معلومة

لماذا لا تهضم نوكليازات التقييد البلازميدات المحولة؟

لماذا لا تهضم نوكليازات التقييد البلازميدات المحولة؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

في الكتاب المدرسي الذي أستخدمه ، يوضح أن البكتيريا لا تهضم الحمض النووي الصبغي الخاص بها لأن المواقع التي سيتم قطعها بواسطة نوكليازها الداخلي يتم ميثيلها. هل توجد آلية مماثلة لحماية البلازميدات الخاصة بها؟ إذا كان الأمر كذلك ، فكيف يتم قطع البلازميدات أثناء عملها كناقلات؟


تمت هندسة السلالات المختبرية المستخدمة لأغراض الاستنساخ جينيًا لمعالجة هذه المشكلة ، عادةً عن طريق حذف جينات أنظمة تعديل التقييد المختلفة. هناك أربع فئات واسعة من أنظمة تعديل التقييد ، والتي سأناقشها بشكل فردي. ما لم تتم الإشارة إليها بشكل فردي ، فإن معظم المعلومات الواردة أدناه تستند إلى الملاحظات الفنية التالية للمورد:

بروميغا: ما هي تأثيرات أنظمة تعديل الحمض النووي البكتيرية على الاستنساخ؟

نيو إنجلاند بيولابس: تقييد الحمض النووي الأجنبي بواسطة الإشريكية القولونية K-12


النوع I

في الإشريكية القولونية، يتكون هذا النظام من جينات hsdR و hsdM و hsdS وهو قادر على تقييد (هضم) الحمض النووي غير الميثيل وميثيل الحمض النووي الميثيل. الضربة القاضية لـ hsdR و / أو hsdM يمنع التقييد والمثيلة ، على التوالي. هذا يسمح لهندسة السلالات لأغراض محددة. على سبيل المثال ، شائع بكتريا قولونية السلالة المستخدمة في الاستنساخ ، DH5α ، لها النمط الجيني hsdR17 (rK- ، mK +) الذي يلغي نشاط التقييد ولكنه يحافظ على نشاط المثيلة. هذا يعني أن الحمض النووي الخارجي لن يتم تقييده ، ولكن سيتم ميثيلته وبالتالي يمكن تحويله لاحقًا إلى سلالات r + دون القلق من التحلل ، إذا دعت الحاجة.


النوع الثاني

هذا هو فئة إنزيم التقييد المستخدم بشكل شائع في المختبر لقطع الحمض النووي لأنه يتعرف عمومًا على التسلسلات القصيرة المتناظرة ويتم قطعه داخل موقع التعرف أو بالقرب منه. ال بكتريا قولونية لا تحتوي سلالات الخلفية K و B ، التي تُشتق منها معظم سلالات المختبر ، على إنزيمات من النوع الثاني. تم عزل إنزيم النوع II EcoRI ، على سبيل المثال ، من بكتريا قولونية سلالة RY13 (Yoshimori ، 1971 ؛ أطروحة دكتوراه).


النوع الثالث

على غرار النوع الثاني ، لا تمتلك السلالات K و B نظام تعديل التقييد هذا ، والذي تم تمييزه لأول مرة في بكتريا قولونية 15 ت-.


النوع الرابع

يختلف هذا النظام عن الأنظمة الأخرى من حيث أنه يشق الحمض النووي الميثيل ونصف الميثيل ، على الرغم من أنه لا يتعرف على المثيلة بواسطة أنظمة التعديل من النوع الأول أو النوع الثاني ، ولا مثيلة السد أو Dcm. في بكتريا قولونية، يتكون هذا النظام من جينات mcrA و mcrBC و mrr ويكون أكثر إشكالية عند محاولة تحويل الحمض النووي من الكائنات الحية مع مثيلة السيتوزين أو الأدينين في كل مكان (مثل النباتات والثدييات). على سبيل المثال ، السلالة المعملية T7 Express ، المشتقة من السلالة الشائعة BL21 ، لها النمط الجيني Δ (mcrC-mrr) 114 :: IS10 الذي يحذف mcrBC و hsdRMS و mrr.


ملحوظة عن السد و Dcm Methylases

هذه الإنزيمات البكتيرية ميثيلات الأدينين ومخلفات السيتوزين ، على التوالي ، ولكنها لا تشارك بشكل مباشر في أنظمة تعديل التقييد التي تمت مناقشتها أعلاه. ومع ذلك ، فإن بعض إنزيمات النوع الثاني المستخدمة في الاستنساخ حساسة لهذه المثيلة ، وبالتالي تتوفر سلالات معملية مع حذف هذه الإنزيمات.


نوكليازات تقييدية

مع & gt 45 عامًا من تقديم الإنزيمات المقيدة لمجتمع البحث ، اكتسب NEB سمعة كونه رائدًا في تقنيات الإنزيم. من خلال العمل المستمر ليكون جديرًا بهذا التميز ، يسعى NEB جاهدًا لتطوير إنزيمات بأعلى درجة نقاء وأداء لا مثيل له.

يواصل علماء NEB تحسين محفظته من إنزيمات التقييد ، وكذلك استكشاف فائدتها في التقنيات الجديدة. نتيجة لذلك ، يواصل علماء NEB نشر الأوراق العلمية والحصول على منح في هذا المجال. مع أكبر مجموعة بحث وتطوير في الصناعة و rsquos مخصصة لأنزيمات التقييد ، نحن فخورون بأن نكون هناك أولاً: أول من قام بتسويق إنزيم مؤتلف ، وهو أول من أدخل إنزيمًا مقشرًا. بالإضافة إلى ذلك ، يتمتع NEB بتاريخ مستمر من الابتكار عن طريق هندسة إنزيمات التقييد ذات الخصائص المتغيرة والأداء المحسن. من خلال البحث المستمر في هذه المجالات ، نحن ملتزمون بقيادة الابتكارات التي تسمح لنا بتقديم أقصى درجات الراحة والأداء.

يشعر NEB أن الابتعاد عن المنتجات التي تحتوي على الحيوانات هو خطوة في الاتجاه الصحيح. يسعدنا أن نعلن أننا بصدد تحويل جميع مخازن التفاعل لتكون خالية من BSA! تعرف على المزيد على www.neb.com/BSA-free.

للحصول على تفاصيل حول ضوابط جودة NEB و rsquos للنويدات الداخلية المقيدة ، تفضل بزيارة صفحة جودة إنزيم التقييد.


لقد تحولت جميع إنزيمات التقييد الخاصة بـ NEB إلى نظام عازل جديد. قم بزيارة NEBCutSmart.com لمزيد من التفاصيل.

