معلومة

طريقة Edman لتحديد الببتيدات مع Phenylisothiocyanate (PTH)

طريقة Edman لتحديد الببتيدات مع Phenylisothiocyanate (PTH)


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

نعلم جميعًا أنه في هذه الطريقة يتفاعل PTH مع الحمض الأميني الأول (aa) من الطرف N إلى الببتيد ويفصل عنه معطيًا PTH-aa حتى نتمكن من معرفة تسلسل الأحماض الأمينية في الببتيد.

السؤال هو ما الذي يمنع PTH من التفاعل مع الحمض الأميني الثاني بعد انفصاله مع الحمض الأميني الأول في نفس الوقت والمرحلة؟ لأنه إذا حدث ذلك ، فلا يمكننا التمييز بين بقايا الأحماض الأمينية الأولى والثانية في التسلسل.


الإجابة المختصرة هي أن تدهور Edman هو عملية متعددة الخطوات. تحتوي صفحة ويكيبيديا على صورة جيدة للآلية. في الممارسة العملية ، يتفاعل الببتيد مع فينيل أيزوثيوسيانات (PTH) في ظل ظروف أساسية معتدلة لإعطاء ثيوريا ، وهو مستقر. يتم فصل PTH الزائد عن وسيط ثيوريا. ثم يتم معالجة الثيوريا بالحمض لشق ن- بقايا نهائية من الببتيد. لم يعد الهرمون PTH موجودًا ، لذلك لا داعي للقلق بشأن التفاعل مع البقايا الثانية.


مخططات تدهور إدمان

آلان دوسيه ، كريستوفر إم بشكل عام ، في طرق في علم الإنزيمات ، 2011

الملخص

يعد تدهور Edman تقنية قديمة لتسلسل N-terminal للبروتينات وشظايا الانقسام. ومع ذلك ، لتحليل البيانات الدقيق وتخصيصات الأحماض الأمينية ، يستمر تسلسل Edman في عينات من البروتينات الفردية فقط وبالتالي يفتقر إلى قدرات الإنتاجية العالية. وصفنا طريقة جديدة لتحديد الإنتاجية العالية لتسلسلات N- الطرفية لشظايا بروتين متعددة في المحلول. يمكن للمعالجة المحللة للبروتين أن تغير نشاط البروتينات النشطة بيولوجيًا وتكشف أيضًا عن مواقع ربط مشفرة وتولد بروتينات بوظائف جديدة (بروتينات نيوبروتينات) غير موجودة في الجزيء الأصلي. على سبيل المثال ، غالبًا ما تنتج معالجة بروتين المصفوفة خارج الخلية (ECM) شظايا بروتينية متعددة مع توليد مواقع ربط مشفرة وبروتينات نيوبروتينات عن طريق معالجة بروتين ECM موثقة جيدًا. يجب تحديد مواقع الانقسام المضاد للبروتين لفهم وظائف شظايا الانقسام والأدوار البيولوجية للبروتياز بشكل كامل في الجسم الحي. ومع ذلك ، فإن تحديد مواقع الانقسام في البروتينات الجزيئية العالية المعقدة مثل تلك التي تتكون منها ECM ليس بالأمر السهل. إن التسلسل الدقيق N- الطرف للشظايا المحللة للبروتين هي الطريقة المعتادة المستخدمة ، ولكنها تعاني من ضعف تحليل هلام الصوديوم دوديسيل كبريتات-بولي أكريلاميد الكهربائي وهي غير فعالة في تحديد الانقسامات المتعددة ، مما يتطلب تحضير العديد من المواد الهلامية أو شرائح الغشاء للتحليل. لقد طورنا مؤخرًا مطياف الكتلة Amino-terminal الموجهة للركائز (ATOMS) للتغلب على هذه القيود كمكمل لتسلسل N-terminal. تستخدم ATOMS وضع العلامات النظيرية والقياس الطيفي الكمي الترادفي لتحديد مواقع الانقسام بطريقة سريعة ودقيقة. استخدمنا بنجاح ATOMS لتحديد ما يقرب من 100 موقع انشقاق في بروتينات ECM اللامينين والفيبرونيكتين. المقدم هنا هو بروتوكول مفصل خطوة بخطوة لـ ATOMS.


المبدأ

يسمح تحلل Edman بتحديد ترتيب الأحماض الأمينية (تسلسل الأحماض الأمينية) في الببتيد عن طريق التجميع النهائي المتكرر. تتكسر سلسلة الببتيد تدريجياً. يتم استخدام هذا التفاعل لتحديد ن - حمض أميني طرفي من الببتيد ويتكون من تفاعل الببتيد مع فينيل أيزوثيوسيانات ، والذي يُعرف أيضًا باسم كاشف إيدمان.

لأن كل حمض أميني له بقايا مختلفة ر ، كل منها يشكل مشتق فينيل ثيوهيدانتوين مختلف (مشتق PTH). ال ن- ينفصل الحمض الأميني الطرفي كمشتق PTH يتم تحديده بواسطة كروماتوغرافيا بالمقارنة مع معيار. يمكنك إجراء المزيد من التحلل على التوالي على نفس البروتين (تم اختصاره مسبقًا بواسطة حمض أميني في ن النهاية الطرفية) وبالتالي تحديد تسلسل الأحماض الأمينية تدريجيًا. أ منظم هو جهاز آلي يسمح بالتنفيذ غير المراقب لما يصل إلى 50 دورة تدهور. نظرًا لأن التفاعل يتواصل مع عائد نسبي يبلغ 98 ٪ ، فمن ناحية ، تزداد المشتقات المتأصلة من الدورات السابقة ومن ناحية أخرى منتجات الانقسام غير المرغوب فيها للبروتينات التي خضعت لدورة انقسام واحدة أو أكثر مع كل دورة ، بحيث بعد بحد أقصى 50 دورة ، تصبح نسبة الإشارة إلى الضوضاء غير مقروءة. تستغرق الدورة من ساعة إلى ثلاث ساعات ، حسب المتغير.


