معلومة

ما هي البيانات الجيدة عن نموذج التمثيل الغذائي البشري وأين يمكنني الحصول عليها؟

ما هي البيانات الجيدة عن نموذج التمثيل الغذائي البشري وأين يمكنني الحصول عليها؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

محاولة الحصول على تمثيل SBML جيد لنموذج التمثيل الغذائي البشري لاستخدامه في محاكاة تحليل توازن الجريان واستهداف الأدوية (أي الضربة القاضية للجينات).

ما هي المصادر الجيدة لهذه البيانات؟

شكرا جزيلا!


على حد علمي ، لا يوجد نموذج واحد يُعرف رسميًا باسم "نموذج التمثيل الغذائي البشري" ، ولكن نموذج Recon 2 ، الموصوف بأنه نموذج "إجماع" وهو الأكثر شمولاً حتى الآن في Thiele et al. 2013 ، إعادة بناء عالمية يقودها المجتمع لعملية التمثيل الغذائي البشري (http://www.nature.com/nbt/journal/v31/n5/full/nbt.2488.html) متاح على http://humanmetabolism.org/؟page_id=75

تتوفر أيضًا نماذج خاصة بالأنسجة. انظر على سبيل المثال Wang et al: إعادة بناء نماذج التمثيل الغذائي على نطاق الجينوم لـ 126 من الأنسجة البشرية باستخدام mCADRE. بي إم سي سيستمز بيولوجي 2012 ، 6:153:


أ C. ايليجانس نموذج لدراسة تنظيم التمثيل الغذائي البشري

اضطراب التمثيل الغذائي للدهون هو عامل خطر حاسم لمتلازمة التمثيل الغذائي ، مما يؤدي إلى أمراض منهكة مثل السمنة ومرض السكري. تعد كل من السمنة ومرض السكري بؤرة المشكلات الطبية المهمة ، وتمثل تهديدًا دوليًا رئيسيًا للصحة العامة. يؤدي تراكم الدهون في الأنسجة الدهنية والعضلات والكبد و / أو عيوب قدرتها على استقلاب الأحماض الدهنية إلى مقاومة الأنسولين. هذا يؤدي إلى التسبب في مرض السكري من النوع 2 (T2D) في وقت مبكر. في الثدييات ، يشمل التمثيل الغذائي للدهون عدة أعضاء ، بما في ذلك الدماغ والأنسجة الدهنية والعضلات والكبد والأمعاء. هذه الأعضاء هي جزء من نظام الاستتباب المعقد وتتواصل من خلال الهرمونات والخلايا العصبية والمستقلبات. توضح دراستنا أهمية العوامل الشبيهة بالثدييات في جميع أنواع استتباب الطاقة. يتم حفظ العوامل التي تتحكم في استقلاب الطاقة بين الثدييات و أنواع معينة انيقة توفير استراتيجية جديدة وقوية لتحديد المسارات الجزيئية التي تؤدي إلى اضطراب التمثيل الغذائي. ال C. ايليجانس الأمعاء هو نظامنا النموذجي حيث يتم استخدام علم الوراثة والبيولوجيا الجزيئية وبيولوجيا الخلية لتحديد وفهم الجينات المطلوبة في التمثيل الغذائي للدهون. حتى الآن ، وجدنا دورًا مهمًا لـ C. ايليجانس KLF في التخليق الحيوي FA ، تكاثر الميتوكوندريا ، إفراز الدهون ، وأكسدة بيتا. الآلية التي يتحكم بها KLF في هذه الأحداث في التمثيل الغذائي للدهون غير معروفة. لقد لاحظنا ذلك مؤخرًا C. ايليجانس يعمل KLF-3 بشكل انتقائي على مكونات الأنسولين لتنظيم نشاط مسار الأنسولين. هناك العديد من العوامل التي تتحكم في توازن الطاقة والعيوب في نظام التحكم هذا متورط في التسبب في السمنة البشرية ومرض السكري. في هذا الاستعراض نناقش دور KLF في تنظيم التمثيل الغذائي البشري.


مقال MINI REVIEW

  • 1 مختبر رئيسي للولاية لهندسة المفاعلات الحيوية ، جامعة شرق الصين للعلوم والتكنولوجيا ، شنغهاي ، الصين
  • 2 مركز شنغهاي التعاوني للابتكار لتكنولوجيا التصنيع الحيوي ، شنغهاي ، الصين

أصبحت النماذج الأيضية على نطاق الجينوم (GEMs) أداة شائعة لبيولوجيا الأنظمة ، وقد تم استخدامها في العديد من المجالات مثل التكنولوجيا الحيوية الصناعية وطب الأنظمة. منذ إجراء المزيد والمزيد من الدراسات باستخدام الأحجار الكريمة ، فقد حظيت مؤخرًا باهتمام كبير. في هذا الاستعراض ، نقدم المفهوم الأساسي للأحجار الكريمة ونقدم لمحة عامة عن تطبيقاتها في التكنولوجيا الحيوية وطب الأنظمة وبعض المجالات الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، نصف المبدأ العام للتطبيقات والتحليلات المبنية على الأحجار الكريمة. الغرض من هذه المراجعة هو تقديم تطبيق الأحجار الكريمة في التحليل البيولوجي وتعزيز استخدامها على نطاق أوسع من قبل علماء الأحياء.


نتائج ومناقشة

وصف شبكة التمثيل الغذائي للكبد البشري

استخدمنا نموذج استقلابي للكبد البشري ممثلة بمجموعة من التفاعلات الأيضية [8] ، والتي تحتوي على 1360 مستقلبًا و 1826 تفاعلًا. تم إنشاء نموذج التمثيل الغذائي البشري بناءً على خوارزمية ماجستير إدارة الأعمال [8] ، وهي عبارة عن خوارزمية لبناء النموذج تُستخدم لاشتقاق نماذج التمثيل الغذائي الخاصة بالأنسجة من نموذج عام [6] من خلال دمج مجموعة متنوعة من مصادر البيانات الجزيئية الخاصة بالأنسجة ، بما في ذلك الأدبيات المعرفة المستندة إلى البيانات ، النسخية ، البروتينية ، الأيضية ، والنمط الظاهري. في نموذج التمثيل الغذائي للكبد البشري ، يتم تمثيل كل مستقلب في شكل أ[x]، أين أ هو اسم المستقلب و x في القوس [] هو اختصار مقصورة الخلية حيث المستقلب أ يظهر (انظر ملف إضافي 1). المستقلب أ قد تظهر في حجرات خلايا مختلفة x,…,ذ، لذلك هناك أ[x],…,أ[ذ] لنفس المستقلب ولكن لمقصورات خلوية مختلفة ، والتي يتم حسابها على أنها نواتج أيضية مختلفة.

استنادًا إلى المبدأ القائل بأنه يمكن ترجمة مجموعة من التفاعلات الأيضية إلى تمثيل شبكي [25] ، قمنا بإعادة صياغة نموذج الكبد بالطريقة التالية: الإشارة إلى كل مستقلب بواسطة عقدة مسماة بـ أ[x] ، وربط عقدتين من خلال أ[x] → ب[ذ] إذا كان هناك تفاعل كيميائي حيث أ[x] ركيزة و ب[ذ] منتج. يحتوي HLMN المشتق على 1360 عقدة و 6501 رابطًا (انظر الملف الإضافي 1). من أجل توضيح عملية إعادة صياغة HLMN ، يرد مثال مع ثلاثة تفاعلات أيضية في الشكل 1.

مثال لإظهار كيفية إعادة تنسيق HLMN من نموذج الكبد. أ) تظهر ثلاثة تفاعلات أيضية في نموذج الكبد على اليسار ، حيث hgentis و o2 و 4mlacac و h و hco3 و h2co3 عبارة عن نواتج أيضية ، [c] و [m] هي اختصارات مقصورات الخلية "السيتوبلازم" و "الميتوكوندريون" التي تشير إلى المكان تظهر المستقلبات المقابلة. يمثل التفاعل الأيضي الأول أن homogentisate في السيتوبلازم (hgentis [c]) يتأكسد إلى 4-مالييل أسيتو أسيتات (4mlacac [c]) وأيون الهيدروجين (h [c]) ويعني الثاني أن أيون الهيدروجين في السيتوبلازم (h [c] ) إلى الميتوكوندريا (h [m]) يمثل الثالث أن أيون الهيدروجين في الميتوكوندريا (h [m]) يتفاعل مع البيكربونات (hco3 [m]) لتكوين حمض الكربونيك (h2co3 [m]). تظهر الشبكة التي تمت إعادة تنسيقها من هذه التفاعلات الأيضية الثلاثة على اليمين ، حيث تشير كل عقدة إلى مستقلب بمعلومات حجرة الخلية حيث تظهر ، ويكون للعقدتين رابط إذا كان هناك تفاعل كيميائي بحيث يكون أحد المستقلبات عبارة عن ركيزة والآخر منتج. ب) اختصارات مقصورة الخلية والأسماء الكاملة المقابلة لها.