راحة

  • & gt215 إنزيمات التقييد نشطة بنسبة 100٪ في مخزن مؤقت واحد & ndash rCutSmart & trade Buffer.
  • & gt195 إنزيمات التقييد مؤهلة لتوفير الوقت ، مما يعني أنه يمكنك هضم الحمض النووي في 5-15 دقيقة ، أو هضم الحمض النووي بأمان بين عشية وضحاها.
  • اختر من بين & gt285 إنزيمات التقييد ، أكبر مجموعة متاحة تجاريًا.

أداء

  • اختر إنزيم تقييد عالي الدقة (HF & reg) ، والذي تم تصميمه لتقليل نشاط النجوم ، والهضم السريع (5-15 دقيقة) والنشاط بنسبة 100٪ في rCutSmart Buffer. يتم تضمين قارورة من 6X Purple Loading Dye مع معظم الإنزيمات المقيدة.
  • تخضع جميع إنزيمات التقييد الخاصة بنا لاختبارات صارمة لمراقبة الجودة ، مما يضمن أعلى مستويات النقاء والاتساق بين الكثير.

استخدم Enzyme Finder لتحديد إنزيم التقييد بالاسم أو التسلسل أو البروز أو النوع.


دليل استكشاف أخطاء إنزيم التقييد

يمكن استخدام الدليل التالي لاستكشاف أخطاء هضم إنزيم التقييد وإصلاحها. قد تكون مهتمًا أيضًا بمراجعة نصائح إضافية لتحسين تفاعلات الهضم.

يسعدنا أن نعلن أننا بصدد تحويل جميع مخازن التفاعل لتكون خالية من BSA. اعتبارًا من أبريل 2021 ، ستقوم NEB بتحويل مخازن رد الفعل الحالية المحتوية على BSA (NEBuffer & trade 1.1 و 2.1 و 3.1 و CutSmart & reg Buffer) إلى مخازن مؤقتة تحتوي على الألبومين المؤتلف (الرالبومين) (NEBuffer r1.1 و r2.1 و r3.1 و rCutSmart & Trade Buffer). نتوقع أن يستغرق هذا التبديل ما يصل إلى 6 أشهر حتى يكتمل. نشعر أن الابتعاد عن المنتجات التي تحتوي على الحيوانات خطوة في الاتجاه الصحيح ويمكننا تقديم هذا التحسين بنفس السعر. اعثر على مزيد من التفاصيل على www.neb.com/BSA-free.

خلال هذه الفترة الانتقالية ، قد تتلقى منتجًا به مخازن مؤقتة تحتوي على BSA أو rAlbumin. اختبر NEB كلاهما بدقة ولم يلاحظ أي اختلاف في أداء الإنزيم عند استخدام أي من المخزن المؤقت. يمكن استخدام أي من المخزن المؤقت مع الإنزيم الخاص بك. سيتم تبديل كل محتوى موقع الويب في أبريل لتعكس التغييرات ، على الرغم من أنك قد لا تتلقى المخزن المؤقت الجديد مع منتجك على الفور.

أشرطة فيديو

مشكلة هضم إنزيم التقييد: مسحة الحمض النووي على هلام الاغاروز

تعرف على المزيد حول أسباب هذه المشكلة الشائعة ، وكيف يتم مراقبة الجودة في إنزيمات NEB لتجنب تلطيخ الحمض النووي.

لماذا لا يقطع إنزيم التقييد الحمض النووي؟

لا تحصل على الانقسام الذي توقعته؟ دع عالم NEB يساعدك في استكشاف رد فعلك.

مشكلة الهضم في إنزيم التقييد: الكثير من عصابات الحمض النووي

هل تجد نطاقات غير متوقعة في رد فعل الهضم لديك؟ فيما يلي بعض النصائح لمساعدتك في تحديد السبب.

بروتوكول هضم إنزيم التقييد: قطع بالقرب من نهاية الحمض النووي

عند القطع بالقرب من نهاية جزيء الحمض النووي ، تأكد من معرفة عدد القواعد التي يجب إضافتها إلى نهايات بادئات PCR.

بروتوكول توفير الوقت والتجارة لهضم إنزيم التقييد

هل تحتاج إلى بروتوكول للاستيعاب بسرعة وبشكل كامل؟ جرب هذا البروتوكول للإنزيمات الموفرة للوقت والتجارة المؤهلة من NEB.

قلل نشاط النجوم باستخدام إنزيمات تقييد عالية الدقة

صمم NEB إنزيمات HF & reg للقضاء على نشاط النجوم. تعلم كيف وماذا يعني هذا بالنسبة لهضم الخاص بك.

البروتوكول القياسي لهضم إنزيم التقييد

دع أحد خبراء إنزيم التقييد في NEB يساعدك على تحسين أسلوبك وتجنب الأخطاء الشائعة في إعداد الهضم.

