معلومة

هل يجب أن تكون هناك مسافة بين فاصل البروتين ومحفز بروتين آخر؟

هل يجب أن تكون هناك مسافة بين فاصل البروتين ومحفز بروتين آخر؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أريد أن أفعل تداخل PCR للحصول على منتج الجين المطلوب الذي أريده. هل يمكنني وضع محفز البروتين الثاني بعد فاصل البروتين الأول مباشرة ، أم يجب أن يكون هناك مسافة بينهما مليئة بقواعد عشوائية ؟!


عدم التحديد

عدم التحديد هي مساعدة الخلية بدائية النواة لإصلاح الإنهاء المبكر لتخليق الحمض النووي الريبي أثناء نسخ الحمض النووي الريبي. يحدث عندما يتجاهل RNA polymerase إشارة الإنهاء ويستمر في إطالة نصه حتى يتم الوصول إلى إشارة ثانية. يوفر Antitermination آلية يمكن بواسطتها تشغيل جين واحد أو أكثر في نهاية المشغل أو إيقاف تشغيله ، اعتمادًا على البوليميراز الذي يتعرف على إشارة النهاية أو لا يتعرف عليها.

تستخدم بعض العاثيات Antitermination لتنظيم التقدم من مرحلة واحدة من التعبير الجيني إلى المرحلة التالية. يرمز جين لامدا N ، لبروتين مضاد للانقراض (pN) ضروري للسماح لـ RNA polymerase بقراءة النهايات الموجودة في نهايات الجينات المبكرة المباشرة. مطلوب بروتين آخر مضاد للإنقراض ، pQ ، لاحقًا في عدوى الملتهمة. يعمل pN و pQ على بوليميراز الحمض النووي الريبي أثناء مروره بمواقع محددة. تقع هذه المواقع في مواقع نسبية مختلفة في وحدات النسخ الخاصة بها.


مقدمة

يشير الإجراء عن بعد إلى تحريض و / أو تعديل معاملة DNA (مثل النسخ) المحفز بواسطة بروتين ربط DNA بعيد عن موقع الربط الأساسي الخاص به. ربما تتضمن العملية حركة مقاطع الكروموسوم التي تجعل موقع الربط الأساسي (على سبيل المثال ، مُحسِّن) في اتصال مع موقع ثانٍ بعيد (على سبيل المثال ، محفز) حيث يتجلى النشاط البيولوجي ، إما في نفس (Choy و Adhya ، 1992 Dunn et al.، 1984 Hochschild and Ptashne، 1986 Nemeth et al.، 2008 Tolhuis et al.، 2002) أو في كروموسوم مختلف (Ling et al.، 2006 Spilianakis et al.، 2005). كانت جميع التقارير المذكورة أعلاه على مراقبة النسخ. السؤال المهم والمثير للاهتمام الذي يدعو إلى التحقيق هو ما إذا كان الإجراء عن بعد يتحكم أيضًا في الخطوات الثلاث لتكرار الحمض النووي وهي البدء والتكرار المستمر والإنهاء.

لقد أظهرنا سابقًا أنه في أنظمة البلازميد بدائية النواة ، تتحكم حلقات الحمض النووي في بدء النسخ المتماثل بشكل إيجابي (Miron et al. ، 1992 Mukherjee et al. ، 1988) وسلبيًا (Zzaman and Bastia ، 2005). لم يتم التحقيق في الدور المحتمل للتفاعلات طويلة المدى بين البروتين والحمض النووي في التحكم في التكاثر في حقيقيات النوى سابقًا. في هذا السياق ، أردنا معالجة السؤال حول ما إذا كان موقعان Ter الموجودان على كروموسومين مختلفين يتحكمان في توقف الشوكة المبرمج عن طريق تفاعلات طويلة المدى بين البروتين والحمض النووي. العمل الحالي يعالج هذا السؤال.

تم توضيح آلية (آليات) إنهاء النسخ المتماثل بشكل أفضل في بدائيات النوى حيث يرتبط بروتين إنهاء النسخ المتماثل بتسلسل Ter محدد لإعاقة حركة الشوكة في الوضع القطبي. تقوم معقدات البروتين المنهي بدائيات النوى بإيقاف تفكيك الحمض النووي المحفز بالهيلياز التكراري في اتجاه واحد ولكنها تسمح للإنزيم الذي يقترب من الاتجاه المعاكس بالمرور دون عوائق (باستيا وآخرون ، 2008 كاول وآخرون ، 1994 Khatri et al. ، 1989 لي وآخرون ، 1989). تناقش مراجعة حديثة بشكل نقدي الوضع الحالي للميدان بما في ذلك النماذج البديلة لآليات إيقاف الشوكة (كابلان وباستيا ، 2009). يحدث توقيف الشوكة القطبية المبرمجة فسيولوجيًا في حقيقيات النوى في الفواصل غير المنقولة من الحمض النووي الريبي من الخميرة إلى الإنسان وفي مواقع أخرى معينة في الكروموسومات ، على الرغم من أنه لا يحتوي بالضرورة على موقع Ter (راجع مراجعات Kaplan and Bastia ، 2009 باستيا وموهانتي 2006). تفضل البيانات الحالية نموذج توقف الشوكة القطبية الذي لا يتضمن فقط تفاعل البروتين المنهي - Ter ولكن أيضًا تفاعلات البروتين البروتين بين بروتين المنهي وإنزيم (إنزيمات) تفكيك الحمض النووي التي تقود الشوكات (Bastia et al. ، 2008 Mulugu et. آل ، 2001). لم يتم توضيح الآلية التفصيلية لتوقيف الشوكة القطبية في حقيقيات النوى حتى الآن ، على الرغم من أن الأدلة غير المباشرة تشير إلى أن الآلية لا تتضمن فقط تفاعلات البروتين المنهي للبروتين-تير ، بل ربما أيضًا تفاعلات البروتين المنهي (Biswas and Bastia ، 2008 Eydmann et al. ، 2008) ).

إلى جانب الفواصل غير المنقولة لـ rDNA (Bastia and Mohanty ، 1996 Bastia and Mohanty ، 2006) ، توجد مواقع Ter أيضًا خارج هذه المواقع ، على سبيل المثال ، أعلى موقع نوع التزاوج Mat1 وفي مواقع أخرى في 3 كروموسومات من S. بومبي (على سبيل المثال ، هذا العمل). تقع محطة النسخ المتماثل في المنبع من موضع تبديل نوع التزاوج S. بومبي يرتبط بالبروتين Rtf1 ويعزز تبديل نوع التزاوج عن طريق منع شوكة النسخ المتماثل من عبور موضع Mat1 من الاتجاه الخاطئ (Dalgaard and Klar ، 2001). توجد ثلاث نهايات نسخ متماثل (Ter1-Ter3) وموقع إيقاف شوكة (FPS4) في منطقة الفاصل غير المنقولة لكل تكرار لـ rDNA S. بومبي (كرينجز وباستيا ، 2004). يرتبط Ter1 ببروتين Sap1 (Krings and Bastia، 2005، 2006 Mejia-Ramirez et al.، 2005) الذي يرتبط أيضًا بموقع تنشيط التبديل (SAS1) الموجود بالقرب من مكان نوع التزاوج Mat1 (Arcangioli and Klar ، 1991) ، ولكن لا توقف الشوكات في موقع SAS1 (Krings and Bastia ، 2005). يرتبط Ter2 و Ter3 من rDNA بـ Reb1 ، وهو بروتين يشبه myb ، والذي لا يعزز فقط توقيف الشوكة القطبية في مواقع الربط (Krings and Bastia ، 2004 Sanchez-Gorostiaga et al. ، 2004) ولكنه أيضًا يعوق النسخ المحفز لـ RNA polymerase I- الاقتراب من الموقع من الاتجاه المعاكس (الشكل 1 أ) (Zhao et al. ، 1997). بروتين Reb1 ثنائي الأبعاد ويحتوي على مجال ثنائي التباين الطرفي N (الشكل 1 ب) يمكن الاستغناء عنه للمستوى الأساسي لتوقف الشوكة في موقع Ter واحد في الجسم الحي (بيسواس وباستيا ، 2008).

أ، يتم عرض تمثيل تخطيطي لمنطقة الفاصل غير المنقولة من rDNA ، ومواقع 3 Ter وموقع الإيقاف المؤقت للشوكة RFP4 ، ويرتبط Ter1 بـ Sap1 و Ter2 و Ter3 يرتبط ببروتينات Reb1 ، وشوكات النسخ المتماثل Ter2 و Ter3 تقترب من اتجاه واحد (الأسهم الحمراء ) ، والنسخ المحفز بواسطة RNA polymerase I من الاتجاه المعاكس (الأسهم الزرقاء) ب، التمثيل التخطيطي لبروتين Reb1 الذي يُظهر المجال ثنائي النواة N-terminal باللون الأخضر ومجالات myb1 المتوقعة باللون الأحمر ، المجال المرتبط myb منطقة Reb1 من بقايا الأحماض الأمينية 156 إلى 418 قادرة على إيقاف شوكات النسخ المتماثل ج، (1) الصور المجهرية التي تُظهر مجالًا من الخلايا في تباين الطور ، نفس الحقل المضاء بطول الموجة الذي يُظهر التألق الأحمر لـ Gar2 ، وهو بروتين نووي ، مضان أصفر-أخضر ينبعث من Reb-GFP وصورة مدمجة لـ Gar2-cherry و يظهر Reb1-GFP في اللوحات (ii) و (iii) و (iv) على التوالي.

في هذا العمل ، نُبلغ عن نتائج جديدة تُظهر أن مواقع Ter المعتمدة على Reb1 في S. pombe لا تعمل بمعزل عن بعضها البعض ولكنها تتواصل بشكل حكيم مع مواقع أخرى من هذا القبيل إما عن طريق حلقات الحمض النووي أو عن طريق التقبيل الكروموسوم الذي ينظم حجم الشوكة المبرمجة فسيولوجيًا. .