للراحة وبدون غموض ، لن نفرق العقد من المستقلبات فيما يلي عند الإشارة إلى خصائص HLMN. على سبيل المثال ، عندما نقول عقدة سائق في HLMN ، فقد نعني مستقلب سائق في HLMN.

تصنيف وتحليل مستقلبات المحرك

مستقلبات المحرك في HLMN هي نواتج أيضية يتم فيها حقن المدخلات. إذا تم التحكم في مستقلبات المحرك في مجموعة مستقلبات المحرك الدنيا (MDMS ، باختصار) بواسطة مدخلات مختلفة ، فيمكن توجيه HLMN من أي حالة معينة إلى الحالة المرغوبة في وقت محدد. يعني "الحد الأدنى" أنه إذا تم إدخال الإشارات فقط على مجموعة فرعية مناسبة من س، ثم لا يمكن توجيه HLMN إلى بعض الحالات النهائية المرغوبة في وقت محدود. يتم تحديد MDMS من خلال الكشف عن الحد الأقصى من المطابقات في HLMN (انظر الطرق).

الحد الأقصى للمطابقة هو الحد الأقصى لمجموعة الروابط التي لا تشارك عقد البداية أو النهاية [16]. هناك حد أقصى مختلف للمطابقات في الشبكة [26] ، مما قد ينتج عنه أنظمة MDMS مختلفة في HLMN. ثبت أن حساب عدد جميع المطابقات القصوى في شبكة عشوائية ينتمي إلى فئة المشاكل ♯P-complete (حاد P-complete) [27]. لا توجد خوارزمية متعددة الحدود معروفة حاليًا لحل مشكلة ♯P كاملة. يمكن أن ينمو عدد المطابقات القصوى بشكل كبير مع حجم الشبكات ، وبالتالي فإن الشبكة التي تحتوي على مئات العقد فقط تؤدي غالبًا إلى الملايين من المطابقات القصوى. يعد تعداد الحد الأقصى من المطابقات أمرًا محظورًا من الناحية الحسابية بالنسبة للشبكات الكبيرة [28]. وبالتالي ، يصعب تعداد الحد الأقصى من المطابقات في HLMN (التي تحتوي على 1360 عقدة).

تصنيف مستقلبات السائق

حددنا بشكل عشوائي 5000 مطابقة كحد أقصى مختلفة (انظر الملف الإضافي 2) وأنظمة إدارة الوسائط المتعددة (MDMS) المقابلة لها (انظر الطرق). في HLMN ، قد تظهر العقدة في MDMSs مختلفة. لكل عقدة الخامس، قمنا بإحصاء عدد MDMSs التي تمثلها العقدة الخامس يظهر في الرقم ثم يتم تطبيعه (أي أن الرقم مقسوم على 5000). القيم المقيسة تميز التردد F د من كل عقدة تظهر في 5000 MDMS. وفقًا لتكرار كل عقدة ، قمنا بتصنيف المستقلبات إلى ثلاث مجموعات: مستقلبات المحرك الحرجة مع F د = 1 ، نواتج الأيض عالية التردد مع 0.6 ≤ F د & lt 1 ، مستقلبات المحرك ذات التردد المنخفض بصفر F د & lt 0.6.

العقدة ذات F د = 1 يعني أن العقدة تظهر في جميع MDMSs. قد تمتلك هذه العقد بعض الخصائص أو الوظائف المحددة ، والتي يمكن أن توفر معلومات قيمة عن HLMN. لذلك قمنا بتصنيف العقد بـ F د = 1 كونه عقدة سائق حاسمة. السبب في اختيارنا للحد 0.6 لفصل مستقلبات المحرك عالي التردد عن مستقلبات المحرك ذات التردد المنخفض ، هو أننا نود أن نجعل الفرق بين دور المستقلبات في هاتين المجموعتين كبيرًا قدر الإمكان (للحصول على تحليل مفصل ، انظر القسم الفرعي "أدوار المستقلبات عالية التردد للمحرك").

من أجل اختبار ما إذا كان تصنيف المستقلبات استنادًا إلى 5000 MDMSs موثوقًا ، قمنا بحساب ترددات المستقلبات في 51 عائلة مختلفة من MDMSs بأحجام 5000،5100،5200 ، ... ، 10000. يبقى تكرار كل مستقلب محسوبًا على أساس عائلات مختلفة من MDMSs في نفس المنطقة ، حيث توجد المناطق F د = 1, 0.6 ≤ F د & lt 1 و 0 F د & lt 0.6 (انظر ملف إضافي 3). بمعنى آخر ، تصنيفات كل مستقلب هي نفسها بناءً على هذه العائلات المختلفة. ومن ثم فإن تصنيف المستقلبات على أساس 5000 MDMSs يمكن الاعتماد عليه. علاوة على ذلك ، استخدمنا طريقة أخذ عينات عشوائية غير متحيزة [28] للتحقق من صحة النتائج بناءً على 5000 MDMS (للتحليل التفصيلي ، راجع القسم الفرعي "التحقق من صحة تصنيف وخصائص نواتج الأيض المحركة").

التحليل الطوبولوجي لمستقلبات المحرك في HLMN

قمنا بحساب مركزيات مختلفة لكل مستقلب أنا في HLMN ، والتي تشمل درجة جامعية أوتد، في الدرجة إن دي، الدرجة العلمية دبيني قبل الميلادالقرب نسخة، في القرب CCI والقرب CCO (للحصول على تعريفات ، انظر الطرق). التردد F د وجد أنه يتناقص بسرعة مع الدرجة الداخلية (انظر الملف الإضافي 4) في حين أن هذا النمط لا ينطبق على المركزية الأخرى ، وهو ما يتوافق مع النتيجة في [28]. لكل مركزية ، يتم تقسيم جميع المستقلبات في HLMN إلى ثلاث مجموعات من الأحجام المتشابهة ، بناءً على درجات مركزيتها (منخفضة ومتوسطة وعالية) ، وبهذه الطريقة ، تم الحصول على سبع مجموعات من المجموعات: FD = ، F OutD = ، F InD = ، F BC = ، F CC = ، F CCI = ، F CCO = ، حيث تحتوي كل عائلة على ثلاث مجموعات ، والمشتريات ل,م,ح تمثل على التوالي منخفضة ومتوسطة وعالية.

استخدمنا مجموعة أ للدلالة على اتحاد المستقلبات من 5000 MDMSs ، وتعيين ب للإشارة إلى مجموعة اتحاد نواتج التشغيل الحرجة وعالية التردد. لكل من العائلات F D ، F OutD ، F InD ، F BC ، F CC ، F CCI ، F CCO ، كسور المستقلبات من المجموعة أ التي تنتمي إلى المجموعات الثلاث في الأسرة (انظر الشكل 2 (أ)) ، وكسور المستقلبات من المجموعة ب التي تنتمي إلى المجموعات الثلاث في الأسرة تم حسابها أيضًا (انظر الشكل 2 (ب)). على سبيل المثال ، بالنسبة للعائلة F D ، قمنا بحساب |أد ل|/|أ|, |أد م|/|أ|, |أد ح|/|أ| و |بد ل|/|ب|, |بد م|/|ب|, |بد ح|/|ب| ، أين | ∗ | يدل على حجم المجموعة ∗.

التحليل الطوبولوجي لمستقلبات المحرك. أ) المستقلبات في المجموعة A (اتحاد المستقلبات من 5000 MDMSs) ب) المستقلبات في المجموعة B (مجموعة المستقلبات الحرجة وذات التردد العالي). بالنسبة إلى الملصقات الموجودة في المحور الأفقي ، تمثل "D" ، و "InD" ، و "OutD" ، و "BC" ، و "CC" ، و "CCI" ، و "CCO" على التوالي الدرجة ، والداخلية ، والدرجة الخارجية ، وبين المسافة ، والتقارب ، التقارب ، التقارب. يمثل ارتفاع الأشرطة الزرقاء والخضراء والبنية على التوالي كسور نواتج الأيض مع درجات مركزية عالية ومتوسطة ومنخفضة. الفرق بين كسور كل مركزية في ب) أكبر من ذلك في أ). باستثناء القرب الخارجي في B) ، فإن الأشرطة البنية كلها أقل من تلك الزرقاء والخضراء لنفس المركزية ، مما يشير إلى أن نواتج الأيض تميل إلى تجنب العقد ذات الدرجة العالية (على التوالي ، خارج الدرجة ، في -الدرجات ، بين الدرجات ، التقارب والتقارب) ، بينما تميل نواتج الأيض ذات التردد العالي والحرجة إلى التقارب العالي.

