معلومة

المعدلات النسبية لانتقال الحمض النووي الدائري والخطي وفائق الالتفاف في الرحلان الكهربائي للهلام الغاردي

المعدلات النسبية لانتقال الحمض النووي الدائري والخطي وفائق الالتفاف في الرحلان الكهربائي للهلام الغاردي


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد قرأت أن الحمض النووي البلازميدي الفائق الالتفاف يهاجر بشكل أسرع عند تعرضه للرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز وهذا منطقي بالنسبة لي لأنه صغير ويواجه أقل احتكاك بسبب بنيته فائقة الالتفاف.

ينتقل الحمض النووي الخطي أسرع من الشكل الدائري. لم أفهم لماذا بالضبط. ألا ينبغي اعتبار الشكل الدائري أصغر من الخطي ، وبالتالي أسرع؟


أولاً ، اسمحوا لي أن أقدم توضيحًا للوضع الموصوف في السؤال ، مع الإشارة.

على الرغم من أنه يمكنك رؤية هذا النوع من الأشياء ، فقط من خلال البحث عن "هجرة البلازميد على هلام الاغاروز" ، هذا واحد خاص بي من الألفية الماضية (plasmid pBR322) ، يظهر في نص من الألفية الماضية ، Adams وآخرون. الكيمياء الحيوية للأحماض النووية (الطبعة 11).

إن محاولة الملصق تبرير النتائج ، رغم أنها تعبر عن المأزق ، شابها الاستخدام الفضفاض للكلمة صغير، وغياب أي بيان يفسر لماذا يجب أن تهاجر القطع "الصغيرة" من الحمض النووي بسرعة أكبر.

الأشكال المختلفة من البلازميد لها نفس الكتلة الجزيئية تمامًا ، فما المقصود بالصغير؟ طريقتي الأولية في النظر إلى هذا هي اعتبار هلام الاغاروز كشبكة أو غربال يجب أن تمر الجزيئات من خلاله ، بحيث كلما زاد الحجم الذي يشغلونه في الفضاء ، قل احتمال مرورهم عبر "الثقوب" في الشبكة. يمكن اعتبار الحجم الذي يشغلونه في الفضاء على أنه الحجم الناتج عن تدويرهم من نقطة المنتصف في ثلاثة أبعاد. على هذا الأساس ، فإن الملفات الفائقة ، التي ينهار فيها الحمض النووي إلى أ قصيرة يجب أن يحتل الشكل الخطي الزائف للدهون أقل حجم في الفراغ ، و طويل رقيق خطي أعظم. يجب أن يضع قطر الدائرة في مكان ما بين الاثنين الآخرين.

لذلك ، نصل إلى نفس النتيجة التي توصل إليها الملصق: الهجرة الأسرع لـ "الخطية" من الدوائر المصقولة لا تتناسب مع هذا النموذج البسيط. في النص المصاحب للشكل كتبت "... نتيجة غير متوقعة إلى حد ما" دون محاولة شرحها.

هل يمكنني شرح هذه النتيجة غير المتوقعة إلى حد ما الآن؟ ينتج عن البحث على الإنترنت إما التلويح باليد أو التهرب (سأصحح هذا الأمر) ، لذلك يمكنني فقط أن أتخيل أن النتيجة لها علاقة بالجزيئات الخطية التي لديها فرصة أكبر لتوجيه نهاياتها إلى الثقوب في "الشبكة" من الدوائر المكسورة ، بسبب الطبيعة المفتوحة لهذه الأخيرة. ربما يمكن للمرء أن يتخيل جزءًا من الكرة على شكل ساعة زجاجية لتدوير الخطوط الخطية التي تسمح بتوجيه الأطراف نحو الثقوب.

المزيد من التلويح بالأيدي؟ ربما. لكن النقطة الأساسية هي أن التفسير الفيزيائي لهجرة الجزيئات ذات الأشكال المختلفة أثناء الرحلان الكهربائي أكثر تعقيدًا مما كان يأمله مجرد عالم أحياء.


آثار الالتفاف الفائق في المحاصرة الكهربي للحمض النووي الدائري في المواد الهلامية بولي أكريلاميد