نتائج

يقلل متحولة SoxS التنشيط بعيدًا عن الهدف

من الناحية المثالية ، يجب على المنشط النسخي الاصطناعي تنشيط جيناته المستهدفة المبرمجة فقط. مجال التنشيط لنظام CRISPRa الخاص بنا هو SoxS ، وهو مواطن أصلي بكتريا قولونية عامل النسخ الذي يربط الحمض النووي مباشرة وينشط أهداف الجينات الذاتية كجزء من برنامج الاستجابة للضغط 3. لقد أظهرنا سابقًا أن الطفرات النقطية في موقع ربط SoxS DNA يمكن أن تقلل من تنشيط أهداف SoxS الذاتية مع الحفاظ على نشاط CRISPRa في جين مراسل غير متجانسة. ومع ذلك ، فإن أكثر المسوخات ذات النقطة الواحدة فعالية ، R93A و S101A ، لم تلغ تمامًا النشاط في الأهداف الذاتية. لتقليل نشاط SoxS غير المستهدف بشكل أكبر ، قمنا باختبار SoxS مزدوج متحولة (R93A / S101A). احتفظ هذا المتحول المزدوج SoxS بنشاط CRISPRa الكامل وأظهر انخفاضًا في التعبير الجيني المعتمد على SoxS الداخلي إلى مستويات لا يمكن تمييزها عن الخلفية (الشكل 1). وبالتالي ، فإن SoxS (R93A / S101A) هو مؤثر نسخ معياري فعال يمكنه تنشيط التعبير الجيني فقط عند تجنيده إلى الجين المستهدف عبر مجمع CRISPR-Cas.

أ نظام مراسل لقياس نشاط CRISPRa والتعبير الجيني الداخلي المعتمد على SoxS من النوع البري أو بنيات SoxS المتحولة. تم تحديد نشاط CRISPRa في سلالة تؤوي مراسل sfGFP متكامل جينومياً (CD06 ، الجدول التكميلي 1). تم تحديد التعبير الجيني المعتمد على SoxS الداخلي من خلال المراقبة لاكز التعبير من مراسل البلازميدات حيث لاكز كانت مدفوعة من قبل المروجين الخاضعين لرقابة SoxS zwfp و fumCp 44. تم قياس مضان GFP بواسطة قياس التدفق الخلوي و لاكز تم قياس النشاط باستخدام مقايسة β-galactosidase. ب يحافظ SoxS (R93A / S101A) على نشاط CRISPRa ولا ينشط التعبير من التعبير الداخلي من zwfp و fumCp المراسلين. الإسفار و لاكز تم طرح قيم النشاط الأساسي باستخدام سلالة لا تعبر عن سكرنا. كلا مستويات GFP و لاكز تم تطبيع الأنشطة إلى القيم التي لوحظت في السلالة باستخدام SoxS من النوع البري. تمثل القيم المتوسط ​​± الانحراف المعياري المحسوب من ن = 3 عينات مستقلة بيولوجيا. بيانات المصدر الخاصة بـ ب يتم توفيرها كملف بيانات مصدر.

مقياس المسافة للمواقع المستهدفة غير فعال

لتحديد ما إذا كان بإمكاننا تنشيط الجينات الذاتية باستخدام CRISPRa بشكل متوقع ، اخترنا ثلاثة جينات مرشحة مع مواقع PAM في موضع مناسب أعلى المنبع من TSS. في السابق ، أظهرنا أن CRISPRa يمكنها تنشيط المروجين غير المتجانسين حتى 50 ضعفًا مع المواقع المستهدفة الموضوعة داخل نافذة 40 قاعدة بين 60 و 100 قاعدة في اتجاه المنبع من TSS 3. لذلك استهدفنا مجمع CRISPR-Cas لنفس النافذة المنبثقة من الجينات المستهدفة المرشحة. أولاً ، استهدفنا aroK-aroB أوبرون ، الذي يعبر عن الإنزيمات المشاركة في التخليق الحيوي للأحماض الأمينية العطرية ، والتي يمكن أن يكون الإفراط في التعبير المبرمج فيها مفيدًا للإنتاج الحيوي 9. لم ينتج عن استهداف مجمع CRISPR-Cas إلى موقعين ضمن النافذة الأساسية 40 المثلى أي زيادات ذات دلالة إحصائية في التعبير الجيني. علاوة على ذلك ، أعطت المواقع داخل وخارج النافذة الأساسية 40 تأثيرات مماثلة (الشكل 2 أ). بعد ذلك ، استهدفنا سيسك، وهو إنزيم يشارك في التخليق الحيوي للسيستين 10. على غرار ما لاحظناه aroK-aroB، استهداف ثلاثة مواقع ضمن إطار 40 قاعدة لم ينتج عنه زيادات ذات دلالة إحصائية في التعبير الجيني (الشكل 2 ب). أخيرًا ، استهدفنا ldhA، وهو إنزيم يشارك في التخمر الحمضي المختلط 11. اخترنا ثمانية مواقع ولاحظنا عدم وجود علاقة واضحة بين موقع الموقع المستهدف و ldhA التعبير (الشكل التكميلي 1). تشير هذه النتائج معًا إلى أنه لا يمكن تنشيط الجينات الذاتية ببساطة عن طريق استهداف مجمع CRISPR-Cas للمواقع الواقعة بين 60 و 100 قاعدة من TSS.

أ CRISPRa على aroK-aroB أوبرون. تم اختيار موقعين مستهدفين للـ scRNA داخل النافذة الأساسية 40 حيث تكون CRISPRa فعالة (100 إلى −60) في جينات المراسل غير المتجانسة (A3 – A4) وموقعان آخران في المنبع (A1 – A2) تم اختيارهما من أجل aroKp1 المروجين. ب CRISPRa على سيسك الجين. تم اختيار ثلاثة مواقع مستهدفة للـ scRNA داخل النافذة الأساسية 40 حيث تكون CRISPRa فعالة في جينات المراسل غير المتجانسة (C1-C3) وموقعين آخرين في اتجاه مجرى النهر (C4-C5) cysKp2 المروجين. نتج عن مواقع C4 و C5 قمع استهداف هذه المواقع القريبة من المروج الأساسي قد يتداخل مع ربط بوليميريز الحمض النووي الريبي. تم قياس التعبير الجيني باستخدام RT-qPCR. يمثل تنشيط الطية مستويات التعبير بالنسبة إلى سلالة تعبر عن scRNA خارج الهدف (hAAVS1). في أ و ب، تمثل الأشرطة المتوسط ​​± الانحراف المعياري المحسوب من ن = 4 (C1، C2) ، ن = 3 (A1–4، C4، C5) أو ن = 2 (C3) عينات مستقلة بيولوجيا. يبدو أن بعض التكرارات الفردية في العينات A1–4 و C1–2 تُظهر التنشيط ، لكن ولش ثنائي الذيل غير مقترن ر يشير الاختبار إلى أن متوسط ​​الفروق المتعلقة بالسيطرة غير المستهدفة ليست ذات دلالة إحصائية (ص القيمة & GT 0.05). أدى استهداف CRISPRa إلى C4-5 إلى قمع ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى المسافة القصيرة بين المواقع والمُحفز. تشير النجوم إلى اختلاف ذي دلالة إحصائية عن التحكم خارج الهدف باستخدام ويلش ثنائي الذيل غير المزاوج ر اختبار (**ص القيمة & لتر 0.01). بالضبط ص القيم: A1: 0.18 ، A2: 0.27 ، A3: 0.36 ، A4: 0.17 ، C1: 0.29 ، C2: 0.66 ، C3: 0.098 ، C4: 0.0022 ، C5: 0.00043. يتم توفير بيانات المصدر كملف بيانات المصدر.

هناك العديد من التفسيرات المحتملة لعدم قدرتنا على تنشيط الجينات البكتيرية الذاتية باستخدام كريسبرا. أولاً ، أظهرنا في الأصل تقنية CRISPRa باستخدام مروج اصطناعي ضعيف نسبيًا. تختلف المستويات القاعدية للتعبير عن الجينات الذاتية بشكل ملحوظ 12 ، وقد يكون من الصعب زيادة نسخ الجينات التي تم التعبير عنها بقوة بالفعل 13. بالإضافة إلى ذلك ، قد تتطلب بعض الجينات المستهدفة الذاتية عامل سيغما بديل. يتم التحكم في جين مراسلنا الأصلي بواسطة σ 70 عامل سيغما التدبير المنزلي ، ولا نعرف ما إذا كان نظام CRISPRa لدينا فعالًا في الأهداف الجينية التي تستخدم عوامل سيجما البديلة. الاحتمال الآخر هو أن مواقع ربط منظم النسخ الأصلي بالقرب من محفزات الجينات الذاتية يمكن أن تعطل تقنية CRISPRa. أخيرًا ، ربما تم تبسيط مقياس نافذة المسافة الأمثل الذي حددناه سابقًا. حددنا في البداية النافذة المثلى من تجربة مع مواقع مستهدفة متباعدة عن بعضها بعشر قواعد ، والتي قد لا تكون كافية للتعميم على أي موقع ضمن نافذة 40 قاعدة. لاستكشاف هذه الاحتمالات بشكل منهجي ، شرعنا في اختبار فعالية CRISPRa بمجموعة جديدة من المروجين الاصطناعية المصممة بمستويات التعبير القاعدية المتغيرة ، وعوامل سيغما البديلة ، ومواقع ربط المنظم المتغيرة ، ومواضع موقع الهدف المتغير لـ scRNA.

إن كريسبرا حساسة لقوة المروج

لتقييم ما إذا كانت القوة الجوهرية للمروج تؤثر على CRISPRa ، قمنا باختبار التنشيط على مجموعة من جينات المراسل الفلوري مع الحد الأدنى من المروجين الذي يمتد على مدى 200 ضعف في مستوى التعبير الأساسي (//parts.igem.org) (الشكل 3 أ) ). لاحظنا التنشيط الجيني الأكثر فاعلية باستخدام مروج J23117 ضعيف نسبيًا. مع أضعف المروجين ، لم نتمكن من اكتشاف أي تنشيط ، على الرغم من أن مستويات التعبير الأساسي كانت أضعف من المروج J23117. مع المروجين الأقوى ، لاحظنا تنشيطًا أصغر تدريجيًا بوساطة CRISPRa للتعبير الجيني ، زاد مستوى التعبير الأساسي ، في حين ظل التعبير الأقصى الناجم عن CRISPRa ثابتًا تقريبًا. تشير هذه النتائج إلى أن نشاط CRISPRa البكتيري يختلف اختلافًا كبيرًا مع قوة المروج ، على غرار التأثيرات التي لوحظت في الأنظمة حقيقية النواة 14،15. وبالتالي ، عند استهداف الجينات الداخلية التعسفية ، قد يعتمد مستوى التنشيط الذي يمكن تحقيقه على المستوى الأساسي للتعبير عن مروجها.