بمقارنة النتائج الموضحة في الشكل 2 (أ) والشكل 2 (ب) ، نجد أنه لكل مركزية ، الفرق بين الكسور المحسوبة في المجموعة ب أكبر من ذلك في المجموعة أ، مما يعني أن الاختلافات المميزة الطوبولوجية أكبر في مجموعة المستقلبات الحرجة وعالية التردد. تقيس الدرجة والتقارب قابلية المستقلب للتأثر بالمستقلبات الأخرى. تشير الدرجة الأعلى والأعلى في القرب إلى أن المستقلب يمكن أن يتأثر بسهولة بالآخرين. يقيس التقارب الخارجي قدرة المستقلب على التأثير في المستقلبات الأخرى. يشير القرب الأعلى إلى أن المستقلب يمكن أن يؤثر على الآخرين بسهولة أكبر. المستقلبات في مجموعة ب تميل إلى أن تكون ذات درجة منخفضة ، وتقارب منخفض ، وتقارب مرتفع. لذلك ، فإن المستقلبات الدافعة ، وخاصة المستقلبات الحرجة وعالية التردد ، تميل إلى أن يكون لها قدرة قوية على التأثير على حالات الأيضات الأخرى وقابلية ضعيفة للتأثر بحالات الأيضات الأخرى. علاوة على ذلك ، فإن حقن مدخلات التحكم (الأدوية ، والإشارات من البيئة أو داخل الكائن الحي ، وما إلى ذلك) في المستقلبات الحرجة وعالية التردد يمكن أن ينظم الحالة الكاملة لـ HLMN ، مما يشير إلى أن المستقلبات الحرجة وعالية التردد قد تكون محتملة أهداف المخدرات.

بالنسبة لكل مركزية ، استخدمنا اختبار مربع كاي (انظر الطرق) لتحديد ما إذا كان توزيع الكسور في المجموعة أ والمجموعة ب يختلف عن ذلك في الشبكة بأكملها (السبب وراء اختيارنا اختبار كاي سكوير مذكور في الطرق) . القيم الإحصائية لمربع كاي لكل مركزية في المجموعة أ والمجموعة ب موضحة في الجدول 1. بينما قيمة الجدول لإحصاء مربع كاي هي 5.99 ، بناءً على الحرية التي تكون 2 ومستوى الأهمية 0.05. ما عدا CCO، القيم الإحصائية الأخرى لـ chi-square أكبر من قيمة الجدول في المجموعة A ، والقيم الإحصائية لمربع chi لجميع المركزية أكبر من قيمة الجدول في المجموعة B. وهذا يعني أنه باستثناء CCO في المجموعة A ، بالنسبة للمراكز المركزية الأخرى في المجموعة A وجميع المركزية في المجموعة B ، تختلف توزيعات الكسور عن تلك الموجودة في الشبكة بأكملها. وبالتالي ، فإن نتيجة السمات الطوبولوجية لمستقلبات المحرك لها أهمية إحصائية.

خصائص مستقلبات المحرك الحرجة

في HLMN ، اكتشفنا 36 مستقلبًا حرجًا للسائق (انظر الجدول 2). جميع درجاتها الداخلية هي صفر ، وهو ما يتوافق مع النتيجة في [29] ويعني أن المستقلبات المحركة الـ 36 الحرجة هي جميع نواتج الأيض الأولية للمسارات (المسارات في HLMN هي تفاعلات متسلسلة بين المستقلبات). من خلال نظرية لين الهيكلية للتحكم [18 ، 30] ، إذا كان النظام يمكن التحكم فيه ، فلا توجد عُقد لا يمكن الوصول إليها (أي العقد التي لا يمكن الوصول إليها أو "تتأثر" بالمدخلات الخارجية). نظرًا لأن مستقلبات البداية هذه لا يمكن أن تتأثر بالمدخلات الخارجية عبر المستقلبات الأخرى ، فيجب التحكم فيها بشكل مباشر عن طريق المدخلات الخارجية.

تم العثور على جميع المستقلبات الحرجة للسائق البالغ عددها 36 خارج الخلية (يرتبط كل من 36 مستقلبًا بالغ الأهمية للمحرك باختصار المعلومات الجزئية "[e]" ، مما يعني خارج الخلية). من خلال فحص أنشطة الكيمياء الحيوية لـ 36 مستقلبًا حرجًا ، وجدنا أنها تشارك جميعًا في تفاعلات النقل من خارج الخلية إلى الخلية ، مما يشير إلى أن مآخذ هذه المستقلبات خارج الخلية تلعب أدوارًا مهمة في الأنشطة البيولوجية لخلايا الكبد. على سبيل المثال ، زيادة تناول المستقلب الحرج جاما توكوفيرول بشكل مناسب يمكن أن يساعد في خفض مستوى الكوليسترول ، وزيادة تناول المستقلب الحرج ألفا توكوفيرول يمكن أن يقلل من أكسدة الدهون وتنشيط الخلايا النجمية الكبدية ، والتي يمكن أن تحمي خلايا الكبد و منع تليف الكبد [51].

لقد بحثنا في الأهمية البيولوجية لـ 36 مستقلبًا حرجًا. تقيس أهمية المستقلب مدى أهمية المستقلب في أنظمة التمثيل الغذائي بأكملها أو بعض عمليات التمثيل الغذائي. على الرغم من أن المستقلب يمكن أن يوجد في أجزاء مختلفة ، إلا أنه من المعروف أن المستقلب ضروري طالما وجد أنه ضروري في أي من المقصورات [33]. بناءً على الأساسيات المختلفة للمستقلبات ، تم تصنيف المستقلبات إلى ثلاث مجموعات:

المستقلبات العالمية (UM): بعض المستقلبات غير العضوية أو العامل المساعد ، مثل CMP و ATP ، والتي وُجدت في جميع أنحاء العالم في أكثر من 90٪ من الكائنات الحية. عادة ما يتم التعامل مع المستقلبات العامة كمستقلبات أساسية لأن معظم المواد الحية لا يمكنها البقاء على قيد الحياة بدونها [33 ، 52].

المستقلبات الأساسية الوظيفية (FEM): المستقلبات التي ليست UM ولها أدوار أساسية في بعض الوظائف البيولوجية. على سبيل المثال ، حمض الفوليك ضروري للعديد من وظائف الجسم ، ويطلبه جسم الإنسان لتخليق وإصلاح وميثيل الحمض النووي بالإضافة إلى العمل كعامل مساعد في بعض التفاعلات البيولوجية [31] الهيالورونان ضروري للتكون الجنيني [37] يتطلب جسم الإنسان حمض البانتوثنيك لتخليق أنزيم A (CoA) ، وكذلك لتخليق واستقلاب البروتينات والكربوهيدرات والدهون [44].

المستقلبات الأساسية غير المكتشفة (EUM): المستقلبات التي لم يتم اكتشاف أهميتها. قد تكون هذه المستقلبات هي المستقلبات الأساسية المحتملة ، والتي تتطلب مزيدًا من التحقق التجريبي.

من بين 36 مستقلبًا مهمًا للسائق ، نجد أن 10 مستقلبات هي مستقلبات UM 17 هي مستقلبات FEM 9 وهي EUM. لذلك ، من بين 36 مستقلبًا مهمًا ، 27 مستقلبًا ضروريًا ، مما يشير إلى أن المستقلبات المحركة الحاسمة تلعب أدوارًا مهمة في استقلاب الكبد البشري.

أدوار نواتج الأيض عالية التردد

استخدمنا خوارزمية محاكاة التلدين (SA) [53] لاكتشاف الوحدات في HLMN. السبب في اختيارنا لخوارزمية SA هو أنها تقنية شائعة الاستخدام لاكتشاف الوحدات ، ومعيار للتحقق من فعالية خوارزميات اكتشاف الوحدات المطورة حديثًا [54 ، 55]. بالمقارنة مع خوارزميات أخرى للكشف عن الوحدات ، مثل طريقة ماركوف العنقودية ، فإن خوارزمية SA تعمل بشكل أفضل في الكشف عن الوحدات في شبكات التمثيل الغذائي واسعة النطاق والوحدات المكتشفة ذات مغزى بيولوجي أكثر [56] ، نظرًا لأن خوارزمية SA أقل حساسية للضوضاء مثل كخطأ تجريبي أو بيانات غير كاملة.

وفقًا للمعلمتين داخل الدرجة ومعامل التقسيم لكل عقدة في HLMN المعياري ، تم تقسيم العقد إلى سبع فئات: R1 ، R2 ، R3 ، R4 ، R5 ، R6 ، R7 (لمزيد من التفاصيل ، انظر الطرق).

نظرًا لأن خوارزمية SA عشوائية ، يمكن الحصول على نتائج مختلفة للوحدة في عمليات تشغيل مختلفة. لقد قمنا بتشغيل خوارزمية SA 100 مرة. بناءً على نتيجة كل تشغيل ، تم تصنيف عقد HLMN في الفئات السبع R1 ، R2 ، R3 ، R4 ، R5 ، R6 ، R7. من بين نتائج التصنيف المائة ، يتم حساب احتمال تصنيف كل عقدة في كل فئة. كما هو مبين في الشكل 3 ، يتم دائمًا تصنيف معظم العقد في نفس الفئة ، مما يشير إلى أن تصنيف الدور للعقد في HLMN استنادًا إلى خوارزمية SA موثوق به.