تم استخدام السرعة والتوجيه الكهربي لدراسة الاصطياد الناتج عن المجال الكهربائي للحمض النووي الدائرية فائقة الالتفاف والمرتاح (2926 و 5386 bp) في المواد الهلامية بولي أكريلاميد (5٪ T ، 3.3٪ C) عند 7.5-22.5 فولت / سم ، باستخدام يتحكم في الجزيئات الخطية التي لها نفس طول الكفاف أو نفس نصف قطر الدوران. الملاءمة الخاصة بالدائرة قابلة للعكس. من مدة النبضة العكسية اللازمة لفصل الجزيئات ، يقدر متوسط ​​عمق المصيدة بـ 90 Å ، وهو ما يتوافق مع الشحنة الجزيئية وشدة المجال اللازمة لإبقاء الجزيئات محاصرة. تظهر الدوائر المحاصرة محاذاة قوية للمجال مقارنة بالشكل الخطي ، وهناك علاقة جيدة بين محاذاة المجال المحسنة للدوائر وبداية الملائمة في كل من الحقول الثابتة والنبضية. لا تُظهر الدوائر استجابة التجاوز في الاتجاه لنبضة الحقل التي تُرى بالحمض النووي الخطي ، ومعدل مقاييس نمو الاتجاه مثل ه −2 ± 0.1 مع المجال ، بدلاً من ه −1.1 ± 0.1 للصيغة الخطية. تظهر هذه النتائج أن الشكل الخطي يهاجر عن طريق التكرار الدوري ، في حين أن الدوائر على الأرجح محاصرة بواسطة خازوق على ألياف هلامية. ويدعم هذا الاقتراح سرعة متشابهة للغاية وسلوك توجيه للحمض النووي الدائري في مواد هلامية الاغاروز ، حيث تم اعتبار الخازوق أكثر احتمالًا بسبب ألياف الهلام الأكثر صلابة. كفاءة الاصطياد حساسة لطوبولوجيا الحمض النووي ، كما هو متوقع للتخوز. في بولي أكريلاميد ، يكون الشكل الملفوف (الكثافة الفائقة σ = −0.05) لديه احتمال اصطياد أقل بمرتين إلى أربعة أضعاف من الأنواع المسترخية المقابلة ، بينما في المواد الهلامية agarose ، لا يتم احتجاز الشكل المغطى بشكل فائق على الإطلاق. تتوافق هذه النتائج مع البيانات الموجودة حول متوسط ​​الثقوب في الهياكل الفائقة الالتفاف وسمك الألياف في نوعي الهلام. على أساس تأثير الطوبولوجيا ، يُقال أن الخوزق أثناء الرحلان الكهربائي للمجال النبضي في المواد الهلامية بولي أكريلاميد قد يكون مفيدًا لفصل هياكل الحمض النووي الأكثر تعقيدًا مثل العقد. تشير النتائج أيضًا إلى أنه يمكن استخدام ازدواج اللون الخطي على الجزيئات المحاذية للحقل لقياس زاوية الالتواء الفائق ، إذا تم استخدام دوائر DNA المريحة كعناصر تحكم لدرجة الاتجاه العالمية.


كيف أقوم بفتح وتكوين مربع حوار Simulate Agarose Gel؟

افتح & quotSimulate Agarose Gel & quot الحوار

لفتح مربع الحوار Simulate Agarose Gel ، انقر فوق أدوات → محاكاة هلام الاغاروز. .

حدد المسار 1 ، ثم اختر علامة MW من القائمة المنسدلة.

لاختيار حارة ، انقر فوق رقم فوق الجل.

بدلاً من ذلك ، انقر فوق رقم الممر في القائمة الموجودة أسفل الجل.

حدد تسلسل الهضم أو تفاعل البوليميراز المتسلسل

لتحديد تسلسل الهضم أو PCR ، قم بتوسيع حارة [N] القائمة ، ثم اختر الملف المطلوب.

جديد لـ SnapGene 5.2 والإصدارات الأحدث: يحاكي SnapGene بدقة معدلات الهجرة النسبية للحمض النووي فائق الالتفاف (الدائري المغلق تساهميًا).

قبل تحديد الهضم باستخدام إنزيمات التقييد ، سوف يقوم SnapGene بمحاكاة هجرة تسلسل دائري مثل DNA فائق الالتفاف. سيتم تمييز التسلسلات الفائقة غير المقطوعة على هذا النحو في القائمة.

سيتم عرض التسلسل المضاف حديثًا في الجل.

حدد اختياريًا Gel Buffer

يختلف هجرة الحمض النووي الفائق الالتفاف بالنسبة إلى الحمض النووي الخطي بشكل كبير اعتمادًا على محلول الرحلان الكهربائي.

إذا كنت ترغب في تغيير المخزن المؤقت الكهربائي المستخدم لمحاكاة ترحيل الحمض النووي فائق الالتواء ، فانقر فوق مؤشر المخزن المؤقت الأزرق لفتح تفضيلات SnapGene.


الشكل 2:

الآن دعونا نرى بعض الصور الحقيقية.

صورة الهلام أعلاه هي نتيجة تقييد الهضم. الممر 3 و 5 و 7 و 8 عبارة عن أليل عادي متماثل مع نطاق 184bp هنا أيضًا نطاق واحد من 68bp موجود ، لكنه غير مرئي.

لين 2 هو أليل متحولة غير مقطوع يبلغ 252 نقطة أساس.

الممر 1 و 6 متغاير الزيجوت يحتويان على ثلاثة أليلات: 252 نقطة أساس و 184 نقطة أساس و 68 نقطة أساس. ومع ذلك ، من الصعب التمييز بين النطاق 64bp ، لأن تركيز الهلام أقل من 3٪.

إذا كان تركيز الهلام 3٪ ، فسيتم رؤية المزيد من الأشرطة الأكثر حدة وربما يظهر النطاق 64 بت.

حارة 4 هي علامة جزيئية.


كيفية تشغيل هلام الاغاروز؟

يتم صب قالب الهلام على شكل لوح أفقي. يتم إنشاء المسافات البادئة باستخدام أمشاط بلاستيكية يتم فيها تحميل الحمض النووي. ومع ذلك ، قبل تحميل الحمض النووي ، يتم استخدام صبغة تحميل لخلط الحمض النووي لوزن العينة في المحلول. تترك هذه الطريقة علامة مرئية تساعد في تتبع تقدم حركة الحمض النووي.

بالنسبة للعينات غير المعروفة ، يتم تشغيلها على طول سلم الحمض النووي بطول معروف للحمض النووي للمقارنة. يتم وضع هلام الاغاروز في حاوية (خزان / علبة هلامية) تحتوي على محلول منظم موصّل يتم التحكم فيه عن طريق الأس الهيدروجيني. يتم تطبيق مجال كهربائي على طول الهلام.