أ إن كريسبرا حساسة لقوة المروج. تحتوي المروجين على موقع هدف scRNA عند 81 من TSS لمروج الحد الأدنى المشار إليه J231NN ، على الشريط غير القالب 3. تُظهر اللوحة الموجودة على اليسار الفلورة / OD600 من السلالات التي تعبر عن سكرنا على الهدف أو بعيدًا عن الهدف. تُظهر اللوحة الموجودة على اليمين تنشيط الطية المقاس في كل مروج بالنسبة لتعبير خط الأساس الخاص به باستخدام scRNA خارج الهدف (J206). ب يمكن لـ CRISPRa تنشيط المروجين المنظمين بواسطة عوامل سيجما σ 38 (RpoS) و 32 (RpoH) و 24 (RpoE). تم استبدال المروج الأدنى من البلازميد المراسل بـ sodCp, glnAp2, rdgBp، أو نعم. يتم تمييز المناطق -35 و -10 بالخط العريض. تظهر المؤامرة على اليسار الإسفار / OD600 عندما استهدفت CRISPRa كل مروج في الموقع المستهدف J109 (−80 من TSS على شريط القالب) أو باستخدام scRNA خارج الهدف (hAAVS1 ، المسمى (-)). تُظهر المؤامرة الموجودة على اليمين تنشيط الطية المقاس في كل مروج بالنسبة إلى scRNA خارج الهدف (J206). ج يختلف نشاط CRISPRa اختلافًا كبيرًا بين المروجين بتكوين تسلسل متفاوت بين هدف scRNA والمنطقة 35. تمثل الأشرطة الخضراء الأسفار / OD600 من الثقافات بين عشية وضحاها من المستعمرات الفردية. يمثل الشريط الأزرق الإسفار / OD600 سلالة تعبر عن مراسل J3-J23117-sfGFP ، تم تنشيطه بواسطة CRISPRa باستخدام J306 scRNA. يمثل الشريط الرمادي عنصر تحكم سلبي يعبر عن بلازميد مراسل J3-J23117-sfGFP مع CRISPRa الذي يستهدف موقعًا بعيدًا عن الهدف (J206). د تم منع CRISPRa من ربط مثبط النسخ TetR بموقع مشغل tet (tetO) الموجود في الجزء العلوي من منطقة 35. تمت زراعة الثقافات التي تم فيها استهداف CRISPRa إلى موقع J306 أو إلى موقع خارج الهدف (J206) بين عشية وضحاها في وسائل الإعلام ± 1 ميكرون aTc. في اللوحات أ, ب، و د، تمثل القيم المتوسط ​​± الانحراف المعياري المحسوب من ن = 3 عينات مستقلة بيولوجيا. ج تمثل الأعمدة قيمة ن = 1 عينات مستقلة بيولوجيا. يتم توفير بيانات المصدر كملف بيانات المصدر.

تعد تقنية CRISPRa فعالة مع عوامل سيجما البديلة

يبدأ النسخ البكتيري عن طريق ارتباط عامل سيجما بالمحفز الأدنى و إنزيم بوليميريز RNA 16. يرتبط المنشط SoxS مباشرة بالوحدة الفرعية α من RNA polymerase 17 ، مما يشير إلى أن نظام CRISPRa الخاص بنا يمكن أن يكون متوافقًا مع الجينات التي يتحكم فيها غير. عوامل سيجما التدبير المنزلي. للتحقيق في هذا الاحتمال ، قمنا ببناء مروج اصطناعي ينظمه σ 38 (RpoS) و 32 (RpoH) و 24 (RpoE) و σ 54 (RpoN) للمقارنة مع مروج التدبير المنزلي الأصلي σ 70 (RpoD) (الشكل. 3 ب) 18،19،20،21. تمكنت CRISPRa من تنشيط التعبير الجيني للمراسل عندما استهدفنا المروجين σ 38 و 32 و 24 المعتمد ، فهذه العوامل σ كلها أعضاء في عائلة 70. لم يكن CRISPRa نشطًا على محفز σ 54 ، ربما لأن σ 54 يبدأ التعبير الجيني باستخدام آلية مميزة تتطلب المزيد رابطة الدول المستقلة- العناصر التنظيمية 16. تشير هذه النتائج إلى أن CRISPRa يمكنها تنشيط المروجين الخاضعين لعوامل سيجما غير التدبير المنزلي مثل σ 38 و σ 32 و 24 ، ومن المحتمل أن يكونوا أعضاء آخرين من عائلة σ 70 المتجانسة.

وصفت ورقة بحثية حديثة نظامًا بديلاً لـ CRISPRa قادرًا على تنشيط الجينات المعتمدة على σ 54 ، والتي تشتمل على جزء صغير من الجينوم 8 (الشكل التكميلي 2). يجب أن يؤدي توفر أنظمة CRISPRa المتعددة والمكملة إلى توسيع نطاق CRISPRa البكتيرية.يعمل كلا النظامين بشكل فعال على تنشيط التعبير من المروجين الاصطناعية وغير المتجانسة ، ولكل نظام القدرة على استهداف مجموعة مختلفة وغير متداخلة من الجينات الذاتية.

إن تقنية CRISPRa حساسة للتدخل في تكوين التسلسل

لتحديد ما إذا كان تكوين التسلسل بين الموقع المستهدف وموقع −35 يؤثر على CRISPRa ، قمنا ببناء مكتبة مروج بتسلسلات عشوائية في هذه المنطقة المتداخلة. قمنا بتحليل المستعمرات المفردة من هذه المكتبة ولاحظنا تنشيط الجينات بتوزيع واسع على مدى 27 ضعفًا (الشكل 3 ج). على الرغم من أنه لا يزال من الممكن تنشيط معظم التسلسلات المتغيرة (أكثر من شقين) باستخدام CRISPRa ، إلا أن التباين الكبير في النشاط كان غير متوقع لأن كل جين مراسل كان مدفوعًا بنفس المروج الأدنى واحتوى على نفس موقع scRNA المستهدف. أحد التفسيرات المحتملة لهذه النتيجة هو أن هذه التسلسلات المتداخلة العشوائية تحتوي على مواقع ربط لمنظمي النسخ الداخلي ، وهناك دليل على أن مواقع الربط يمكن أن تظهر بتردد مرتفع نسبيًا من التسلسلات العشوائية. يمكن أن تؤثر هذه المواقع على CRISPRa عن طريق منع الوصول مباشرة إلى موقع هدف scRNA ، أو عن طريق منع ارتباط بوليميريز RNA ، أو عن طريق التداخل مع قدرة بروتين مؤثر CRISPRa على التفاعل مع بوليميريز RNA.

لاختبار الفرضية القائلة بأن مؤثر النسخ المرتبط يمكن أن يعطل CRISPRa ، قدمنا ​​موقعًا ملزمًا لمانع النسخ TetR المنبع للمنطقة −35 23. أدى وجود TetR المرتبط إلى تعطيل تنشيط الجين بوساطة CRISPRa بشكل كبير. علاوة على ذلك ، فإن إضافة anhydrotetracycline (aTc) ، الذي يطلق TetR من الحمض النووي ، أعاد نشاط CRISPRa إلى المستويات التي لوحظت عندما لم يكن TetR موجودًا (الشكل ثلاثي الأبعاد). نظرًا لأن الجينات الذاتية تحتوي على مواقع ربط لمجموعة متنوعة من المنشطات النسخية والمثبطات في بداية المروج الأدنى 24،25 ، فقد يساهم هذا التأثير في التأثيرات غير المتسقة والمتغيرة التي لاحظناها عند استهداف الجينات الذاتية لـ CRISPRa (الشكل 2).

لتحديد ما إذا كانت مواقع ربط عامل النسخ تظهر في مكتبة التسلسلات المتداخلة العشوائية ، قمنا بتسلسل 29 متغيرًا تغطي النطاق الكامل لمستويات التنشيط المرصودة (الجدول التكميلي 6). احتوت خمسة متواليات متداخلة فقط على تطابق تام مع نموذج ربط عامل نسخ إجماعي معروف. ومع ذلك ، احتوت جميع التسلسلات على تطابق واحد على الأقل داخل قاعدة واحدة لعنصر معروف ، ومن الثابت جيدًا أن بروتينات ربط الحمض النووي يمكنها التعرف على المواقع التي تنحرف عن السلبيات 26. لا توجد علاقة ارتباط ذات دلالة إحصائية بين التنشيط الجيني بواسطة CRISPRa وعدد هذه الأشكال (ارتباط ترتيب رتبة سبيرمان صس = 0.29, ص = 0.11 ، الشكل التكميلي 3 أ) ، لكننا نلاحظ أنه من غير المعروف أيًا من هذه الأشكال يرتبط بالفعل بعوامل النسخ الذاتية. لقد وجدنا أن التسلسلات المتداخلة التي تعطي CRISPRa أكثر فعالية تميل إلى أن تكون أكثر ثراءً في GC ، على الرغم من أننا لم نفهم بعد أساس هذا الاتجاه (صس = 0.42, ص = 0.02 ، الشكل التكميلي 3 ب وأمبير ج). ومع ذلك ، تشير هذه التجارب إلى أن تكوين التسلسل المتداخل بين مركب CRISPR-Cas والمحفز الأدنى هو عامل مهم في تحديد مستوى CRISPRa.

تعتمد تقنية CRISPRa بشكل حاد على التحولات الأساسية الفردية

استندت فرضيتنا الأصلية القائلة بأن المواقع المستهدفة المثلى تقع من 60 إلى 100 قاعدة في اتجاه مجرى TSS إلى تجربة مع مواقع scRNA متباعدة كل 10 قواعد 3. لمزيد من اختبار هذه الفرضية ، استهدفنا مجمع CRISPRa إلى نافذة من -61 إلى -113 بدقة أساسية واحدة. استخدمنا الجين المراسل مع خمسة مواقع scRNA تقع في 61 و −71 و −81 و −91 و 101 بالنسبة إلى TSS ، وقمنا بإدخال 1–12 قاعدة منبع موقع −35 لإنشاء مجموعة من المراسل الجينات التي سمحت لمركب CRISPRa باستهداف كل مسافة ممكنة في نافذة الاستهداف الأمثل. باستخدام مجموعة الجينات المراسل هذه ، وجدنا أن تغيير الموقع المستهدف بمقدار 1-3 قواعد تسبب في انخفاض كبير في التنشيط (الشكل 4 أ). أدى تغيير الموقع المستهدف بمقدار 4-9 قواعد إلى تقليل التعبير إلى مستويات لا يمكن تمييزها تقريبًا عن الخلفية. في 10-11 نوبات قاعدية ، والتي تقابل دورة واحدة كاملة لولب الحمض النووي ، زاد التعبير الجيني مرة أخرى. امتد هذا الاعتماد الدوري على الموضع لـ CRISPRa على كامل نافذة 60 إلى 100 ، مع أقوى القمم المتمركزة في 81 و −91 والقمم الأصغر تتركز عند 102 و 70. لا يوجد استرداد للنشاط عندما يتم نقل الموقع في 101 إلى 111 ، خارج النافذة 60 إلى −100. تشير هذه العلاقة الدورية الحادة إلى أن معايير المواقع المستهدفة الفعالة صارمة للغاية ، وأن المسافة والدورية النسبية إلى TSS هي عوامل حاسمة.