احتمال كل مستقلب لكل دور بين 100 قسم. اللون بشكل أساسي أحمر غامق (الاحتمال المقابل يساوي 1) أو أزرق داكن (الاحتمال المقابل يساوي 0). هذا يعني أن معظم المستقلبات في HLMN يتم تصنيفها دائمًا في نفس فئة الدور بين 100 قسم ، مما يشير إلى أن تصنيف دور المستقلبات يمكن الاعتماد عليه.

لقد وجد أن غير المحاور التي تربط وحدات مختلفة مسؤولة عن التدفقات بين الوحدات التي تؤثر على حالة الشبكات الأيضية [57] ، بينما العقد ذات التردد العالي F د لديها قدرة قوية على التأثير على حالات المستقلبات الأخرى ، مما يدفعنا إلى التفكير فيما إذا كانت العقد ذات تردد عالٍ F د تميل إلى أن تكون غير محاور تربط وحدات مختلفة. في HLMN ، أكثر من 92٪ من العقد هي من الأدوار R1 و R2 ، وكلاهما غير محوري والعقد R1 ليس لها اتصال مع وحدات أخرى بينما العقد R2 لها وصلات مع وحدات مختلفة. كما هو مبين في الشكل 4 (أ) ، مع حد التردد F د زيادة ، جزء من العقد R1 بين مجموعة العقد مع F دF د & lt 1 ينقص بينما يزداد جزء عقد R2. تتقلب كسور العقد ذات الأدوار المختلفة عندما F د ≥ 0.7 نظرًا لصغر حجم مجموعة العقد ذات F دF د العلامة & lt 1. متى F د & lt 0.7 ، يكون الفرق بين كسور عقد R1 وعقد R2 هو الأكبر في جميع أنحاء F د = 0.6. لذلك ، اخترنا العتبة F د = 0.6 للتمييز بين نواتج التشغيل عالية التردد من نواتج الأيض ذات التردد المنخفض. حقيقة أن أدوار مستقلبات المحرك عالية التردد تميل إلى أن تكون R2 ، تشير إلى أن نواتج الأيض عالية التردد تميل إلى أن تكون غير محاور تربط وحدات مختلفة. يمكن تعيين وحدات مختلفة لمسارات مختلفة [56] ، مما يعني أن نواتج الأيض عالية التردد تميل إلى المشاركة في مسارات التمثيل الغذائي المختلفة. على سبيل المثال ، يلعب مستقلب الأدينوزين أحادي الفوسفات الدوري عالي التردد أدوارًا تنظيمية في مسارات التمثيل الغذائي للجلوكوز والبروتين والدهون في نفس الوقت [58]. يقترح أن المستقلبات عالية التردد تلعب أدوارًا مهمة في شبكة التمثيل الغذائي للكبد البشري.

تعتمد كسور المستقلبات على أدوار مختلفة على عتبة تردد مختلفة. أ) و ب) على التوالي ، تظهر النتائج التي تعتمد على الوحدات التي تم اكتشافها بواسطة خوارزمية التلدين المحاكاة وخوارزمية الجشع السريع. كل نقطة متصلة بخطوط منقطة هي جزء من المستقلبات ذات دور محدد بين مجموعة نواتج التشغيل التي يتردد ترددها F دF د & lt 1 ، في حين أن كل خط صلب يعني جزء المستقلبات مع كل دور بين HLMN. في HLMN ، تكون معظم المستقلبات من الأدوار R1 و R2. مع حد التردد F د زيادة ، جزء من المستقلبات R1 بين مجموعة المستقلبات مع F دF د & lt 1 ينقص بينما يزداد جزء مستقلبات R2. تتقلب كسور المستقلبات ذات الأدوار المختلفة عندما F د ≥ 0.7 نظرًا لصغر حجم مجموعة المستقلبات مع F دF د العلامة & lt 1. متى F د & lt 0.7 ، يكون الفرق بين كسور مستقلبات R1 ومستقلبات R2 هو الأكبر في حوالي F د = 0.6. وهكذا نختار العتبة F د = 0.6 للتمييز بين مستقلبات المحرك عالية التردد من مستقلبات محرك التردد المنخفض ، وتميل نواتج الأيض عالية التردد إلى أن تكون ذات دور R2.

للتحقق من أن نتيجة مستقلبات محرك التردد العالي لا تعتمد على خوارزمية طريقة اكتشاف الوحدة النمطية ، استخدمنا طريقة أخرى للكشف عن الجشع السريع [59] لاكتشاف الوحدات في HLMN ، وتصنيف العقد إلى 7 فئات: R1 ، R2 ، R3 ، R4 ، R5 ، R6 ، R7. مع حد التردد F د زيادة كسور عقد R1 وعقد R2 بين مجموعة العقد ذات F دF د & lt 1 يُظهر نمطًا مشابهًا للنمط المستند إلى خوارزمية SA ، والذي يظهر في الشكل 4 (ب). لقد توصلنا إلى نفس النتيجة التي مفادها أن نواتج الأيض عالية التردد تميل إلى أن تكون غير محورية تربط وحدات مختلفة.

التحقق من تصنيف وخصائص نواتج الأيض

تستند نتائج الخصائص على مستقلبات المحرك ومستقلبات المحرك الحرجة ومستقلبات المحرك عالية التردد إلى 5000 MDMSs. للتحقق من أن هذه النتائج لا تعتمد على 5000 MDMS ، طبقنا طريقة أخذ عينات غير متحيزة اقترحها Jia et al. [28] لحساب التردد F د أن كل عقدة تعمل كعقدة سائق (انظر ملف إضافي 5).

بالمقارنة مع النتائج التي تستند إلى 5000 MDMS ، فإن مجموعة عقد المحرك الحرجة التي تحددها هذه الطريقة هي نفسها ، في حين أن مجموعة عُقد المحرك عالية التردد التي تحددها هذه الطريقة ليست متطابقة تمامًا ، والتي قد تكون ناجمة عن عشوائية أخذ العينات. ومع ذلك ، فإن النتيجة التالية تنطبق على كلتا الطريقتين: تميل عقد المحرك عالية التردد إلى أن تكون غير محاور تربط وحدات مختلفة. (انظر ملف إضافي 4). علاوة على ذلك ، تم تطبيق التحليل الطوبولوجي على المجموعة أ (مجموعة المستقلبات ذات F د & gt 0) ومجموعة B (مجموعة المستقلبات مع 1 F د & GT 0.6) بواسطة الطريقة في [28]. لا يزال الاستنتاج يشير إلى أن المستقلبات المحركة ، وخاصة المستقلبات الحرجة وعالية التردد ، تميل إلى امتلاك قدرة قوية على التأثير على حالات الأيضات الأخرى وقابلية ضعيفة للتأثر بحالات المستقلبات الأخرى (انظر ملف إضافي 4).

في الختام ، على الرغم من أن تصنيف وتحليل مستقلبات المحرك يعتمدان على 5000 MDMS ، فإن النتائج على خصائص مستقلبات المحرك المختلفة لا تعتمد على 5000 MDMS.

التصنيف البديل لعقد السائق ووضع التحكم في HLMN

أعطت ورقة منشورة مؤخرًا [29] تصنيفًا بديلاً للعقد بناءً على مشاركتها في التحكم. تعتبر العقدة بالغة الأهمية ، أو متكررة ، أو زائدة عن الحاجة إذا كانت تعمل كعقدة سائق في كل أو بعض أو لا شيء من مجموعات الحد الأدنى من عقد السائق. عن طريق قياس الكسر ن ص من العقد الزائدة عن الحاجة لشبكة ذات درجات متوسطة متفاوتة ، تم اكتشاف وضعين مختلفين للتحكم في [29]. بناءً على قيمة الفرق في الكسر ن ص و nr T لشبكة التحويل الخاصة بها (التي يكون مخطط الأسلاك الخاص بها مطابقًا للشبكة الأصلية ولكن اتجاه كل ارتباط معكوس) ، يمكن تحديد وضع التحكم في الشبكة: إذا كانت Δ nr = nr - nr T & gt 0 تكون الشبكة مركزي وإذان ص & lt 0 يتم توزيعها.

