معلومة

Cph1 - علم الأحياء

Cph1 - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

الفئة: البكتيريا الزرقاء

العائلة: أحمر / أخضر

أصل: متزامن

الكروموفور (ق): ثنائي الفينيل متعدد الكلور

http://larsenlab.ucdavis.edu/@api/deki/files/1602/Cph1.txt

تبدأ الإضاءة الحمراء لحالة 15Z Pr المظلمة لـ Cph1Δ (الشكل 1B ، المنحنى الأحمر) تحويل ضوئي إلى الأمام (Pr إلى Pfr) ، مما يؤدي إلى إنشاء Lumi-Rf الوسيط الأساسي المتشابه. يتطور Lumi-Rf حراريًا عبر العديد من الوسائط لإنشاء منتج ضوئي 15E Pfr (الشكل 1B ، منحنى أحمر داكن) على مقياس زمني> 100 مللي ثانية. يمكن إعادة توليد حالة 15Z Pr المستقرة المظلمة من 15E Pfr إما بسرعة بواسطة الضوء الأحمر البعيد (∼700 نانومتر) أو عن طريق الارتداد المظلم العفوي على نطاق زمني بطيء جدًا (> 24 ساعة).

مراجع

  1. ديناميكا ضوئية غير متجانسة لحالة Pfr في فيتوكروم سيانوبكتيري Cph1 ، بيتر دبليو كيم ، ناثان سي روكويل ، شيلي إس.مارتن ، جي كلارك لاجارياس ، ديلمار إس لارسن ، الكيمياء الحيوية، 53 (28) ، ص 4601-4611 (2014). بي دي إف
  2. عدم التجانس الديناميكي في فيتوكروم السيانوبكتيري Cph1 ، بيتر دبليو لارسن ، الكيمياء الحيوية 53, 2818–2826 (2014). بي دي إف
  3. الكشف عن ديناميكيات الأيزوميرات الأساسية لنبات Cph1 الزرقاء البكتيري مع التلاعب متعدد النبضات ، بيتر دبليو كيم ، ناثان روكويل ، لوسي فرير ، تشي وي تشانغ ، شيلي مارتن ، جيه لارسن ، J. فيز. تشيم. بادئة رسالة.، 4 ، ص 2605-2609 (2013). بي دي إف
  4. ديناميكيات التشابه الضوئي فائقة السرعة من E إلى Z لـ Cph1 Phytochrome، Peter W. Kim، Jie Pan، Nathan C. Rockwell، Che-Wei Chang، Keenan C. Taylor، J. Larsen، تشيم. حروف، 549 ، 86-92 (2012). بي دي إف

التحليل الطيفي والهيكل البلوري عالي الدقة لطفرات Tyr263 من Phytochrome Cph1

Phytochromes هي مستقبلات ضوئية ثنائية البروتين يمكن تبديلها ضوئيًا بين حالة امتصاص الضوء الأحمر (Pr) وحالة امتصاص الضوء الأحمر البعيد (Pfr). على الرغم من الإبلاغ عن الهياكل ثلاثية الأبعاد لكلتا الحالتين ، إلا أن آليات التحويل الضوئي وداخل الجزيئات لا تزال غير واضحة. هنا ، نقوم بالإبلاغ عن امتصاص الأشعة فوق البنفسجية - المرئية ، والفلورة ، والتحليل الطيفي للقرص المضغوط جنبًا إلى جنب مع العديد من المعلمات الكيميائية الضوئية من النوع البري و Y263F و Y263H و Y263S في الوحدة الحسية الضوئية Cph1 ، بالإضافة إلى بنية بلورية بدقة 2.0 Å من متحولة Y263F في حالة العلاقات العامة. على الرغم من الحفاظ على Y263 ، فإننا نظهر أن الخاصية العطرية وليس مجموعة الهيدروكسيل لـ Y263 مهمة لتكوين Pfr. يؤكد الهيكل البلوري لـ Y263F mutant (معرف بنك بيانات البروتين: 3ZQ5) على ZZZssa تكوين chromophore ويوفر صورة مفصلة لجيب الربط الخاص به ، ولا سيما عدم التجانس المطابق حول chromophore. تكشف المقارنة مع الهياكل النباتية الأخرى عن اختلافات في الموضع النسبي لـ PHY (phyخاص بـ tochrome) وتفاعل اللسان مع الطرف N المتطرف. تدعم بياناتنا فكرة أن الكروميات النباتية الأصلية في حالتها Pr غير متجانسة هيكليًا.


الملخص

Cph1 ، عامل نسخ لمسار كيناز البروتين المنشط Mitogen (MAP) ، ينظم التكوُّن في مسببات الأمراض الفطرية البشرية المبيضات البيض. هنا ، باتباع نهج الحذف النظامي ، حددنا المجالات الوظيفية والزخارف لـ Cph1 التي تشارك في نشاط عامل النسخ والتشكل الخلوي. لقد وجدنا أن المجال المنزلي N-terminal ضروري لنشاط ربط الحمض النووي ، ومع ذلك ، لا غنى عن المجال الطرفي C وعزر polyglutamine (PQ) لوظيفة التنشيط النسخي. التحليل التكميلي لـ سيف 1كشفت متحولة فارغة باستخدام مشتقات حذف مختلفة عن أهمية وظيفية للمجالات الطرفية N و C و PQ في عملية الفتيل ، وتشكيل الكلاميديا ​​والحساسية لمركبات التداخل في جدار الخلية. تحديد الجينوم على نطاق واسع لموقع ربط Cph1 وتحليل نسخ RT-PCR الكمي في سيف 1كشف متحولة فارغة أن عددًا من الجينات المرتبطة بالنمو الخيطي ، والحفاظ على تنظيم جدار الخلية ووظيفة الميتوكوندريا ، وجينات مسار استجابة الأس الهيدروجيني هي أهداف النسخ لـ Cph1. تشير البيانات أيضًا إلى أن Cph1 قد يعمل كمنظم إيجابي أو سلبي اعتمادًا على الحالة المورفولوجية والظروف الفسيولوجية. علاوة على ذلك ، فإن التعبير التفاضلي لجينات مسار MAP kinase المنبع في النوع البري و سيف 1Δ أشار متحولة فارغة إلى وجود لائحة تغذية راجعة.


عائلة Cph1 Holin

ال عائلة Cph1 Holin (TC # 1.E.16) تسمى أيضًا عائلة CDD Holin 4 الفائقة ، ولكنها تنتمي إلى Holin Superfamily IV وفقًا لتصنيف قاعدة بيانات تصنيف الناقل (TCDB). [1] يمكن العثور على قائمة تمثيلية بالأعضاء المنتمين إلى عائلة Cph1 في TCDB. [2]

  1. ^ ريدي ، بهاسكارا ل.ساير جونيور ، ميلتون هـ (2013/11/01). "التحليلات الطوبولوجية والتطورية لعائلات الهولين البكتيرية والعائلات الفائقة". Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - الأغشية الحيوية. 1828 (11): 2654-2671. دوى: 10.1016 / j.bbamem.2013.07.004. PMC3788059. PMID23856191.
  2. ^
  3. Martín، A.C López، R. García، P. (1998-01-01). "التحليل الوظيفي لنظام التحلل ثنائي الجينات لعقم المكورات الرئوية Cp-1 في الخلايا المضيفة المتجانسة وغير المتجانسة". مجلة علم الجراثيم. 180 (2): 210-217. دوى: 10.1128 / JB.180.2.210-217.1998. ISSN0021-9193. PMC106873. بميد9440507.

اعتبارًا من هذا التعديل ، تستخدم هذه المقالة محتوى من "1.E.16 عائلة Cph1 Holin (Cph1 Holin)"، والتي تم ترخيصها بطريقة تسمح بإعادة الاستخدام بموجب ترخيص Creative Commons Attribution-ShareAlike 3.0 Unported License ، ولكن ليس بموجب GFDL. ويجب اتباع جميع المصطلحات ذات الصلة.

هذه المادة المتعلقة بالبروتين الغشائي هي كعب. يمكنك مساعدة ويكيبيديا من خلال توسيعها.


الملخص

Phytochromes هي فئة مهمة من المستقبلات الضوئية ذات الاستجابة الحمراء / الحمراء البعيدة والتي تعمل كمفاتيح بيولوجية تنشط بالضوء ، مما يؤدي في النهاية إلى نمو وتطور النباتات والبكتيريا والفطريات. تمت مناقشة تكوين الحالة الأرضية الممتصة للأحمر على نطاق واسع نظرًا لوجود ميزة كتف على الحافة الزرقاء لأطياف الامتصاص الإلكترونية ، والتي عزاها الكثيرون إلى وجود العديد من مطابقات الحالة الأرضية. هنا نستخدم تحليل شدة رامان بالرنين لحساب ملف الامتصاص vibronic للبكتيريا الزرقاء phytochrome Cph1 وإظهار أن ميزة الكتف هذه ترجع ببساطة إلى التحولات الذبذبية من نوع واحد ، وبالتالي تعكس حالة سكانية متجانسة.