أ تعرض CRISPRa اعتمادًا دوريًا لتحديد المواقع مع أنشطة الذروة كل 10-11 قاعدة بين -60 و -100 من TSS. تم إنشاء جينات المراسل عن طريق إدخال 0-12 قاعدة في المنبع من منطقة 35 لمراسل J1-J23117-mRFP1. تم استهداف خمسة مواقع scRNA (J102 ، J104 ، J106 ، J108 ، J110) بمواضع −61 ، −71 ، −81 ، −91 ، −101 من TSS على الشريط غير القالب للمروج الأصلي. بهذه الطريقة ، يمكن تغطية المنطقة الكاملة من -61 إلى -113 بدقة أساسية واحدة. يشير الترميز اللوني إلى نقل البيانات لنفس الموقع الهدف عبر نافذة 12 أساسية. تُظهر اللوحة الموجودة على اليمين التعبير الأساسي للمراسلين ذوي القواعد المتغيرة عند استخدام scRNA خارج الهدف (J206). تمثل المنطقة الرمادية نطاق الخطوط الأساسية بين سلسلة المراسلين. للمقارنة ، يتم عرض بيانات CRISPRa السابقة للمواضع المستهدفة J102 و J104 و J106 و J108 و J110 بدقة أساسية 10 على المخطط فوق المؤامرة 3. ب لا يؤدي تمديد طول الرابط بين MCP و SoxS إلى تغيير اعتماد موضع CRISPRa. تم تسليم سلسلة البلازميد المراسل J1-J23117-mRFP1 مع التحولات الأساسية جنبًا إلى جنب مع مكونات CRISPRa لاستهداف J106. احتوى المستجيب MCP-SoxS (R93A) على روابط 5aa و 10aa و 20aa. للمقارنة ، يتم عرض بيانات CRISPRa السابقة مع رابط 5aa أو 10aa أو 20aa بين استهداف MCP و SoxS في المواضع −81 و 91 على المخطط أعلى المؤامرة 3. القيم في أ و ب تمثل المتوسط ​​± الانحراف المعياري المحسوب من ن = 3 عينات مستقلة بيولوجيا. يتم توفير بيانات المصدر كملف بيانات المصدر.

والجدير بالذكر أن المسافة إلى TSS ليست العامل المحدد الوحيد لمستوى التعبير بوساطة CRISPRa. المواقع التي تتداخل على نفس المسافة ، مثل موقع 81 الأصلي وموقع 71 الذي تم إزاحته بمقدار 10 ، لا تعطي نفس ناتج التعبير الجيني (الشكل 4 أ). يمكن أن تنشأ هذه التناقضات من الاختلافات الجوهرية في نشاط تسلسل هدف 20 قاعدة scRNA (الشكل التكميلي 4) أو من تأثير تكوين تسلسل متداخل مختلف بين موقع scRNA المستهدف والمروج الأدنى (الشكل 3).

نظرًا لأننا أوضحنا أن تكوين التسلسل يمكن أن يكون له تأثيرات غير متوقعة على CRISPRa (الشكل 3) ، فقد اختبرنا ما إذا كانت دورية CRISPRa متشابهة في سياقات التسلسل المختلفة. لقد حصلنا على اعتماد طور دوري مشابه عندما تم استخدام تسلسلات نيوكليوتيد مختلفة لتغيير موقع هدف scRNA ، وعندما تم إدخال القواعد في موقع مختلف في المروج (الشكل التكميلي 5 أ). تم الحصول على نتائج مماثلة أيضًا عندما أجرينا تجربة التحول الأساسي مع مراسل له تسلسل مختلف 5 بوصات (الشكل التكميلي 5 ب) أو حيث تم استبدال مروج BBa_J23117 الأدنى بـ داخلي المنشأ اروك المروج (الشكل التكميلي 5 ج). علاوة على ذلك ، لوحظ اعتماد تحديد المواقع الحاد عند استهداف القالب أو الشريط غير النموذجي للمراسل (الشكل التكميلي 5 د). أخيرًا ، يمكن أن يظهر أحد التأثيرات المربكة المحتملة إذا تغير مستوى التعبير الأساسي لجين المراسل عند إدخال القواعد ، مما قد يؤثر على فعالية CRISPRa (الشكل 3 أ). ومع ذلك ، لاحظنا أن التعبير الأساسي من المراسل الأصلي والمراسل المتحول للقاعدة +5 لا يمكن تمييزهما (الشكل التكميلي 5E). تؤكد هذه التجارب معًا أن CRISPRa البكتيرية حساسة للتواتر في سياقات تسلسل مختلفة متعددة.

في التجارب الموصوفة أعلاه ، تم إجراء مقارنات بين مواقع سكرنا المزاحة ذات القاعدة الواحدة باستخدام تركيبات جينية مختلفة للمراسل ، ولكل منها عدد مختلف من القواعد المدرجة. لاختبار الاعتماد الموضعي لـ CRISPRa بدقة قاعدة واحدة في بنية مراسل واحد ، قمنا بتصميم جين مراسل بديل مع 6 مواقع مستهدفة متجاورة لـ scRNA بين -81 و 86. لاحظنا مرة أخرى انخفاضًا حادًا في التعبير الجيني عند استهداف مواقع قاعدة واحدة أو أكثر بعيدًا عن الموقع الأمثل عند -81 (الشكل التكميلي 5F).

اكتشاف أن تقنية CRISPRa تعرض نفس الشيء

10 دورية أساسية حيث يشير حلزون DNA إلى أن المرحلة الزاوية لمركب CRISPRa بالنسبة إلى المروج الأدنى أمر بالغ الأهمية للتنشيط الفعال. يتطلب نظام CRISPRa البكتيري الخاص بنا تفاعلًا مباشرًا بين مجال تنشيط SoxS و RNA polymerase 3 ، ويبدو أن هذا التفاعل حساس للغاية لكل من المسافة والمرحلة النسبية للموقع المستهدف إلى الحد الأدنى من المروج. قد يكون الاعتماد الحاد على المرحلة لـ CRISPRa سمة عامة لتنظيم النسخ في بكتريا قولونية. بروتين SoxS الأصلي وعوامل النسخ الأخرى مثل CAP و LacI لها متطلبات تحديد المواقع المقيدة التي تتوافق مع دورية الحمض النووي 27،28،29،30،31،32،33،34 لقد أكدنا هذه النتيجة مع مراسل SoxS داخلي (الشكل التكميلي. 6). في الممارسة العملية ، يعني هذا السلوك الدوري أن المواقع المستهدفة الفعالة يجب أن تكون موجودة في واحدة من قمم التنشيط الضيقة ضمن نطاق المسافة الأمثل. تشير هذه المتطلبات الصارمة إلى أن استهداف الجينات الذاتية سيكون أمرًا صعبًا للغاية. هنالك

1 موقع PAM كل 10 قواعد في المناطق المنبع للمروجين الداخليين في بكتريا قولونية (الشكل التكميلي 7A و amp B) ، واحتمالية وجود موقع PAM في المرحلة المناسبة ضمن نافذة 10 أساسية منخفضة (الشكل التكميلي 7C).

هيكل الضبط لتوسيع نطاق الموقع المستهدف غير فعال

إذا كان تدوير مركب CRISPRa خارج الطور على طول الحمض النووي يمنع SoxS من التفاعل مع RNA polymerase ، فإن رابط الأحماض الأمينية الأطول إلى SoxS قد يسمح لـ CRISPRa الفعال في المزيد من مواقع scRNA. لاختبار هذا الاحتمال ، قمنا بتوسيع الرابط بين MCP و SoxS من خمسة أحماض أمينية (aa) إلى 10 أو 20 aa ، ولكن حتى مع هذه الروابط الأطول ، لاحظنا نفس الاعتماد الحاد على موضع الموقع المستهدف كما هو الحال مع الرابط الأصلي 5 aa (الشكل 4 ب). لقد حصلنا على نتائج مماثلة باستخدام رابط بتركيبة مختلفة من الأحماض الأمينية (الشكل التكميلي 8 أ).

هناك طريقة أخرى محتملة لتوسيع نطاق مواقع CRISPRa الفعالة وهي تغيير الموقع المكاني لبروتين MCP-SoxS عن طريق تغيير موضع دبوس الشعر MS2 الذي يربط MCP. لذلك قمنا باختبار تصميمات متعددة بديلة للـ scRNA والتي تقدم دبوس الشعر MS2 في مواقع مختلفة. أدى تمديد جذع MS2 بمقدار 2 و 5 و 10 و 20 نقطة أساس إلى انخفاض تدريجي في نشاط CRISPRa ، ولكن لم يحدث تغيير في موضع المواقع المستهدفة الأكثر فعالية (الشكل التكميلي 8 ب). وبالمثل ، لم يلاحظ أي تغييرات مع تصاميم scRNA البديلة مع واحد أو اثنين من دبابيس الشعر MS2 المقدمة من مواقع مختلفة داخل بنية scRNA (الشكل التكميلي 8C).

أخيرًا ، قمنا بتقييم ما إذا كانت أي مجالات تنشيط بديلة يمكن أن تنتج سلوكًا مختلفًا يعتمد على المرحلة. في السابق ، أنتجت جميع هذه التركيبات تنشيطًا أضعف من SoxS 3 ، ربما لأن كل منها لها مواقع هدف مثالية مميزة. لقد اختبرنا MCP مدمجًا في TetD و αNTD و lambda cII و RpoZ 3 و dCas9 مدمجًا في RpoZ 35 ومع ذلك ، لم ينتج عن أي من هذه التركيبات تنشيط الجينات في أي موقع لم يكن فعالًا بالفعل مع SoxS (الشكل التكميلي 9).

على الرغم من أن عوامل النسخ البكتيرية الذاتية تظهر اعتمادًا دوريًا حادًا على المسافة 27،28،29،30،31،32،33،34 ، إلا أنه لا يزال من المدهش أنه لم ينتج عن أي تعديلات هيكلية لمركب CRISPRa أي تغييرات في اعتماد المرحلة. إذا تم ربط SoxS ببساطة بمجمع CRISPRa بواسطة رابط مرن ، فقد توقعنا أن تتوسع ذروة مواقع CRISPRa الفعالة باستخدام روابط أطول. يشير فشل هذا التنبؤ إلى أن فهمنا لمركب CRISPR-Cas وتفاعلاته مع آلية النسخ البكتيرية غير مكتمل بشكل أساسي ، أو أن الرابط الذي يربط SoxS بمركب CRISPRa ليس مرنًا حقًا. من الناحية العملية ، هذا يعني أننا ما زلنا نفتقر إلى طريقة لتوسيع نطاق مواقع استهداف CRISPRa الفعالة.