يؤثر تدرج الجهد على سرعة الحركة عبر الهلام. يستخدم مصدر طاقة التيار المستمر لتشغيل المجال الكهربائي. في عملية الرحلان الكهربائي لجيل الاغاروز ، يتم ضبط مصدر الطاقة على جهد ثابت مع مراعاة حجم الخزان. (6 و 7 و 8)

الصورة 4: خضع الحمض النووي الجيني ، المستمد من عينة الدم ، لعملية الاغاروز الكهربائي للهلام.
مصدر الصورة:
Researchgate.net

تصور الحمض النووي

بمجرد انتقال الحمض النووي بالكامل من خلال الهلام ، فإن الخطوة المهمة التالية هي التخيل. الهدف هو التحقق من طول وعدد الجزيئات في عينة معينة. الحمض النووي ملطخ لتسهيل التصور نظرًا لحقيقة أن الحمض النووي غير مرئي للعين المجردة. عند التصوير بالهلام ، يتم استخدام صبغة الفلورسنت لأنها توفر مستويات كشف أفضل.

يتم التقاط صورة هلام الاغاروز باستخدام كاميرات عالية الحساسية ومجهزة بأضواء الضوء الأزرق. يتم استخدامه لإثارة بقع الفلورسنت لإصدار الضوء ثم يتم التقاطها بواسطة الكاميرا.

تحتوي مستندات الهلام على نوع من مصدر الإضاءة ، وهو مرشح يتخلص من ضوء الخلفية ، وكاميرا للتحقق من الإشارة. تُستخدم الصورة الملتقطة للتحقق من ذلك وفقًا لأنماط نطاق الحمض النووي ، وهو أمر مفيد في التحقق من طول وكمية الحمض النووي. (5 و 7 و 8 و 9)

الصورة 5: يعتبر الرحلان الكهربائي لجيل الاغاروز أحد الإجراءات الشائعة الاستخدام لفصل الجزيئات البيولوجية.
مصدر الصورة:
wikimedia.org

لماذا يستخدم الاغاروز في الرحلان الكهربائي للهلام بدلا من الاجار؟

Agar هو أحد المواد المستخدمة بشكل شائع عند القيام بالرحلان الكهربي. ومع ذلك ، فإن استخدام هلام الاغاروز أصبح شائعًا بشكل متزايد. في الواقع ، يُفضل على أجار لأنه سهل الإلقاء ويحتوي على عدد أقل من المجموعات المشحونة.

إنه مثالي لفصل الحمض النووي بأحجام مختلفة ، خاصةً تلك التي يتم مواجهتها بشكل شائع في المختبر. يمكن رؤية الحمض النووي المنفصل بسهولة عن طريق التلوين وبمساعدة الإضاءة المناسبة مثل الضوء فوق البنفسجي.

عملية الاستخراج سهلة نسبيًا أيضًا. يتراوح هلام الاغاروز النموذجي المستخدم بين 0.7٪ و 2٪ ويذوب في محلول رحلان كهربائي. (2 و 4 و 7)


المعدلات النسبية لانتقال الحمض النووي الدائري والخطي وفائق الالتفاف في الرحلان الكهربائي للهلام الغاريني - علم الأحياء

الحمض النووي معاد التركيب


ما هو هلام التفريد؟


الرحلان الكهربائي للهلام هو طريقة تفصل الجزيئات الكبيرة - سواء الأحماض النووية أو البروتينات - على أساس الحجم والشحنة الكهربائية والخصائص الفيزيائية الأخرى.

الجل هو مادة غروانية في شكل صلب. يصف مصطلح الرحلان الكهربائي هجرة الجسيمات المشحونة تحت تأثير المجال الكهربائي. يشير Electro إلى طاقة الكهرباء. Phoresis ، من الفعل اليوناني phoros ، يعني & quotto ينقل عبر. & quot وهكذا ، يشير الرحلان الكهربائي للهلام إلى التقنية التي يتم فيها دفع الجزيئات عبر مدى من الهلام ، بدافع من تيار كهربائي. توفر الأقطاب الكهربائية النشطة في أي من طرفي الجل القوة الدافعة. تحدد خصائص الجزيء مدى السرعة التي يستطيع بها المجال الكهربائي تحريك الجزيء عبر وسط هلامي.

تمتلك العديد من الجزيئات البيولوجية المهمة مثل الأحماض الأمينية والببتيدات والبروتينات والنيوكليوتيدات والأحماض النووية مجموعات قابلة للتأين ، وبالتالي ، في أي درجة حموضة معينة ، توجد في محلول كأنواع مشحونة كهربائيًا إما كاتيونات (+) أو أنيونات (-). اعتمادًا على طبيعة الشحنة الصافية ، ستهاجر الجسيمات المشحونة إما إلى القطب السالب أو إلى القطب الموجب.

هناك نوعان أساسيان من المواد المستخدمة في صناعة المواد الهلامية: الاغاروز وبولي أكريلاميد. Agarose هو غرواني طبيعي مستخرج من الأعشاب البحرية. Agarose هو سلسلة من جزيئات السكر ، ويتم استخراجه من الأعشاب البحرية. يقوم المصنعون بإعداد درجات خاصة من الاغاروز للتجارب العلمية. لأن الاغاروز يخضع لكثير من المعالجة التجارية فهو مكلف للغاية.