آلية

يتفاعل Phenylisothiocyanate مع مجموعة أمينية طرفية غير مشحونة ، في ظل ظروف قلوية معتدلة ، لتشكيل مجموعة دورية فينيل ثيوكاربامويل المشتق. ثم ، في ظل الظروف الحمضية ، يتم شق هذا المشتق من الحمض الأميني النهائي كمشتق ثيازولينون. يتم بعد ذلك استخلاص الحمض الأميني ثيازولينون بشكل انتقائي إلى مذيب عضوي ومعالجته بالحمض لتكوين مشتق من الأحماض الأمينية (PTH) الفينيل ثيوهيدانتوين الأكثر استقرارًا والذي يمكن تحديده باستخدام الكروماتوجرافيا أو الرحلان الكهربي. يمكن بعد ذلك تكرار هذا الإجراء مرة أخرى لتحديد الحمض الأميني التالي. العيب الرئيسي لهذه التقنية هو أن الببتيدات التي يتم تسلسلها بهذه الطريقة لا يمكن أن تحتوي على أكثر من 50 إلى 60 وحدة بنائية (وعمليًا ، أقل من 30). طول الببتيد محدود بسبب الاشتقاق الدوري لا يكتمل دائمًا. يمكن حل مشكلة الاشتقاق عن طريق شق الببتيدات الكبيرة إلى ببتيدات أصغر قبل متابعة التفاعل. إنه قادر على تسلسل ما يصل إلى 30 من الأحماض الأمينية بدقة باستخدام آلات حديثة قادرة على كفاءة تزيد عن 99٪ لكل حمض أميني. تتمثل ميزة تدهور Edman في أنه يستخدم فقط 10-100 بيكو مول من الببتيد لعملية التسلسل. تفاعل انحلال Edman مؤتمت لتسريع العملية. [2]


انحطاط ادمان

انحطاط ادمانتم تطويره بواسطة Pehr Edman ، وهي طريقة لتسلسل الأحماض الأمينية في الببتيد. في هذه الطريقة ، يتم تمييز البقايا الأمينية الطرفية وتشقها من الببتيد دون الإخلال بالروابط الببتيدية بين بقايا الأحماض الأمينية الأخرى.

آلية تدهور إدمان

يتفاعل Phenylisothiocyanate مع مجموعة أمينية طرفية غير مشحونة ، تحت ظروف قلوية معتدلة ، لتشكيل فينيل ثيوكاربامويل المشتق. ثم ، في ظل الظروف الحمضية ، يتم شق هذا المشتق من الحمض الأميني النهائي كمشتق ثيازولينون. يتم بعد ذلك استخلاص الحمض الأميني ثيازولينون بشكل انتقائي في مذيب عضوي ومعالجته بالحمض لتكوين مشتق من الأحماض الأمينية (PTH) الفينيل ثيوهيدانتوين الأكثر استقرارًا والذي يمكن تحديده باستخدام الكروماتوجرافيا أو الرحلان الكهربي. يمكن بعد ذلك تكرار هذا الإجراء مرة أخرى لتحديد الحمض الأميني التالي. العيب الرئيسي لهذه التقنية هو أن الببتيدات التي يتم تسلسلها بهذه الطريقة لا يمكن أن تحتوي على أكثر من 50 إلى 60 وحدة بنائية. وذلك لأن تفاعل تدهور Edman ليس فعالًا بنسبة 100٪ ، مما يعني أن خطوة الانقسام لا تحدث في كل مرة. ومع ذلك ، يمكن حل هذه المشكلة عن طريق شق الببتيدات الكبيرة إلى ببتيدات أصغر قبل متابعة التفاعل. إنه قادر على التسلسل الدقيق لما يصل إلى 30 من الأحماض الأمينية بكفاءة 98٪ لكل حمض أميني. تتمثل ميزة تدهور Edman في أنه يستخدم فقط 10 - 100 بيكومول من الببتيد لعملية التسلسل. تفاعل انحلال Edman مؤتمت لتسريع العملية. & # 911 & # 93


ما هو انحطاط ادمان؟

انحطاط ادمان، غالبًا ما يشار إليها باسم تسلسل N-terminal أو تسلسل Edman ، هي عملية معروفة لتحديد الحمض الأميني N-terminal للبروتين ويظل نهجًا فريدًا يمكن أن ينتج بيانات تسلسل بروتين جديد. إنها أيضًا التقنية المفضلة لتأكيد التعبير السريع للبروتين.

تم تقديم كيمياء هذا النهج لأول مرة في عام 1950 من قبل P. تعمل البروتينات المنتجة داخل الخلايا الفردية كهرمونات وأنزيمات ومنظمات مهمة أخرى. يمكن أن يكون للطفرة الجينية التي تؤدي إلى بروتين غير طبيعي عواقب صحية خطيرة.

يتم شق الحمض الأميني N- طرفي عن طريق المعالجة بواحد من عدة كواشف ، ثم يتحلل بالماء لتشكيل حمض أميني منفصل. يحدد كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة أو HPLC أو الرحلان الكهربائي حجم الحمض الأميني ويقارنه بمعيار الحجم المعروف. يمكن شق الطرف الجديد N-terminal للبروتين المتبقي بالمثل لتحديد الهوية.