نتائج ومناقشة

قمنا بتنقية البروتين الهولوغرافي في حالته الأرضية Pr عن طريق كروماتوغرافيا التقارب واستبعاد الحجم وحددنا ظروف التبلور المناسبة. تشبه أطياف الامتصاص UV-Vis لـ Cph1 في الحالة البلورية أطياف المحاليل (الشكل 1).د) ، مما يعني أن الهيكل يمثل بالفعل بنية الجزيء الحر. تم حل الهيكل بدقة 2.45 عن طريق الحيود الشاذ متعدد الطول الموجي (MAD) - مراحل (ر العامل 24.4٪ رمجانا، 27٪، [انظر المعلومات الداعمة (SI) الجدول S1].

الهيكل والخصائص الطيفية للوحدة الحسية Cph1 phytochrome من متزامن 6803. (أ) حدود مجال Cph1 phytochrome. في الوحدة الحسية المؤتلفة Cph1 الموصوفة ، تم استبدال جهاز إرسال هيستيدين كيناز C-terminal (Leu-515 – Asn-748) بـ (His)6 بطاقة شعار. (ب) تمثيل الشريط لهيكل الوحدة الحسية يُظهر المجالات N-terminal α-helix (الأخضر) و PAS (الأزرق) و GAF (البرتقالي) و PHY (الأحمر). يتم ربط الكروموفور ثنائي الفينيل متعدد الكلور (سماوي) تساهميًا بـ Cys-259. يشار إلى مناطق الحلقة المضطربة (Gln-73 – Arg-80 و Gly-100-Asp-101 و Arg-148-Gln-150 و Glu-463-Gly-465) كخطوط منقطة. يظهر السطح الجزيئي المحسوب بواسطة PYMOL (نصف قطر المجس ، 1.4 Å) باللون الرمادي. (ج) حذف كثافة الإلكترون من التقريب بين PCB chromophore و Cys-259 محدد عند 2σ. (د) أطياف UV / Vis للوحدة الحسية Cph1 في محلول عند درجة حرارة الغرفة (الخط الأحمر) وفي شكل بلوري عند 100 كلفن (■) في حالة Pr (العلوي) وبعد تشعيع الضوء الأحمر (أدنى). بينما في المحلول يتم الوصول إلى توازن ضوئي عند 70٪ Pfr ، يكون جزء الخلد 50٪ في البلورة. تم تسجيل الأطياف من البلورات في Cryobench في ESRF ، غرونوبل. تم إجراء التحويل الضوئي عن طريق التشعيع لمدة 10 ثوانٍ في درجة حرارة الغرفة باستخدام ليزر أرجون 635 نانومتر يركز على 100 ميكرومتر.

تتبلور على شكل ثنائى موازى مضاد [الشكل. S1] ، يكون المستشعر ثنائي القطب ، ومجال N-terminal PAS ومجال GAF المركزي المرتبط بالكروموفور الذي يشكل الفص الأكبر ، والذي يتشابه الهيكل العام له ، بما في ذلك العقدة المكونة من ثمانية أشكال بواسطة الطرف N ، إلى تلك الخاصة بـ PAS-GAF bidomains من جرثومة الخلايا الجرثومية (الأشكال 1ب و 2ب) (12). يشتمل الفص الثاني الأصغر على مجال PHY للطرف C (Thr-324 – Glu-514) للمستشعر. تُظهر مقارنات DALI لهذا الهيكل بوضوح أنه ينتمي إلى عائلة مجال GAF (الشكل 2ج). يظهر الشكل S2 محاذاة قائمة على البنية مع المجالات ذات الصلة وملخصًا للبنية الثانوية. يؤدي تشابه التسلسل الضعيف ولكن المهم (& lt15٪ هوية على مستوى الأحماض الأمينية) إلى اقتراح سابق بأن مجالات PHY و GAF متعامدة ومترابطة هيكليًا (19 ، 20). على الرغم من أن نطاقات GAF ، مثل الأعضاء الآخرين في عائلة PAS الفائقة ، تربط عادةً العوامل المساعدة الصغيرة المحبة للماء ، إلا أنه لم يتم رؤية كثافة إلكترونية تمثل مثل هذا الترابط في بنية PHY الخاصة بنا.

مقارنات هيكلية لمجالات الوحدة الحسية. (أ) ترتيبات المجال Tandem-GAF كما لوحظ في Cph1 (برتقالي / أحمر) ، وفوسفوديستراز الفئران (أخضر) (22) ، و cyanobacterial adenylyl cyclase (أزرق) (24). (ب) مجال العرض PAS / GAF. يتم فرض نطاقات PCB chromophore (سماوي) و N-terminal α-helix (أخضر) و PAS (أزرق فاتح) و GAF (برتقالي) في Cph1 على العناصر المقابلة لنطاقات ثنائية الكروم الجرثومية لـ D. radiodurans (12) (رمادي ، r.m.s.d. 1.08 Å لـ 235 درجة مئويةα-مواضع) و Rhodopseudomonas palustris (13) (أرجواني ، r.m.s.d. 1.10 Å لـ 252 درجة مئويةα) ، والتي تربط biliverdin IXα (BV). (ج) تراكب نطاقات Cph1 PHY (أحمر) و GAF (برتقالي) ومجال N-terminal GAF من phosphodiesterase 2a (أخضر) (22). يعطي تراكب PHY وأقرب متماثل لها ، مجال Cph1 GAF ، جذر متوسط ​​التربيع. 1.77 Å لـ 94 مكافئ Cα المواقف. تشير علامة النجمة الخضراء إلى حلقة مجال GAF ، والتي تمر من خلالها المحطة N لتشكيل العقدة. يتم عرض cNMPs (الأخضر) و chromophore PCB (السماوي) المرتبط داخل مجالات GAF ذات الصلة مع أسطحها الجزيئية ، مما يُظهر التداخل الجزئي لمواقع الربط الخاصة بها.

تشكل فصوص PAS-GAF و PHY وحدة هيكلية معقدة متصلة عند نقطتين. أولاً ، حلزون α-66-Å وخطي تمامًا تقريبًا (α9، Phe-299 – Ala-345) يربط المجالين تساهميًا. تعتبر ترتيبات GAF الترادفية من هذا النوع نموذجية للوحدات التنظيمية لـ cNMP phosphodiesterases (21 ، 22) و cyclases adenylyl eubacterial [phosphodiesterase (PDE) و adenylyl cyclase (AC) ، على التوالي] (23 ، 24). في كل من فئتي الإنزيم ، تعمل مجالات GAF الترادفية كمفاتيح خيفية تعتمد على cNMP تنظم تخليق cNMP أو التحلل المائي. يُظهر كلاهما مجالين من GAF مفصولين عن طريق 50- إلى 60-يربط α-helix ، وهو مشابه بشكل مذهل للوضع في مستشعر Cph1 (الشكل 2)أ) (22 ، 24). ومن المثير للاهتمام ، أن cGMP متورط في إشارات فيتوكروم النبات (25 ، 26) ، ولكن لا يبدو أن الهيكل الذي نقدمه ولا المكافئات في النبات النباتي من المحتمل أن يوفر موقعًا ملزمًا لـ cGMP. ثانيًا ، في Cph1 ، يتم توفير اتصال إضافي بين فصين من خلال 49 بقايا غير عادية (Pro-442 – Gln-490) نتوء شبيه باللسان بين β16 و α15 من مجال PHY. يمتد هذا اللسان للخلف على شكل دبوس شعر طويل متعرج من فص PHY باتجاه مجال GAF ، مما يجعل الاتصال الحميم ليس فقط مع سطح GAF ولكن أيضًا مع α1 (Thr-4 – Leu-18) البارزة من خلال العقدة ، تم تأكيد التفاعلات من خلال بيانات الربط المتبادل للبكتيريا الفيتوكروم Agp1 (27). يوجد اللسان في جميع فئات الفيتوكروم ويتضمن العديد من المخلفات المحفوظة للغاية ، والتي تساهم إما في تفاعله مع مجال GAF (شكل PRxSF ، انظر أدناه) أو في شكله غير المعتاد على طول أسطح GAF-PHY (عزر WGG: Trp-450 –Gly-452، Glu-480) (الشكل S3). تقتصر الاختلافات في الطول داخل ألسنة فيتوكروم على أطرافها ، حيث من المحتمل أن تتفاعل النصائح بشكل ضعيف فقط مع مجال GAF ، وهو ما تقترحه حقيقة أن طرف اللسان مختل جزئيًا في بنيتنا (Glu-463-Gly-465). ومن المثير للاهتمام ، أن أقصر الألسنة توجد في الأشكال النباتية غير الكنسية من النوع Cph2 ، والتي لا يتم تقصيرها فقط بواسطة تسعة بقايا ولكنها أيضًا تفتقد مجال N-terminal PAS.