يوسع متغير dCas9 نطاق المواقع القابلة للاستهداف

نظرًا لوجود عدد محدود من الجينات مع موقع NGG PAM مناسب في الموضع الأمثل بالتحديد في اتجاه المنبع للمروج (الشكل التكميلي 7C) ، حاولنا توسيع نطاق مواقع PAM القابلة للاستهداف لـ CRISPRa. استخدمنا متغير dCas9 المميز مؤخرًا ، dxCas9 (3.7) ، والذي أدى إلى تحسين النشاط في مجموعة متنوعة من المواقع غير NGG PAM بما في ذلك NGN و GAA و GAT و CAA 6. لقد أنشأنا بلازميدات المراسل عن طريق استبدال مواقع AGG PAM بتسلسلات PAM البديلة وقدمنا ​​نظام CRISPRa مع dxCas9 (3.7) لاستهداف هؤلاء المراسلين. حافظت dxCas9 (3.7) على القدرة على استهداف AGG PAM وأظهرت زيادة كبيرة في مستويات التنشيط في مواقع PAM البديلة مقارنة بـ dCas9 (الشكل 5 أ). تباينت مستويات التنشيط باختلاف مواقع PAM وترتبط جيدًا بنشاط dxCas9 (3.7) الذي تم الإبلاغ عنه مسبقًا في الخلايا البشرية (الشكل التكميلي 10 أ) 6. أظهر dxCas9 (3.7) تفضيلات موقع الهدف تعتمد على المسافة والمرحلة مثل dCas9 (الشكل التكميلي 10B & amp C) ، لكن نطاق PAM الموسع يجعل من المرجح أن يكون للجين التعسفي موقع PAM قابل للاستهداف في موضع فعال. تحليل المعلومات الحيوية للتسلسلات بين وحدات النسخ في بكتريا قولونية كشفت أن هناك في المتوسط ​​6.4 مرات أكثر من مواقع PAM المتوافقة مع dxCas9 (3.7) من مواقع NGG PAM (الشكل التكميلي 10D). نظرًا لحقيقة أن dCas9 لديه بعض النشاط في مواقع غير NGG 6 (الشكل 5 أ) ، لا يزال هناك متوسط

2.2 أضعاف مواقع PAM المتوافقة مع dxCas9 (3.7) أكثر من مواقع PAM المتوافقة مع dCas9 (الشكل التكميلي 10 د).

أ عرض CRISPRa مع dxCas9 (3.7) نشاطًا على مواقع غير NGG PAM مع تسلسلات AGA و AGC و AGT و CGA و CGC و CGT و GGA و GGC و GGT و TGA و TGC و TGT و GAA و GAT و CAA. كان نشاط CRISPRa مع dxCas9 (3.7) على مواقع غير NGG PAM أقل عمومًا (تنشيط 6 أضعاف إلى 89 ضعفًا بالنسبة لعنصر تحكم بدون سكرنا) مقارنة بموقع AGG PAM (تنشيط 188 ضعفًا). Spعرض -dCas9 أيضًا نشاط CRISPRa معتدلًا في مواقع غير NGG PAM مع تسلسل AGA و CGA و GGA و GGC و GGT و TGA ، بما يتوافق مع التقارير المنشورة 6. تم إنشاء البلازميدات المراسل عن طريق استبدال موقع AGG PAM للهدف J306 في المراسل J3-J23117-mRFP1 بتسلسلات PAM البديلة التي تم الإبلاغ عنها مسبقًا ليتم التعرف عليها بواسطة dxCas9 (3.7) في الخلايا البشرية 6. تشير العلامة (-) إلى عنصر تحكم يعبر عن المراسل الأصلي باستخدام AGG PAM ومكونات CRISPRa مع س-dCas9 ، مجال التنشيط ولا يوجد سكرنا. ب يمكن لـ dxCas9 (3.7) تنشيط المروجين الذين لا يمكن تنشيطهم بواسطة Sp-dCas9. عندما يكون هدف scRNA في الموضع الأمثل (−81 إلى TSS) يحتوي على موقع AGG PAM ، كلاهما Spزاد -dCas9 و dxCas9 (3.7) من التعبير الجيني بمقدار 50 ضعفًا. عندما يكون هدف scRNA في الموضع الأمثل له موقع AGT PAM ، فقط dxCas9 (3.7) أظهر زيادة سبعة أضعاف في التعبير الجيني أثناء Sp-dCas9 كان غير نشط. الجين المراسل له هدف مع AGG PAM (M1) وهدف مع AGT PAM (M2) المنبع لمروج BBa_J23117 الأدنى. في الجين المراسل A ، كان هدف AGG يقع 81 على TSS على الخيط غير القالب وكان هدف AGT يقع −76 على TSS على الشريط غير القالب. في الجين المراسل B ، تم إدخال 5 قواعد في الجزء العلوي من منطقة 35 ، مما أدى إلى تحويل مواقع هدف AGG وهدف AGT إلى −86 و 81 ، على التوالي. تشير العلامة (-) إلى سلالة تحكم سلبية تحتوي على البلازميد المراسل والبلازميد الذي يعبر عن Sp-dCas9 ومجال التنشيط و scRNA خارج الهدف (J206). الحانات في أ و ب تمثل المتوسط بكتريا قولونية المروج ± الانحراف المعياري المحسوب من ن = 3 عينات مستقلة بيولوجيا. يتم توفير بيانات المصدر كملف بيانات المصدر.

لإثبات فائدة dxCas9 (3.7) لـ CRISPRa في المواقع التي يتعذر الوصول إليها إلى dCas9 ، قمنا ببناء بلازميد مراسل يحتوي على موقع AGG PAM في الموضع الأصلي مع أقصى نشاط CRISPRa وقواعد AGT PAM في اتجاه مجرى النهر. باستخدام هذا المراسل ، نلاحظ أن كلاً من dCas9 و dxCas9 (3.7) فعالان بالنسبة لـ CRISPRa في موقع NGG PAM ذي الموقع الأمثل ، لكن لا أحد منهما قادر على تنشيط موقع AGT PAM ، وهو خمس قواعد خارج الطور من الموقع الأمثل (الشكل . 5 ب). ثم أدخلنا خمس قواعد في المراسل لتحويل موقع AGT PAM إلى نطاق التنشيط الذروة. مع هذا المراسل ، لا يمكن لـ dCas9 ولا dxCas9 (3.7) تنشيط موقع NGG PAM ، والذي أصبح الآن خارج المرحلة. كان dxCas9 (3.7) قادرًا الآن على تنشيط موقع AGT PAM بشكل فعال ، وكان dCas9 غير فعال في هذا الموقع (الشكل 5 ب). تؤكد هذه النتيجة أن dxCas9 (3.7) قادر على تنشيط المواقع المستهدفة ذات المواضع المثلى التي لا يمكن الوصول إليها إلى dCas9. نتوقع أن يكون هذا السلوك فعّالًا لدى العديد من المروجين للأسرة 70 (الشكل 3 ب) ، وقد أظهر تقرير حديث سلوكًا مشابهًا لـ dxCas9 (3.7) عند المروجين المعتمدين 54.

القواعد المحددة تمكن من تنشيط الجينات الذاتية

توصيفنا المنهجي لمتطلبات CRISPRa الفعال في بكتريا قولونية يوضح أن الجينات المرشحة يجب أن يكون لها موقع PAM قابل للاستهداف يقع في أحد القمم الحادة للنشاط المنبع من TSS. بعد فوات الأوان ، لاحظت مواقع scRNA في الجينات الذاتية التي استهدفناها في البداية في الشكل 2 استيفاء هذا المعيار. لتحديد ما إذا كانت القواعد المنقحة ستسمح بتنشيط داخلي بكتريا قولونية الجينات ، قمنا بمسح الجينوم للجينات المرشحة مع مواقع PAM المتوافقة ، dxCas9 (3.7) (الطرق التكميلية) (الشكل التكميلي 7C). لقد اخترنا المرشحين الذين لديهم العديد من مواقع PAM التي يحتمل أن تكون فعالة وقمنا بتضييق المجموعة بناءً على معيارين إضافيين: (1) لا ينبغي التعبير عن الجينات بشكل كبير (الشكل 3 أ) و (2) يجب تنظيم الجينات بواسطة σ 70 ، وهو عامل سيجما الذي ينظم معظم الجينات 8 (الشكل 3 ب). من الناحية المثالية ، يمكننا أيضًا استبعاد الجينات ذات منظمات النسخ المرتبطة بإحكام في منطقة المروج (الشكل ثلاثي الأبعاد) ، ولكن هذه المعلومات ليست متاحة بسهولة. اخترنا ستة جينات يمكن اختبارها باستخدام سلالات مراسل من بكتريا قولونية مجموعة المروج 36 واستهدفت موقعين PAM لكل جين.

قمنا أولاً بفحص ملف ياج الجين ، الذي كان له موقعان مستهدفان معقولان ، أحدهما متوافق فقط مع dxCas9 (3.7). قمنا أيضًا بتضمين موقع إضافي من المتوقع أن يكون خارج المرحلة وغير فعال بالنسبة لـ CRISPRa. لاحظنا أهمية ،

تنشيط الجين من 4 إلى 6 أضعاف للموقعين الموجودين في ذروة النشاط المتوقعة عند -80 / 81 ، ولا يوجد تنشيط في موقع خارج الطور عند -87 (الشكل 6 أ). لا يمكن الوصول إلى الموقع في 81 إلى dCas9 ، وقد لاحظنا التنشيط فقط باستخدام dxCas9 (3.7). شرعنا في اختبار خمسة جينات إضافية بنجاح جزئي. لاحظنا تنشيطًا كبيرًا في الجدري ب (

10 أضعاف) و uxuR (ذو شقين تقريبًا) (الشكل 6 ب). لقد تحققنا من صحة هذه النتائج عن طريق إجراء RT-qPCR على الجهاز الداخلي ياج و الجدري ب الموقع. أدى استهداف CRISPRa لهذه الجينات إلى زيادات في مستويات الحمض النووي الريبي (الشكل التكميلي 11). استهداف CRISPRa لـ أرا أنتج فرقًا مهمًا إحصائيًا في التعبير ، لكن التنشيط الذي تم قياسه كان متواضعًا (1.13 ضعفًا). بالنسبة للجينات المرشحة المتبقية ، الجواب تم قمعها بشكل متواضع في أحد المواقع المستهدفة ولم نلاحظ فرقًا ذا دلالة إحصائية في التعبير في نقطة في البوصة. وبالمثل ، فإن أحد ldhA كانت المواقع التي استهدفناها في التجارب الأولية (الشكل التكميلي 1) في الموقع الأمثل المتوقع عند −91 وفشلت في إعطاء تنشيط كبير. وهكذا ، من بين سبعة جينات داخلية تم اختبارها مع مواقع مستهدفة ، نتوقع أن تكون فعالة (الجينات الستة من الشكل 6 ب و ldhA من الشكل التكميلي 1) ، تمكنا من تنشيط ثلاثة جينات بأكثر من ضعف الزيادات في التعبير الجيني.