قادت شركة أبلايد بيوسستمز (Applied Biosystems) تطوير عملية تحلل Edman الأوتوماتيكي ، والتي تربط البروتين المنقى بغشاء ويعالجها بفينيل أيزو ثيوسيانات. يتم حقن الحمض الأميني المجاني & # 8217s تلقائيًا في نظام HPLC لتحديد الهوية.

يتفاعل Phenylisothiocyanate مع مجموعة أمينية طرفية غير مشحونة ، تحت ظروف قلوية معتدلة ، لتشكيل مشتق فينيل ثيوكاربامويل دوري. ثم ، في ظل الظروف الحمضية ، يتم شق هذا المشتق من الحمض الأميني النهائي كمشتق ثيازولينون. يتم بعد ذلك استخلاص الحمض الأميني ثيازولينون بشكل انتقائي إلى مذيب عضوي ومعالجته بالحمض لتكوين مشتق من الأحماض الأمينية (PTH) الفينيل ثيوهيدانتوين الأكثر استقرارًا والذي يمكن تحديده باستخدام الكروماتوجرافيا أو الرحلان الكهربي. يمكن بعد ذلك تكرار هذا الإجراء مرة أخرى لتحديد الحمض الأميني التالي. العيب الرئيسي لهذه التقنية هو أن الببتيدات التي يتم تسلسلها بهذه الطريقة لا يمكن أن تحتوي على أكثر من 50 إلى 60 وحدة بنائية.

قادت شركة أبلايد بيوسستمز (Applied Biosystems) تطوير عملية تحلل Edman الأوتوماتيكي ، والتي تربط البروتين المنقى بغشاء ويعالجها بفينيل أيزو ثيوسيانات. يتم حقن الحمض الأميني المجاني & # 8217s تلقائيًا في نظام HPLC لتحديد الهوية. N- (9-فلورينيل ميثوكسي كاربونيلوكسي) سكسينيميد (CAS No. 82911-69-1) بالاشتراك مع Isothiocyanate لإجراء تحلل جزئي ل Edman على الببتيدات النشطة بيولوجيًا. نظرًا لأن تحلل Edman ينشأ من الطرف N للبروتين ، فلن يعمل إذا تم تعديل الحمض الأميني N- طرفي كيميائيًا أو إذا تم إخفاؤه داخل جسم البروتين.

يجب أن تكون البروتينات نقية وخالية من الملوثات لتحديد الحمض الأميني N-terminal بدقة. تتطلب حدود تدهور Edman جزيئات بروتينية كبيرة مجزأة إلى سلاسل ببتيد صغيرة لم تعد 50 حمض أميني.


الملخص

تعكس بروتينات الخلايا والأنسجة والكائنات الحية العمليات الخلوية النشطة وتتغير باستمرار استجابةً للإشارات داخل الخلايا وخارجها. يجب أن يوفر التنميط الكمي العميق للبروتين ، خاصة إذا تم دمجه مع قياسات mRNA والمستقلب ، رؤية غير مسبوقة لحالة الخلية ، وكشف عن وظائف وتفاعلات مكونات الخلية بشكل أفضل. يجب أن يستفيد التشخيص الجزيئي واكتشاف العلامات الحيوية بشكل خاص من التحديد الكمي الدقيق للبروتينات ، لأن الأمراض المعقدة مثل السرطان تغير وفرة البروتين وتعديلاته. في الوقت الحالي ، يعد قياس الطيف الكتلي للبندقية التقنية الأساسية لتحديد البروتين عالي الإنتاجية وتحديد كميته في حين أنه قوي ، إلا أنه يفتقر إلى الحساسية والتغطية العالية. نرسم أوجه تشابه مع تسلسل الجيل التالي من الحمض النووي ونقترح استراتيجية ، تسمى التسلسل الفلوري ، لتسلسل الببتيدات في عينة بروتين معقدة على مستوى الجزيئات المفردة. في النهج المقترح ، يتم تصور الملايين من الببتيدات الفردية ذات العلامات الفلورية بالتوازي ، مع مراقبة أنماط التغيير المتغيرة لشدة التألق حيث تتم إزالة الأحماض الأمينية N-terminal بشكل متسلسل ، وباستخدام تواقيع التألق الناتجة (التتابعات الفلورية) لتحديد الببتيدات الفردية بشكل فريد. نقدم أساسًا نظريًا للتسلسل الفلوري ، وباستخدام المحاكاة الحاسوبية لمونتي كارلو ، نستكشف جدواها ، ونتوقع الأخطاء التجريبية الأكثر احتمالًا ، ونقيس تأثيرها المحتمل ، ونناقش الفائدة المحتملة الواسعة التي تقدمها تقنية تسلسل الببتيد عالي الإنتاجية.


استنتاج

تم عزل مركب ببتيد شحمي جديد من 5812-A / C. ستربتوميسيس ص. INA-5812 ووجد أن له خصائص هيكلية ووظيفية مماثلة للمضادات الحيوية التجارية الأخرى ، بما في ذلك نظيره الهيكلي المفترض دابتومايسين. تم العثور على بعض الاختلافات الوظيفية الرئيسية بالمقارنة مع الدابتومايسين ، بما في ذلك التأثير المباشر على الغشاء الخلوي ، يليه نفاذية سريعة وتأثير قوي للجراثيم على السكان المستهدفين. علاوة على ذلك ، كان 5812-A / C قادرًا بشكل فريد على تثبيط استقلاب الخلايا البكتيرية المرتبطة بالأغشية الحيوية الناضجة ، وهو أمر مثير للاهتمام فيما يتعلق بالسلالات المقاومة للأدوية المتعددة والعزلات السريرية.