في حين أن البيانات الهيكلية السابقة من البكتريوفيتوكروم PAS-GAF تضمن الوصول الجزئي للمذيب إلى حامل الصبغ ، في الوحدة الحسية الكاملة الآن ، يغلق اللسان الجيب بشكل فعال ، ويعزل حامل اللون (الشكل 3).أ). وبالتالي ، يتكون الجيب من غلاف ثلاثي يتكون من مجال PAS مع α1، ومجال GAF واللسان (الشكل 3ب). تم تحسين الثبات الذي تمنحه العقدة التي تشكلت بواسطة الطرف N وحلقة GAF في بنية Cph1 بواسطة α1-تفاعل اللسان. أيضا ، α1 و α7 خطية متداخلة وقد تمثل موقعًا لرسو السفن (الشكل 3ب). α1- الحلزون لا يتوقع في السيليكو ولا يُرى في هياكل البكتريوفيتوكروم السابقة ، ربما لأن ارتباط الكروموفور بواسطة كرومات الجراثيم في سيستين N-terminal (8 ، 11-13 ، 27) يفرض قيودًا توافقية مختلفة في هذه المنطقة و / أو ببساطة لأن المناطق المزدحمة تفتقر إلى التفاعلات مع اللسان. تشمل الاختلافات الهيكلية الرئيسية الأخرى بين الوحدة الحسية Cph1 والمجالات الثنائية البكتيرية ، أولاً ، الرقعة السطحية لنطاق PAS البعيد لواجهة PAS-GAF ، وهي مرتبة جزئيًا فقط في هيكلنا البلوري (Leu-81 – Met-99) والثاني ، موقف GAF α4-helix مرتبط بمجال PAS السابق. (الأشكال 1ب و 2ب).

اللسان وجيب التجليد الصبغي. (أ) نموذج ملء الفراغ لـ Cph1 (اليسار) بالمقارنة مع البنى الجرثومية المعروفة (12 ، 13). يكون PCB chromophore (سماوي) مغلقًا تمامًا من وصول المذيبات بواسطة اللسان (أحمر غامق) على عكس biliverdin المكشوف (الأخضر) في النطاقات غير المكتملة. (ب و ج) جيب ربط ثنائي الفينيل متعدد الكلور ثلاثي الأطراف لـ Cph1 يشتمل على مجال GAF (برتقالي) ، وبروز شبيه باللسان من مجال PHY (أحمر) وطرف N α1- حلزوني (أخضر). تظهر المياه على شكل كرات حمراء. (ب) منظر جانبي للجيب يُبرز الترتيب الخطي للطرف N-terminal α1- الحلزون و α7- حلزونية من مجال GAF وتفاعلها مع حامل اللون واللسان. (ج) يعتمد تشكيل كروموفور ثنائي الفينيل متعدد الكلور (سماوي) داخل موقع ربط ثنائي الفينيل متعدد الكلور أ ZZZssa تكوين مشابه لتكوين BV في كرومات الجراثيم (12 ، 13). من أجل الوضوح ، استخدم α8- تم حذف حلزونات مجال GAF وكذلك Tyr-263 و Phe-475.

تعلق Cph1 / نباتات نباتية من نوع النبات الكروموفورات الخاصة بها بمجال GAF (9 ، 10) ، يكشف هيكلنا عن رابط الإثير الكربوني الأحادي بين حلقة الكروموفور A والكبريت في Cys-259 (الأشكال 1).ج, 3بو 3ج). في الكروميات الجرثومية ، تربط ذرتان من الكربون الحلقة A بسيستين بالقرب من الطرف N ، بينما في Cph1 ، تشكل البقايا المقابلة ، Leu-18 ، جنبًا إلى جنب مع Leu-15 و Ile-20 جزءًا من الجدار الكارهة للماء حول الحلقات A و B من كروموفور. كما أن وصلة الثيوثير محمية من المذيب بواسطة Tyr-458 و Leu-469-Pro-471 للسان. يوضح هيكل Cph1 بوضوح أن الكروموفور يتبنى أ ZZZssa التشكل (الأشكال 1ج و 3ج) كما رأينا في البكتريوفيتوكروميس ، على النقيض من التنبؤات القائمة على التحليل الطيفي الاهتزازي (28) ، والتي فضلت المزيد من الخطية ززاسا المطابق. ومع ذلك ، ليس هناك شك في ذلك ZZZssa صحيح. أولاً ، تناسب كثافة الإلكترون هذا المطابق فقط (الشكل 1ج) (أظهرت مجموعات البيانات المستخدمة الحد الأدنى من أضرار الأشعة السينية). ثانياً ، ر تمنع الكيمياء الفراغية للكروموفور ثنائي الفينيل متعدد الكلور (و phytochromobilin المستخدم في النباتات النباتية) ارتباط الأثير الثنائي بـ Cys-259 في ززاسا لأن هذه البقايا وفينيل الحلقة A سيكونان بعد ذلك على جوانب متقابلة بدلاً من أن يكونا متجاورين كما هو مطلوب (29).

يُظهر الهيكل التفصيلي للشق الملزم للكروموفور للوحدة الحسية الكاملة Cph1 أوجه تشابه واختلافات مهمة مع تلك الخاصة بنطاقات عرض الجراثيم PAS-GAF. تشكل Pro-471 و Arg-472 شكل PRxSF محفوظًا مع متحولة R472A تُظهر تحولًا متناغمًا خاصًا بـ Pr (الشكل S4)أ) مثل بعض الطفرات الأخرى في اللسان (16). في حين أن السلسلة الجانبية لحلقة دروع Pro-471 A من chromophore ، فإن Arg-472 يعمل بمثابة إصبع أرجينين يشير إلى شق ربط ثنائي الفينيل متعدد الكلور لتشكيل جسر ملح إلى البقايا الحمضية المحفوظة Asp-207 من مجال GAF. يقع جسر الملح هذا بين الحلقتين A و D من حامل اللون ومتصل به بشبكة رابطة هيدروجينية (الشكل 3). ب و ج) على غرار ما شوهد في الهياكل السابقة. له 260 ، الماء 3 فوق النيتروجين الحلقي ذو اللونين الثلاثة والروابط الهيدروجينية التي تربطهم محفوظة أيضًا هيكليًا. وبالمثل ، فإن السلاسل الجانبية للمخلفات Tyr-176 ، و Val-186 ، و Tyr-203 (Phe في معظم تكرارات البكتيريا) ، و Pro-204 ، و Tyr-263 تشكل جيبًا فرعيًا كارهًا للماء حول الحلقة D ، مشابهًا للوضع في الكروميات الجرثومية. ومع ذلك ، فإن بنية الوحدة الحسية Cph1 الكاملة تُظهر بالإضافة إلى ذلك أن اللسان Phe-475 يغلق الجيب ، وبالتالي يحمي حامل اللون من المذيب. أيضًا ، يكون حامل اللون في Cph1 أقل تواءًا مما كان عليه في الهياكل البكتيرية السابقة للكروم. يُظهر نموذجنا إمالة 9.8 درجة و 1.4 درجة و 26.3 درجة بين الحلقات AB و BC و CD ، على التوالي ، ويكون الأخير على وجه الخصوص أقل بكثير من -40-50 درجة التي تم الإبلاغ عنها سابقًا بالنسبة لتكوينات البكتيريا (12 ، 13) (الأشكال التين). .4 ب و ج). من شأن هذا الميل المعتدل أن يوفر اتصالًا مداريًا كاملًا من خلال نظام الحلقة ، وبالتالي امتصاص قوي للضوء الأحمر. تدعم البيانات الطفرية الفكرة القائلة بأن aplanibility الأقوى قد ينتج عن مجال PHY المفقود (16). في بنية Cph1 ، تكون الحلقة D كربون الميثيل أقرب إلى Tyr-263 hydroxyl ، وهو التفاعل الفاصل الذي يمنع حدوث تشوه أكثر اتساعًا. يبدو أن السطح اللوني النسبي في Cph1 ينشأ من اتجاه مختلف قليلاً لـ Tyr-263 بسبب تفاعله مع جسر الملح Asp-207-Arg-472 و Phe-475 من اللسان (الشكل 4). ب و ج). نتيجة لذلك ، لم تعد الحلقة D متحد المستوى مع جزء إيميدازول من His-290 ، والذي تشكل معه رابطة هيدروجينية محفوظة عبر مجموعة الكاربونيل الخاصة بها. لوحظ اختلاف آخر في الشق الذي يستوعب سلاسل البروبيونات الجانبية للحلقة B و C (الشكل 4أ). في Cph1 ، يتم تجسير Arg-222 عبر الماء 10 لكل من البروبيونات ويأتي ضمن 4 Å من واجهة المجال PAS-GAF. أيضًا ، يتم استبدال Phe-216 ، المحفوظ في النبات والبكتيريا النباتية ، بالتيروزين في الفطريات والبكتريا المعتمد على biliverdin. بدلاً من Arg-222 ، يرتبط هذا التيروزين الهيدروجين بالحلقة B بروبيونات ، مما يسمح للسلسلة الجانبية لـ Arg-222 أن تشير إلى مجال GAF.