  • تحقق من حساسية المثيلة للإنزيم (الإنزيمات) لتحديد ما إذا كان الإنزيم مسدودًا عن طريق مثيلة تسلسل التعرف
  • استخدم المخزن المؤقت الموصى به المزود بإنزيم التقييد
  • نظف الحمض النووي لإزالة أي ملوثات قد تثبط الإنزيم
  • عند هضم جزء من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، تأكد من وجود 6 نيوكليوتيدات على الأقل بين موقع التعرف ونهاية جزيء الحمض النووي
  • قلل عدد الوحدات
  • أضف SDS (0.1 & ndash0.5٪) إلى المخزن المؤقت للتحميل لفصل الإنزيم عن الحمض النووي أو استخدم صبغة جل تحميل ، أرجواني (6X) (NEB # B7024)
  • استخدم عازلة تشغيل نظيفة وجديدة
  • استخدم هلام الاغاروز الطازج
  • تنظيف الحمض النووي (NEB # T1030)
  • تحقق من حساسية المثيلة للإنزيم (الإنزيمات) لتحديد ما إذا كان الإنزيم مسدودًا عن طريق مثيلة تسلسل التعرف
  • قد يتم حظر الحمض النووي المعزول من مصدر بكتيري بواسطة مثيلة Dam و Dcm
  • إذا تم تثبيط الإنزيم بواسطة مثيلة السد أو Dcm ، فقم بتنمية البلازميد في a السد- / dcm- سلالة (NEB # C2925)
  • قد يتم حظر الحمض النووي المعزول من مصدر حقيقيات النوى بواسطة مثيلة CpG
  • قد تكون الإنزيمات التي لها نشاط منخفض في المحاليل التي تحتوي على الملح (NEBuffer r3.1) حساسة للملح ، لذا نظف الحمض النووي (NEB # T1030) قبل الهضم
  • يمكن أن تؤدي إجراءات تنقية الحمض النووي التي تستخدم الأعمدة الدورانية إلى ارتفاع مستويات الملح ، مما يثبط نشاط الإنزيم. 1 لمنع هذا ، يجب ألا يزيد محلول الحمض النووي عن 25٪ من إجمالي حجم التفاعل.
  • تنظيف جزء PCR قبل ملخص التقييد (NEB # T1030)
  • استخدم المخزن المؤقت الموصى به المزود بإنزيم التقييد
  • استخدم ما لا يقل عن 3 & ndash5 وحدات من الإنزيم لكل & كوب من الحمض النووي
  • زيادة وقت الحضانة
  • بعض الإنزيمات لها نشاط أقل على الحمض النووي فائق التوليف. زيادة عدد وحدات الإنزيم في التفاعل.
  • يمكن أن تظهر بعض الإنزيمات انقسامًا أبطأ نحو مواقع محددة. زيادة وقت الحضانة ، 1 & ndash2 ساعة كافية عادة.
  • تتطلب بعض الإنزيمات وجود موقعين للتعرف على القطع بكفاءة
  • فحص ركيزة DNA في وجود DNA تحكم. لن ينكسر DNA الضبط إذا كان هناك مثبط. الحمض النووي المصغر للإعدادات معرض بشكل خاص للملوثات.
  • نظف الحمض النووي باستخدام عمود الدوران (NEB # T1030) أو قم بزيادة الحجم لتخفيف الملوثات
  • قلل عدد الوحدات في التفاعل
  • أضف SDS (0.1 & ndash0.5٪) إلى المخزن المؤقت للتحميل لفصل الإنزيم عن الركيزة
  • استخدم المخزن المؤقت الموصى به المزود بإنزيم التقييد
  • قلل عدد وحدات الإنزيم في التفاعل
  • تأكد من أن كمية الإنزيم المضاف لا تتجاوز 10٪ من إجمالي حجم التفاعل. هذا يضمن أن تركيز الجلسرين الكلي لا يتجاوز 5٪ حجم / حجم
  • تقليل وقت الحضانة. إن استخدام الحد الأدنى من وقت رد الفعل المطلوب لعملية الهضم الكامل سيساعد في منع نشاط النجوم.
  • جرب استخدام إنزيم تقييد عالي الدقة (HF). تم تصميم إنزيمات HF لتقليل نشاط النجوم.
  • قد تكون الإنزيمات التي لها نشاط منخفض في المحاليل التي تحتوي على الملح (على سبيل المثال ، NEBuffer r3.1) حساسة للملح. تأكد من تنظيف الحمض النووي (NEB # T1030) قبل الهضم.
  • يمكن أن تؤدي إجراءات تنقية الحمض النووي التي تستخدم الأعمدة الدورانية إلى ارتفاع مستويات الملح ، مما يثبط نشاط الإنزيم. 1 لمنع هذا ، يجب ألا يزيد محلول الحمض النووي عن 25٪ من إجمالي حجم التفاعل.
  • تنظيف جزء PCR قبل ملخص التقييد (NEB # T1030)
  • استخدم المخزن المؤقت الموصى به المزود بإنزيم التقييد
  • استخدم ما لا يقل عن 5 & ndash10 وحدات من الإنزيم لكل & كوب من الحمض النووي
  • هضم الحمض النووي لمدة 1 & ndash2 ساعة


1 Monarch Kits (NEB # T1010 و NEB # T1020 و NEB # T1030) تستخدم الأعمدة التي تم تصميمها لتقليل انتقال الملح إلى الحمض النووي المزال ، لذلك يمكن أن يؤدي استخدامها إلى تقليل هذه المشكلة.


كيف يمكنني معرفة ما إذا كان الإنزيم الخاص بي سيقطع؟

سواء أكان إجراء ملخص لأغراض الاستنساخ أو للتشخيص ، فإننا نقترح التحقق مرة أخرى للتأكد من أن نتائجك لن تتأثر بالمثيلة. بشكل ملائم ، لا تحتوي غالبية إنزيمات التقييد المستخدمة بشكل شائع في المختبر على مواقع التعرف التي يمكن أن تتداخل مع موقع المثيلة. يسرد الجدول المرجعي السريع أدناه 10 إنزيمات شائعة قد تتأثر بالمثيلة. هذا الجدول ليس شاملاً بأي حال من الأحوال ، لذا قد ترغب في الرجوع إلى قاعدة بيانات REBASE للحصول على معلومات أكثر تفصيلاً.

إنزيم مثيلة السد مثيلة Dcm مثيلة EcoKI
ابي لم تتأثر تم حظره عن طريق تداخل المثيلة لم تتأثر
بي إس آي لم تتأثر تم حظره عن طريق تداخل المثيلة لم تتأثر
CLI تم حظره عن طريق تداخل المثيلة لم تتأثر لم تتأثر
دراي لم تتأثر لم تتأثر تم حظره عن طريق تداخل المثيلة
هبا لم تتأثر لم تتأثر تم حظره عن طريق تداخل المثيلة
مبوي تم حظره عن طريق تداخل المثيلة لم تتأثر لم تتأثر
ماجستير لم تتأثر تم حظره عن طريق تداخل المثيلة لم تتأثر
PmeI لم تتأثر لم تتأثر تم حظره عن طريق تداخل المثيلة
XbaI تم حظره عن طريق تداخل المثيلة لم تتأثر لم تتأثر
DpnI يتطلب مثيلة للنشاط لم تتأثر لم تتأثر

إذا تأثر إنزيمك بالمثيلة ، فإن معرفة تسلسل الحمض النووي المحيط بموقع (مواقع) التقييد الخاص بك يمكن أن يساعدك على التنبؤ بسرعة بأي من هذه المواقع (إن وجدت) سيتم ميثليتها. باستخدام نفس مثال البلازميد كما هو مذكور أعلاه (والذي تم حظر موقع XbaI بواسطة مثيلة) ، يوضح الشكل أدناه كيف يمكن لبرنامج تصور التسلسل (استخدمنا Snapgene هنا) مساعدتك في تقييم ما إذا كان سيتم حظر موقع التقييد الخاص بك عن طريق المثيلة وكيف يمكن أن يتغير ذلك نتائج الملخص المتوقعة. إذا لم يتم أخذ مثيلة السد في الاعتبار ، فمن المتوقع أن يكون نمط الملخص الموضح في المسار 1 لهضم XbaI / NotI. ومع ذلك ، يسمح لك البرنامج باختيار ما إذا كنت تريد البحث عن مواقع مثيلة Dam و / Dcm و / أو EcoKI ويحذرك عندما يتم حظر موقع إنزيم مختار. علاوة على ذلك ، يأخذ البرنامج ذلك في الاعتبار عند محاكاة الملخص كما هو موضح في المسار 2.


إنزيمات التقييد هي أدوات قوية في علم الوراثة الجزيئي تستخدم في:
& الثور خريطة جزيئات الحمض النووي
& bull تحليل تعدد الأشكال السكانية
& bull إعادة ترتيب جزيئات الحمض النووي
& الثور تحضير المجسات الجزيئية
والثور خلق المسوخ

درجة حرارة: تتم معظم عمليات الهضم في درجة حرارة 37 درجة مئوية. ومع ذلك ، هناك بعض الاستثناءات على سبيل المثال ، يتم إجراء الهضم باستخدام Sma I في درجات حرارة منخفضة (

25 درجة مئوية) ، بينما مع Taq I عند درجة حرارة أعلى ، أي 65 درجة مئوية.