المواد والأساليب

تحضير البروتين المسمى

المسمى [14 ج] الجلوتاثيون بشكل موحد ستم تحضير -transferase (GST) على النحو التالي. تم استخدام بلازميد الحمض النووي المحتوي على الفأر GST Yc (19) ، والذي قدمه T. Bammler (جامعة واشنطن ، سياتل) ، لتحويل خلايا BL21 (DE3) من الإشريكية القولونية. نمت البكتيريا التي تؤوي ناقل GST لمدة 26 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز ، في M9 متوسط ​​أدنى يحتوي على الأمبيسلين (50 ميكروغرام / مل). تم نقل ميكرولتر واحد من مزرعة الخلية هذه إلى 200 ميكرولتر من وسط M9 يحتوي على 85 ميكروليتر (1 Ci = 37 GBq) د - [U- 14 C] جلوكوز (323 ميكروليتر / مليمول أميرشام فارماسيا) مع 350 ميكروغرام من الجلوكوز d nonlabeled. تم تحضين الثقافة عند 37 درجة مئوية مع الرج حتى OD600 بلغ 0.5-1.0. تم بعد ذلك تحفيز إنتاج GST المؤتلف عن طريق إضافة isopropyl β- d -thiogalactopyranoside (IPTG) إلى تركيز نهائي قدره 1 ملي مولار. نمت البكتيريا لمدة 12 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز وحصادها بالطرد المركزي عند 2000 جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تم إعادة تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من جدار الخلية الذي يعطل كاشف BugBuster (Novagen) مع نوكلياز Benzonase (Novagen) لتقليل اللزوجة. تم اهتزاز الخلايا برفق عند درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة ، وتم طرد المعلق عند 16000 × ز لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تم تطبيق المادة الطافية على حبات الجلوتاثيون سيفروز 4B (75 ميكرولتر حجم السرير سيجما) في أنابيب إيبندورف ، والتي تمت معايرتها في المخزن المؤقت A (50 ملي مولار من Tris⋅HCl ، ودرجة الحموضة 7.4 / 200 ملي كلوريد الصوديوم / 0.5 ملي مولار DTT) ، وحضنت لمدة 35 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تم طرد المعلق عند 500 جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتم التخلص من المادة الطافية. تم غسل الحبيبات أربع مرات باستخدام 1 مل من المخزن المؤقت أ. تمت التصفية من [14 درجة مئوية] GST ثلاث مرات باستخدام 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت B (200 ملي مولار من Tris⋅HCl ، ودرجة الحموضة 9.0 / 50 ملي مولار مخفض الجلوتاثيون) عند 4 درجات مئوية وشطف. تم تجميعها. تم استبدال المخزن المؤقت بـ PBS يحتوي على 0.5 ملي مولار DTT باستخدام Microcon 10 (ميليبور). تم تحديد تركيز [14 C] GST المسمى بشكل موحد عن طريق تحليل SDS / PAGE مع تلطيخ الفضة باستخدام ضريبة السلع والخدمات غير الملصقة كمعيار. تم تحديد تركيز GST القياسي من خلال تحليل الأحماض الأمينية. تم استخدام Scion Image (Scion ، Frederick ، ​​MD) لهذا التحليل الكمي. تم استخدام Wallac 1409 LSC (Wallac ، Gaithersburg ، MD) لتحديد النشاط المحدد.

تخليق عشوائي للخرز الببتيد.

تم تصميم حبات الببتيد لإطلاق كميات متساوية من كل من الأحماض الأمينية الطبيعية مع كل دورة Edman. تقترن مخاليط الفلورينيل ميثوكسي كاربونيل-الأحماض الأمينية (Fmoc ، 5 مكافئ) مع TentaGel NH2 الراتنج (0.26 مليمول / غرام Rapp Polymere ، Tübingen ، ألمانيا) باستخدام طريقة 1،3-diisopropylcarbodiimide / 1-hydroxybenzotriazole (5 eq) (20). تمت إزالة مجموعات Fmoc بمحلول 25 ٪ بيبريدين / ثنائي ميثيل فورماميد (DMF) وتم إجراء تفاعل اقتران تدريجي حتى تم الحصول على حبيبات ببتيد 10 مير. بعد إزالة Fmoc ، تم غسل حبات الببتيد العشوائية بـ DMF ، والميثانول ، وثاني كلورو ميثان ، وتجفيفها تحت ضغط.

تسلسل البروتين.

تم إجراء تسلسل البروتين الآلي على جهاز تسلسل 477A مجهز بنظام 120A HPLC (أنظمة بيولوجية مطبقة PE). تم الحصول على جميع الكواشف والمذيبات المستخدمة في جهاز التسلسل من PE Applied Biosystems وفحصها لمحتوى 14 C بواسطة AMS قبل الاستخدام. تم تخفيف محلول [14 درجة مئوية] GST إلى تركيزات من 10-1000 آمول / ميكرولتر مع 0.1٪ TFA في ماء يحتوي على β-lactoglobulin (2.5 ميكرولتر / ميكرولتر). تم تحديد تركيز كل محلول [14 درجة مئوية] GST مخفف باستخدام قياس 14 درجة مئوية بواسطة مقياس الدعم الكلي. تم وضع بوليبرين (3.0 مجم) على مرشح زجاجي في غرفة التفاعل وتعريضه لثلاث دورات أولية. قبل إضافة [14 درجة مئوية] GST ، تم تحميل بيتا-لاكتوجلوبولين (25 ميكرولامول) وحبيبات الببتيد (4-7 حبيبات) على مرشح زجاجي وتجفيفها تحت غاز الأرجون. تم تعديل برنامج منظم التسلسل بحيث تم تسليم كمية معروفة من الأحماض الأمينية PTH القياسية إلى دورق التحويل في كل دورة قبل نقل الأحماض الأمينية الأنيلينوثيازولينون إلى الدورق بالإضافة إلى الأحماض الأمينية من حبيبات الببتيد واللاكتوجلوبولين. تم جمع أجزاء HPLC كل 30 أو 60 ثانية في أنابيب ثقافة زجاج البورسليكات (6 × 50 مم) ، والتي تم تحللها بالحرارة قبل استخدامها لإزالة أي كربون متبقي.