مقارنات بين جيب chromophore في Cph1 (برتقالي) و bacteriophytochrome (أصفر) (12) مع chromophores ثنائي الفينيل متعدد الكلور (سماوي) وبيليفيردين (أخضر). تظهر المياه على شكل كرات حمراء. (أ) الموقع الفرعي للتفاعلات بين مجموعات بروبيونات البيلين ومجال GAF ، يُظهر المطابقات المختلفة المعتمدة بواسطة Arg-222 و Phe / Tyr-216 في Cph1 والبكتيريا الجرثومية. (ب و ج) الحلقة D المكروية في Cph1 والبكتريوفيتوكروم ، على التوالي. تظهر الأسطح الجزيئية للبروتينات (باللون الرمادي) تجاويف مماثلة مع مقطع عرضي مثلثي يوفر مساحة لـ ضه صورة. يتم عزل الكروموفور عن المذيب في حالة الوحدة الحسية الكاملة Cph1 ، في حين أن جيب البدومين البكتيريوموفيتوكروم مفتوح على المذيب (لاحظ المياه العديدة).

سيسمح الهيكل الذي أبلغنا به لـ chromophore بتبني المتوقع ZZEssa يساعد تشكيل Pfr (6 ، 30) في شرح كيف يمكن أن تنتقل التغييرات التوافقية التي يسببها الضوء في الكروموفور إلى البروتين. في حين تم تفسير إشارات الرنين المغناطيسي النووي الضعيفة التي تم الحصول عليها من أجل Cph1 على أنها تعكس تنقلًا كبيرًا للكروموفور غير متسق مع التفاعلات القوية مع البروتين (31 ، 32) ، يشير كل من Cph1 والبنى الجرثومية السابقة إلى تعبئة قريبة حول حلقات الكروموفور A-C. مثل هذا التغليف المحكم يستبعد التغييرات التوافقية الرئيسية في تلك المنطقة من حامل اللون دون تغييرات جذرية مرتبطة بالبروتين. قد تسمح التعبئة الضيقة خاصة حول ذرة C10 التي تربط الحلقتين B و C بدلاً من ذلك للبروتين بإدراك التغييرات الصغيرة في موضع الكروموفور. على النقيض من ذلك ، كما هو الحال في الهياكل السابقة ، هناك مساحة كافية للحلقة D للدوران عليها زاEa الأزمرة (الشكل 4 ب و ج) ، الحدث الكيميائي الضوئي الأساسي (7). من بين بقايا التيروزين المحفوظة المطلوبة لإنتاج Pfr في نباتات نباتية (33) ، من المحتمل أن يكون أحدهما Tyr-176 ، أسفل الحلقة D مباشرة: يفشل متحور Y176H في التحويل الضوئي ، بل يفقد طاقة الإثارة عن طريق التألق (16). قد يكون الثاني هو Tyr-263 أعلى الحلقة أو Tyr-203 (Phe في كرومات الفيتوكروم البكتيرية) على الجانب (الشكل 4).ب). وفقًا لهيكلنا ، ستضع الحلقة D photoflip مجموعة الكاربونيل بجوار Asp-207 و Tyr-263 ، مما يؤدي إلى تثبيت شكل Pfr ، ومن خلال تشكيل شبكة رابطة هيدروجينية مع هذه البقايا ، تزعج جسر الملح بين Asp-207 و أرغ -472. تفسر التغييرات الناتجة المنقولة إلى سطح البروتين إمكانية الوصول التفاضلي للسان إلى البروتياز في حالات Pr و Pfr (27 ، 34). ومن المثير للاهتمام ، أن طفرات D207A تبيض في الضوء الأحمر دون توليد Pfr (10) ، في حين أن طفرات R472A لها تأثيرات طفيفة فقط على خصائص الامتصاص. ومع ذلك ، على عكس الوحدة الحسية WT ، فشل R472A في التقليل في حالة Pr ، في حين أن Pfr dimerisation لا يتأثر (الشكل S4). وبالتالي ، من المحتمل أن يكون اللسان مهمًا في نقل إشارة الضوء إلى سطح الجزيء ، ومن المحتمل أن يكون تعطيل جسر الملح إلى Arg-472 الخطوة الأولى. قد يقرن Arg-472 التغييرات على الحلقة D الضوئية لتشكل اللسان ، لأنه يرتبط بالهيدروجين بالسلسلة الرئيسية للأكسجين بين Gly-451 و Gly-452 عند ملتوية اللسان (الشكل S3).

على الجانب الآخر من حامل اللون ، قد يكون جسر الملح بين بروبيونات الحلقة B و Arg-254 ، المحفوظ حتى في بعض البروتينات ثنائية الكروم غير الفيتوكرومية ، طريقًا بديلًا لنقل الإشارات داخل الوحدة الحسية (الشكل 4).أ). تُظهر طفرات Arg-254 و Arg-472 تغيرات متشابهة في ثنائياتها المعتمدة على الحالة (الشكل S4) ، مما يعني أنهما متورطان في التوسط في نقل الإشارات داخل الجزيء إلى سطح الجزيء. في الواقع ، Arg-254 ضروري في تأشير النبات فيتوكروم A (A. Nagatani ، الاتصال الشخصي). يمكن للحلقة D photoflip تغيير موضع حلقات بيلين B و C ، مما يؤثر على جسور الملح وبالتالي على واجهة مجال PAS / GAF ، على سبيل المثال عن طريق حركة خارجية / داخلية لـ Arg-222 المحفوظة. قد يتم إعادة ربط بروبيونات B بـ Arg-222 وهو نظام إشارات مشابه يتضمن جسور ملح بروبيونات أرجينين - هيم وقد تم اقتراحه من أجل مستشعر الأكسجين FixL (35). يتم وضع بروبيونات C-ring بشكل مختلف في Cph1 بالنسبة لهياكل الجرثومية (الشكل 4).أ) ، الرابطة الهيدروجينية بـ Thr-274 (وعبر اثنين من المياه إلى Ser-272). قد تكون هذه التفاعلات مهمة أيضًا في إرسال الإشارات. أخيرًا ، يمكن أن ينتقل فقدان تفاعل الحلقة D – His-290 بسهولة إلى سطح البروتين عن طريق His-291.

إلى جانب التشكل ، يعتبر بروتونات البيلين عاملاً مهمًا في تحسين امتصاص الضوء (36 ، 37). في الواقع ، تُظهر بيانات الرنين المغناطيسي النووي الحديثة السائلة والصلبة بوضوح أن جميع النيتروجينات الأربعة التي تحتوي على الكروموفور يتم إنتاجها في كل من حالات Pr و Pfr (31 ، 32). ومع ذلك ، لا تظهر أي من تركيبات فيتوكروم المعروفة سلاسل جانبية حمضية بالقرب من حامل الكروم والتي يمكن أن تعمل بمثابة معاكسات لنظام رباعي بيرول موجب الشحنة. توجه Asp-207 سلسلتها الجانبية بعيدًا عن chromophore لتشكيل جسر الملح إلى Arg-472. أيضًا ، يبدو أن طفرة D207A لا تؤثر على بروتون البروتون (10 ، 38). ومع ذلك ، قد يكون pK للكروموفور المرتبط أعلى بكثير من المحلول الحر ، لذلك يمكن أن يعمل الهيستيدين أو حتى التيروزين والسيستين كمانحين للبروتون. من المحتمل أن يعمل جهاز His-260 المحفوظ كمصدر / حوض للبروتون عن طريق الارتباط بالهيدروجين عبر الماء 3 إلى نيتروجين الحلقات من A إلى C ، كما هو الحال في طفرة H260Q ، ينفصل حامل الكروم عن درجة الحموضة 8 (10). قد تؤدي الشحنات السالبة الجزئية لأكسجين العمود الفقري Asp-207 والنيتروجين His-260 1 إلى تثبيت الكروموفور الموجب (20). قد يكون لتفاعل His-290-ring D المذكور أعلاه دور مماثل. ال ZZZssa يقيد تشابه العلاقات العامة مع البروتونات الكاملة في كل من Pr و Pfr نماذج لآلية التحويل البيني بواسطة الضوء الأحمر والضوء الأحمر البعيد. على الرغم من إطلاق البروتون العابر القابل للقياس وامتصاصه من phytochromes أثناء التحويل الضوئي (37) ، لا توجد قناة توصيل بروتون واضحة تؤدي إلى chromophore. نظرًا لأن تبادل البروتون يحدث في النطاق الزمني للميلي ثانية ، فمن المحتمل أن تكون التغييرات التوافقية للبروتين متضمنة. يمكن أن يؤدي فقدان تفاعل الحلقة D – His-290 على التشمير الضوئي إلى نزع توتر الكروموفور (37) ، بينما قد يحدث إعادة التنميط اللاحق عن طريق His-260 و / أو السلسلة الجانبية المحررة حاليًا من Asp-207. قد يبدو من الضروري لامتصاص الضوء ذي الطول الموجي الطويل أن يكون هناك نظام إلكترون واسع النطاق ، مما يتطلب بروتونات جميع النيتروجين الحلقي في حالات Pr و Pfr ، كما هو الحال بالفعل (31 ، 32).