لقد طبقنا الأدوات الموجودة في [29] على HLMN ، ووجدنا أن وضع التحكم في HLMN موزع. بينما في [29] ، لا يمكن تحديد أوضاع التحكم للشبكات الأيضية الثلاثة المعنية ، وهو ما ينتج عن عدم اكتمال شبكات التمثيل الغذائي ، التي يقع متوسط ​​درجاتها في منطقة "التشعب المسبق" (حيث لا توجد أوضاع تحكم مميزة) . مع الكشف عن مزيد من المعلومات حول شبكات التمثيل الغذائي هذه ، يزيد متوسط ​​الدرجات ويؤدي إلى أوضاع تحكم يمكن تحديدها. على سبيل المثال ، تم تجميع شبكة التمثيل الغذائي للإشريكية القولونية [11] التي تمت دراستها في [29] في عام 2000 ، ومع ذلك لا يمكن تحديد وضع التحكم فيها ، عندما طبقنا الأدوات على شبكة التمثيل الغذائي للإشريكية القولونية iJO1366 [60] ، والتي كانت في عام 2011 ، يمكننا أن نجد أن وضع التحكم في الشبكة iJO1366 مركزي. ليس من السهل معرفة سبب توزيع وضع التحكم في شبكة التمثيل الغذائي للكبد البشري وجعل شبكة التمثيل الغذائي للإشريكية القولونية iJO1366 مركزية ، بسبب عدم اكتمال هاتين الشبكتين ، وقد يتغير وضع التحكم مع زيادة مقياس الشبكة.

دور التفاعلات في متانة قابلية التحكم في HLMN

يمكن أن تحدث حالات فشل التفاعل في أنظمة التمثيل الغذائي ، كما أن حالات فشل التفاعل المختلفة لها تأثيرات مختلفة على متانة وظيفة التمثيل الغذائي. تميز المتانة قدرة أنظمة التمثيل الغذائي على التصرف بشكل طبيعي في ظل فشل التفاعل. قد تؤدي بعض حالات فشل التفاعل إلى كسر التوازن الخلوي ، مما يؤدي إلى تأثير مضاد للتكاثر [61] أو موت الخلايا المبرمج [62] ، في حين أن البعض تقريبًا ليس له تأثير على الوظائف الخلوية [63]. فيما يلي ، نركز على تأثيرات حالات فشل التفاعل المختلفة على المتانة (ما إذا كانت الشبكة يمكن التحكم فيها باستخدام نفس MDMS في ظل حالات فشل التفاعل) لإمكانية التحكم في شبكة HLMN.

استنادًا إلى التأثيرات المختلفة على متانة إمكانية التحكم الناتجة عن غياب الروابط ، تم تصنيف الروابط إلى ثلاث فئات [16]: "حرجة" إذا تسبب غيابها في زيادة الحد الأدنى من عقد السائق وذلك للحفاظ على التحكم الكامل "زائدة عن الحاجة" إذا يمكن إزالته دون التأثير على المجموعة الحالية من عقد السائق "العادية" إذا لم تكن حرجة أو زائدة عن الحاجة. من أجزاء الروابط المهمة والعادية والمكررة في HLMN ، والتي تظهر في الشكل 5 ، يمكننا أن نجد أن القليل من الروابط مهمة وأن معظم الروابط عادية ، والتي قد يؤدي غيابها إلى تغيير المجموعة الحالية لعقد برنامج التشغيل ، ولكن لا يزال بإمكان الشبكة يتم التحكم فيها بنفس عدد عقد السائق. في عملية التمثيل الغذائي للكبد البشري ، لا يوجد سوى عدد قليل من التفاعلات التي يتم تمثيلها من خلال الروابط الحاسمة ، والتي تقدم تفسيراً لماذا يمكن لعملية التمثيل الغذائي للكبد البشري أن تعمل بشكل جيد في ظل العديد من الظروف المختلفة.

كسور الروابط من أنواع مختلفة. يتم عرض كسور الروابط الحرجة والعادية والزائدة عن الحاجة بين الرابط الكامل الذي تم تعيينه في HLMN في أ). قليل من الروابط مهمة ومعظم الروابط عادية ، مما يعني أنه لا يوجد سوى عدد قليل من ردود الفعل التي يمكن أن يتسبب فشلها في زيادة الحد الأدنى لعدد عقد السائق. يتم عرض كسور ارتباطات التفاعل الأساسية العالية (CH) ، والمعتدلة الأساسية (CM) وغير الأساسية (NC) بين مجموعة الروابط الحرجة ، العادية ، الزائدة عن الحاجة أو مجموعة جميع الروابط (المجموعة) في ب). جزء الروابط الأساسية عالية التفاعل هو الأصغر ، وجزء روابط التفاعل غير الأساسية هو الأكبر في مجموعة الروابط الحرجة ، مما يعني أن التفاعلات التي تمثلها الروابط الحرجة تميل إلى أن تكون التفاعلات غير الأساسية في الإنسان. شبكة التمثيل الغذائي للكبد.

في نموذج التمثيل الغذائي للكبد البشري [8] ، تم تصنيف التفاعلات إلى ثلاث فئات: التفاعلات الأساسية العالية لهذه التفاعلات المضمنة في المسارات الخاصة بنسيج الإنسان ، والتي تعتبر ضرورية في عملية التمثيل الغذائي للكبد البشري. بواسطة بيانات الجزيء تفاعلات غير أساسية للآخر ، ومعظمها غير مرتبط بالجينات في النموذج و 50٪ تفاعلات نقل. قمنا بحساب كسور الروابط التي تمثل ردود الفعل الأساسية العالية والمعتدلة وغير الأساسية بين مجموعة الروابط الحرجة والعادية والمكررة ومجموعة جميع الروابط في HLMN ، والتي تظهر في الشكل 5. بالمقارنة مع الكسور الموجودة بين مجموعات الروابط العادية والمكررة والرابط الكامل الذي تم تعيينه في HLMN ، فإن جزء الروابط الذي يمثل التفاعلات الأساسية العالية هو الأدنى ويكون جزء ارتباطات التفاعل غير الأساسية هو الأعلى في مجموعة الروابط الحرجة الروابط ، مما يشير إلى أن التفاعلات التي تمثلها الروابط المهمة تميل إلى أن تكون ردود الفعل غير الأساسية.

تنقل تفاعلات النقل المستقلبات عبر الأجزاء ، والعديد منها ينقل المستقلبات من البيئة إلى الخلية. يبلغ جزء روابط تفاعل النقل بين مجموعة الوصلات الحرجة 47.5٪ ، بينما تبلغ النسبة بين مجموعة الوصلات الكاملة في HLMN 20.8٪. Moreover, we computed the fraction of links representing transport reactions which transfer metabolites from the environment into the cell among the set of critical links and that among the whole link set in the HLMN, which are 33.6% and 12.2%, respectively. These comparisons indicate that transport reactions and the environment are important in influencing the robustness of controllability of the HLMN. The metabolites carried in by transport reactions could activate a series metabolic reactions in human liver cells, which could change the state of the liver metabolism and influence the controllability of the HLMN.

Validation for the result that the reactions represented by critical links tend to be the non-core reactions

We used chi-square test (see Methods) to test whether or not the differences between the fractions of the core high, core moderate and non-core reaction links among the whole network and those among the set of critical links are out of chance. The observed data are the number of core high, core moderate and non-core reaction links among each of the sets of the critical links, which are 132, 59 and 226 respectively. The expected percentages are the fractions of core-high, core moderate and non-core reaction links among the whole network, which are 60.14% and 14.55% and 25.3% respectively. The chi-square statistic value was computed based on the chi-square formula (see Methods), which is 193.9. With the freedom degree being 2 and the significance level being 0.05, the table value for chi-square statistic is 5.99. The chi-square statistic value is bigger than the table value, so there is a significant difference between the fractions among the set of critical links and those among the whole network, which means that the reactions represented by critical links tend to be the non-core reactions.


الملخص

One element of classical systems analysis treats a system as a black or grey box, the inner structure and behaviour of which can be analysed and modelled by varying an internal or external condition, probing it from outside and studying the effect of the variation on the external observables. The result is an understanding of the inner make-up and workings of the system. The equivalent of this in biology is to observe what a cell or system excretes under controlled conditions — the 'metabolic footprint' or exometabolome — as this is readily and accurately measurable. Here, we review the principles, experimental approaches and scientific outcomes that have been obtained with this useful and convenient strategy.


Models of obesity with hyperlipidemia

Obese mouse models such as A y /a, Lep ob/ob and LepR db/db have increased total plasma cholesterol levels however, this is the result of increased HDL rather than increased VLDL and LDL levels (Nishina et al., 1994a Silver et al., 1999 Silver et al., 2000 Gruen et al., 2005 Gruen et al., 2006 Coenen and Hasty, 2007). The increase in HDL probably accounts for the resistance of these obese mice to atherosclerotic lesion formation (Nishina et al., 1994b). By contrast, human MetS is associated with obesity, increased levels of TG-rich VLDL and reduced levels of HDL. To generate obese mouse models with hyperlipidemia, our laboratory and others have crossed the Lep ob/ob , LepR db/db and A y /a mice onto LDLR −/− and apoE −/− backgrounds. The models described below are all on the C57BL/6J strain.