إعداد عينة AMS والقياس.

تم جمع كل عينة في أنبوب زجاجي صغير وأضيف 50 ميكرولتر من محلول حامل الكربون (40.0 مجم / مل من ثلاثي البوترين في ميثانول) قبل التجفيف في جهاز طرد مركزي مفرغ للحصول على 1.19 مجم من المادة الحاملة C. تم تحضير ثلاث فراغات حامل ثلاثي ثلاثي البوترين مع كل مجموعة. من الكسور. تم رسم العينات لرسومات AMS كما وصفها Vogel (21). كانت أوقات قياس مقياس الدعم الكلي النموذجية 3 دقائق / عينة ، مع دقة عد من 1.4-2.0٪ و SD بين 3-7 قياسات من 1-3٪. تم تطبيع نسب 14 C / 13 C للمجهول لقياسات أربعة معايير معدة بشكل متماثل لتركيز نظائر معروف (الجامعة الوطنية الأسترالية سكروز المرجع 22).


بير فيكتور إدمان 1916-1977

ولد بير فيكتور إدمان في ستوكهولم ، السويد ، في أبريل 1916 وتوفي في ميونيخ ، FRG ، في مارس 1977. ولد لعائلة محام وتلقى تعليمه في ستوكهولم. في عام 1935 بدأ دراساته الطبية في معهد كارولينسكا وتخرج بمؤهلاته الطبية الأولية في عام 1938. وأصبح مهتمًا بالبحث ، وبعد التخرج واصل العمل في معهد كارولينسكا ، إلى حد كبير في مختبر البروفيسور إريك يوربيس. يبدو أنه علّم نفسه بشكل منهجي الكيمياء العضوية في هذا الوقت من خلال القراءة المكثفة. خلال سنوات الحرب ، توقفت أبحاثه بسبب فترة طويلة من الخدمة في السلك الطبي للجيش السويدي. حصل على درجة الدكتوراه في الطب عام 1946. وكان موضوع أطروحته تنقية وتحليل الأنجيوتنسين من دم الأبقار. تتعلق دراساته السابقة المنشورة بالهيبارين والسكرتين ، والتي كانت من اهتمامات معلمه يوربس.

في هذا المنعطف ، بدأ إدمان في اتخاذ اتجاه البحث المستقل الذي اتبعه دون انقطاع تقريبًا لبقية حياته المهنية. قبل منحة للعمل لمدة عام في مختبر Northrop-Kunitz في فرع Princeton من معهد Rockefeller للأبحاث الطبية. تم عزل البحوث الطبية السويدية خلال الحرب وكان حريصًا على معرفة التقدم المحرز في الولايات المتحدة. علاوة على ذلك ، جعله عمله على الأنجيوتنسين يدرك أن التحليل التركيبي البسيط لن يكون مفيدًا في توفير أساس لفهم الوظيفة البيولوجية للببتيدات أو البروتينات. بدأ إدراك أن البروتينات ليست غرويات ولكن لكل منها وزن جزيئي محدد وبنية معينة في الظهور ، خاصة نتيجة لعمل مجموعة أوبسالا. عرف إيدمان أن ترتيب الأحماض الأمينية المرتبطة بروابط الببتيد كان جزءًا أساسيًا من التركيب الفريد لأي بروتين معين. في برينستون ، بدأ تجارب لمحاولة إيجاد طريقة لفك تشفير تسلسل الأحماض الأمينية للبروتينات كيميائيًا.

في السنوات الأولى من محاولات إدمان في هذا المجال ، تم استخدام إجراءين عامين لمهاجمة مشكلة التسلسل. تم العثور على العديد من الكواشف المفيدة في وضع العلامات على aminoterminal (أو الأول) aminoacid من خلال مجموعته الأمينية التفاعلية والسماح بالتعريف كمشتق. أحد هذه الكواشف ، فلورودينيتروبنزين (FDNB) ، الذي أعطى مشتق ثنائي نتروفينول (DNP) من أمينوترمينوس ، استخدمه سانجر في عمله التاريخي على بنية الأنسولين. باستخدام تفاعل FDNB مع مجموعات من الببتيدات المتداخلة المشتقة من الانقسام الجزئي للأنسولين ، كان Sanger ، بحلول عام 1956 ، قادرًا على استنتاج بنية فريدة لجزيء الأنسولين. كان هذا هو أول هيكل أساسي لبروتين يتم فك تشفيره ، ولكن على الرغم من الأهمية التي لا شك فيها لهذا العمل الفذ ، كان من الواضح أن الطريقة كانت مرهقة للغاية بحيث لا يمكن تطبيقها على نطاق واسع.