إنه هش للغاية ويمكن تدميره بسهولة عن طريق التعامل معه. المواد الهلامية من Agarose لها حجم كبير جدًا & quot؛ & quot؛ وتستخدم بشكل أساسي لفصل الجزيئات الكبيرة جدًا ذات الكتلة الجزيئية التي تزيد عن 200 كيلو دالتون. يمكن معالجة المواد الهلامية Agarose بشكل أسرع من المواد الهلامية بولي أكريلاميد ، ولكن حلها أقل شأنا. وهذا يعني أن العصابات المتكونة في المواد الهلامية agarose مشوشة ومنتشرة بشكل متباعد. هذا ناتج عن حجم المسام ولا يمكن التحكم فيه.

Agarose هو عديد السكاريد الخطي (متوسط ​​الجزيئي حوالي 12000) يتكون من وحدة التكرار الأساسية agarobiose ، والتي تشتمل على وحدات متناوبة من الجالاكتوز و 3،6-anhydrogalactose. عادة ما يستخدم الاغاروز بتركيزات بين 1٪ و 3٪.

يتم تشكيل المواد الهلامية Agarose عن طريق تعليق الاغاروز الجاف في محلول مائي ، ثم غلي الخليط حتى يتشكل محلول واضح. يُسكب ويُترك ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة لتشكيل مادة هلامية صلبة.


بولي أكريلاميد

هناك نوعان أساسيان من المواد المستخدمة في صناعة المواد الهلامية: الاغاروز وبولي أكريلاميد. تم تقديم تقنية الرحلان الكهربائي للهلام متعدد الأكريلاميد (PAGE) بواسطة Raymond and Weintraub (1959). بولي أكريلاميد هو نفس المادة المستخدمة في أقطاب الجلد والعدسات اللاصقة اللينة. يمكن تحضير هلام بولي أكريلاميد لتوفير مجموعة متنوعة من ظروف الرحلان الكهربي. قد يتنوع حجم المسام للجيل لإنتاج تأثيرات متسلسلة جزيئية مختلفة لفصل البروتينات ذات الأحجام المختلفة. بهذه الطريقة ، يمكن التحكم في نسبة بولي أكريلمايد في مادة هلامية معينة. من خلال التحكم في النسبة المئوية (من 3٪ إلى 30٪) ، يمكن الحصول على أحجام مسام دقيقة ، عادة من 5 إلى 2000 دينار كويتي. هذا هو النطاق المثالي لتسلسل الجينات ، والبروتين ، والببتيد ، وتحليل الإنزيم. يمكن صب المواد الهلامية بولي أكريلاميد في نسبة مئوية واحدة أو بتدرجات متفاوتة. توفر المواد الهلامية المتدرجة انخفاضًا مستمرًا في حجم المسام من أعلى إلى أسفل الجل ، مما ينتج عنه أشرطة رفيعة. بسبب تأثير النطاقات هذا ، يمكن إجراء تحليل جيني وجزيئي مفصل على المواد الهلامية المتدرجة بولي أكريلاميد. توفر المواد الهلامية بولي أكريلاميد مرونة أكبر ونطاقات محددة بشكل أكثر حدة من المواد الهلامية agarose.

هجرة شظايا الحمض النووي في الاغاروز

تهاجر شظايا من الحمض النووي الخطي من خلال المواد الهلامية agarose مع قابلية التنقل التي تتناسب عكسًا مع log 10 لوزنها الجزيئي. بعبارة أخرى ، إذا قمت برسم المسافة من البئر التي هاجرت بها شظايا الحمض النووي مقابل اللوغاريتم 10 لأوزانها الجزيئية أو عدد أزواج القواعد ، فسيظهر خط مستقيم تقريبًا.

تهاجر الأشكال الدائرية للحمض النووي في [اغروس) بشكل مختلف تمامًا عن الحمض النووي الخطي من نفس الكتلة. عادةً ما يبدو أن البلازميدات غير المقطوعة تهاجر بسرعة أكبر من نفس البلازميد عندما تكون خطية. بالإضافة إلى ذلك ، تحتوي معظم مستحضرات البلازميد غير المقطوع على الأقل على شكلين طوبولوجيين مختلفين من الحمض النووي ، يتوافقان مع الأشكال فائقة الالتفاف والدوائر المقطوعة. تُظهر الصورة على اليمين هلامًا ملطخًا بالإيثيديوم مع بلازميد غير مقطوع في الممر الأيسر ونفس البلازميد خطيًا في موقع واحد في الممر الأيمن.

بالإضافة إلى ذلك ، هناك العديد من العوامل التي لها تأثيرات مهمة على تنقل شظايا الحمض النووي في مواد هلامية الاغاروز ، ويمكن استخدامها للاستفادة في تحسين فصل أجزاء الحمض النووي. من أهم هذه العوامل:

تركيز الاغاروز: باستخدام المواد الهلامية بتركيزات مختلفة من الاغاروز ، يمكن حل الأحجام المختلفة لشظايا الحمض النووي. تركيزات أعلى لفصل agarose facilite للحمض النووي الصغير ، بينما تسمح تركيزات agarose المنخفضة بتحليل الحمض النووي الأكبر.