Lep ob/ob LDLR −/− and LepR db/db LDLR −/− mice

To develop a model that better reflects MetS-related hyperlipidemia, we crossed Lep ob/ob mice onto an LDLR −/− background (Lep ob/ob LDLR −/− ) (Hasty et al., 2001). These mice are obese and develop dramatic hypercholesterolemia characterized by elevated VLDL and LDL (Fig. 1D please note that the figure represents a LepR db/db LDLR −/− mouse, however, the Lep ob/ob LDLR −/− mice have a similar profile), as well as hypertriglyceridemia. Furthermore, these mice spontaneously develop atherosclerotic lesions, and are thus very useful for studying the role of obesity in cardiovascular disease. Our group and others have used this model to study therapeutic treatments for MetS, as well as to study mechanisms of obesity-related hyperlipidemia (Mertens et al., 2003 Verreth et al., 2004 Hasty et al., 2006 Verreth et al., 2006 Coenen et al., 2007a). LepR db/db LDLR −/− mice have a phenotype identical to that of the Lep ob/ob LDLR −/− mice with the exception that they have very high circulating leptin levels (Gruen et al., 2006). We have also crossed the Lep ob/ob and LepR db/db mice onto an apoE −/− background, and these mice are also obese, insulin resistant and hyperlipidemic (Gruen et al., 2006 Atkinson et al., 2008). The Lep ob/ob apoE −/− and LepR db/db apoE −/− mice have extreme elevations in VLDL and almost no HDL (Fig. 1D). Although these mice provide a better model for MetS than do Lep ob/ob and LepR db/db mice, because of their hyperlipidemia and susceptibility to atherosclerosis, the hyperlipidemia is quite extreme and the caveat remains that they are completely deficient in leptin signaling.

LDLR 3KO and apoE 3KO mice

Recently, Lloyd et al. crossed Lep ob/ob LDLR −/− and Lep ob/ob apoE −/− mice onto an apoB100 only background (named LDLR 3KO and apoE 3KO, respectively) (Lloyd et al., 2008). These mice are obese (>40 grams), hyperinsulinemic (>30 ng/ml), hyperlipidemic (total cholesterol >750 mg/dl and TGs >250 mg/dl) and hypertensive (systolic pressure >150 mmHg), as measured by the tail cuff method. Interestingly, the apoE 3KO mice are diabetic by 9–10 weeks of age, whereas the LDLR 3KO mice are not. This may be because of their apoE versus LDLR genotype, or the fact that the apoE 3KO mice were only 74.6% C57BL/6J, whereas the LDLR 3KO mice were 94.7% C57BL/6J in the original report. One unique aspect to these mice is that they only express apoB100 (and not apoB48) from their livers. In humans, apoB48 is expressed solely from the intestines and apoB100 is expressed solely from the liver, whereas, in rodents, both forms of apoB are expressed in the liver. Thus, expression of only apoB100 from the livers of these mice provides a lipoprotein metabolism setting which is similar to that seen in humans.

A y /aLDLR −/− and A y /aapoE −/− mice

To develop a model of MetS with delayed onset obesity and hyperlipidemia, we crossed the A y /a mice onto an LDLR −/− background (Coenen et al., 2007b Coenen and Hasty, 2007). In contrast to LDLR −/− mice, the A y /aLDLR −/− mice are obese, have an increased fat mass, and have slightly elevated plasma cholesterol and TG levels. Furthermore, when these mice are placed on a Western diet they become even more obese and hyperlipidemic, and also develop IR. The hyperlipidemia appears to be the result of both increased hepatic TG production and decreased VLDL clearance. The A y /aLDLR −/− mice do not develop overt hypertension however, on the Western-type diet they develop a fatty liver. Thus, these mice seem to have many different aspects of MetS and, to date, appear to be one of the best models for use.

The A y /a and apoE −/− mice have also been crossed to generate A y /aapoE −/− mice (Gao et al., 2007). Interestingly, the deficiency of apoE protects A y /a mice from obesity and hepatic steatosis, and improved their insulin sensitivity. Thus, the phenotype of A y /a mice differs in the presence of LDLR versus apoE deficiency.

Summary of obese hyperlipidemic mouse models of the MetS

By crossing models of hyperlipidemia onto obesity-prone backgrounds, it is possible to study several aspects of MetS simultaneously. The mouse models listed above are the most commonly used in this regard, and their use has shed light on the mechanisms by which obesity influences lipoprotein metabolism. In addition, these models have been useful in testing various agents for their therapeutic potential. One disappointment in the studies of these models is that the presence of IR does not appear to impact atherosclerotic lesion formation in most models unless there are concomitant changes in plasma lipid levels (Merat et al., 1999 Wu et al., 2006 Coenen and Hasty, 2007 and reviewed in Goldberg and Dansky, 2006).


المواد والأساليب

زراعة الخلايا

Primed hiPSC IMR90-4 (RRID: CVCL_C437) were purchased from WiCell and WTC-11 (RRID: CVCL_Y803) were obtained from The J. David Gladstone Institutes, designated throughout the text by hiPSC 1 and hiPSC 2 respectively. Primed hiPSC were maintained under feeder-free conditions with Matrigel (Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix and Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, BD Biosciences) and fed daily with mTeSR1 medium (STEMCELL Technologies). Versene (Gibco Life Technologies) and Accutase (STEMCELL Technologies) were used to enzymatically dissociate hiPSCs into single cells for hiPSC 1 and hiPSC 2, respectively. At cell passage, mTeSR1 was also supplemented with 5 μM of ROCK inhibitor Y-27632 (Calbiochem). Complete medium exchange was performed every day. Cells were maintained under humidified atmosphere with 5% CO2, at 37°C.

hNSC 1 was derived from hiPSC 1 IMR90-4 using a dual SMAD inhibition protocol [40]. Briefly, hiPSC differentiation was induced by supplementing the culture media with 10 μM SB431542 and 1 μM LDN193189 (both from STEMCELL Technologies) for 10 days. hNSC 2 was originally derived from hiPSC line RIi001-A (RRID: CVCL_C888), as previously described [41] and designated throughout the text as hNSC 2. hNSC were expanded in DMEM/F12 (Invitrogen) with Glutamax, N2 and B27 supplements (Invitrogen), 20 μg/mL insulin and 20 ng/mL of bFGF (Peprotech) and of EGF (Sigma). Half of culture media volume was exchanged every other day [41]. hNSC were maintained under humidified atmosphere with 5% CO2 and 3% O2, at 37°C.

Stirred-tank bioreactor cultures

hiPSC and hNSC were inoculated in 200 mL of media as single cell suspensions of 0.25x10 6 cell/mL and 0.4x10 6 cells/mL, respectively, into software-controlled stirred-tank DASGIP Bioblock bioreactor system (Eppendorf). hiPSC 1, hiPSC 2, hNSC 1 and hNSC 2 were used for these experiments at cell passage number P40, P36, P12 and P34, respectively (four bioreactor runs in total). Bioreactor temperature was set to 37°C, dissolved oxygen to 15%, pH to 7.4, aeration rate to 0.1 vvm and the agitation rate to a range from 70 to 100 rpm [12,42]. Perfusion was initiated after inoculation and interrupted just before the perturbation experiment. Perfusion rates of hiPSC and hNSC were 1.3 day -1 and 0.33 day -1 , respectively. Cells were allowed to aggregate for 2 to 3 days before performing the perturbation experiment.

Perturbation experiments and sampling for metabolomics

Before initiating the perturbation experiment, perfusion was interrupted. Glutamine concentration in the culture medium was determined using an YSI 7100 MBS analyser (YSI Life Sciences, Yellow Springs, Ohio USA) offline. The glutamine pulse was induced by adding the required volume of glutamine concentrated solution (L-Glutamine, 200 mM, Gibco) to attain a concentration of 15 mM in the culture media. Changes in osmolarity of the culture medium of bioreactor cultures were later determined using a K-7400S Semi-Micro Osmometer (KNAUER Wissenschaftliche Geräte GmbH, Germany). Sampling was performed before the glutamine step and at several time-points after the step: immediately (0 min), 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 1 h and 2 h after. A sample of 15 mL of culture was collected per time-point sample and distributed equitably in three 50 mL tubes, containing ice-cold PBS to quench cell metabolism, generating three technical replicates that were processed independently. After centrifugation at 300xg for 3 min at 4°C, a sample of supernatant was stored for later quantification of extracellular glutamine, glucose, lactate and ammonia. The remaining supernatant was discarded and the cell pellet was washed with ice-cold PBS and centrifuged again. The supernatant was removed and a solution of 40:40:20 acetonitrile:methanol:water was added to extract intracellular metabolites from the cell pellet. Sonication was performed to guarantee a complete cell lysis. The extracts were transferred to microcentrifuge tubes and centrifuged at 20000 x g at 0°C for 15 minutes. Supernatant was collected, snap-frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C until metabolomic analysis. The pellet was also snap-frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C until protein quantification. Protein was dissolved in lysis buffer containing 2% SDS (v/v) and quantified using a Microplate BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific). Ammonia was quantified using the Ammonia Assay Kit (Megazyme).