كاشف آخر يستخدم لتقدير أمينوتيرمينال هو فينيل أيزوسيانات (PIC) ، تم إدخاله لهذا الغرض بواسطة Abderhalden و Brockmann في عام 1930. كما هو الحال مع FDNB ، دمر التحلل المائي لتحرير مشتق aminoacid aminoterminal العديد من روابط الببتيد الأخرى ، تاركًا البروتين المتبقي عديم الفائدة للتحليل. في برينستون ، أدرك إيدمان أنه إذا تم استخدام فينيل أيزو ثيوسيانات (PITC) ، فإن الكبريت النيوكليوفيلي سيضعف رابطة الببتيد المجاورة ، مما يزيد من إمكانية إيجاد ظروف لتحللها المائي لا تشق باقي الجزيء. يمكن بعد ذلك إخضاع هذا الببتيد المتبقي لتفاعل ثانٍ مع PITC ويتم تحديد الحمض الأميني الثاني ، وهكذا نظريًا إلى الطرف الكربوكسي تيرمينال للجزيء. ما إذا كان إيدمان قد فكر في هذا الحل بشكل مستقل تمامًا ، أو ما إذا كانت بعض الأوراق غير ذات الصلة التي تم الكشف عنها في قراءته الواسعة قد لفتت انتباهه ، أو ما إذا كان بعض الزملاء في برينستون أو ستوكهولم اقترحوا أن استخدامها غير معروف. في ضوء النجاح الذي حققه رد الفعل في نهاية المطاف ، يبدو أن هذا الأخير غير مرجح في غياب أي ادعاءات أو ذكريات بهذا المعنى. في مراجعته لطرق تسلسل الأحماض الأمينية المكتوبة في عام 1969 ، كان إيدمان في مأزق للتأكيد على أن تفاعل PITC لم يكن مشتقًا على الإطلاق من تفاعل PIC السابق ، حيث كان لديهم آليات عمل مختلفة. ومع ذلك ، في ضوء أوجه التشابه السطحية بين الكواشف والاستخدامات المماثلة التي تم وضعها في كيمياء البروتين ، يبدو هذا متوترًا بعض الشيء. بحلول الوقت الذي عاد فيه إدمان إلى السويد في عام 1947 ، كان قد أجرى تجارب كافية ليعرف أن الفكرة قابلة للتطبيق ويمكن أن تشكل أساسًا لتقنية تسلسل البروتين.

تولى إيدمان أستاذًا مشاركًا في Lund واستمر في العمل بشكل حصري تقريبًا على تدهور البروتين. أثبت المشتق الناتج عن اقتران PITC مع aminoacid ، 3-phenyl-2-thiohydantoin (PTH) aminoacid ، أنه مركب مستقر في جميع الحالات تقريبًا. قام Edman بتجميع مشتقات PTH لجميع الأحماض الأمينية الموجودة في البروتينات وطور أنظمة كروماتوجرافية لتحديد وقياس شروط اقتران PITC مع aminoterminus وانقسام مشتق PTH الذي يعمل بسلاسة لجميع روابط الببتيد. بعد عامين من العمل ، تمكن إيدمان من نشر التفاصيل الكيميائية لطريقة قادرة ، من الناحية النظرية ، على حل مشكلة البنية الأولية للبروتينات وتوفير المعلومات الأساسية حول عدد لا يحصى من البروتينات الضرورية لمزيد من التقدم في الكيمياء الحيوية للبروتين. جعلها أطياف امتصاص الأشعة فوق البنفسجية المميزة للأحماض الأمينية PTH مناسبة بشكل خاص للدراسات الكمية. سمح بقياسات مفيدة لبنية الوحدة الفرعية والوزن الجزيئي للبروتينات ، وبالاقتران مع كروماتوجرافيا العمود ، كان بديلاً لتفاعل النينهيدرين لتحليل الأحماض الأمينية. ومع ذلك ، لا يمكن استغلال هذه الاحتمالات بالكامل حتى التطورات الأخيرة في الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء. أصبحت الطريقة معروفة على نطاق واسع وأعطيت اسم "تدهور إدمان" من قبل كاي ليندرستروم-لانج من مختبرات كارلسبرج.

في أوائل الخمسينيات من القرن الماضي ، توفي السيد 'Jack' Holt ، مدرب خيول السباق الفيكتوري المعروف ، وكانت وصيته شريطة أن يتم استخدام الدخل من ممتلكاته ، الذي سيتم الاحتفاظ به على سبيل الثقة ، في الأبحاث الطبية في مستشفى سانت فنسنت في ملبورن . بحلول عام 1956 ، قررت سلطات المستشفى إنشاء مؤسسة بحثية منفصلة في المستشفى بدلاً من صرف الأموال كمنح بحثية لوحدات المستشفى القائمة. كما تم اتخاذ القرار لتطوير مجال العلوم الأساسية غير السريرية ، ويفضل الكيمياء الحيوية. كان لكلية الأبحاث الطبية ، كما كانت تُعرف في الأصل ، مجلس إدارتها الخاص بها ولأغراض عملية تعمل بشكل مستقل عن إدارة المستشفى.