أنظمة العازلة: Tris-HCl هو عامل التخزين المؤقت الأكثر استخدامًا في مخاليط الحضانة ، والذي يعتمد على درجة الحرارة. تنشط معظم إنزيمات التقييد في نطاق الأس الهيدروجيني 7.0-8.0.

الظروف الأيونية: Mg2 + هو مطلب مطلق لجميع نوكليازات التقييد ، لكن متطلبات الأيونات الأخرى (Na + / K +) تختلف باختلاف الإنزيمات.

مثيلة الحمض النووي: تؤثر ميثيل مخلفات الأدينين أو السيتدين المحددة ضمن تسلسل التعرف على إنزيم التقييد على هضم الحمض النووي.


إنزيم تقييد الهضم

اقرأ عن إنزيمات تقييد النوع الثاني والخصائص المميزة للأنواع الفرعية الأربعة الأساسية.

أحدثت طرق التسلسل عالية الإنتاجية ثورة في التحليل الجينومي من خلال إنتاج ملايين القراءات المتسلسلة من الحمض النووي للكائن الحي بتكلفة متناقصة باستمرار.

الكتيبات

أدوات التحديد

أدلة استكشاف الأخطاء وإصلاحها

إرشادات الاستخدام

هذا المنتج مغطى بواحدة أو أكثر من براءات الاختراع والعلامات التجارية و / أو حقوق النشر المملوكة أو الخاضعة لسيطرة New England Biolabs، Inc (NEB).

بينما تقوم NEB بتطوير منتجاتها والتحقق منها لتطبيقات مختلفة ، فإن استخدام هذا المنتج قد يتطلب من المشتري الحصول على حقوق ملكية فكرية إضافية لطرف ثالث لتطبيقات معينة.

لمزيد من المعلومات حول الحقوق التجارية ، يرجى الاتصال بفريق تطوير الأعمال العالمية في NEB على [email protected]

هذا المنتج مخصص لأغراض البحث فقط. هذا المنتج غير مخصص للاستخدام لأغراض علاجية أو تشخيصية في البشر أو الحيوانات.

أشرطة فيديو

ما هو إنزيم التقييد من النوع الثاني؟

تُستخدم إنزيمات التقييد من النوع الثاني بشكل شائع في تطبيقات البيولوجيا الجزيئية ، لأنها تتعرف على التسلسلات النمطية وتنتج نمط انقسام يمكن التنبؤ به. تعرف على المزيد حول كيفية عمل Type II REs.

ما هو إنزيم التقييد من النوع الأول؟

إنزيمات التقييد من النوع الأول هي مجموعة من نوكليازات داخلية تتعرف على تسلسل ثنائي ، ولكنها لا تنتج نمط انقسام يمكن التنبؤ به. تعرف على المزيد حول كيفية عمل Type I REs.

ما هو إنزيم التقييد من النوع الثالث؟

إنزيمات التقييد من النوع الثالث هي مجموعة من نوكليازات داخلية تتعرف على تسلسل غير مرن ، يشتمل على موقعين موجَّهين عكسيًا. تعرف على المزيد حول هذه الإنزيمات غير المفهومة.

الاستنساخ باستخدام إنزيمات تقييدية

تعد إنزيمات التقييد جزءًا لا يتجزأ من سير عمل الاستنساخ ، لتوليد نهايات متوافقة على الأجزاء والناقلات. تناقش هذه الرسوم المتحركة ثلاثة إرشادات لتحديد إنزيمات التقييد التي يجب استخدامها في تجربة الاستنساخ.

البروتوكول القياسي لهضم إنزيم التقييد

دع أحد خبراء إنزيم التقييد في NEB يساعدك على تحسين أسلوبك وتجنب الأخطاء الشائعة في إعداد الهضم.

لماذا لا يقطع إنزيم التقييد الحمض النووي؟

لا تحصل على الانقسام الذي توقعته؟ دع عالم NEB يساعدك في استكشاف رد فعلك.

مشكلة الهضم في إنزيم التقييد: الكثير من عصابات الحمض النووي

هل تجد نطاقات غير متوقعة في رد فعل الهضم لديك؟ فيما يلي بعض النصائح لمساعدتك في تحديد السبب.

ما هو نشاط إنزيم التقييد النجمي؟

تعرف على ماهية نشاط Star ، ولماذا يضر بعملية الهضم الدقيقة لإنزيم التقييد ، وكيف يتم تصميم إنزيمات HF الخاصة بـ NEB لتجنبه.

قلل نشاط النجوم باستخدام إنزيمات تقييد عالية الدقة

صمم NEB إنزيمات HF & reg للقضاء على نشاط النجوم. تعلم كيف وماذا يعني هذا بالنسبة إلى هضمك.

NEB & reg Restriction Enzyme Double Digest Protocol

يمكن أن يوفر لك الهضم المزدوج الوقت ، ويمكن أن يقدم هذا الفيديو نصائح حول كيفية تحقيق أفضل النتائج ، بغض النظر عن إنزيمات التقييد الخاصة بـ NEB التي تستخدمها.

بروتوكول هضم إنزيم التقييد: قطع بالقرب من نهاية الحمض النووي

عند القطع بالقرب من نهاية جزيء الحمض النووي ، تأكد من معرفة عدد القواعد التي يجب إضافتها إلى نهايات بادئات PCR.

مشكلة هضم إنزيم التقييد: مسحة الحمض النووي على هلام الاغاروز

تعرف على المزيد حول أسباب هذه المشكلة الشائعة ، وكيف يتم مراقبة الجودة في إنزيمات NEB لتجنب تلطيخ الحمض النووي.

إنزيمات التقييد في التضخيم متساوي الحرارة

يولد التضخيم متساوي الحرارة نسخًا عديدة من تسلسل مستهدف في فترة زمنية قصيرة ، عند درجة حرارة ثابتة. تعرف على المزيد حول التضخيم متساوي الحرارة.

إنزيمات التقييد في رسم الخرائط البصرية

الخرائط البصرية هي طريقة تسمح بإنتاج خرائط تقييد للكروموسومات أو الجينومات الكاملة. تعرف على المزيد حول التعيين البصري.