صلاحية الخلية

Cell viability in spheroids was analysed before the glutamine perturbation experiment by staining the spheroids with fluorescein diacetate (FDA) in PBS (0.02 mg/mL) and propidium iodide (PI) in PBS (0.002 mg/mL), followed by visualization by fluorescence microscopy using an inverted phase contrast microscope (Leica Microsystems GmbH).

التدفق الخلوي

Single-cell suspensions of hiPSC were prepared by Versene/Accutase treatment of cell spheroids. Cell density was determined and 0.5x10 6 cells were transferred to a microcentrifuge tube, centrifuged at 300xg for 5 min and washed with 2% FBS in PBS. The cells were resuspended in 50 μl of a solution containing the primary antibody: TRA-1-60 (Santa Cruz Biotechnology, sc-21705, dilution 6:100) or SSEA4 (Santa Cruz Biotechnology, sc-21704, dilution 1:10). Cells were incubated with the primary antibody solution for 1 hour at 4°C, washed with 2% FBS in PBS and centrifuged twice, followed by 30 minutes at 4°C incubation with AlexaFluor 488 secondary antibodies (Invitrogen, A21042 for TRA-1-60 and A11001 for SSEA4, dilution 1:1000). Cells were washed and centrifuged twice with 2% FBS in PBS, and finally resuspended in 500 uL of 2% FBS in PBS for flow cytometry analysis. Data was collected on a CyFlow Space flow cytometer from Partec. Cells were gated on forward and side scatter dot plots. 10,000 events per sample were acquired and the data were analyzed with FloMax software (version 3.0).

Immunofluorescence microscopy

hNSC spheroids were plated on sterile glass coverslips inserted on 24-well plates and left for adherence at 37°C and 5% CO2. Each coverslip containing spheroids were washed once with cold PBS +/+ and then fixed in 500 μL of 4% paraformaldehyde + 4% sucrose in phosphate-buffered saline (PBS) for 20 min at room temperature. Before storage, fixed cells were washed twice with 500 μL PBS. Cells were blocked and permeabilized with 0.2% FSG (Gelatin from cold water fish skin, Sigma, G7765) + 0.1% TritonX-100 in PBS for 20 minutes at room temperature. Primary antibodies were diluted in 0.125% FSG in PBS + 0.1% TritonX-100 and added to fixed spheroids for an incubation of 2 hours at room temperature. Afterwards, cells were washed twice with PBS and incubated with secondary antibodies diluted in 0.125% FSG in PBS for 1 hour and protected from light. Primary and secondary antibodies were used as follows: anti-nestin (Merck Millipore, AB5922), anti-Sox2 (Merck Millipore, AB5603), anti-βIII-tubulin (Merck Millipore, 1:200, MAB1637), AlexaFluor 488 goat anti-rabbit IgG (Invitrogen, A11008), AlexaFluor 594 goat anti-mouse IgG (Invitrogen, A11005). Coverslips were mounted in ProLong Gold antifade reagent with DAPI (Invitrogen, P36935) for staining of cell nuclei. Preparations were visualized on an inverted microscope Leica DMI6000 B (Leica Microsystems). The obtained images were processed using FIJI software [43] and relying solely on linear adjustments.

Metabolomic analysis of intracellular extracts

Targeted and quantitative metabolomic analysis was performed using the AbsoluteIDQ p180 kit and the Energy Metabolism Assay (Biocrates Life Sciences AG, Innsbruck, Austria). The two assays quantify a total of 201 metabolites from different biological classes, including amino acids, biogenic amines, acylcarnitines, lysophosphatidylcholines, phosphatidylcholines, sphingomyelins and several metabolites of the energy metabolism. For the first assay, analyses were carried out after phenylisothiocyanate (PITC)-derivatization in the presence of internal standards by flow-injection tandem mass spectrometry (FIA-MS/MS, for quantification of acylcarnitines, (lyso-) phosphatidylcholines, sphingomyelins, hexoses) and liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS, for amino acids, biogenic amines) using a SCIEX 4000 QTRAP (SCIEX, Darmstadt, Germany) and a Xevo TQ-S Micro (Waters, Vienna, Austria) instrument with an electrospray ionization (ESI) source. The experimental metabolomics measurement technique is described in detail by patent US 2007/0004044 (accessible online at http://www.freepatentsonline.com/20070004044.html). For the second assay, after derivatization to their corresponding methoxime-trimethylsilyl (MeOx-TMS) derivatives, energy metabolites were determined by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) using an Agilent 7890 GC/5975 MSD (Agilent, Santa Clara, USA) system. Pretreated samples were evaporated to complete dryness and subjected to a two-step methoximation-silylation derivatization. N-methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide (MSTFA) was used as silylation reagent. Split injection was performed and chromatograms were recorded in selected ion monitoring (SIM) mode. External standard calibration curves and ten internal standards were used to calculate concentrations of individual energy metabolites. Data were quantified using the appropriate MS software (Agilent, Masshunter) and imported into Biocrates MetIDQ software for further analysis.

Data pre-processing and statistical analyses

Absolute metabolic values were normalized by the protein content of the cell pellet for each replicated sample (S2 Table). Metabolites with more than 62.5% of missing values or with coefficients of variation greater than 15% were excluded.

For unsupervised analyses, normalized and averaged metabolic values per time-point were z-scored by subtracting to each value the mean for each metabolite-cell and then dividing by the respective standard-deviation. Principal component analysis and hierarchical clustering was performed in Matlab R2015b (MathWorks, Natick MA) and in Perseus software [44], respectively.

Steady-state fold changes were statistically tested by performing a two-sample t-test, two-sided, assuming the two samples comes from independent random samples from normal distributions with equal means and equal but unknown variances. The Benjamini-Hochberg method was used to correct for multiple testing errors using a false discovery rate of 5% [45]. These fold-changes were log2-transformed for depiction in volcano plots and in the Pearson Correlation matrices. These statistical tests and correlations were performed in Matlab R2015b (MathWorks, Natick MA).

Dynamic modelling and characterization of parameters

A classical model from process dynamics and control based on two liquid surge tanks placed in series [23] was used for modelling the dynamical metabolic profiles. The specific model, named second order with numerator dynamics, has different equations for two scenarios: one for an underdamped process and another for an overdamped process, displayed below with a complex variable س.

Metabolic profiles were fit to these two equations by minimization of the sum of squared residuals. The scenario that presented the lowest residual was chosen. المعلمة م was calculated based on the concentration of extracellular concentration of glutamine (S1 Table). Fitting of the four other parameters, the steady-state gain K, the numerator coefficient τأ, the response time τ and the damping coefficient ζ, was performed in MATLAB using lsqnonlin and nlinfit functions. The former function was used to get a first estimation of model parameters which would serve as initial parameters to the latter, as the latter function accepts standard-deviations as weights for fitting. Fits with residual norm above 4% were not considered. The fitting of intracellular glutamine for the four cell lines, instantly subjected to the sudden extracellular glutamine step, using the same model parameters except one, display considerable resemblance and very low average fitting error (S6 Fig). So, to tackle randomness variable affecting the quantification of moles of metabolites per protein quantity between time-points, experimental values of hNSC (especially affected by the mentioned random variable) were normalized to the shared glutamine profile by multiplying the ratio of simulated value per experimental value of glutamine at that time-point and for that cell line (for all i, g and y, Met normalized i,cell line g, time-point y = Met i,cell line g, time-point y x (Gln simulated cell line g, time-point y / Gln experimental cell line g, time-point y).

The settling time of each fitting curve was determined by finding the time-point after which the metabolic pool value would remain inside a band whose width is equal to ±5% of the final metabolic pool concentration.

The damping coefficient in the overdamped case was calculated directly from the model parameters obtained for each metabolite:


Dynamic stability against short-term variation

Short-term fluctuations in input are inevitable in metabolic systems because inputs of metabolites can change dramatically after each meal. The role of the homeostatic mechanisms in damping the effect of fluctuating inputs can be illustrated by varying the amino acid input terms in the model to reflect the changes in their blood values during and after meals over a 24-hour period [29]. In Fig. 3 we see the effect of three meals on a few concentrations and reaction velocities in an enlarged model of the folate-mediated one carbon metabolism (FOCM) system that also includes the mitochondria and the synthesis of glutathione (GSH) [4]. The fluxes in different parts of the system vary enormously with meals, except for three critical reactions (e.g., thymidylate synthase, the rate-limiting step for DNA synthesis, and DNA methyl transferase), and the concentration of GSH (Fig. 3c), which vary little if at all. This system has the property that many reactions and substrate levels change dramatically in order to maintain stability of a few critical ones. This is typical of physiological homeostasis. By removing the feedbacks one-by-one, or in different combinations, one can study the degree to which each contributes to the stabilization of each of the four critical reactions. For instance, we showed that the inhibition of MTHFR by SAM has the biggest effect on stabilizing the DNMT reaction, whereas the stimulation of cystathionine β-synthase (CBS) by SAM has a smaller effect [2]. The well-known mechanism of product inhibition also has important stabilization effects. S-adenosylhomocysteine (SAH) inhibits all the methyl transferases. Figure 3d shows how this product inhibition helps stabilize the DNMT reaction.