بشكل مميز ، تربط apophytochromes وربطها chromophores تلقائيًا (39). ومع ذلك ، على عكس الهياكل السابقة ، فإن جيب ربط الكروموفور المرئي في هيكلنا مغلق (الشكل 3أ). أيضًا ، يتم ربط مجالات PAS و GAF معًا ، ويربط اللسان كلا من مجال GAF والنهاية N البارزة من خلال العقدة. وهكذا ، في سياق الخطوات الحركية المنفصلة التي لوحظت أثناء التجميع الذاتي (40) ، تصبح كيفية دخول حامل اللون إلى الجيب سؤالًا مثيرًا للاهتمام.

يتناقض مع الافتراضات السابقة ، يبدو أن إشارات النبات النباتية تنشأ من الوحدة الحسية الطرفية N ، والنصف الطرفي C للجزيء مسؤول عن التباين والتوطين النووي المعتمد على Pfr (41 ، 42). وبالتالي ، فإن هيكلنا للوحدة الحسية الكاملة Cph1 وثيق الصلة بالآلية الجزيئية الأولية الكامنة وراء تطوير النبات المنظم بالضوء. قد تكون التغييرات السطحية المعتمدة على الحالة التي نلاحظها (الشكل S4) ، والتي ربما تعكس التغييرات في اللسان وربما مناطق أخرى من البروتين ، من أسلاف إشارة الاستهداف النووي المشفرة (43) وربط الشريك (44) الخاص بـ Pfr. على عكس جزيئات البيدومين الجرثومية التي تم الإبلاغ عن هياكلها حتى الآن ، فإن الوحدة الحسية Cph1 الكاملة تشبه كيميائيًا ضوئيًا للبروتين كامل الطول (6). تتمتع البلورات أيضًا بخصائص امتصاص UV-Vis مماثلة لـ Cph1 في المحلول بالفعل ، فمن الممكن تحويل بلورات Pfr ضوئيًا إلى Pfr في ظل الظروف المناسبة (الشكل 1).د والشكل S5). ومع ذلك ، تزامن التحويل الضوئي في الحالة البلورية مع فقدان شديد للحيود ، لذلك ستكون هناك حاجة إلى طرق أخرى لاشتقاق بنية Pfr.

كينازات بروتين الهيستيدين الحسية لها دور مركزي في بيولوجيا معظم الكائنات بدائية النواة ، ومبادلة المجال لـ Cph1 و EnvZ (45) مما يعني وجود آلية تنظيمية مشتركة. نظرًا لأنه يمكن تنشيط Cph1 وإلغاء تنشيطه بشكل غير موسع عن طريق نبضات الضوء البيكو ثانية أي عدد من المرات ، فقد يمثل نظامًا مفيدًا بشكل خاص للتحقيق في هذه الآلية. بشكل عام ، الدراسات الهيكلية / الوظيفية للكرومات النباتية لها أهمية واسعة في علم الأحياء.


نتائج

سلالات الكيس المتزامن تنتج Cph1 الموسوم بالهيستيدين

اثنين متزامن تم تصميم 6803 سلالات لتجميع له6-موسم Cph1 بروتين. في سلالة PhyHis ، التعبير المعدل سيف 1 الجين (cph1 – his6) تحت سيطرة المواطن الأصلي سيف 1 المروج في سلالة PsbPhyHis ، التعبير عن cph1 – his6 مدفوع بمحفز قوي منظم للضوء لجين البناء الضوئي psbA2.

تم اختيار PhyHis عند تحويل متزامن 6803 خلية من النوع البري تحتوي على DNA للبلازميد pF10Hisδ-RUC (الشكل 1). احتوى Plasmid pF10Hisδ-RUC على منطقة تشفير 3′ من سيف 1 بما في ذلك امتدادا في إطار له6-tag ترميز تسلسل و سيف 1 تسلسل المصب (انظر المواد والطرق). إعادة التركيب المزدوج المتماثل بين البلازميد و متزامن استبدل DNA الجينوم منطقة الترميز 3 ′ في سيف 1 البرية من نوع الجينات cph1 – his6 DNA من pF10Hisδ-RUC. عند اختيار المحول في وجود الكلورامفينيكول ، يتم الفصل الكامل لـ cph1 – his6 تم تأكيد الأليل في PhyHis بواسطة التهجين الجنوبي (غير موضح). في سلالة PhyHis ، كل شيء سيف 1 يتم استبدال نسخ الجينات بترميز His-tag cph1 – his6 أليل.

بناء سيف 1 الإفراط في التعبير سلالة PsbPhyHis of متزامن ص. PCC 6803. ال سيف 1/rcp1 تظهر المناطق الجينية للبلازميدات pF10Hisδ-RUC و pUpPsbPhy-K. تشير الصلبان إلى إدخالها في الحمض النووي للجينوم لخلايا من النوع البري وخلايا PhyHis ، على التوالي ، عن طريق إعادة التركيب المتماثل. الأسهم تدل على اتجاه النسخ. سم ، جين مقاومة الكلورامفينيكول Km ، جين مقاومة الكاناميسين. الصندوق الأسود في نهاية 3 سيف 1 يشير إلى تسلسل ترميز العلامة الخاصة به. يشار إلى مواقع التعرف على نوكليازات التقييد: H ، هينdIII E ، سابقة بمعنى البيئةRI C ، كلاأنا.

تم بعد ذلك تحويل Strain PhyHis باستخدام DNA للبلازميد pUpPsbPhy-K (انظر المواد والطرق) لتوليد إجهاد PsbPhyHis معربًا عن cph1 – his6 تحت سيطرة الجين psbA2 المروج (الشكل 1). 160 نقطة أساس psbA2 تم مؤخرًا إثبات أن جزء المروج الموجود في pUpPsbPhy-K يؤوي كل شيء رابطة الدول المستقلة العناصر التنظيمية اللازمة لكل من النسخ المعتمد على الضوء والنسخ عالي الضوء [[30]]. تم اختيار المحولات في وجود الكلورامفينيكول والكاناميسين. مرة أخرى ، تم تأكيد الفصل الكامل للسلالة PsbPhyHis عن طريق التهجين الجنوبي (غير معروض). التكامل الصحيح لـ psbA2 المروج المنبع من سيف 1 الجين والاندماج في إطار له6 -tag ترميز تمديد 3 ′ إلى سيف 1 تم التحقق من الجين في سلالة PsbPhyHis من خلال تسلسل اثنين من منتجات PCR التي تم الحصول عليها من PsbPhyHis والتي تغطي cph1 – his6 مناطق 5 ′ و 3 ، على التوالي (البيانات غير معروضة).

نسخ سيف 1 في PhyHis و PsbPhyHis

مستوى الحالة المستقرة لـ سيف 1 تم تحديد النصوص في النوع البري ، PhyHis و PsbPhyHis من خلال تحليل اللطخة الشمالية (الشكل 2 أ). لم يتم الكشف عن أي نصوص في الخلايا البرية وخلايا PhyHis ، مما يشير إلى ذلك سيف 1 يتم نسخها في كلا السلالتين عند مستوى أقل من حدود الكشف للطريقة المطبقة. في ال سيف 1 المبالغة في التعبير PsbPhyHis ، سيف 1 تم الكشف عن النصوص بسهولة. أدت زيادة شدة الضوء إلى زيادة كمية الضوء سيف 1 mRNA ، كما هو متوقع للجينات التي يقودها psbA2 المروجين.

تحليل سيف 1 النصوص. (أ) تحليل اللطخة الشمالية. مجموع الحمض النووي الريبي من الخلايا الخفيفة من متزامن تم فحص 6803 من نوع wild-type و PhyHis و PsbPhyHis باستخدام 32 P- المسمى سيف 1 الجين الداخلي 249 ب الحمض النووي الريبي المضاد. LL ، شدة الضوء المنخفضة (10 ميكرولتر · م −2 · ثانية −1) لتر ، شدة الضوء العادية (50 ميكرولتر · م −2 · ثانية −1). تُعطى مواضع الـ RNAs على اليمين بالكيلوباس. (ب) مقايسة حماية RNase. تم تهجين إجمالي الحمض النووي الريبي من الخلايا البرية وخلايا PhyHis مع 32 P. سيف 1- مسبار مضاد. عند هضم RNase ، تم فصل المنتجات المحمية من التحلل على هلام بولي أكريلاميد وتصور بواسطة التصوير الشعاعي الذاتي. Lane ‘probe’ shows the antisense probe prior to RNase degradation note the larger size of the undigested probe lane ‘probe (+)’ shows the entire degradation of the probe in the absence of متزامن 6803 RNA. The size of the protected probe is indicated at the right in number of bases.