نوكليازات التقييد: الاستنساخ الجزيئي وما بعده

إن نشاط انشقاق الحمض النووي الخاص بالتسلسل الخاص بالنويدات الداخلية المقيدة (REases) ، جنبًا إلى جنب مع الأنشطة الأنزيمية الأخرى التي تضخم وتربط الأحماض النووية ، قد مكنت البيولوجيا الجزيئية الحديثة. بعد أكثر من نصف قرن من البحث والتطوير ، تطورت تطبيقات REases من استنساخ الحمض النووي الخارجي ورسم خرائط الجينوم إلى تطبيقات أكثر تعقيدًا ، مثل تحديد ورسم خرائط التعديلات اللاجينية والتجميع عالي الإنتاجية للمكتبات التوافقية. علاوة على ذلك ، فإن اكتشاف وهندسة نوكليازات نوكلياز (NEases) قد فتح الباب أمام تقنيات مثل التضخيم الحراري للحمض النووي من بين أمور أخرى. في هذه المراجعة ، سوف ندرس الإنجازات الرئيسية لبحوث REase ، وتطبيقات REases و NEases في مختلف مجالات البحث البيولوجي والتقنيات الجديدة لتجميع جزيئات الحمض النووي الكبيرة.

سيو هونغ تشان ، دكتوراه ، New England Biolabs، Inc.

المقدمة

في الخمسينيات من القرن الماضي ، تم الإبلاغ عن ظاهرة تُعرف باسم & ldquohost التي يتم التحكم فيها / التباين المحرض للفيروسات البكتيرية ، حيث تم عزل العاثيات من واحدة. بكتريا قولونية أظهرت السلالة انخفاضًا في قدرتها على التكاثر في سلالة مختلفة ، لكنها استعادت قدرتها في دورات العدوى اللاحقة (1،2). في عام 1965 ، أنشأ Werner Arber & rsquos seminal paper الإطار النظري لنظام تعديل التقييد ، والذي يعمل كدفاع بكتيري ضد غزو العاثيات (3). اكتشفت REases الأولى تسلسل DNA محددًا ، ولكنها قطعت على مسافات متغيرة بعيدًا عن تسلسل التعرف عليها (النوع الأول) ، وبالتالي لم تكن ذات فائدة تذكر في معالجة الحمض النووي. بعد فترة وجيزة ، سمح اكتشاف وتنقية REases التي تم التعرف عليها وقطعها في مواقع محددة (Type II REases) للعلماء بإجراء معالجة دقيقة للحمض النووي في المختبر، مثل استنساخ الجينات الخارجية وإنشاء نواقل فعالة للاستنساخ. الآن ، أكثر من 4000 REases معروفة ، تتعرف على أكثر من 300 تسلسل مميز (للحصول على قائمة كاملة ، قم بزيارة REBASE & reg على rebase.neb.com). مع ظهور منهجيات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، و RT-PCR ، ومنهجيات الطفرات القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أدى سير عمل الاستنساخ التقليدي إلى تحويل البحث البيولوجي في العقود التالية.


تطوير إنزيمات التقييد وتقنيات التحرير الجيني

هندسة إنزيمات التقييد

تقليديا ، تم تنقية REases من الكائن الحي الأصلي. أدى تطوير نواقل استنساخ الجينات ومنهجيات الاختيار إلى تمكين استنساخ REases. لم يسمح الاستنساخ بإنتاج كميات كبيرة من الإنزيمات عالية النقاء فحسب ، بل جعل هندسة REases ممكنة أيضًا. حاليًا ، تعتبر البروتينات المؤتلفة من إنزيمات gt 250 من إنزيمات التقييد التي توفرها New England Biolabs (NEB).

تحسين الأداء الهندسي

تم ملاحظة نشاط الانقسام في المواقع غير المتشابهة (أي نشاط النجوم) وتوثيقها جيدًا لبعض REases. من بين هؤلاء ، يُظهر البعض نشاطًا نجميًا في ظل ظروف تفاعل دون المستوى الأمثل ، بينما يمتلك البعض الآخر نطاقًا ضيقًا جدًا من وحدات الإنزيم التي تهضم تمامًا كمية معينة من الركيزة دون إظهار نشاط نجمي (4). من خلال البحث المكثف ، بدأ العلماء في NEB هندسة إنزيمات التقييد التي تظهر نشاط نجمي ضئيل ، إن وجد ، مع أوقات رد فعل ممتدة وبتركيزات عالية من الإنزيمات. أتاح هذا البحث تقديم REases عالية الدقة (HF & trade) التي حسنت الأداء في ظل مجموعة واسعة من ظروف التفاعل (لمزيد من المعلومات ، قم بزيارة www.neb.com/HF).

خصائص التسلسل الهندسي الجديد

كانت محاولات تغيير خصائص التسلسل الخاصة بـ REases من النوع IIP غير ناجحة إلى حد كبير ، ويفترض أن محدد خصوصية التسلسل يتكامل هيكليًا مع المواقع النشطة لـ Type IIP REases. MmeI ، نوع IIG REase مع كل من أنشطة methyltransferase (MTase) و REase في نفس البولي ببتيد ، يتعرف على التسلسل المستهدف TCCRAC باستخدام مجال التعرف على الهدف (TRD) داخل مكون MTase الخاص به. يمثل هذا فرصة ممتازة لتصميم خصوصية تسلسل معدلة في REase. كميزة إضافية ، أدت مشاركة TRD بين أنشطة REase و MTase إلى تغيير مكافئ في نشاط MTase لأي تغيير في خصوصية انشقاق التسلسل المستهدف ، مما يحمي الموقع المستهدف الجديد من الانقسام في الخلايا المضيفة المؤتلفة. من خلال تحليل المعلوماتية الحيوية لتسلسل البروتين المتماثل ، حدد العلماء في NEB بقايا الأحماض الأمينية التي تعرفت على قواعد معينة ضمن التسلسلات المستهدفة وخلقت طفرات MmeI ذات خصائص تسلسل متغيرة (5). فتح التصميم العقلاني لطفرات MmeI والمتجانسات إمكانية إنشاء REases بمئات من خصائص التسلسل الجديدة.

الشكل 1. احتكاك هندسة الإنزيم
نوع IIS REases ، مثل FokI (بني فاتح وداكن) و BstNBI (isoschizomer of BspD6I ، أرجواني فاتح وداكن) ، ونوكلياز داخلي موجه I-AniI (سماوي) ، تم تصميمه لامتلاك أنشطة إنزيم.

Nicking Endonucleases الهندسة

أدت الأبحاث الأساسية التي تضمنت REases إلى نتائج مفاجئة حول آلية الانقسام التي تبدو واضحة. عادةً ما تعمل REases النموذجية من النوع IIP كقوالب متجانسة ، حيث يقوم كل من المونومرات بتقطيع نصف الموقع المتناوب. من ناحية أخرى ، يُظهر النوع IIS REases نطاقًا واسعًا من آليات الانقسام مزدوجة الشريطة ، أي التغاير ، كما هو الحال بواسطة BtsI و BbvCI ، والانقسام المتسلسل لـ dsDNA كمونومر ، كما بواسطة FokI. تم استغلال هذه الخصائص لإنشاء إنزيمات خاصة بالخصل (NEases) (لمزيد من المعلومات حول إنزيمات الخدر ، راجع المراجعة في (6)).