تقدم إدمان لشغل منصب مدير البحوث. من الواضح أنه كان المرشح المتميز وعلاوة على ذلك تزامنت اهتماماته مع تفضيل الكيمياء الحيوية كمحور تركيز المدرسة. في عام 1957 قبل إيدمان عرض منصب أول مدير للأبحاث في كلية سانت فنسنت للأبحاث الطبية في ملبورن. يجب أن تكون أسبابه لهذه الخطوة ، والتي قيل أنها كانت مزيجًا من عدم الرضا العام عن الموارد العلمية في لوند والانهيار الوشيك لزواجه ، قوية ولم تكن موجهة في المقام الأول لتحسين الحياة المهنية. لقد أنجز للتو قطعة متميزة من الأبحاث البيوكيميائية الفردية التي كان من شأنها أن تجعله موضع ترحيب في العديد من المراكز الرائدة في نصف الكرة الشمالي. في أستراليا ، في ملبورن ، سيكون معزولًا إلى حد كبير عن هذه المراكز ، كانت المدرسة مؤسسة جديدة ، بدون تقاليد ، ولا عمال راسخين ، ولا أي طاقم دعم ، وعلى الرغم من أنها تقع في مستشفى تعليمي بجامعة ملبورن ، إلا أنها لم يكن لديها الانتماء الأكاديمي أو الجامعي. علاوة على ذلك ، لم تكن أستراليا في ذلك الوقت معروفة بتمويل حكومي سخي للأبحاث. على الرغم من هذه المجموعة الهائلة من المثبطات ، قرر إدمان الانتقال بمفرده إلى ملبورن لمواصلة عمله ، في البداية بدون مساعدة مدربة وبدون زملاء مقربين.

في أستراليا ، أكمل إيدمان عددًا قليلاً من المشاريع الصغيرة حول جوانب أخرى من بنية البروتين التي كان قد بدأها في السويد ، ولكنه عمل بشكل شبه كامل على تحلل فينيل أيزو ثيوسيانات (PITC). انقسم هذا العمل إلى ثلاث مراحل: التحسينات في ظروف التدهور ، والتي تركز بشكل كبير على التخلص من "أتمتة" التفاعلات الجانبية لتسلسل التفاعل وتطبيق التدهور على مشاكل التسلسل المختلفة. تداخلت المرحلة الأخيرة مع المرحلتين الأخريين وعادة ما تضمنت اهتمامات العلماء الزائرين الذين جاءوا إلى مختبر إدمان لتعلم أو استخدام تقنيته.

بحلول 1960-1961 ، كان تفاعل التحلل ثلاثي المراحل قد تم إتقانه بشكل أساسي. اقترح تطبيقه العالمي وطبيعته المتكررة على جي إس بيغ ، مساعد إيدمان الفني الأسترالي ، أنه سيكون مناسبًا للأتمتة. أدرك إيدمان أن عدد البروتينات الموجودة (حوالي عشرة ملايين) جعلت التسلسل اليدوي مهمة مستحيلة وتم تحويلها بسرعة إلى فكرة الأتمتة. كما أن التحكم الدقيق في ظروف التفاعل الممكنة مع الأتمتة أعطى وعدًا بإنتاج متكرر أعلى وأكثر ثباتًا مما كان ممكنًا يدويًا. الغلة المتكررة عالية ضرورية للعمليات المتكررة ، سواء كانت تركيبية أو متحللة. كان جيفري بيج أحد أوائل الموظفين الفنيين الذين وظفهم إدمان بعد وصوله إلى ملبورن. لم يكن لديه مؤهلات رسمية ولكن من خلال مجموعة من الدورات في الكلية التقنية والتعليم الذاتي حقق خبرة رائعة في الكيمياء العملية ونفخ الزجاج والهندسة الميكانيكية والإلكترونيات. قدم مشروع التسلسل فرصة مثالية لاستخدام هذه المواهب المتعددة التي أكملت المعرفة الأكاديمية والنظرية لإدمان. عمل Edman and Begg كفريق واحد في مشروع أتمتة التسلسل ، مع عدم وجود مدخلات مستمرة من العمال الآخرين. كان من المعتاد في نهج إيدمان الشامل لجميع المهام أنه أصبح صانع أدوات ماهرًا بدرجة كافية في هذه الفترة للقيام بالكثير من التركيب والتحويل.

تم تطوير أساس ما كان سيصبح مُتسلسل البروتين إلى مرحلة النموذج الأولي في فترة أسابيع قليلة في خريف عام 1961 - الكوب الزجاجي يدور على محوره الأسطواني ، إضافة الكواشف عبر قسطرة ، تفاعلات في سائل رقيق فيلم على جدار الكوب الدوار ، وعمليات الاستخراج بواسطة المذيب تتحرك لأعلى فوق الفيلم إلى أخدود. في غضون عامين ، بنى إدمان وبيغ ، في ورشة عملهم الخاصة ، آلة قادرة على تنفيذ ردود أفعال التدهور بشكل موثوق. لقد وجدوا ظروفًا وكواشف جديدة مناسبة للظروف الفيزيائية لكوب الغزل ، على سبيل المثال ، تتطلب الكوب المفتوح عمومًا مواد كيميائية أقل تطايرًا ، وتطلب التوصيل الضيق وأنابيب الصرف اهتمامًا خاصًا بالتوتر السطحي والخصائص الانسيابية للمذيبات. مكنت معرفة إيدمان الواسعة بالكيمياء العضوية الكلاسيكية من إحراز تقدم سريع في تحويل التفاعل اليدوي إلى شكله الآلي. في عام 1964 ، أبلغ إدمان النتائج الأولية التي توصل إليها إلى اجتماع في اسكتلندا. في عام 1967 في العدد الأول من المجلة الأوروبية للكيمياء الحيوية نشر مع بيج كمؤلف مشارك ورقته البحثية النهائية التي توضح تحديدًا آليًا غير منقطع للحمض الأميني الستين من الأحماض الأمينية من ميوغلوبين الحوت الأحدب بمعدل بقايا واحدة في الساعة. يمكن قياس مدى هذا التقدم من خلال معرفة أنه في ذلك الوقت كان التدهور اليدوي الأكثر شمولاً يشمل حوالي خمسة عشر بقايا بمعدل واحد في اليوم. لم تستطع العديد من المختبرات إثبات التدهور اليدوي على الإطلاق ، بسبب الفشل في تقدير أهمية الكواشف النقية في القضاء على التفاعلات الجانبية. خلال السنوات القليلة التالية ، كان هدف Edman هو تحسين العائد المتكرر الذي تم الحصول عليه من الجهاز ، حيث تم حساب زيادة من 98٪ من ورقة 1967 إلى 99٪ لمضاعفة طول التسلسل القابل للتحديد. ظل مُتسلسل البروتين في ملبورن فريدًا حتى أواخر عام 1969 عندما طرحت شركة Beckman Instrument Company في الولايات المتحدة إصدارًا تجاريًا يعتمد على تصميم Edman في السوق. لم يلعب إدمان أي دور في تسويق أجهزته. ناقش مجلس المدرسة إمكانيات تسجيل براءات الاختراع ولكن سرعان ما قبل وجهة نظر إدمان القوية بأنه يجب أن ينشر بالكامل دون حماية براءات الاختراع. تم انتخاب إيدمان زميلًا في الأكاديمية الأسترالية للعلوم عام 1968 وزميلًا في الجمعية الملكية بلندن عام 1974. وأصبح إدمان مواطنًا أستراليًا في منتصف الستينيات.