تُظهر الصورة إلى اليمين هجرة مجموعة من شظايا الحمض النووي في ثلاثة تركيزات من الاغاروز ، وكلها كانت في نفس علبة الهلام وتم نقلها بالكهرباء بنفس الجهد ولأوقات متطابقة. لاحظ كيف يتم حل الأجزاء الأكبر بشكل أفضل في هلام 0.7٪ ، بينما تفصل الأجزاء الصغيرة بشكل أفضل في 1.5٪ [اغروس). يشار إلى جزء 1000 نقطة أساس في كل ممر.

الجهد: مع زيادة الجهد المطبق على مادة هلامية ، تنتقل الأجزاء الأكبر بشكل أسرع نسبيًا من الأجزاء الصغيرة. لهذا السبب ، يتم الوصول إلى أفضل دقة للأجزاء الأكبر من حوالي 2 كيلو بايت من خلال تطبيق ما لا يزيد عن 5 فولت لكل سم على الهلام (قيمة سم هي المسافة بين القطبين ، وليس طول الجل).

محلول الرحلان الكهربائي: تم التوصية بعدة مخازن مختلفة للرحلان الكهربائي للحمض النووي. الأكثر استخدامًا للحمض النووي المزدوج هو TAE (Tris-acetate-EDTA) و TBE (Tris-borate-EDTA). سوف تهاجر شظايا الحمض النووي بمعدلات مختلفة إلى حد ما في هذين المخزنين المؤقتين بسبب الاختلافات في القوة الأيونية. لا تنشئ المحاليل درجة الحموضة فحسب ، بل توفر أيونات لدعم الموصلية. إذا كنت تستخدم الماء عن طريق الخطأ بدلاً من المخزن المؤقت ، فلن يكون هناك انتقال للحمض النووي في الجل! وبالمثل ، إذا كنت تستخدم محلولًا مركّزًا (مثل محلول مخزون 10x) ، فقد يتم توليد حرارة كافية في الجل لإذابه.

تأثيرات بروميد الإيثيديوم: بروميد الإيثيديوم هو صبغة فلورية تتداخل بين قواعد الأحماض النووية وتسمح بالكشف السهل جدًا عن شظايا الحمض النووي في المواد الهلامية ، كما هو موضح في جميع الصور الموجودة في هذه الصفحة. كما هو موضح أعلاه ، يمكن دمجه في هلام الاغاروز ، أو إضافته إلى عينات من الحمض النووي قبل التحميل لتمكين تصور الشظايا داخل الهلام. كما هو متوقع ، يؤدي ارتباط بروميد إيثيديوم بالحمض النووي إلى تغيير كتلته وصلابته ، وبالتالي قدرته على الحركة.

توفر المواد الهلامية Agarose ، كما نوقش أعلاه ، أكثر الوسائل شيوعًا لعزل وتنقية أجزاء الحمض النووي ، وهو شرط أساسي لبناء أي نوع من جزيئات الحمض النووي المؤتلف.

من خلال تغيير تكوين المخزن المؤقت وظروف التشغيل ، يمكن تمديد فائدة المواد الهلامية من الاغاروز. الامثله تشمل:

* الرحلان الكهربائي للمجال النبضي هو تقنية يتم فيها تغيير اتجاه تدفق التيار في غرفة التفريد بشكل دوري. يسمح هذا بتجزئة قطع الحمض النووي التي تتراوح من 50000 إلى 5 مليون برميل ، وهو أكبر بكثير مما يمكن حله في المواد الهلامية القياسية.

* يتم تحضير المواد الهلامية القلوية الاغاروز مع فصلها كهربائيا في محاليل عازلة تحتوي على هيدروكسيد الصوديوم. هذه الظروف القلوية مفيدة لتحليل الحمض النووي أحادي الجديلة.


الاغاروز الكهربائي للهلام

إنها طريقة مستخدمة في الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية لفصل جزيئات الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو البروتين حسب الحجم. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحريك جزيئات الحمض النووي سالبة الشحنة عبر مصفوفة agarose مع مجال كهربائي (الرحلان الكهربائي). تهاجر شظايا من الحمض النووي الخطي من خلال المواد الهلامية agarose مع قابلية التنقل التي تتناسب عكسًا مع log 10 لوزنها الجزيئي. بعبارة أخرى ، إذا قمت برسم المسافة من البئر التي هاجرت بها شظايا الحمض النووي مقابل اللوغاريتم 10 لأوزانها الجزيئية أو عدد أزواج القواعد ، فسيظهر خط مستقيم تقريبًا.

تهاجر الأشكال الدائرية للحمض النووي في [اغروس) بشكل مختلف تمامًا عن الحمض النووي الخطي من نفس الكتلة. بشكل نموذجي ، ستظهر البلازميدات غير المقطوعة على أنها تهاجر بسرعة أكبر من نفس البلازميد عندما تكون خطية. بالإضافة إلى ذلك ، تحتوي معظم مستحضرات البلازميد غير المقطوع على الأقل على شكلين طوبولوجيين مختلفين من الحمض النووي ، يتوافقان مع الأشكال فائقة الالتفاف والدوائر المقطوعة. تُظهر الصورة على اليمين هلامًا ملطخًا بالإيثيديوم مع بلازميد غير مقطوع في الممر الأيسر ونفس البلازميد خطيًا في موقع واحد في الممر الأيمن.