التطبيقات التي تستخدم إنزيمات التقييد

الاستنساخ التقليدي

بالاقتران مع ligases DNA ، سهلت REases سير عمل قوي & ldquocut ولصق & rdquo حيث يمكن نقل جزء DNA محدد من كائن حي إلى آخر (الشكل 2). باستخدام هذه المنهجية ، دمج ستانلي كوهين وزملاؤه الحمض النووي الخارجي في البلازميدات الطبيعية لإنشاء وسيلة لاستنساخ نواقل البلازميد التي تنتشر ذاتيًا في بكتريا قولونية (7). أصبحت هذه هي العمود الفقري للعديد من النواقل الحالية ، ومكنت من استنساخ الحمض النووي لدراسة وإنتاج البروتينات المؤتلفة. إنزيمات التقييد مفيدة أيضًا كأدوات تأكيدية بعد الاستنساخ ، لضمان أن عمليات الإدخال تمت بشكل صحيح. أصبح سير عمل الاستنساخ التقليدي ، جنبًا إلى جنب مع تقنيات تضخيم الحمض النووي ، مثل PCR و RT-PCR ، تطبيقًا سائدًا لـ REases ويسهل دراسة العديد من الآليات الجزيئية.

الشكل 2. سير عمل الاستنساخ التقليدي
باستخدام PCR ، تتم إضافة مواقع التقييد إلى طرفي dsDNA ، والتي يتم هضمها بعد ذلك بواسطة REASE المقابلة. يمكن بعد ذلك ربط الحمض النووي المشقوق بناقل بلازميد مشقوق بواسطة REASE نفسه أو المتوافق مع T4 DNA ligase. يمكن أيضًا نقل شظايا الحمض النووي من ناقل إلى آخر عن طريق الهضم باستخدام REases والربط إلى الأطراف المتوافقة للمتجه المستهدف.

رسم خرائط الحمض النووي

مسلحًا بعدد قليل من REases في أوائل السبعينيات ، رسم Daniel Nathans خريطة للوحدات الوظيفية لـ SV40 DNA (8) ، وبدأ عصر رسم خرائط التضيق & rdquo ومقارنة الجينومات المعقدة. وقد تطور منذ ذلك الحين إلى منهجيات متطورة تسمح باكتشاف تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNP) وعمليات الإدراج / الحذف (Indels) (9) ، والتي تقود التطبيقات التي تشمل تحديد مواقع الاضطرابات الوراثية ، وتقييم التنوع الجيني للسكان واختبار الوالدين.

فهم التعديلات الجينية

تم استغلال REases & rsquo الحساسية لحالة المثيلة للقواعد المستهدفة لتعيين القواعد المعدلة داخل الجينوم. مسح الجينوم المقيد (RLGS) هو تقنية رسم خرائط على أساس الهلام ثنائي الأبعاد تستخدم NotI (GC ^ GGCCGC) أو AscI (GG ^ CGCGCC) أو EagI (C ^ GGCCG) أو BssHII (G ^ CGCGC) لاستجواب التغييرات في أنماط مثيلة الجينوم أثناء تطور الخلايا الطبيعية والسرطانية. يستفيد تعدد الأشكال للتضخيم الحساس للميثيل (MSAP) من الحساسية التفاضلية لـ MspI و HpaII تجاه حالة المثيلة لـ C الثاني من CCGG الرباعي لتحديد 5-ميثيل سيتوزين (5-mC) أو 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC) (10 ، 11). استغل العلماء في NEB أيضًا خاصية MspI و HpaII على 5-glucosyl hydroxymethylcytosine (5-ghmC) في مجموعة تحليل EpiMark & ​​reg 5-hmC و 5-mC (NEB # E3317S) (12) ، والتي تميز 5-hmC من 5- mC لمزيد من تحديد العلامات اللاجينية وتقديرها (لمزيد من المعلومات ، قم بزيارة EpiMark.com). بالإضافة إلى ذلك ، تم اكتشاف REases المكتشفة مؤخرًا والتي تتعرف على الحمض النووي وتقطعه في مواقع 5-mC و 5-hmC (على سبيل المثال ، MspJI و FspEI و LpnPI) ، بالإضافة إلى تلك التي تشق بشكل مفضل 5-hmC أو 5-ghmC فوق 5-mC أو C (على سبيل المثال ، PvuRts1I ، AbaSI) (13) ، هي أدوات محتملة لرسم الخرائط عالية الإنتاجية للعلامات اللاجينية القائمة على السيتوزين في الجينومات السيتوزينية الميثيلية (14 ، 15).

في المختبر تقنيات تجميع الحمض النووي

علم الأحياء التركيبي هو مجال سريع النمو ، يتم فيه استخدام مكونات محددة لإنشاء أنظمة بيولوجية لدراسة العمليات البيولوجية وإنشاء أجهزة بيولوجية مفيدة (16). ظهرت تقنيات جديدة مثل BioBrick & trade لتسهيل بناء مثل هذه الأنظمة البيولوجية. في الآونة الأخيرة ، تم اعتماد مناهج أكثر قوة ، مثل Golden Gate Assembly و Gibson Assembly & trade ، على نطاق واسع من قبل مجتمع البيولوجيا التركيبية. كلا النهجين يسمحان بالتجميع المتوازي والسلس لشظايا الحمض النووي المتعددة دون اللجوء إلى قواعد غير قياسية.

بيوبريك: سعى مجتمع BioBricks إلى إنشاء آلاف & ldquostandized Parts & rdquo من الحمض النووي للتجميع الجيني السريع. من خلال المسابقة الدولية السنوية للآلات المهندسة وراثيًا (iGEM) ، نما مجتمع BioBricks وأثار اهتمامًا واسعًا من العديد من طلاب الجامعات في البيولوجيا التركيبية. استنادًا إلى منهجية ربط REase التقليدية ، فإن BioBrick ومنهجياتها المشتقة (BioBrick Assembly Kit ، NEB # E0546 ، ومشتقاتها ، BglBricks (17)) سهلة الاستخدام ، لكنها تقدم تسلسلات ندبة عند التقاطعات. كما أنها تتطلب دورات استنساخ متعددة لإنشاء نظام بيولوجي فعال.