أ تم استهداف CRISPRa باستخدام dCas9 و dxCas9 (3.7) إلى ياج مراسل البلازميد من بكتريا قولونية 36- مسعود. تم اختيار ثلاثة مواقع مستهدفة لـ scRNA تم تحديد موقعين في المواضع التي كانت فيها CRISPRa أكثر فعالية (Y1-2) ، وكان أحدهما خارج المرحلة (Y3). تم تضمين عنصر تحكم سلبي (OT) يعبر عن سكرنا بعيدًا عن الهدف (J306). ب تم استهداف CRISPRa ل ياج وخمسة مروجين إضافيين من بكتريا قولونية مجموعة المروج (الطرق التكميلية). تم استهداف موقعين من مواقع scRNA الموجودة في المواضع التي كانت فيها CRISPRa أكثر فعالية لكل جين باستخدام dxCas9 (3.7). يتم ترتيب العينات حسب التعبير الأساسي للجينات المستهدفة ، بترتيب تصاعدي من اليسار إلى اليمين. يشير تنشيط الطية إلى متوسط ​​مضان السلالات بالنسبة لعنصر تحكم بعيد عن الهدف (J306). قيم أ و ب تمثل المتوسط ​​± الانحراف المعياري المحسوب من ن = 3 عينات مستقلة بيولوجيا. تشير النجوم إلى اختلاف ذي دلالة إحصائية عن التحكم خارج الهدف باستخدام ويلش ثنائي الذيل غير المزاوج ر اختبار (*ص-القيمة & لتر 0.05 ، **ص القيمة & لتر 0.01). بالضبط ص القيم: E1: 0.036 ، E2: 0.024 ، B1: 0.031 ، B2: 0.141 ، P1: 0.033 ، P2: 0.021 ، D1: 0.088 ، D2: 0.585 ، U1: 0.0008 ، U2: 0.001 ، Y1: 0.013 ، Y2: 0.003. يتم توفير بيانات المصدر كملف بيانات المصدر.

على الرغم من أن أي نجاح في تنشيط الجينات الذاتية أمر مشجع ، إلا أن هناك تحديات كبيرة لا تزال قائمة بالنسبة لـ CRISPRa الذي يمكن التنبؤ به في البكتيريا. تشير نتائجنا إلى أنه حتى مع وجود مقياس دقيق للمسافة للمواقع المستهدفة الفعالة ، لن يتم تنشيط بعض الجينات بشكل متوقع. هناك العديد من التفسيرات المحتملة: (1) يمكن للمنظمين السلبيين المرتبطين بإحكام أن يتداخلوا مع CRISPRa (الشكل ثلاثي الأبعاد) ، و (2) قد تؤدي الأخطاء الصغيرة في شرح TSS التوضيحي إلى تنبؤات غير دقيقة للمواقع الفعالة ، بالنظر إلى أن التحولات الأساسية 1-2 يمكن أن يكون لها تأثيرات دراماتيكية على CRISPRa (الشكل 4) ، و (3) الاختلافات الجوهرية في نشاط تسلسل هدف 20 قاعدة scRNA (الشكل التكميلي 4).


مناقشة

اكتشفت هذه الدراسة أن نسخة RNA يتم إصدارها أولاً من مجمع النسخ ، وينفصل RNAP عن قالب الحمض النووي بعد ذلك بكثير في معظم الأوقات في بكتريا قولونية الإنهاء الجوهري ، بناءً على مراقبة الجزيء الفردي لنسخة الحمض النووي الريبي الفلوري ، أو قالب الحمض النووي ، أو العامل. هذا التفكك المتسلسل (94٪) أكثر تواتراً بكثير من التفكك المتزامن (6٪) ، على الرغم من أنه تم قياسه باستخدام قوالب DNA خطية قصيرة وطويلة بدلاً من الكروموسومات الدائرية فائقة الالتفاف. بالنظر إلى أن 75 ٪ فقط من مجمعات الاستطالة تحتفظ بعامل ، يبدو أن الاحتفاظ بعد النهاية لـ RNAP على الحمض النووي يحدث بشكل مشابه مع كل من الإنزيمات الأساسية والأنزيمات المجسمة. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرنا أن معظم الإنزيمات المجسمة تحتفظ بعامل σ بعد الإنهاء الجوهري.

نظرًا لأن الإنهاء يجب أن يشير إلى إطلاق RNA فقط ، فإن الاحتفاظ اللاحق بـ RNAP على DNA يشكل مرحلة غير محددة سابقًا. هذه المرحلة الرابعة من النسخ بعد مراحل البدء والاستطالة والإنهاء تسمى هنا إعادة التدوير (الشكل 7). أثناء مرحلة إعادة التدوير ، تنتشر RNAPs بعد النهاية على الحمض النووي أحادي البعد في اتجاهين نحو الأسفل والأعلى ، حتى تسقط من الحمض النووي.

(1) البدء أو إعادة التهيئة: بعد ربط الحمض النووي (الخط الأسود) عند المروج (الخط الأخضر) ، يدمج RNAP (البيضاوي السماوي) عدة NTPs في RNA (الخط الأزرق) ، ويتقدم نحو الأسفل لتطهير المحفز. (2) الاستطالة: تتقدم RNAP بشكل تدريجي نحو الأسفل ، وتستأنف من التوقف المؤقت أو التراجع. (3) الإنهاء: يتوقف RNAP مؤقتًا عند نقطة نهاية (خط أرجواني) للخضوع لتغييرات مطابقة ، ويطلق منتج RNA. (4) إعادة التدوير: ينتشر RNAP على الحمض النووي لأسفل ولأعلى حتى يعيد النسخ في نفس المروج أو مروج آخر ما لم ينفصل RNAP عن الحمض النووي.

تم اقتراح نشر 1D لـ RNAP لتسريع بحث المروج ، 20،21،22 لكن القليل من التجارب أثبتت ذلك بشكل مباشر. علاوة على ذلك ، تم قياس انتشار RNAP على الحمض النووي مؤخرًا ليكون قصيرًا جدًا (& lt30 مللي ثانية) للمساهمة في حركية البدء في ظل الظروف الفسيولوجية. 23 هذا العمر لـ RNAP قبل البدء على الحمض النووي هو أقصر بكثير من عمر RNAP بعد انتهاء المدة (& gt1 min) الذي لوحظ في هذه الدراسة ، مما يشير إلى أن وضع الانتشار 1D والتشكيل يختلفان بين RNAPs قبل البدء وبعد النهاية. تقدم هذه الدراسة أول دليل مباشر على أن الانتشار 1D لـ RNAP بعد انتهاء الصلاحية على الحمض النووي متكرر وطويل بما يكفي لتسهيل إعادة التأسيس بكفاءة. سيعتمد هذا التأثير على إعادة التشغيل على تركيز RNAP ومسافة المحفز-المُحسِّن.

تسمح حيازة RNAP لما بعد الإنهاء لـ σ وانتشارها على الحمض النووي بإعادة إنشاء النسخ ، والذي يتم تعريفه عن طريق ربط المروج من خلال 1D بدلاً من الانتشار ثلاثي الأبعاد لـ RNAP بعد الإنهاء. تم توضيح إعادة التهيئة هنا ليس فقط على مروج المصب الموجه في اتجاه المعنى (إعادة التشغيل المصب) ، ولكن أيضًا على المروج الأصلي الموجود في المنبع من TS (إعادة التشغيل المنبع) بطريقة ردود الفعل الإيجابية. وبالتالي ، يمكن أن ينتشر RNAP بعد النهاية إلى أسفل وإلى أعلى على الحمض النووي لإعادة تنشيطه على أي محفز يمكن الوصول إليه خلال فترة الانتشار. إذا كان بإمكان RNAP الانتشار أحادي الأبعاد أن ينقلب على الحمض النووي ، فقد يكون من الممكن إعادة التهيئة في محفز موجه بشكل معاكس (إعادة تنشيط عكسي) الموجود في المنبع أو المصب. علاوة على ذلك ، يظهر ملحق عامل σ هنا لزيادة كفاءة إعادة التشغيل ، مما يشير إلى أنه حتى الإنزيم الأساسي يمكن أن يصبح مؤهلاً لإعادة التأهيل أثناء مرحلة إعادة التدوير.

إن الاحتفاظ بعد النهاية ونشر RNAP على الحمض النووي ، وكفاءة إعادة النسخ لمثل هذا RNAP أثناء مرحلة إعادة التدوير لها آثار وظيفية عديدة ، على الرغم من أنه لم يتم ملاحظتها حتى الآن في الجسم الحي. أولاً ، سيسهلون الاندفاع النسخي ، والذي تمت ملاحظته لكل من النسخ البكتيرية وحقيقية النواة. 24،25،26 قد يؤدي الاحتفاظ بعد انتهاء المدة لـ RNAP إلى زيادة كثافتها المحلية وجعلها قابلة للتحويل بسهولة إلى حالة مؤهلة لإعادة التشغيل. سيسهم الانتشار الأمامي في تراكم RNAP المصب ، على الرغم من أن الانتشار العكسي الضروري لتراكم المنبع قد يتداخل مع التصادم المباشر مع RNAPs الأخرى.

ثانيًا ، يمكن تسهيل تنظيم النسخ المتزامن للعديد من العوامل. في الجينومات البكتيرية ، غالبًا ما يتم تجميع الجينات والأوبراونات المرتبطة وظيفيًا وتنظيمها معًا كنظام عادي. 27،28،29،30 يمكن للمرء أن يفترض أن جزيء RNAP واحد يقوم باستمرار بنسخ الأوبرا العنقودية ، بينما ينتشر في مناطق inter-operon من كروموسوم الحمض النووي.

في هذا العمل ، أنشأنا اختبار التألق أحادي الجزيء لدراسة ديناميات إنهاء النسخ البكتيري. يمكن أن يسمح بناء مجمعات النسخ الفلوريسنت بمراقبة جزيء واحد لمكوناتها في الدراسات حول استطالة النسخ ، والإنهاء ، وإعادة التدوير ، وإعادة التشغيل.