العديد من العوامل الإضافية لها تأثيرات مهمة على تنقل أجزاء الحمض النووي في مواد هلامية الاغاروز ، ويمكن استخدامها لصالحك في تحسين فصل أجزاء الحمض النووي. من أهم هذه العوامل:

تركيز الاغاروز: باستخدام المواد الهلامية بتركيزات مختلفة من الاغاروز ، يمكن حل الأحجام المختلفة لشظايا الحمض النووي. تركيزات أعلى لفصل agarose facilite للحمض النووي الصغير ، بينما تسمح تركيزات agarose المنخفضة بتحليل الحمض النووي الأكبر.

تُظهر الصورة إلى اليمين هجرة مجموعة من شظايا الحمض النووي في ثلاثة تركيزات من الاغاروز ، وكلها كانت في نفس علبة الهلام وتم نقلها بالكهرباء بنفس الجهد ولأوقات متطابقة. لاحظ كيف يتم حل الأجزاء الأكبر بشكل أفضل في هلام 0.7٪ ، بينما تفصل الأجزاء الصغيرة بشكل أفضل في 1.5٪ [اغروس). يشار إلى جزء 1000 نقطة أساس في كل ممر.


الجهد: مع زيادة الجهد المطبق على مادة هلامية ، تنتقل الأجزاء الأكبر بشكل أسرع نسبيًا من الأجزاء الصغيرة. لهذا السبب ، يتم الوصول إلى أفضل دقة للأجزاء الأكبر من حوالي 2 كيلو بايت من خلال تطبيق ما لا يزيد عن 5 فولت لكل سم على الهلام (قيمة سم هي المسافة بين القطبين ، وليس طول الجل).

محلول الرحلان الكهربائي: تم التوصية بعدة مخازن مختلفة للرحلان الكهربائي للحمض النووي. الأكثر استخدامًا للحمض النووي المزدوج هو TAE (Tris-acetate-EDTA) و TBE (Tris-borate-EDTA). سوف تهاجر شظايا الحمض النووي بمعدلات مختلفة إلى حد ما في هذين المخزنين المؤقتين بسبب الاختلافات في القوة الأيونية. لا تنشئ المحاليل درجة الحموضة فحسب ، بل توفر أيونات لدعم الموصلية. إذا كنت تستخدم الماء عن طريق الخطأ بدلاً من المخزن المؤقت ، فلن يكون هناك انتقال للحمض النووي في الجل! على العكس من ذلك ، إذا كنت تستخدم محلولًا مركزًا (مثل محلول مخزون 10x) ، فقد يتم توليد حرارة كافية في الجل لإذابه.

تأثيرات بروميد الإيثيديوم: بروميد الإيثيديوم هو صبغة فلورية تتداخل بين قواعد الأحماض النووية وتسمح بالكشف السهل جدًا عن شظايا الحمض النووي في المواد الهلامية ، كما هو موضح في جميع الصور الموجودة في هذه الصفحة. كما هو موضح أعلاه ، يمكن دمجه في هلام الاغاروز ، أو إضافته إلى عينات من الحمض النووي قبل التحميل لتمكين تصور الشظايا داخل الهلام. كما هو متوقع ، يؤدي ارتباط بروميد إيثيديوم بالحمض النووي إلى تغيير كتلته وصلابته ، وبالتالي قدرته على الحركة.


سؤال : يمكن أن يحل الرحلان الكهربائي جزيئات ذات أحجام مختلفة. تهاجر الجزيئات الكبيرة بشكل أبطأ من الجزيئات الصغيرة في المواد الهلامية من مادة الاغاروز والبولي أكريلاميد. ومع ذلك ، فإن حقيقة أن الأحماض النووية من نفس الطول قد توجد في مجموعة متنوعة من المطابقات يمكن أن تعقد في كثير من الأحيان تفسير عمليات الفصل الكهربي. على سبيل المثال ، البكتيرية الفردية

يمكن أن يحل الرحلان الكهربائي جزيئات ذات أحجام مختلفة. تهاجر الجزيئات الكبيرة بشكل أبطأ من الجزيئات الصغيرة في المواد الهلامية من مادة الاغاروز والبولي أكريلاميد.

ومع ذلك ، فإن حقيقة أن الأحماض النووية من نفس الطول قد توجد في مجموعة متنوعة من المطابقات يمكن أن تعقد في كثير من الأحيان تفسير عمليات الفصل الكهربي. على سبيل المثال ، قد توجد البلازميدات البكتيرية الفردية في ثلاثة أشكال:

  • superhelical / supercoiled (النموذج الأول):النموذج I مضغوط وملفوف بإحكام شديد ، مع استمرار كل من خيوط الحمض النووي.
  • دائرة مكشوفة / مفتوحة (النموذج الثاني): يوجد النموذج II كدائرة مفكوكة لأن أحد خيوط الحمض النووي قد تم كسره ، مما أدى إلى إطلاق الملف الفائق.
  • الخطي (النموذج الثالث)

جميع الأشكال الثلاثة لها نفس الكتلة ، لكن كل منها سينتقل بمعدل مختلف من خلال مادة هلامية.


ما الذي يسبب النطاقات الخافتة في الرحلان الكهربائي للهلام؟

ال هلام تعمل المصفوفة كمنخل: جزيئات الحمض النووي الأصغر تهاجر أسرع من الجزيئات الأكبر ، لذلك تنفصل جزيئات الحمض النووي ذات الأحجام المختلفة إلى جزيئات مختلفة يربط خلال الكهربائي. المزيد من الحمض النووي في ملف حافظة مسافة يعطي تلطيخًا أكثر كثافة لذلك حافظة مسافة.