In order to determine whether cph1 is transcribed in wild-type and PhyHis, the more sensitive method of RNase protection was applied. Using this technique, we identified cph1 transcripts in both strains at identical levels (Fig. 2B).

Expression and characterization of the Cph1–His6 بروتين

Because spectral detection of phytochrome in crude extracts of wild-type, PhyHis and PsbPhyHis failed, purification by affinity chromatography and subsequent enrichment were required to obtain the concentrations necessary for difference spectroscopy. For routine isolations, either 2- or 10-L cultures were harvested at a density of ≈ 5 × 10 7 cells·mL −1 . Soluble proteins were extracted, precipitated with ammonium sulfate and subjected to Ni/nitriloacetic acid affinity chromatography (see Materials and methods). The eluates were concentrated by ultrafiltration to 0.5–1 mL and analysed by difference spectroscopy. Extracts from the strains expressing His6-tagged Cph1, PhyHis and PsbPhyHis, exhibited red/far-red photoreversible absorbance changes characteristic for phytochromes. The calculated far-red minus red difference spectra were similar to that of the phycocyanobilin (PCB) adduct of recombinant Cph1 (Cph1-PCB) from بكتريا قولونية(تين. 3). No red/far-red photoactivity was found with eluates from wild-type (Fig. 3A and Table 3). Because in wild-type cells Cph1 does not possess a His6-tag, wild-type Cph1 was anticipated not to be retained by Ni/nitriloacetic acid affinity. This in turn implied that the spectral activities of the extracts from PhyHis and PsbPhyHis were derived from the presence of Cph1–His6. The ≈10-fold higher amplitude of the difference spectrum from PsbPhyHis compared to that from PhyHis (Table 3) most probably reflected the increased amount of photoactive Cph1–His6 in the over-expressor strain and correlated with the enhanced level of cph1 mRNA in PsbPhyHis (Fig. 2A). The protein Cph1–His6 will be referred to below as Cph1.

Difference spectra from متزامن extracts and recombinant Cph1-PCB, spectrum of red-irradiated sample subtracted from far-red-irradiated sample. Soluble proteins were extracted and purified as described. (A) Extracts from PhyHis (solid line) and wild-type (dotted line) (B) extracts from PsbPhyHis with (solid line) and without imidazole (dotted line) (C) recombinant Cph1-PCB with (straight line) and without imidazole (dotted line). All spectra were scaled to unity for the peak to peak value except the wild-type spectrum in (A) which was scaled to the same per cell level as the PhyHis spectrum of (A).

Δ(ΔA) mL·cm −1 , calculated
Per litre culture (× 10 −5 ) Per cell (× 10 −15 ) Per mg protein (× 10 −6 )
Wild-type (ن = 2) < 0.1 < 0.4 < 0.2
PhyHis (ن = 5) 0.87 ± 0.24 2.4 ± 1.4 3.1 ± 1.1
PsbPhyHis (ن = 2) 7 ± 3 21 ± 8 50 ± 30

Difference spectra were usually determined in the presence of imidazole, which served as eluent during Ni/nitriloacetic acid affinity chromatography. However, we found that imidazole shifts the position of the Pr peak of recombinant Cph1-PCB by ≈ 7 nm to shorter wavelengths. The same ‘imidazole-effect’ was seen with the photoactive extract from PsbPhyHis (Fig. 3B,C and Table 4). Nevertheless, a comparison of the Pr and Pfr peak positions of the difference spectra from PsbPhyHis extracts and from recombinant Cph1-PCB revealed an almost exact match in both the presence and absence of imidazole. This indicated again that the red/far-red photoactivity of the PsbPhyHis extract was related to the presence of a photoactive form of Cph1 and, moreover, suggested that the chromophore attached to Cph1 in PsbPhyHis was phycocyanobilin. Because of the very low amplitudes, difference spectra of extracts from PhyHis were measured with imidazole only. The positions of the Pr and Pfr bands of PhyHis deviated by 1 nm from the Cph1-PCB control (Table 4).

Maxima (nm)
Phytochrome species Pr peak Pfr peak
Cph1–His6, isolated from PhyHis, with 250 m m imidazole 650 705
Cph1–His6, isolated from PsbPhyHis, with 250 m m imidazole 648 703
Cph1–His6, isolated from PsbPhyHis, without imidazole 656 704
Recombinant Cph1–His6, PCB adduct, with 250 m m imidazole 649 706
Recombinant Cph1–His6, PCB adduct, without imidazole 656 706

Recombinant Cph1 was produced in بكتريا قولونية in very high amounts allowing the purification of the protein to almost homogeneity by Ni/nitriloacetic acid affinity chromatography [ [16] ]. A similar attempt failed using the متزامن strain PhyHis and the over-expressor strain PsbPhyHis. Ni/nitriloacetic acid eluates from PhyHis and PsbPhyHis contained several copurified proteins (Fig. 4A). However, the visualization of Cph1 was possible by Western blot analysis with antibodies raised against recombinant Cph1. The antibodies detected one protein of the photoactive extract from PsbPhyHis that had a similar mobility on SDS/PAGE as recombinant Cph1-PCB (Fig. 4B, lane 4). In the presence of Zn 2+ ions this protein and Cph1-PCB showed an orange fluorescence which is characteristic for phytochromes (Fig. 4C) [ [29] ]. No immunoreactive or fluorescent protein was present in extracts from متزامن 6803 wild-type (Fig. 4B,C).

Characterization of the Ni/nitriloacetic acid eluates from the strains PhyHis and PsbPhyHis. Aliquots of a PhyHis (lane 6) and PsbPhyHis eluate (lane 4) and different amounts of purified Cph1-PCB (lane 2–10 ng lane 3–3 ng) were separated by SDS/PAGE. (A) Coomassie brilliant blue stain (B) immunoblot analysis of poly(vinylidene difluoride) membrane-blotted proteins with anti-Cph1 antibodies (C) Zn 2+ -induced tetrapyrrole fluorescence under UV-light. The position of the 84.2-kDa Cph1 protein is indicated at the right arrows at the left represent molecular masses of protein standards in kDa. Note the presence of a protein in the PhyHis eluate that shows Zn 2+ -induced fluorescence but does not react with anti-Cph1 antibodies (B and C, lane 6).


Eukaryotic types Edit

Many eukaryotic cells possess two different types of condensin complexes, known as condensin I و condensin II, each of which is composed of five subunits (Figure 2). [4] Condensins I and II share the same pair of core subunits, SMC2 and SMC4, both belonging to a large family of chromosomal ATPases, known as SMC proteins (SMC stands for Structural Maintenance of Chromosomes). [5] [6] Each of the complexes contains a distinct set of non-SMC regulatory subunits (a kleisin subunit [7] and a pair of HEAT repeat subunits). [8] Both complexes are large, having a total molecular mass of 650-700 kDa.

مركب الوحدة الفرعية تصنيف الفقاريات D. melanogaster C. ايليجانس S. cerevisiae S. بومبي A. thaliana C. merolae T. ثيرموفيلا
condensin I & II SMC2 ATPase CAP-E/SMC2 SMC2 MIX-1 Smc2 Cut14 CAP-E1&-E2 SMC2 Scm2
condensin I & II SMC4 ATPase CAP-C/SMC4 SMC4/Gluon SMC-4 Smc4 Cut3 CAP-C SMC4 Smc4
condensin I CAP-D2 HEAT repeat CAP-D2 CAP-D2 DPY-28 Ycs4 Cnd1 CAB72176 CAP-D2 Cpd1&2
condensin I CAP-G HEAT repeat CAP-G CAP-G CAP-G1 Ycg1 Cnd3 BAB08309 CAP-G Cpg1
condensin I CAP-H kleisin CAP-H CAP-H/Barren DPY-26 Brn1 Cnd2 AAC25941 CAP-H Cph1,2,3,4&5
condensin II CAP-D3 HEAT repeat CAP-D3 CAP-D3 HCP-6 - - At4g15890.1 CAP-D3 -
condensin II CAP-G2 HEAT repeat CAP-G2 - CAP-G2 - - CAP-G2/HEB1 CAP-G2 -
condensin II CAP-H2 kleisin CAP-H2 CAP-H2 KLE-2 - - CAP-H2/HEB2 CAP-H2 -
condensin I DC SMC4 variant ATPase - - DPY-27 - - - - -

The core subunits condensins (SMC2 and SMC4) are conserved among all eukaryotic species that have been studied to date. The non-SMC subunits unique to condensin I are also conserved among eukaryotes, but the occurrence of the non-SMC subunits unique to condensin II is highly variable among species.