جمعية البوابة الذهبية: تستغل Golden Gate Assembly وطرقها المشتقة (19،20) قدرة النوع IIS REASE على شق الحمض النووي خارج تسلسل التعرف. تم تصميم متجهات الإدخالات والاستنساخ لوضع موقع التعرف على النوع IIS بعيدًا عن موقع الانقسام ، بحيث يمكن لـ Type IIS REase إزالة تسلسل التعرف من التجميع (الشكل 3). مزايا مثل هذا الترتيب هي ثلاثة أضعاف: 1. التسلسل المتدلي الذي تم إنشاؤه لا تمليه REase ، وبالتالي لم يتم تقديم تسلسل ندبة 2. التسلسل الخاص بالجزء الخاص بالجزء المتدلي يسمح بالتجميع المنظم لشظايا متعددة في وقت واحد و 3 يتم إزالة موقع التقييد من المنتج المرتبط ، لذلك يمكن إجراء عملية الهضم والربط في وقت واحد. والنتيجة النهائية هي التجميع المنظم والسلس لشظايا الحمض النووي في تفاعل واحد. دقة التجميع تعتمد على طول التسلسلات المتراكمة. لذلك ، يُفضل كتابة قواعد بيانات IIS التي تنشئ وحدات متراكمة من 4 قواعد (مثل BsaI / BsaI-HF و BbsI و BsmBI و Esp3I). يتمثل الجانب السلبي لهذه الأساليب المستندة إلى Type IIS REase في أن العدد الصغير من القواعد المتدلية يمكن أن يؤدي إلى سوء ربط الأجزاء ذات التسلسلات المتراكمة المماثلة (21). من الضروري أيضًا التحقق من أن مواقع نوع IIS REase المستخدمة غير موجودة في الأجزاء الخاصة بتجميع المنتج المتوقع. ومع ذلك ، فإن Golden Gate Assembly هي تقنية قوية تولد طفرات متعددة موجهة من الموقع (22) وتجمع شظايا متعددة من الحمض النووي (23 ، 24). نظرًا لأن الأساليب والكواشف مفتوحة المصدر أصبحت متاحة بشكل متزايد (انظر www.addgene.org) ، فقد تم استخدام Golden Gate Assembly على نطاق واسع في بناء TALENs المخصصة لتحرير الجينات في الجسم الحي (25) ، من بين تطبيقات أخرى.

الشكل 3. سير عمل تجميع Golden Gate
في أبسط أشكالها ، تتطلب Golden Gate Assembly وجود موقع التعرف على BsaI (GGTCTC) مضافًا إلى طرفي جزء dsDNA البعيد إلى موقع الانقسام ، بحيث يتم التخلص من موقع BsaI عن طريق الهضم باستخدام BsaI أو BsaI-HF (GGTCTC 1/5 ). عند الانقسام ، تلتصق التسلسلات المتدلية للأجزاء المجاورة ببعضها البعض. يقوم DNA ligase بعد ذلك بإغلاق الفتحات لإنشاء جزيء DNA جديد مرتبط تساهميًا. يمكن قطع قطع متعددة من الحمض النووي وربطها في وقت واحد. جمعية جيبسون: وصف دانيال جي جيبسون ، من معهد J. Craig Venter ، طريقة قوية تعتمد على نوكلياز خارجي لتجميع الحمض النووي بسلاسة وبالترتيب الصحيح. يتم إجراء التفاعل في ظل ظروف متساوية الحرارة باستخدام ثلاثة أنشطة إنزيمية: يولد نوكلياز خارجي 5 & rsquo نتوءات طويلة ، ويملأ بوليميراز فجوات مناطق ss الملدنة ، ويغلق DNA ligase فتحات الفجوات الملدنة والمملوءة (26) (الشكل 4). بتطبيق هذه المنهجية ، تم تجميع جينوم الميتوكوندريا الفأري بحجم 16.3 كيلو بايت من 600 متراكب يبلغ طوله 60 مترًا (26). بالاشتراك مع في الجسم الحي التجميع في الخميرة ، تم استخدام Gibson Assembly لتجميع 1.1 ميجا بايت في الثانية ميكوبلازما ميكويدات الجينوم. تم زرع الجينوم المركب في أ M. capricolum recipient cell creating new self-replicating M. mycoides cells (27).

Gibson Assembly can also be used for cloning the assembly of a DNA insert with a restriction-digested vector, followed by transformation, can be completed in a little less than two hours with the Gibson Assembly Cloning Kit (NEB #E5510S, for more information, visit NEBGibson.com). Other applications of Gibson Assembly include the introduction of multiple mutations, assembly of plasmid vectors from chemically synthesized oligonucleotides, and creating combinatorial libraries of genes and pathways.

Figure 4. Gibson Assembly Workflow
Gibson Assembly employs three enzymatic activities in a single-tube reaction: 5´ exonuclease, the 3´ extension activity of a DNA polymerase and DNA ligase activity. The 5´ exonuclease activity chews back the 5´ end sequences and exposes the complementary sequence for annealing. The polymerase activity then fills in the gaps on the annealed regions. A DNA ligase then seals the nick and covalently links the DNA fragments together. The overlapping sequence of adjoining fragments is much longer than those used in Golden Gate Assembly, and therefore results in a higher percentage of correct assemblies. The NEB Gibson Assembly Master Mix (NEB #E2611) and Gibson Assembly Cloning Kit (NEB #E5510S) enable rapid assembly at 50˚C.

Construction of DNA Libraries

SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) has allowed the identification and quantification of a large number of mRNA transcripts. It has been widely used in cancer research to identify mutations and study gene expression. REases are key to the SAGE workflow. NlaIII is instrumental as an anchoring enzyme, because of its unique property of recognizing a 4-bp sequence CATG and creating a 4 nucleotide overhang of the same sequence. The use of Type IIS enzymes as tagging enzymes that cleave further and further away from the recognition sequence allows for the higher information content of SAGE analyses (e.g., FokI and BsmFI in SAGE (28), MmeI in LongSAGE (29) and EcoP15I in SuperSAGE (30) and DeepSAGE (31)).

Chromosome conformation capture (3C) and derivative methods allow the mapping of the spatial organizations of genomes in unprecedentedly high resolution and throughput (32). REases plays an indispensible role in creating the compatible ends of the DNA cross-linked to its interacting proteins, such that spatially associated sequences can be ligated and, hence, identified through high-throughput sequencing.

Although REases do not allow for the random fragmentation of DNA that most next-generation DNA sequencing technologies require, they are being used in novel target enrichment methodologies (hairpin adaptor ligation (33) and HaloPlex&trade enrichment (Agilent)). The long-reach REase, AcuI, and USER&trade Enzyme are also used to insert tags into sample DNA, which is then amplified by rolling circle amplification (RCA) to form long, single-stranded DNA &ldquonanoballs&rdquo that serve as template in the high density, chip-based sequencing-by-ligation methodology, developed by Complete Genomics (34). ApeKI was also used to generate the DNA library for a genotyping-by-sequencing technology for the study of sequence diversity of maize (35).