بعد ذلك ، السؤال هو ، ما هي الأخطاء التي يمكن أن تؤدي إلى عدم وجود عصابة على الجل بعد الرحلان الكهربائي؟ أنت قد قد نفذت الحمض النووي الخاص بك خارج هلام من خلال الجري لفترة طويلة. أنت قد قد ذاب الخاص بك هلام عن طريق الجري لفترة طويلة أو استخدام قديمة الكهربائي سعة عازلة منخفضة. أنت قد استخدموا نسبة خاطئة بشكل رهيب من الاغاروز والحمض النووي إما عالق في البئر أو نفد قبل الأوان من هلام.

تعرف أيضًا ، لماذا تُصاب نطاقات PCR بالإغماء؟

الإجابات الشائعة (1) تحقق أولاً من البرمجة الخاصة بك لكل خطوة من PCR دورة مثل عصابات باهتة يرجع ذلك إلى عدة أسباب مثل عدم كفاية عدد دوراتك ، ووقت التمديد المنخفض ، ووقت التلدين المنخفض ، وزيادة درجة حرارة التلدين ، وانخفاض درجة حرارة تغيير الطبيعة ، وارتفاع أو انخفاض وقت التمسخ.

كم عدد النطاقات التي ستظهر على هلام الرحلان الكهربائي؟

النتيجة سوف هلام تكشف عن اثنين يربط. الكهربائي يفصل شظايا الحمض النووي وفقًا لحجمها النسبي (الوزن الجزيئي).


المزيد عن التكنولوجيا الحيوية

الاغاروز الكهربائي للهلام هو وسيلة سهلة لفصل أجزاء الحمض النووي بأحجامها وتصورها. إنه إجراء تشخيصي شائع يستخدم في المختبرات البيولوجية الجزيئية.

الكهربائي:

تعتمد تقنية الرحلان الكهربي على حقيقة أن الحمض النووي مشحون سلبًا عند درجة حموضة متعادلة بسبب العمود الفقري للفوسفات. لهذا السبب ، عندما يتم وضع جهد كهربائي على الحمض النووي ، فإنه سيتحرك نحو القطب الموجب:

يتم إبطاء معدل تحرك الحمض النووي نحو القطب الموجب عن طريق جعل الحمض النووي يتحرك من خلال هلام الاغاروز. هذا محلول منظم (يحافظ على درجة الحموضة وتركيز الملح المناسبين) مع إضافة 0.75٪ إلى 2.0٪ [اغروس). يشكل الاغاروز شبكة مسامية في محلول المخزن المؤقت ويجب أن ينزلق الحمض النووي عبر الثقوب الموجودة في الشبكة من أجل التحرك نحو القطب الموجب. هذا يبطئ الجزيء. سيتم إبطاء الجزيئات الأكبر حجمًا أكثر من الجزيئات الأصغر ، نظرًا لأن الجزيئات الأصغر يمكن أن تتناسب مع الثقوب بسهولة. نتيجة لذلك ، سيتم فصل مزيج من الأجزاء الكبيرة والصغيرة من الحمض النووي التي تم تمريرها من خلال هلام الاغاروز حسب الحجم. هذا تمثيل بياني لهلام الاغاروز المصنوع عن طريق "تشغيل" علامات الوزن الجزيئي للحمض النووي ، والبلازميد المعزول ، ونفس البلازميد بعد الخطي باستخدام إنزيم التقييد:

يتم تصوير هذه المواد الهلامية على الأشعة فوق البنفسجية. عبر المنور عن طريق تلطيخ الحمض النووي بصبغة الفلورسنت (بروميد إيثيديوم). محدد الوزن الجزيئي للحمض النووي عبارة عن مجموعة من أجزاء الحمض النووي ذات الأحجام الجزيئية المعروفة والتي تُستخدم كمعيار لتحديد أحجام الأجزاء غير المعروفة.

إذا نقرت على الشكل ، فسترى فيلمًا قصيرًا يحاكي حركة عصابات الحمض النووي عبر الهلام. عند مشاهدة الفيديو ، لاحظ أن العصابات ذات الوزن الجزيئي المنخفض تتحرك بسرعة كبيرة عبر الهلام بينما تتحرك العصابات ذات الوزن الجزيئي المرتفع ببطء شديد.

ترجمة:

يمكن استخلاص الكثير من المعلومات من هذا الهلام. كما تقرأ النص أدناه ،

1.) & # 160 من خلال النظر في هجرة معايير الوزن الجزيئي للحمض النووي ، يمكنك معرفة أن انتقال الحمض النووي عبر هلام الاغاروز ليس خطيًا فيما يتعلق بالحجم. إذا قمت برسم المسافة المقطوعة مقابل الوزن الجزيئي للجزء ، فسترى أن هناك علاقة لوغاريتمية (أي أن الأجزاء الصغيرة تنتقل أسرع بكثير من الأجزاء الكبيرة).

2.) يمكنك أن ترى أن هناك فرقًا كبيرًا بين الطريقة التي سيعمل بها البلازميد المعزول من تحضير التحلل القلوي مقابل هذا البلازميد نفسه بعد قطعه بإنزيم تقييد وخطي. وذلك لأن البلازميد سيوجد في العديد من الأشكال المختلفة فائقة الالتفاف في البكتيريا. عندما تقوم بعزل البلازميد من مزرعة بكتيرية ، فإنك تقوم بعزل جميع الأشكال الفائقة الالتفاف المختلفة من البلازميد ، وسوف يهاجر كل منها بشكل مختلف على الهلام ، مما يمنحك ثلاثة نطاقات رئيسية والعديد من العصابات الصغيرة. عندما يتم قطع هذا المزيج من البلازميدات فائقة الالتفاف باستخدام إنزيم تقييد ، فإن الأشكال المختلفة تصبح خطية وتسترخي. نتيجة لذلك ، تصبح جميعها متطابقة وتعمل بنفس المعدل ، وسترى رباطًا واحدًا فقط على الجل.