  • For instance, the fruit fly ذبابة الفاكهة سوداء البطن does not have the gene for the CAP-G2 subunit of condensin II. [9] Other insect species often lack the genes for the CAP-D3 and/or CAP-H subunits, too, indicating that the non-SMC subunits unique to condensin II have been under high selection pressure during insect evolution. [10]
  • The nematodeأنواع معينة انيقة possesses both condensins I and II. This species is, however, unique in the sense that it has a third complex (closely related to condensin I) that participates in chromosome-wide gene regulation, i.e., dosage compensation. [11] In this complex, known as condensin I DC , the authentic SMC4 subunit is replaced with its variant, DPY-27 (Figure 2).
  • Some species, like fungi (e.g., the budding yeast خميرة الخميرة and the fission yeast شيزوساكارومايس بومب), lack all regulatory subunits unique to condensin II. [12][13] On the other hand, the unicellular, primitive red alga سيانيديوشيزون ميرولاي, whose genome size is comparable to those of the yeast, has both condensins I and II. [14] Thus, there is no apparent relationship between the occurrence of condensin II and the size of eukaryotic genomes.
  • The ciliateرباعي الغشاء ثيرموفيلا has condensin I only. Nevertheless, there are multiple paralogs for two of its regulatory subunits (CAP-D2 and CAP-H), and some of them specifically localize to either the macronucleus (responsible for gene expression) or the micronucleus (responsible for reproduction). [15] Thus, this species has multiple condensin I complexes that have different regulatory subunits and display distinct nuclear localization. [16] This is a very unique property that is not found in other species.

Prokaryotic types Edit

Prokaryotic species also have condensin-like complexes that play an important role in chromosome (nucleoid) organization and segregation. The prokaryotic condensins can be classified into two types: SMC-ScpAB [17] and MukBEF. [18] Many eubacterial and archaeal species have SMC-ScpAB, whereas a subgroup of eubacteria (known as γ-proteobacteria) including الإشريكية القولونية has MukBEF. ScpA and MukF belong to a family of proteins called "kleisins", [7] whereas ScpB and MukF have recently been classified into a new family of proteins named "kite". [19]

مركب الوحدة الفرعية تصنيف B. الرقيقة كولوباكتر بكتريا قولونية
SMC-ScpAB SMC ATPase SMC/BsSMC SMC -
SMC-ScpAB ScpA kleisin ScpA ScpA -
SMC-ScpAB ScpB kite ScpB ScpB -
MukBEF MukB ATPase - - MukB
MukBEF MukE kite - - MukE
MukBEF MukF kleisin - - MukF

Despite highly divergent primary structures of their corresponding subunits between SMC-ScpAB and MukBEF, it is reasonable to consider that the two complexes play similar if not identical functions in prokaryotic chromosome organization and dynamics, based on their molecular architecture and their defective cellular phenotypes. Both complexes are therefore often called prokaryotic (or bacterial) condensins. Recent studies report the occurrence of a third complex related to MukBEF (termed MksBEF) in some bacterial species. [20]

Molecular structures Edit

SMC dimers that act as the core subunits of condensins display a highly characteristic V-shape, each arm of which is composed of anti-parallel coiled-coils (Figure 3 see SMC proteins for details). [21] [22] The length of each coiled-coil arm reaches

50 nm, which corresponds to the length of

150 bp of double-stranded DNA (dsDNA). In eukaryotic condensin I and II complexes, a kleisin subunit bridges the two head domains of an SMC dimer, and binds to two HEAT repeat subunits (Figure 1). [23] [24]

Early studies elucidated the structure of parts of bacterial condensins, such as MukBEF [25] [26] and SMC-ScpA. [27] [28] In eukaryotic complexes, several structures of subcomplexes and subdomains have been reported, including the hinge and arm domains of an SMC2-SMC4 dimer, [29] [30] a CAP-G(ycg1)/CAP-H(brn1) subcomplex, [31] [32] and a CAP-D2(ycs4)/CAP-H(brn1) subcomplex. [24] On the other hand, fast-speed atomic force microscopy has demonstrated that the arms of an SMC dimer is far more flexible than was expected. [33]

Molecular activities Edit

Condensin I purified from Xenopus egg extracts is a DNA-stimulated ATPase and displays the ability to introduce positive superhelical tension into dsDNA in an ATP-hydrolysis-dependent manner (positive supercoiling activity). [34] [35] Similar activities have been detected in condensins from other organisms. [36] [37] The positive supercoiling activity is activated في المختبر by Cdk1 phosphorylation, suggesting that it is likely one of the physiological activities directly involved in mitotic chromosome assembly. [38] It is postulated that this activity of condensin I helps fold DNA and promotes topoisomerase II-mediated resolution of sister chromatids. [39] Early single-DNA-molecule experiments also demonstrated in real time that condensin I is able to compact DNA in an ATP-hydrolysis dependent manner. [40]

Most recently, single-molecule experiments have demonstrated that budding yeast condensin I is able to translocate along dsDNA (motor activity) [41] and to "extrude" DNA loops (loop extrusion activity) [42] in an ATP hydrolysis-dependent manner. In the latter experiments, the activity of individual condensin complexes on DNA was visualized by real-time fluorescence imaging, revealing that condensin I indeed is a fast loop-extruding motor and that a single condensin I complex can extrude 1,500 bp of DNA per second in a strictly ATP-dependent manner. It has been proposed that condensin I anchors DNA between Ycg1-Brn1 subunits [31] and pulls DNA asymmetrically to form large loops. Moreover, it has been shown that condensin complexes can traverse each other, forming dynamic loop structures and changing their sizes. [43]

It is unknown how condensins might act on nucleosomal DNA. Recent development of a reconstitution system has identified the histone chaperone FACT as an essential component of condensin I-mediated chromosome assembly في المختبر, providing an important clue to this problem. [44] It has also been shown that condensins can assemble chromosome-like structures in cell-free extracts even under the condition where nucleosome assembly is largely suppressed. [45] This observation indicates that condensins can work at least in part on non-nucleosomal DNA in a physiological setting.

Only limited information is currently available as to the functional contribution of individual subunits of condensins to their activities. An SMC2-SMC4 dimer has an ability to reanneal complementary single-stranded DNA. [46] This activity does not require ATP. For eukaryotic complexes, it has been reported that HEAT repeat subunits contribute to part of DNA binding [31] [47] and to the assembly of chromosome axes. [48] Flexible and extendable nature of HEAT repeats could underlie the dynamic action of condensins and the architecture of mitotic chromosomes. [49] [50]

Mathematical modeling Edit

Several attempts on mathematical modeling and computer simulation of mitotic chromosome assembly, based on molecular activities of condensins, have been reported. Representative ones include modeling based on loop extrusion, [51] stochastic pairwise contacts [52] and a combination of looping and inter-condensin attractions. [53]

Mitosis Edit

In human tissue culture cells, the two condensin complexes are regulated differently during the mitotic cell cycle (Figure 4). [54] [55] Condensin II is present within the cell nucleus during interphase and participates in an early stage of chromosome condensation within the prophase nucleus. On the other hand, condensin I is present in the cytoplasm during interphase, and gains access to chromosomes only after the nuclear envelope breaks down (NEBD) at the end of prophase. During prometaphase and metaphase, condensin I and condensin II cooperate to assemble rod-shaped chromosomes, in which two sister chromatids are fully resolved. Such differential dynamics of the two complexes is observed in Xenopus egg extracts, [56] mouse oocytes, [57] and neural stem cells, [58] indicating that it is part of a fundamental regulatory mechanism conserved among different organisms and cell types. It is most likely that this mechanism ensures the ordered action of the two complexes, namely, condensin II first and condensin I later. [59]

On metaphase chromosomes, condensins I and II are both enriched in the central axis in a non-overlapping fashion (Figure 5). Depletion experiments في الجسم الحي [4] [58] [60] and immunodepletion experiments in Xenopus egg extracts [56] demonstrate that the two complexes have distinct functions in assembling metaphase chromosomes. Cells deficient in condensin functions are not arrested at a specific stage of cell cycle, displaying chromosome segregation defects (i.e., anaphase bridges) and progressing through abnormal cytokinesis. [61] [62]

The relative contribution of condensins I and II to mitosis varies among different eukaryotic species. For instance, each of condensins I and II plays an essential role in embryonic development in mice. [58] They have both overlapping and non-overlapping functions during the mitotic cell cycle. On the other hand, condensin II is non-essential for mitosis in the primitive alga C. merolae [14] and the land plant A. thaliana. [63] Curiously, condensin II plays a dominant role over condensin I in the C. ايليجانس early embryos. [11] This peculiarity could be due to the fact that C. ايليجانس has a specialized chromosome structure known as holocentric chromosomes. Fungi, such as S. cerevisiae [13] and S. بومبي [12] have no condensin II from the first. These differences among eukaryotic species provide important implications in the evolution of chromosome architecture (see the section of "Evolutionary implications" below).