بروتينات الانصهار

غالبًا ما يتم التعبير عن البروتينات والببتيدات المؤتلفة كبروتينات اندماج ، تتكون من تسلسلات حاملة مرتبطة بالبروتين المستهدف. يتم ربط إطارين أو أكثر من إطارات القراءة المفتوحة (ORFs) معًا بالترتيب المطلوب لتشفير بروتين الاندماج. بعد ذلك ، ينتج عن التعبير عن إطارات القراءة المندمجة بروتين الاندماج الهجين ، حيث يتم ربط البروتين المعني بالنهاية الأمينية أو نهاية الكربوكسيل لبروتين حامل بواسطة رابطة ببتيدية قياسية (Itakura et al. 1977 للمراجعات ، انظر Arnau وآخرون ، 2006 إسبوزيتو وتشاترجي 2006). يتم تسهيل استعادة البروتين المستهدف من خلال تضمين موقع انقسام بروتيني عند تقاطع البروتينات المندمجة.

لبروتينات الانصهار مجموعة واسعة من الاستخدامات المحتملة.

1. قد يوفر ربط البروتينات المستهدفة بمجال ربط يجند طريقة ملائمة لـ "علامة" وتنقية متواليات البروتين المستهدفة.

2. قد تؤدي إضافة متواليات "حاملة" إلى حماية البروتين المستهدف من تحلل البروتين.

3. قد تؤدي إضافة متواليات حاملة إلى تحسين قابلية ذوبان البروتين المستهدف وقد تمنع تكوين أجسام متضمنة غير قابلة للذوبان (انظر تحسين التعبير عن البروتينات الأجنبية للحصول على مزيد من المعلومات حول التعامل مع البروتينات غير القابلة للذوبان).

4. قد تسمح إضافة حواتم جيدة التوصيف بالكشف عن بروتين الاندماج بالطرق المناعية.

5. قد يسمح ربط البروتين المستهدف بإشارات الانتقال بتوجيه بروتين الاندماج إلى أجزاء خلوية محددة.

تم تصميم أو تكييف أكثر من 20 نظامًا اندماجًا مختلفًا لتنقية التقارب ، مع العديد من علامات التنقية الشائعة الاستخدام الملخصة في الجدول 3. في كثير من الأحيان ، يكون البروتين الهدف المرفق ناقلًا ذا تقارب كبير لرابط معين ، مما يتيح تقريبًا لأي بروتين اندماج يتم تنقيتها بخطوة واحدة من كروماتوغرافيا التقارب. على سبيل المثال ، تعد البروتينات GST وبروتين ربط المالتوز (MBP) من العلامات المعروفة لعزل بروتينات الاندماج باستخدام راتنجات كروماتوجرافية مقترنة بروابط كل منها ، الجلوتاثيون (البروتوكول: تنقية بروتينات الانصهار بواسطة كروماتوجرافيا الانجذاب على راتنج الجلوتاثيون [كيلكوف وآخرون. 2020c]) أو الأميلوز. علاوة على ذلك ، تعمل GST و MBP ، بالإضافة إلى ناقلات أخرى ، غالبًا على تحسين قابلية ذوبان بروتين الاندماج وبالتالي قد تقلل من تكوين الجسم المتضمن في بكتريا قولونية أنظمة التعبير (إسبوزيتو وتشاترجي 2006). يمكن تضمين الببتيدات الأقصر في بروتينات الاندماج ، إما كمقبض للتنقية أو كحلمة ملائمة للطرق المعتمدة على الجسم المضاد. تسلسل 6xHis الاصطناعي هو ناقل قصير سائد لتنقية بروتينات الاندماج عن طريق التقارب للأعمدة التي تحمل Ni 2+ أو Co 2+ (سميث وآخرون 1988) كما هو موضح في البروتوكول: تنقية البروتينات ذات العلامات متعددة الهيستدين بواسطة كروماتوغرافيا تقارب المعادن الثابتة (كيلكوبف وآخرون 2020 ب). غالبًا ما تُستخدم علامات حاتمة قصيرة للمقايسات القائمة على الأجسام المضادة. علامة العلم هي عبارة عن octapeptide مصمم معروف وهو محب للماء (لزيادة قابلية ذوبان بروتين الانصهار) ويمكن اكتشافه باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة المتاحة تجاريًا (Hopp et al. 1988 للمراجعة ، انظر Einhauer and Jungbauer 2001). يتم تسويق عدة أنواع مختلفة من الأجسام المضادة للعلم (تسمى M1 أو M2 أو M5) إما للكشف عنها (على سبيل المثال ، باستخدام التجلط المناعي) أو كأشكال مثبتة للترسيب المناعي. تشكل الأحماض الأمينية الخمسة الكربوكسية الطرفية في Flag موقعًا للتعرف على إنزيم إنتيروكيناز البروتياز ، والذي يعمل كوسيلة ملائمة لإزالة الببتيد الحامل من البروتين المستهدف ، كما تمت مناقشته بمزيد من التفصيل أدناه (Dykes et al. 1988 Hopp et al. 1988) . ومع ذلك ، فإن التكاليف الباهظة للأجسام المضادة وحيدة النسيلة تجعل العلامات الحلقية غير عملية لتنقية البروتين على نطاق واسع.

استخدام رئيسي آخر لبروتينات الاندماج هو إضافة ببتيدات إشارة لنقل البروتين. في كثير من الأحيان ، البيئة المؤكسدة والمرافقين من الفضاء periplasmic بكتريا قولونية أو الشبكة الإندوبلازمية (ER) لخلايا الحشرات والخميرة تساعد في تكوين رابطة ثاني كبريتيد وقابلة للطي. علاوة على ذلك ، مطلوب الاتجار تحت الخلوي من خلال الشبكة الإندوبلازمية وشبكة جولجي ن- الارتباط بالجليكوزيل المرتبط بالبروتينات في أنظمة التعبير حقيقية النواة. غالبًا ما يوجه ببتيد الإشارة الطبيعي بشكل مناسب إفراز ومعالجة البروتين المؤتلف المعبر عنه في مضيف غير متجانس (على سبيل المثال ، إشارات الثدييات في خلايا الحشرات) (Talmadge et al. 1980 Gray et al. 1985 Jarvis et al. 1993). ومع ذلك ، فإن قدرات التسلسلات الفردية لتسهيل نقل البروتين ولكي يتم شقها بشكل مناسب بواسطة ببتيداز الإشارة تختلف على نطاق واسع وقد تكون أقل كفاءة في أنظمة التعبير المختلفة (على سبيل المثال ، قد تكون الإشارات النباتية أو البكتيرية غير فعالة في خلايا الحشرات) (Iacono-Connors et آل 1990 Vernet وآخرون 1990). لتجنب المشاكل ، قد تكون إشارة الببتيد الخاص بالبروتين الأجنبي مطلوبة مع ببتيد إشارة جيد التوصيف من ناقل التعبير. تتضمن الأمثلة الشائعة لببتيدات الإشارة المستخدمة في توطين البروتين المؤتلف تلك المشتقة من اروينيا كاروتوفورا pectate lyase B (pelB) (Keen and Tamaki 1986) أو بكتريا قولونية بروتين الغشاء الخارجي 3 أ (أومبا) (غريب وآخرون 1984) من أجل بكتريا قولونية مضيفين ، البروتين السكري GP67 baculovirus (Murphy et al. 1993) أو ميليتين نحل العسل (Tessier et al. 1991) في أنظمة baculovirus ، و S. cerevisiae عامل التزاوج α للتعبير في بيتشيا (الجدول 2) (Cregg 2007). ومع ذلك ، فإن كفاءة نقل إشارة الببتيد وانقسامها يعتمد على البنية الطرفية الأمينية وتسلسل البروتين الهدف المنصهر ، بحيث لا يزال من الضروري إجراء مزيد من التحسين.

انشقاق بروتينات الانصهار

للحصول على عديد ببتيد ذي فائدة في شكل أصلي ونشط بيولوجيًا ، يُفضل غالبًا قطع العلامة من باقي بروتين الاندماج. على عكس ببتيدات الإشارة ، التي يتم شقها عادةً بواسطة ببتيداز إشارة داخلي بعد انتقال البروتين ، تم تطوير مجموعة متنوعة من الطرق الكيميائية والإنزيمية لفصل رابطة الببتيد بين البروتين الحامل والبروتين محل الاهتمام. من الناحية العملية ، يكون للانقسام الكيميائي فائدة محدودة لأن معظم البروتينات المستهدفة تحتوي على واحد أو أكثر من مواقع الانقسام المحتملة وقد يتم تغيير خصائصها في ظل ظروف التفاعل القاسية. بدلاً من ذلك ، عادةً ما يتم تحقيق الإزالة الفعالة للعلامة أو البروتين الحامل باستخدام البروتياز الخاص بالموقع. وفقًا لذلك ، يقع موقع polycloning لمعظم النواقل المتاحة تجاريًا في اتجاه مجرى النهر من التسلسلات التي تشفر بروتين ناقل وموقع انقسام بروتيني (الجدول 2). يتم تلخيص العديد من البروتياز الخاصة بالموقع المستخدمة بشكل شائع لشق بروتينات الانصهار في الجدول 4.

عادة ما تظل العديد من الأحماض الأمينية الأجنبية مرتبطة بالنهاية الأمينية للبروتين المستهدف بعد الانقسام. لا يتطلب عدد قليل من البروتياز ، مثل enterokinase أو العامل Xa ، أحماض أمينية كبيرة تتجاوز نهاية الكربوكسيل في موقع الانقسام. يترك HRV-3C و TEV ومعظم البروتياز النوعي 1–2 من الأحماض الأمينية عند نهاية الكربوكسيل في موقع الانقسام ، ومع ذلك غالبًا ما تكون مفضلة بسبب خصوصية تسلسلها العالية وتوافرها في شكل مؤتلف ومميز. علاوة على ذلك ، فإن مواقع التقييد أو مواقع إعادة التركيب المستخدمة في الاستنساخ في الناقل تقدم في كثير من الأحيان أحماض أمينية إضافية في البروتين المستهدف. في بعض الحالات ، يمكن اختيار مواقع التقييد بعناية لتتوافق مع التسلسلات التي يتعرف عليها البروتياز. على سبيل المثال ، يقوم موقع BamHI بترميز Gly-Ser وبالتالي يمكن وضعه في مكان مناسب عند طرف الكربوكسيل لمواقع انقسام الثرومبين و TEV. في الممارسة العملية ، لا يتداخل وجود عدد قليل من الأحماض الأمينية الإضافية (عادةً عند الطرف الأميني للبروتين المستهدف المشقوق) إلى حد كبير مع وظيفة البروتين. ومع ذلك ، يبقى من المهم إثبات أن البروتين المؤتلف يتصرف بطريقة مماثلة للبروتين المكون فقط من التسلسل الأصلي.