Creation of Nicks in DNA

Before NEases were available, non-hydrolyzable phosphorothioate groups were incorporated into a specific strand of the target DNA such that REases can introduce sequence- and strand-specific nicks into the DNA for applications such as strand displacement amplification (SDA), where a strand-displacing DNA polymerase (e.g., Bst 2.0 DNA Polymerase, NEB #M0537) extends from the newly created 3&rsquo-hydroxyl end, and essentially replicates the complementary sequence (36). Because the nicking site is regenerated, repeated nicking-extension cycles result in amplification of specific single-stranded segments of the sample DNA without the need for thermocycling. NEases greatly streamline the workflow of such applications and open the door to applications that cannot be achieved by REases. Nicking enzyme-based isothermal DNA amplification technologies, such as RCA, NESA, EXPAR and related amplification schemes, have been shown to be capable of detecting very low levels of DNA (37,38). Nicking-based DNA amplification had also been incorporated into molecular beacon technologies to amplify signal (39). The implementation of these sample and/or signal amplification schemes can lead to simple, but sensitive and specific, methods for the detection of target DNA molecules in the field (NEAR, EnviroLogix&trade). By ligating adaptors containing nicking sites to the ends of blunt-ended DNA, the simultaneous actions of the NEase(s) and strand-displacing DNA polymerase can quickly amplify a specific fragment of dsDNA (40). Amplification by nicking-extension cycling is amenable to multiplexing and can potentially achieve a higher fidelity than PCR. The combined activity of NEases and Bst DNA polymerase have also been used to introduce site-specific fluorescent labels into long/chromosomal DNA in vitro for visualization (nanocoding) (41). Innovative applications of nicking enzymes include the generation of reporter plasmids with modified bases or structures (42) and the creation of a DNA motor that transports a DNA cargo without added energy (43). A review of NEases and their applications has been published elsewhere (6).

في الجسم الحي Gene Editing

The ability to &ldquocut and paste&rdquo DNA using REases في المختبر has naturally led to the quest for performing the art في الجسم الحي to correct mutations that cause genetic diseases. Direct use of REases and homing endonucleases in Restriction Enzyme Mediated Integration (REMI) facilitated the generation of transgenic embryos of higher organisms (44,45). There is, however, no control over the integration site. The concept of editing genes through site-specific cleavage has been realized using Zinc Finger Nucleases (ZFNs) and Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs), due to their ability to create customizable double stranded breaks in complex genomes. With the great success of gene editing in model organisms and livestock (46-50), the therapeutic potential of these gene editing reagents is being put to the first test in the Phase I/II clinical trials of a regime that uses a ZFN to improve CD4+ T-cell counts by knocking out the expression of the CCR5 gene in autologous T-cells from HIV patients (ClinicalTrials.gov indentifier NCT00842634) (51). Recent research on CRISPR, the adaptive defense system of bacteria and archaea, has shown the potential of the Cas9-crRNA complex as programmable RNA-guided DNA endonucleases and strand-specific nicking endonucleases for في الجسم الحي gene editing (52,53).

MOVING FORWARD

Restriction enzymes have been one of the major forces that enabled the cloning of genes and transformed molecular biology. Novel technologies, such as Golden Gate Assembly and Gibson Assembly, continue to emerge and expand our ability to create new DNA molecules. The potential to generate new recognition specificity in the MmeI family REases, the engineering of more NEases and the discovery of ever more modification-specific REases continues to create new tools for DNA manipulation and epigenome analysis. Innovative applications of these enzymes will take REases&rsquo role beyond molecular cloning by continuing to accelerate the development of biotechnology and presenting us with new opportunities and challenges.


How do restriction endonucleases cut DNA?

Read rest of the answer. Accordingly, where do restriction endonucleases cut DNA?

Restriction Enzyme Types Generally, Type I enzymes cut DNA at locations distant to the recognition sequence Type II cut DNA within or close to the recognition sequence Type III cut DNA near recognition sequences and Type IV cleave methylated الحمض النووي.

what is DNA restriction? DNA restriction enzymes break الحمض النووي strands at specific sites based on the nucleic acid sequence. Thus, digestion with a given تقييد enzyme or combination of تقييد enzymes will produce fragments of different lengths that are directly related to the الحمض النووي sequence.

Similarly, it is asked, why do restriction enzymes not cut their own DNA?

Bacteria have restriction enzymes، وتسمى أيضا نوكليازات تقييد، أي يقطع double stranded الحمض النووي at specific points into fragments. ومن المثير للاهتمام، restriction enzymes don't cleave their own DNA. Bacteria prevent their own DNA from chop down by انزيم التقييد through methylation of the تقييد المواقع.

Which bonds do restriction enzymes cut?

Restriction enzymes cut الحمض النووي سندات between 3&prime OH of one nucleotide and 5&prime phosphate of the next one at the specific تقييد موقع. Adding methyl groups to certain bases at the recognition sites on the bacterial DNA blocks the انزيم التقييد to bind and protects the bacterial DNA from being يقطع by themselves.


Traditional Cloning

Traditional Cloning usually refers to the use of restriction endonucleases to generate DNA fragments with specific complementary end sequences that can be joined together with a DNA ligase, prior to transformation. This typically involves preparing both a DNA fragment to be cloned (insert) and a self-replicating DNA plasmid (vector) by cutting with two unique restriction enzymes that flank the DNA sequence and are present at the preferred site of insertion of the vector, often called the multiple cloning site (MCS). By using two different REs, two non-compatible ends are generated, thus forcing the insert to be cloned directionally, and lowering the transformation background of re-ligated vector alone. Directional cloning is often useful to maintain an open reading frame or another positional requirement with cis-acting regulatory elements. Non-directional cloning can also be performed with compatible ends generated by a single restriction enzyme in this case, the clones will need to be screened to determine that the gene orientation is correct. Typically, the vector needs to be dephosphorylated to prevent self-ligation, which directly competes with the insert and lowers the efficiency of the cloning reaction.

In the early years of cloning, genomic DNA was often cloned into plasmid vectors using DNA adapters to add the required restriction sites to a gene of interest, prior to ligation. Additionally, genes, or other DNA elements, were swapped between vectors using compatible ends contained by both vectors. More recently, the Polymerase Chain Reaction (PCR) has been used as an upstream step in a cloning protocol to introduce the necessary restriction sites for directional cloning, prior to preparation of the vector and insert by restriction digests, followed by fragment purification, fragment ligation, and transformation into an بكتريا قولونية cloning strain for plasmid amplification. Transformed colonies, now resistant to an antibiotic due to a resistance gene harbored by the plasmid, are screened by colony PCR or restriction digest of plasmid DNA for the correct insert. Direct sequencing of the recombinant plasmid is often performed to verify the sequence integrity of the cloned fragment.

  • Low cost
  • متنوع القدرات
  • Main different vector choices
  • Directional cloning can be easily done
  • Possible sequence constraints due to presence and/or translation of restriction site

Traditional Cloning Workflow

Note that times are based on estimates for moving a gene from one plasmid to another. If the source for gene transfer is gDNA, add 2 hours to calculation for the traditional cloning method. Total time does not include transformation, isolation or analysis.


شاهد الفيديو: Restriction Enzymes (قد 2022).