It has recently become possible that cell cycle-dependent structural changes of chromosomes are monitored by a genomics-based method known as Hi-C (High-throughput chromosome conformation capture). [64] The impact of condensin deficiency on chromosome conformation has been addressed in budding yeast, [65] [66] fission yeast, [67] [68] and the chicken DT40 cells. [69] The outcome of these studies strongly supports the notion that condensins play crucial roles in mitotic chromosome assembly and that condensin I and II have distinct functions in this process. Moreover, quantitative imaging analyses allow researchers to count the number of condensin complexes present on human metaphase chromosomes. [70]

Meiosis Edit

Condensins also play important roles in chromosome assembly and segregation in meiosis. Genetic studies have been reported in S. cerevisiae, [71] D. melanogaster, [72] [73] and C. ايليجانس. [74] In mice, requirements for condensin subunits in meiosis have been addressed by antibody-mediated blocking experiments [57] and conditional gene knockout analyses. [75] In mammalian meiosis I, the functional contribution of condensin II appears bigger than that of condensin I. As has been shown in mitosis, [58] however, the two condensin complexes have both overlapping and non-overlapping functions, too, in meiosis. Unlike cohesin, no meiosis-specific subunits of condensins have been identified so far.

Recent studies have shown that condensins participate in a wide variety of chromosome functions outside of mitosis or meiosis. [59]

  • In budding yeast, condensin I (the sole condensin in this organism) is involved in copy number regulation of the rDNA repeat [76] as well as in clustering of the tRNA genes. [77]
  • In fission yeast, condensin I is involved in the regulation of replicative checkpoint[78] and clustering of genes transcribed by RNA polymerase III. [79]
  • في C. ايليجانس, a third condensin complex (condensin I DC ) related to condensin I regulates higher-order structure of X chromosomes as a major regulator of dosage compensation. [80]
  • في D. melanogaster, condensin II subunits contribute to the dissolution of polytene chromosomes[81] and the formation of chromosome territories[82] in ovarian nurse cells. Evidence is available that they negatively regulate transvection in diploid cells. It has also been reported that condensin I components are required to ensure correct gene expression in neurons following cell-cycle exit. [83]
  • في A. thaliana, condensin II is essential for tolerance of excess boron stress, possibly by alleviating DNA damage. [63]
  • In mammalian cells, it is likely that condensin II is involved in the regulation of interphase chromosome architecture and function. For instance, in human cells, condensin II participates in the initiation of sister chromatid resolution during S phase, long time before mitotic prophase when sister chromatids become cytologically visible. [84]
  • In mouse interphase nuclei, pericentromeric heterochromatin on different chromosomes associates with each other, forming a large structure known as chromocenters. Cells deficient in condensin II, but not in condensin I, display hyperclustering of chromocenters, indicating that condensin II has a specific role in suppressing chromocenter clustering. [58]
  • Whilst early studies suggested the possibility that condensins may directly participate in regulating gene expression, some recent studies argue against this hypothesis. [85][86]

Condensin subunits are subjected to various posttranslational modifications in a cell cycle-dependent manner. Among them, the best-studied example is phosphorylation. [87] For instance, Cdk1 (Cyclin-dependent kinase 1) activates condensin I, [38] whereas CK2 (Casein kinase 2) negatively regulate its activity. [88]

مركب الوحدة الفرعية محيط phosphorylation site كيناز المرجعي
condensin I & II SMC4 S. بومبي T19 Cdk1 [12]
S. cerevisiae عديدة Cdk1 [89]
condensin I CAP-D2 X. laevis T1314, T1348, T1353 Cdk1 [38] [44]
CAP-H H. العاقل S570 CK2 [88]
H. العاقل S70 aurora B [90]
S. بومبي S5, S41, S52 aurora B [90] [91]
CAP-D2, -G, -H H. العاقل - aurora B [92]
S. cerevisiae عديدة polo/Cdc5 [37]
condensin II CAP-D3 H. العاقل T1415 Cdk1 [93]
H. العاقل S1419 Plk1 [93]
CAP-G2 H. العاقل T1010 (PBD binding) ? [94]
CAP-H2 H. العاقل S492 Mps1 [95]
D. melanogaster - CK1α [96]

It has been reported that, in D. melanogaster, the CAP-H2 subunit of condensin II is degraded through the action of SCF Slimb ubiquitin ligase. [97]

It was demonstrated that MCPH1, one of the proteins responsible for human primary microcephaly, has the ability to negatively regulate condensin II. [98] In mcph1 patient cells, condensin II (but not condensin I) is hyperactivated, leading to premature chromosome condensation in G2 phase (i.e., before entering mitosis). [99] There is no evidence, however, that misregulation of condensin II is directly related to the etiology of mcph1 microcephaly. More recently, it has been reported that hypomorphic mutations in condensin I or II subunits cause microcephaly in humans. [100] In mice, hypomorphic mutations in condensin II subunits cause specific defects in T cell development, [101] leading to T cell lymphoma. [102] It is interesting to note that cell types with specialized cell division modes, such as neural stem cells and T cells, are particularly susceptible to mutations in condensin subunits.

Prokaryotes have primitive types of condensins, [17] [18] indicating that the evolutionary origin of condensins precede that of histones. The fact that condensins I and II are widely conserved among extant eukaryotic species strongly implicates that the last eukaryotic common ancestor (LECA) had both complexes. [59] It is therefore reasonable to speculate that some species such as fungi have lost condensin II during evolution.

Then why do many eukaryotes have two different condensin complexes? As discussed above, the relative contribution of condensins I and II to mitosis varies among different organisms. They play equally important roles in mammalian mitosis, whereas condensin I has a predominant role over condensin II in many other species. In those species, condensin II might have been adapted for various non-essential functions other than mitosis. [63] [81] Although there is no apparent relationship between the occurrence of condensin II and the size of genomes, it seems that the functional contribution of condensin II becomes big as the genome size increases. [14] [58] The relative contribution of the two condensin complexes to mitotic chromosome architecture also change during development, making an impact on the morphology of mitotic chromosomes. [56] Thus, the balancing act of condensins I and II is apparently fine-tuned in both evolution and development.

Eukaryotic cells have two additional classes of SMC protein complexes. Cohesin contains SMC1 and SMC3 and is involved in sister chromatid cohesion. The SMC5/6 complex contains SMC5 and SMC6 and is implicated in recombinational repair.


Tyrosine 263 in Cyanobacterial Phytochrome Cph1 Optimizes Photochemistry at the prelumi-R→lumi-R Step

We report a low-temperature fluorescence spectroscopy study of the PAS-GAF-PHY sensory module of Cph1 phytochrome, its Y263F mutant (both with known 3D structures) as well as Y263H and Y263S to connect their photochemical parameters with intramolecular interactions. None of the holoproteins showed photochemical activity at low temperature, and the activation barriers for the Pr→lumi-R photoreaction (2.5–3.1 kJ mol −1 ) and fluorescence quantum yields (0.29–0.42) were similar. The effect of the mutations on Pr→Pfr photoconversion efficiency (ΦPr→Pfr) was observed primarily at the prelumi-R س0 bifurcation point corresponding to the conical intersection of the energy surfaces at which the molecule relaxes to form lumi-R or Pr, lowering ΦPr→Pfr from 0.13 in the wild type to 0.05–0.07 in the mutants. We suggest that the هأ activation barrier in the Pr* س1 excited state might correspond to the D-ring (C19) carbonyl – H290 hydrogen bond or possibly to the hindrance caused by the C13 1 /C17 1 methyl groups of the C and D rings. The critical role of the tyrosine hydroxyl group can be at the prelumi-R bifurcation point to optimize the yield of the photoprocess and energy storage in the form of lumi-R for subsequent rearrangement processes culminating in Pfr formation.

اسم الملف وصف
php12263-sup-0001-FigS1.pdfapplication/PDF, 557.2 KB الشكل S1. Stereo pairs of the chromophore D ring environment.

يرجى ملاحظة ما يلي: الناشر غير مسؤول عن محتوى أو وظيفة أي معلومات داعمة مقدمة من المؤلفين. يجب توجيه أي استفسارات (بخلاف المحتوى المفقود) إلى المؤلف المقابل للمقالة.


Engineering Light- and Pharmacologically Triggered Extracellular Biological Switches

For the chemical switch controlling viral infectivity we used adeno-associated viral particles (AAV) due to their high relevance in gene-therapeutic approaches. We engineered the system in such a way that infection of the target cells occurs only in the presence of the rapamycin structural analog AP21967.

The development of the light-tunable extracellular matrix was realized by combining light-gated molecular switches from the field of optogenetics with cell-compatible polymers from material sciences. To this aim, we covalently coupled the cyanobacterial phytochrome Cph1 to an eight-arm polyethylene glycol forming a biohybrid hydrogel. Illumination with red light triggers dimerization of Cph1, thereby increasing the number of crosslinks within the hydrogel and thus enhancing its stiffness. Vice versa, far-red light illumination induces Cph1 monomerization and decreases hydrogel stiffness. Due to the fast switching properties of Cph1, the stiffness can be modulated reversibly within seconds. By incorporation of RGD cell adhesion motifs our hydrogel serves as suitable matrix for primary cells as well as cell lines. Since variations in matrix stiffness can modulate cellular signaling pathways and even direct cell differentiation, we propose that our engineered light-tunable extracellular matrix will be a unique tool for studying matrix-cell interactions.


شاهد الفيديو: الأول الثانوي علمي - علم الأحياء - الأنظيمات (قد 2022).