنين المغناطيسي النووي ، يصبح الانتشار الدوراني واضحًا من شكل خطوط الرنين المغناطيسي النووي المرصود حيث أن متوسط ​​تفاعلات الدوران متباينة الخواص على طول محور الدوران يغير شكل الخطوط الطيفية وحجم التفاعل. نتيجة لذلك ، يمكن أن تعطي الحويصلات متعددة الطبقات (MLVs) نفس المعلومات مثل العينات الموجهة بشكل مجهري [6،7،177،178] ، ويتم تحديد الاختيار في الغالب من خلال سهولة التحضير وقضايا الحساسية. ومع ذلك ، تم الإبلاغ عن أن القياسات الهيكلية للببتيد المضاد للميكروبات PGLa قد تتأثر بمستويات الترطيب المختلفة الموجودة في MLVs مقارنة بالبيانات التي تم الحصول عليها من العينات الموجهة بشكل مجهري المصنوعة من أكوام من الألواح الزجاجية [7]. بالنسبة للقرص مثل القرص ، وجد أن الانتشار الدوراني حول الطبقة الثنائية العادية يكون سريعًا بما يكفي لمعدل التوزيع الأسطواني حول هذا المحور ، حتى في الحالات النادرة التي لا يخضع فيها البروتين المضمن نفسه للانتشار الدوراني بالسرعة الكافية لتحقيق المتوسط ​​المطلوب [179 ]. نتيجة لذلك ، حتى البروتينات الكبيرة جدًا ومجمعات البروتين قابلة للدراسات في bicelles غير المقلوبة.


ما هي Micelles؟ (مع الصور)

المذيلات هي كرات من الدهون تتشكل في المحاليل المائية. في البشر ، يتشكلون من أملاح الصفراء. تساعد هذه المجاميع الميسيلار على نقل المنتجات الهضمية للدهون إلى الأمعاء ليتم امتصاصها. كما أنها تستخدم كمنظفات.

جزء من الطعام الذي نتناوله مصنوع من الزيوت والدهون. تتحلل هذه أثناء الهضم في المعدة ، بواسطة إنزيم الليباز ، إلى مركبات شبيهة بالدهون ، بما في ذلك الأحماض الدهنية. يحدث تدهور إضافي في البنكرياس باستخدام ليباز مختلف. الليباز قابلة للذوبان في الماء ، على عكس المركبات التي تتحلل. يتطلب التدهور مساعدة المنظفات البيولوجية المعروفة باسم الأملاح الصفراوية ، التي تفرزها المرارة والكبد.

يتم إنتاج الميسيلات من الأملاح الصفراوية التي تساعد في جعل الأحماض الدهنية ومنتجات تحلل الدهون الأخرى متاحة للتحلل بواسطة الليباز. مبدأ تكوين الميلي هو مثل عدم اختلاط الزيت بالماء. تحتوي العديد من فئات الدهون على مجموعة رأس قطبية وتتفاعل جيدًا مع الماء. لديهم أيضًا مجموعتان من الذيل كارهتان للماء. لا تتفاعل مجموعات الذيل هذه جيدًا مع الماء وتفضل أن تكون في مجموعات مع جزيئات أخرى كارهة للماء ، مثل شكل من أشكال الزيت.

بتركيزات منخفضة ، تكون الدهون والأحماض الدهنية قابلة للذوبان في الماء. العامل الدافع لتكوين الميلي هو عندما تصل هذه المركبات إلى تركيز أعلى ، يُعرف باسم تركيز micelle الحرج (CMC). بتركيزات أكبر من CMC ، تتجمع مجموعات الذيل الكارهة للماء بشكل تلقائي لتجنب الماء. تبرز مجموعات الرأس القطبية في مواجهة الماء ، بينما يمتلئ المركز بذيول كارهة للماء تستبعد الماء. This generally gives the miceller aggregates the structure of a sphere, although they can be shaped like a disk.

Mixed micelles can be composed of various compounds that are not very soluble in water. These compounds are dissolved in the center of the sphere where they can blend in with the hydrophobic tails. In this manner, they are transported by micellar aggregates of bile salts to the intestine to be further broken down. These structures are the major way in which lipids get to the cell surface of the intestine to be absorbed. The rate of transport can be increased 1,000 times over that of individual fatty acids.

Cholesterol secreted by the liver can also travel in bile, in micelles. It is virtually insoluble in aqueous solutions, but is soluble in mixed micelles. Sometimes the body produces super-saturated bile with a high ratio of cholesterol. This can lead to gallstone formation. Other types of compounds that travel in these micellar aggregates are lipid-soluble vitamins, such as A, D, E, and K.