Effect of short-term variation in amino acid input on metabolite levels and reaction velocities in the folate and methionine cycles. Three pulses of amino acids are shown by gray bars below the figures, corresponding to three meals over a 24-hour period. Variation in response is shown as percentage deviation from the mean. أ Two metabolites (SAM and 5mTHF) and reaction velocities [cystathionine β-synthase (سي بي اس) and MTHFR] that show complementary responses. ب Reaction velocities of mitochondrial and cytosolic serinehydroxymethyltransferase (SHMT values below −100 % are reversals of direction of the reaction). ج Dynamic variation of fluxes throughout the pathway stabilize the velocities of DNMT, TS, and AICART and the concentration of glutathione. د Eliminating product inhibition by S-adenosylhomocysteine (SAH) increases the sensitivity of the DNMT reaction to variation in input is indicated by the greater amplitude of the response. After [28, 35]


خلفية

Recombinant protein production is a multibillion-dollar business, mainly comprised by therapeutic agents (i.e. recombinant biologic drugs) and industrial enzymes [1–3]. These compounds are commonly synthesized in الإشريكية القولونية, خميرة الخميرة and Chinese Hamster Ovary cells (CHO) [1, 4–6] however, there is strong pressure to find cost-effective alternatives to overcome technical and economic disadvantages of the aforementioned cell factories, especially in downstream processing [7].

Among the unconventional cell factories used for recombinant protein production, the methylotrophic yeast Pichia pastoris (syn. Komagataella phaffii) has received special attention thanks to its convenient physiology and easy handling [8]. There are strong promoters for this cell factory which are commercially available and that allow for the controlled expression of heterologous proteins [8]. على عكس بكتريا قولونية, P. pastoris naturally performs post-translational modifications [6, 9], which are essential for most eukaryotic protein functionality [7, 10, 11]. أضع ثقتي في S. cerevisiae, P. pastoris exhibits a Crabtree-negative phenotype, showing a reduced synthesis of undesirable products, like ethanol, in glucose-limited conditions [12, 13]. It also shows a lower basal secretion of proteins when compared to other yeasts, which makes downstream processing easier [13, 14]. أخيرا، P. pastoris can be efficiently cultivated up to high cell densities using fed-batch technology [8], achieving high titers and productivities. For these desirable features, P. pastoris has been widely used for the expression of recombinant proteins, reaching grams per liter concentrations in several cases [9, 15–18]. Most remarkably, and as proof of its technical feasibility and adequacy, two recombinant proteins produced in this cell factory have already been approved by the FDA for medical purposes [10, 19].

Despite its growing acceptance and actual successful applications, recombinant protein production in P. pastoris can be undermined by several cellular processes, where protein folding and secretion are the most recurrent bottlenecks [14, 20, 21]. In addition, limitations may also be caused by the codon usage of the recombinant protein [22], promoter selection [23], carbon and oxygen availability in the culture [24, 25] and fed-batch operational parameters [26], seriously hampering protein yield, productivity and the economic feasibility of the process.

Industrially, P. pastoris is commonly grown in fed-batch cultures in order to maximize the titer and volumetric productivity of a desired compound, often a recombinant protein [27, 28]. This is achieved by adding a culture medium in such a way that the microorganism grows at a desired specific growth rate, which is chosen to maximize the synthesis of the target product and to limit the formation of inhibitory compounds [29]. During this and other cultivation systems, the cells adapt constantly to the changing extracellular environment and to the limited mass transfer conditions observed at high densities [30, 31]. Therefore, it is critical to understand how the cell metabolism interacts with the nutritional and environmental stresses exerted by process conditions to improve bioreactor performance [32]. This is a complex task, however, since the strain’s characteristics and process variables often require significant amounts of time and money for characterization and fine-tuning [12]. Therefore, it is desirable to have a platform to integrate different levels of information from dynamic cultivations of P. pastoris that can be used to elaborate rational hypotheses to increase process productivity.

Systems biology offers a quantitative and comprehensive approach to address this task [33]. In particular, Genome-Scale dynamic Flux Balance Analysis (GS-dFBA) [34–36] is a modeling framework that allows the simulation of metabolism during non-stationary (batch or fed-batch) cultures. GS-dFBA models couple the dynamic mass balances of the extracellular environment of the bioreactor with comprehensive mathematical representations of cellular metabolism called Genome Scale Metabolic Models (GSMs). These structures represent the cell’s entire metabolism as a set of underdetermined constrained mass-balances [30, 37, 38]. GSMs have been employed to understand cellular behavior under different environmental conditions, to map over omics data, and to define a metabolic engineering targets [39, 40]. There are currently five published GSMs of P. pastoris [41–45] which have been developed to help the strain optimization process with a special emphasis on recombinant protein production. Moreover, one of these models has been successfully employed to improve recombinant protein production in P. pastoris [46], validating these frameworks as strain engineering tools for this particular yeast.

GS-dFBA models usually contain several parameters, whose values can be obtained by regression of experimental data. These parameters are used as inputs to obtain flux distributions throughout cultivations, so their values need to be reliable. To ensure this, pre- and post-regression diagnostics have been employed to determine if a certain parameter is supported by the observed data or not [47, 48]. These analyses consist in verifying the model’s capacity to explain the behavior of a system (goodness-of-fit) and the presence of the following parametric limitations: (i) low or no impact on the state variables (sensitivity), (ii) strong correlations with other parameters of the model (identifiability) and (iii) lack of statistical significance (significance). A model is considered robust if it has the capacity to explain different conditions, while containing only sensitive, identifiable and significant parameters.

Here, we present a robust dynamic genome-scale metabolic model of P. pastoris in glucose-limited, aerobic batch and fed-batch cultivations. To assemble the dynamic modeling framework, we started by selecting one of the available genome-scale metabolic models [43] and manually curated it to yield realistic flux distributions. Then, we included it in a set of mass balances representing the main compounds present in culture supernatant. Once assembled, the model was calibrated using experimental data from eight batch and three fed-batch cultivations. Next, we employed pre/post regression diagnostics to determine sensitivity, significance and identifiability problems in the model. In order to avoid the aforementioned statistical limitations, problematic parameters were fixed (i.e. removed from the adjustable parameter set) based on the pre/post regression diagnostics, yielding reduced and potentially robust model structures. Potentially robust model structures consisted in the original model formulation with less adjustable parameters. After evaluating these reduced models for each type of cultivation, we chose the one that presented fewer parametric limitations after being re-calibrated with the available data. These reduced models yielded no (or just a few) significance, sensitivity or identifiability problems when calibrating new data and they could predict bioreactor dynamics in conditions like the ones used for their determination. Finally, we carried out simulations to assess the potential of the model to study P. pastoris metabolism under industrially relevant conditions, and to select molecular and process engineering strategies to improve recombinant protein production.


شكر وتقدير

Martin Foltz (Unilever) is thanked for providing useful comments on the manuscript. We acknowledge the financial support of the European Community under the Framework 6 Marie-Curie Host Fellowships for the Transfer of Knowledge Industry-Academia Strategic Partnership scheme, specifically GUTSYSTEM Project MTKI-CT-2006-042786. Sam Possemiers and Tom Van de Wiele are postdoctoral research fellows of the Flemish Science Foundation (FWO-Vlaanderen). Part of this project was carried out within the research program of the Netherlands Metabolomics Centre, which is part of the Netherlands Genomics Initiative/Netherlands Organization for Scientific Research.


شاهد الفيديو: طريقة البحث عن بحوث و تقارير جاهزة من الإنترنت (قد 2022).


تعليقات:

  1. Regan

    أعتقد أنك مخطئ. أرسل لي بريدًا إلكترونيًا إلى PM ، سنتحدث.

  2. Nizam

    أنصحك بالاطلاع على الموقع الذي يحتوي على عدد كبير من المقالات حول الموضوع الذي يثير اهتمامك.

  3. Mazubar

    الفكر البائس

  4. Preruet

    أعني ، أنت تسمح للخطأ. أدخل سنناقش. اكتب لي في PM.

  5. Malashakar

    أعتذر ، لكن ، في رأيي ، هذا الموضوع ليس حقيقيًا.

  6. Kaeleb

    هذه العبارة ببساطة لا تضاهى :) ، أنا أحبها))) كثيرا



اكتب رسالة