3.) يمكن تقدير الحجم الجزيئي لقطعة غير معروفة من الحمض النووي من خلال مقارنة المسافة التي تقطعها مع معايير الوزن الجزيئي. هذا صحيح فقط للحمض النووي الخطي. لن ينتقل أي من الأشكال فائقة الالتفاف بمعدل متعلق بالحمض النووي الخطي ، مما يعني أنه لا يمكنك استخدام علامات الحمض النووي لتقدير الوزن الجزيئي لجزيء دنا دائري. لتقدير الوزن الجزيئي للبلازميد ، يجب عليك أولاً أن تجعله خطيًا. بالنظر إلى الهلام أعلاه ، يمكن تقدير الحجم الجزيئي للبلازميد بحوالي 3.0 كيلو قاعدة (kb). يمكن العثور على تقدير أكثر دقة عن طريق رسم بياني للوزن الجزيئي للمعايير (في أزواج القاعدة) مقابل المسافة المقطوعة على ورق شبه لوغاريتم واستخدام هذا الرسم البياني لتحديد الوزن الجزيئي للمجهول. ستفعل هذا في نهاية هذه التجربة. الحجم الجزيئي هو أهم المعلومات المستمدة من هلام الاغاروز والسبب المعتاد لتشغيل الجل.

في هذه التجربة ، ستعمل على وضع خطي للبلازميد الذي عزلته الأسبوع الماضي باستخدام إنزيم مقيد. ثم ستقوم بتشغيل هذا البلازميد الخطي على هلام الاغاروز مع النسخة غير المقطوعة وعلامة الحمض النووي لتحديد حجم البلازميد الخاص بك + الملحق ، والذي سيعطيك تقديرًا لحجم الملحق الخاص بك.

إجراء:

1.) قم بتجميع خليط التفاعل التالي من أجل هضم التقييد:

& # 1602.0 ul 10X راحة. انزيم عازلة

& # 1603.0 ul محلول DNA البلازميد (من الأسبوع الماضي)

& # 1600.5 ul إنزيم التقييد (على سبيل المثال ، HindIII)

أضف الإنزيم أخيرًا واحتفظ به دائمًا على الثلج. سيعتمد الإنزيم الذي ستستخدمه على البلازميد الذي لديك ، وسيتم إخبارك أثناء الفصل. 0.5 ميكرولتر لا يمكن قياسها بواسطة ماصطروبك. يجب عليك تقديرها بالطريقة التي ستبدو بها في طرف الماصة (سيتم إعطاء التعليمات في الفصل). تأكد من استخدام طرف نظيف عند إخراج الإنزيم من الأنبوب. ضع هذا التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.

2.) عند اكتمال الهضم ، استعد لتحميل الجل. في أنبوب جديد ، ضع 17.0 ميكرولتر من H2O و 3.0 ميكرولتر من DNA البلازميد غير المقطوع. أضف 2.0 ul صبغة لكل من أنابيب العينة الثلاثة (علامات الحمض النووي ، والبلازميد غير المقطوع ، والبلازميد المهضوم). قم بتحميل 20.0 ميكرولتر من علامة الحمض النووي في بئر واحد من الجل. افعل ذلك عن طريق شفط المحلول في طرف الماصة ، ووضع الطرف في أعلى البئر ، وطرد السائل برفق في البئر. يحتوي المخزن المؤقت للصبغة في علامة الحمض النووي والعينات على الجلسرين مما يجعله أكثر كثافة من H2O. سيؤدي ذلك إلى غرق السائل في قاع البئر. تحميل 20.0 ميكرولتر من البلازميد غير المقطوع وقيد الهضم.

3.) قم بتشغيل مصدر الطاقة وفصل العينات بالكهرباء عند 110 فولت (تحذير - كن حذرًا من الجهد العالي وإلا سيتم ضبطك على مؤخرتك بشكل كبير.) انقل العينات بالكهرباء حتى تصبح الصبغة الزرقاء الداكنة على بعد حوالي 2 سم من قاع الجل

4) صبغ الجل باحتضانه لمدة 8 دقائق في محلول بروميد إيثيديوم.

بروميد الإيثيديوم مادة مسرطنة للغاية. تعامل مع هذا الجل فقط أثناء ارتداء القفازات. لا تضع أبدًا أصابع غير محمية في محلول الهلام العازل.

5.) سأقوم بتحريك الجل على الأشعة فوق البنفسجية. عبر المنور والتقط صورة له.

6.) سوف أفسد طبيعة بروميد الإيثيديوم عن طريق وضع الجل في محلول برمنجنات البوتاسيوم لمدة 5 دقائق ، ثم أتخلص منه.


شاهد الفيديو: محاضرة الترحيل الكهربائي (قد 2022).


تعليقات:

  1. Ormond

    فضولي لكن غير واضح

  2. Matwau

    انا اعتقد انها فكرة جيدة. أتفق معها تماما.

  3. Calldwr

    لا ، إنه عكس ذلك.



اكتب رسالة