The structure of micelles is very similar to the lipid bilayer of biological membranes. The bilayers have the same type of interactions. The lipids, however, face each other giving a double layer of lipids instead of a sphere. The principle is the same as the structure of micellar aggregates with a hydrophobic interior and a polar exterior. Some types of lipids can readily exchange into the cellular membrane, from the micellar aggregrate.

Lipid bilayers can join ends to form a circle known as a liposome. These structures have an internal compartment. Liposomes are being used medically as carriers for drugs and enzymes. This allows doctors to target particular organs. It helps to avoid side effects like tissue damage and drug breakdown that can happen as drugs are introduced into the body by normal methods.

The compounds that make up micelles are also known as surfactants. These are compounds that are soluble in both oil and water. They allow compounds that are barely soluble in water to accumulate to higher concentrations within the micellar aggregates. The surfactant properties of these aggregates make them useful as detergents. They can dissolve oily deposits on clothes that will not wash off in water.

There is another type of micelle that is the reverse of the oil-in-water type. It has water-soluble substances dissolved in an organic solution. In this case, however, the polar head groups are in the center of the micelles, while the hydrophobic groups are on the outside, interacting with the organic solvent.


Abstract

Cellular respiration, mediated by the passive diffusion of oxygen across lipid membranes, is key to many basic cellular processes. In this work, we report the detailed distribution of oxygen across lipid bilayers and examine the thermodynamics of oxygen partitioning via NMR studies of lipids in a small unilamellar vesicle (SUV) morphology. Dissolved oxygen gives rise to paramagnetic chemical shift perturbations and relaxation rate enhancements, both of which report on local oxygen concentration. From SUVs containing the phospholipid sn-2-perdeuterio-1-myristelaidoyl, 2-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (MLMPC), an analogue of 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC), we deduced the complete trans-bilayer oxygen distribution by measuring 13 C paramagnetic chemical shifts perturbations for 18 different sites on MLMPC arising from oxygen at a partial pressure of 30 bar. The overall oxygen solubility at 45 °C spans a factor of 7 between the bulk water (23.7 mM) and the bilayer center (170 mM) and is lowest in the vicinity of the phosphocholine headgroup, suggesting that oxygen diffusion across the glycerol backbone should be the rate-limiting step in diffusion-mediated passive transport of oxygen across the lipid bilayer. Lowering of the temperature from 45 to 25 °C gave rise to a slight decrease of the oxygen solubility within the hydrocarbon interior of the membrane. An analysis of the temperature dependence of the oxygen solubility profile, as measured by 1 H paramagnetic relaxation rate enhancements, reveals that oxygen partitioning into the bilayer is entropically favored (Δس° = 54 ± 3 J K −1 mol −1 ) and must overcome an enthalpic barrier (Δح° = 12.0 ± 0.9 kJ mol −1 ).


Department of Biology (M 694), University of Konstanz, 78457 Konstanz, Germany

Department of Biology (M 694), University of Konstanz, 78457 Konstanz, Germany

Professor of Molecular Physiology and Biological Physics, University of Virginia, PO Box 800736, Charlottesville, VA 22908-0736, USA

ملخص

Thermodynamic Stability of FepA in Detergent Micelles

Thermodynamic Stability of OmpA in Phospholipids Bilayers

Thermal Stability of FhuA in Detergent Micelles

Insertion and Folding of β-Barrel Membrane Proteins in Micelles

Oriented Insertion and Folding into Phospholipid Bilayers

Assemblies of Amphiphiles Induce Structure Formation in β-Barrel Membrane Proteins

Electrophoresis as a Tool to Monitor Insertion and Folding of β-Barrel Membrane Proteins

pH and Lipid Headgroup Dependence of the Folding of β-Barrel Membrane Proteins

Rate Law for β-Barrel Membrane Protein Folding and Lipid Acyl Chain Length Dependence

Synchronized Kinetics of Secondary and Tertiary Structure Formation of the β-Barrel OmpA

Interaction of OmpA with the Lipid Bilayer is Faster than the Formation of Folded OmpA

Multistep Folding Kinetics and Temperature Dependence of OmpA Folding

Characterization of Folding Intermediates by Fluorescence Quenching

The β-Barrel Domain of OmpA Folds and Inserts by a Concerted Mechanism

Stoichiometry of the Lipid–Protein Interface

Lipid Selectivity of β-Barrel Membrane Proteins

Lipid Dependence of the β-Barrel Orientation Relative to the Membrane

Inclination of the β-Strands Relative to the β-Barrel Axis in Lipid Bilayers