في عام 1972 استقال إدمان من كلية سانت فنسنت للأبحاث الطبية وأصبح مدير كيمياء البروتين 1 في معهد ماكس بلانك للكيمياء الحيوية في مارتينسريد بالقرب من ميونيخ. في عام 1968 كان قد تزوج من زوجته الثانية أغنيس هينشن التي أتت من ستوكهولم وقد منحه ذلك سببًا للتفكير في العودة إلى أوروبا. في السنوات العشر التي تلت وصوله في عام 1957 ، ظلت المدرسة صغيرة ، وقد أثبتت محاولات رفع الدعم للتوسع على أساس نجاح مشروع التسلسل عدم نجاحها. الآن ، كما كان الحال قبل سنوات عديدة في لوند ، كان يعتقد أن أهمية عمله لم يتم الاعتراف بها بشكل صحيح وأنه سيظل لديه موارد غير كافية في ملبورن. يبدو أن الانتقال إلى المختبرات الجديدة لمعهد ماكس بلانك يوفر إجابة لاحتياجاته. أنشأ إدمان مختبره في ميونيخ على غرار ذلك الموجود في ملبورن وبنفس الهدف المتمثل في زيادة كفاءة التدهور. In addition, with his aid, Agnes Henschen began to make substantial progress in her studies of fibrinogen structure. Sadly, Edman developed a cerebral tumour and died after a short period of coma in 1977.

Edman played little if any role in broader scientific administration or politics in Australia. Although his School had no formal academic affiliation, there is no evidence that he would not have been accepted in these arenas. Some efforts to arrange a personal appointment at the University of Melbourne came to nothing. Thus he remained something of an enigma in the scientific community. He was slow to publish, with approximately one and a half papers per year during his Australian period, which made difficulties for those wishing to implement the method. If his impact on the Australian scene was limited, it was paradoxically the result of his single-minded pursuit of the sequence degradation. Such work, despite Edman's reputation, was not very attractive to students and he never built up a tradition of a flow of graduate students. Once the initial work on the manual or especially the automated reaction was complete, the details would easily have been completed by others in his or other laboratories. One cannot help thinking that his impact would have been so much greater had he seen himself able to move strongly into new areas of protein structure and function. Biological research often requires the appreciation of the importance of an approximate result for advancement.

Nevertheless the Fellowships of the Australian Academy of Science and the Royal Society of London indicate in how much esteem his work was held internationally, and this judgement has been supported by later events. Technical advances in related fields, especially in liquid chromatography and sensitive ultra violet detectors, have led to the development of low-level or microsequencing techniques which still employ the reactions described by Edman forty years ago and which play an indispensible role in gene isolation and molecular cloning.

Edman's reputation as a reclusive person, often difficult to deal with, did not arise from those who worked with him in the laboratory. He was reserved by Australian standards, but courteous and always helpful, often humorous, and took pleasure in organising social occasions both at his home and outdoors in the country. To those who came to know him in the laboratory two aspects probably had a lasting influence. In those days he was a rare example in the hospitals and the world of Australian medical research of someone who devoted himself full-time to nonclinical research. This served as an example, to those who came across him, of the possibility of such a career. At a time when biochemistry in Australia was largely concerned with the intricacies of metabolic pathways, an area where the great discoveries had already been made, Edman understood and stressed the importance of the information-containing macromolecules. The double helical structure of DNA had been proposed by Watson and Crick only a few years before Edman's arrival in Australia. The possibility of obtaining a corresponding understanding of the more complex structures of proteins which Edman's work opened up inspired his colleagues with the belief that they were in a position to participate directly in a new era of biological investigation. fic basis for consciousness. Cognitive Studies 5, 95-109.


شاهد الفيديو: THE ORDINARY BUFFET SERUM REVIEW - سيروم بوفيه لشد بشرة الوجه سلسلة ذا اورديناري . نجلاء بخش (قد 2022).


تعليقات:

  1. Hamlett

    في ذلك شيء ما. الآن كل شيء واضح ، شكرًا لك على المساعدة في هذا الأمر.

  2. Ciarrai

    لماذا يتم إطلاقه !!!!!!!!

  3. Gabrian

    أنا آسف ، لكن في رأيي ، أنت مخطئ. أنا قادر على إثبات ذلك. اكتب لي في رئيس الوزراء ، ناقشها.

  4. Kale

    يبدو لي الفكر الرائع



اكتب رسالة