بالإضافة إلى المشاكل المحتملة المرتبطة بإدخال المزيد من الأحماض الأمينية في نهاية البروتين الهدف ، ترتبط ثلاث قضايا أخرى بإزالة علامة الاندماج. أولاً ، يختلف نشاط بروتياز معين لكل بروتين اندماجي. مع العديد من بروتينات الاندماج ، قد تكون كفاءة تفاعل الانقسام المحلل للبروتين ضعيفة إذا تم إغلاق موقع البروتياز في سياق الهيكل المطوي. في هذه الحالات ، يمكن حث البروتياز على الانقسام بمجرد أن يتم تغيير طبيعة بروتين الاندماج جزئيًا أو بعد إدخال "مباعد" على حساب التمديد الاصطناعي للنهاية الأمينية للبروتين المستهدف. ثانيًا ، إما لأن خصوصية البروتياز ليست مطلقة أو لأن الإنزيم المستخدم في الانقسام ملوث ببروتياز آخر ، فقد ينقسم البروتين محل الاهتمام داخليًا في المواقع المرتبطة بموقع التعرف (Nagai and Thogersen 1984 ، 1987 Dykes وآخرون ، 1988 Lauritzen وآخرون ، 1991). يمكن أحيانًا حل مشاكل هذا النوع عن طريق تعديل ظروف الهضم (الوقت ، درجة الحرارة ، أو نسبة البروتين إلى البروتين). خلاف ذلك ، قد يكون من الضروري اختيار بروتياز مختلف للانقسام بعد التعديلات المناسبة لبناء التعبير. ثالثًا ، يجب عزل البروتين المستهدف المشقوق من البروتين الناقل الملوث والبروتياز. لهذا الغرض ، غالبًا ما يكون من الملائم اختيار بروتياز بعلامة اندماج تطابق الناقل على البروتين محل الاهتمام. وبهذه الطريقة ، يمكن إزالة كل من البروتياز والبروتين الحامل عن طريق ممر طرح واحد عبر راتنج التقارب. يمكن إنتاج الإصدارات ذات العلامات 6xHis- و / أو GST من البروتياز HRV 3C أو TEV في بكتريا قولونية أو تم شراؤها من عدة مصادر. على الرغم من أن النسخ ذات العلامات من البروتياز المرتبط بثنائي كبريتيد متعدد السلاسل مثل العامل Xa أو الثرومبين أو إنتيروكيناز أكثر صعوبة في الإنتاج ، يمكن استخدام طرق الكروماتوغرافيا التقليدية أو المناعية لإزالة هذه البروتياز من البروتين محل الاهتمام.


تم حل ورقة الأسئلة المتعلقة ببيولوجيا مركز الدراسات الدولي لعام 2017 للفئة 12

(يُسمح للمرشحين بـ 15 دقيقة إضافية لقراءة الورقة فقط. ويجب ألا يبدأوا الكتابة خلال هذا الوقت.)

  • أجب على جميع الأسئلة في الجزء الأول وستة أسئلة في الجزء الثاني ، باختيار سؤالين من كل قسم من الأقسام الثلاثة أ ، ب ، ج.
  • يجب أن تتم جميع الأعمال بما في ذلك العمل التقريبي على نفس الورقة مثل بقية الإجابة وعلى مقربة منها.
  • العلامات المقصودة للأسئلة أو أجزاء من الأسئلة موضحة بين قوسين [].

السؤال رقم 1.
(أ) قدم إجابة مختصرة عن كل مما يلي: [4]
(ط) لماذا تبدأ النباتات الخضراء في تطوير ثاني أكسيد الكربون2 بدلا من O2، في درجات حرارة عالية؟
(2) تعريف Apomixis.
(3) ما هو ريكون؟
(4) لماذا تستخدم جراثيم Bacillus thuringiensis كمبيد حيوي؟

(ب) لكل سؤال (أسئلة) / بيان (بيانات) التالية أربع إجابات مقترحة. اختر الخيار الصحيح في كل حالة. [4]
1. كودون بدء تخليق البروتين في حقيقيات النوى هو:
(ط) GUA
(2) GGA
(3) التقييم القطري المشترك
(4) أغسطس

2. نوع التفاعل حيث يضحي الفرد برفاهيته (الحياة) لصالح حيوان آخر من نوعه هو:
(ط) الإيثار
(2) الكسح
(3) Protocooperation
(4) التعايش

3. أجنحة الحشرات والطيور أمثلة على:
(ط) مماثل
(2) متماثل
(ثالثا) الأثرية
(رابعا) أتافيسم

4. يُعرف ضغط محتويات الخلية على جدار الخلية بما يلي:
(ط) ضغط الجدار
(2) الضغط الاسموزي
(3) ضغط تورغور
(4) ضغط الانتشار

(ج) إعطاء مصطلح علمي لكل مما يلي: [4]
(ط) فعل طرد الجنين الكامل من رحم الأم في نهاية الحمل.
(2) دخول أنبوب حبوب اللقاح في البويضة من خلال العناصر المدمجة.
(3) شكل بديل للجين المفرد يؤثر على نفس الشخصية وينتج تعبيرات مختلفة في أفراد مختلفين من نوع.
(4) دراسة السكان البشريين التي تغطي جميع الجوانب والمعايير.

(د) توسيع الاختصارات التالية: [4]
(ط) الخطة المتوسطة الأجل
(2) IW
(3) فيروس نقص المناعة البشرية
(4) DPD

(هـ) تسمية العلماء الذين ساهموا في ما يلي: [4]
(ط) اكتشف أحفورة رجل كرومجنون.
(2) الامتصاص النشط والسلبي للمياه بواسطة الجذور.
(3) الهيموفيليا المبلغ عنها.
(4) اكتشاف الإخصاب المزدوج.
إجابة:
(أ) (ط) يرجع إلى التنفس الضوئي. الخلايا الخضراء في وجود الضوء تمتص الأكسجين وتنتج ثاني أكسيد الكربون2، دون إنتاج أي طاقة صالحة للاستعمال.
(2) Apomixis هو نوع من التكاثر اللاجنسي الذي يحاكي الإنجاب الجنسي ، أي إنتاج البذور دون التلقيح والإخصاب.
(3) Recon هو الجزء الصغير من الحمض النووي الذي يمكن أن يخضع لإعادة التركيب.
(4) تحتوي أبواغ Bacillus thuringiensis على بروتينات تبكية سامة تسمى أيضًا Bt -oxin والتي تقتل يرقات الحشرات.

(ب)
1. & # 8211 (4) أغسطس.
2. & # 8211 (2) الإيثار
3. & # 8211 (ط) مماثل
4. & # 8211 (iii) ضغط تورغور

(ج) (ط) الولادة
(2) ميزوجامي
(ثالثا) أليل
(4) الديموغرافيا

(د) (ط) الإنهاء الطبي للحمل
(2) الإخصاب خارج الجسم
(3) فيروس نقص المناعة البشرية
(4) عجز ضغط الانتشار.

(هـ) '1` إدوارد لارتيت (1868)
(الثاني) كرامر (1949)
(الثالث) جون أوتو (1803)
(4) Nawaschin (1898)

Part & # 8211 II (50 علامة)
القسم أ

السؤال 2.
(أ) التفريق بين القردة والإنسان فيما يتعلق بالخصائص التالية:
(ط) الموقف
(2) تلال الحاجب
(3) القدرة الجمجمة
(ب) تحديد protobionts. [1]
(ج) ما هو cognogeny؟ [1]
إجابة:
(أ) (ط) الموقف شبه المنتصب وضع منتصب بالكامل
(2) تم تطوير تلال الحاجب البارزة بشكل ضعيف
(3) سعة الجمجمة 100-500 سم 3
(4) سعة الجمجمة 1400-1450 سم 3

(ب) تحتوي البروتوبيونات على أنواع مختلفة من المواد الكيميائية مثل البروتينات ، والأحماض النووية ، والكربوهيدرات ، وما إلى ذلك ، المحاطة داخل غشاء دهني ، وارتبطت بروتينات & ltf بغطاء غشاء البروتوبيونات.
(ج) Cognogeny: يشير إلى تطور أشكال الحياة المختلفة على هذا الكوكب - الأرض.

السؤال 3.
(أ) اشرح أي ثلاثة أدلة جزيئية (جينية) لصالح التطور العضوي. [3]
(ب) تحديد التولد الحيوي. [1]
(ج) تحديد الحفريات. [1]
إجابة:
(أ) (1) جميع الكائنات الحية لها بنية خلوية والحمض النووي هو المادة الجينية ، مما يشير إلى أسلافهم المشتركين باستثناء فيروس RNA.
(2) تدفق المعلومات الجينية من الحمض النووي إلى الحمض النووي الريبي إلى البروتين ، وهي ظاهرة تسمى العقيدة المركزية.
(3) الطفرات هي مصدر الاختلافات الجديدة ونافورة التطور.
(4) يتم تخزين المعلومات الجينية في الحمض النووي في شكل تسلسل من النيوكليوتيدات. الكود الجيني هو رمز ثلاثي. إنه نفس الشيء من البكتيريا إلى البشر (أي ثلاث نقاط).

(ب) تنص ظاهرة التولد الحيوي على أن الكائنات الحية لا تُنتج تلقائيًا ولا تُخلق. بدلا من ذلك تأتي الحياة من الحياة الموجودة مسبقا.
(ج) الحفريات هي بقايا أو آثار أو آثار أو آثار لكائنات كانت موجودة في الماضي.

السؤال 4.
(أ) ضع قائمة بأي ثلاث عيوب للداروينية. [3]
(ب) مبدأ State Hardy-Weinberg & # 8217s. [1]
(ج) التفريق بين الانتقاء الطبيعي الاتجاهي والانتقاء الطبيعي المضطرب. [1]
إجابة:
(أ) عيوب الداروينية:.
(ط) على الرغم من أن نظريته تستند إلى وجود الاختلافات ، إلا أنه لم يستطع شرح أصل التباين ولا يمكنه أن يعلق أي أهمية على الطفرات.
(2) لم يستطع داروين شرح أصل الشخصيات الجديدة. إنه يوفر فقط آلية تعديل الأحرف الموجودة بالفعل.
(3) على الأجهزة المتخصصة هي تلك التي نمت إلى ما بعد فائدتها القصوى. لقد أصبحت عائقًا للحيوان ، على سبيل المثال ، قرون الغزلان المتفرعة ، ناب الفيل ، إلخ.

(ب) تسمى جميع الجينات وأليلاتها الموجودة في مجتمع التهجين بمجمع الجينات. عادة ، تميل الأليلات إلى الحفاظ على التوازن مع الإشارة إلى جيل المحار الآخر بغض النظر عن التعبير المظهرى. يطلق عليه التوازن الجيني. يؤدي التغيير في التردد النسبي للأليلات إلى التطور.
(ج) إذا كان الاختيار يفضل الأفراد الصغار أو الكبار الحجم ، فسيكون عدد أكبر من الأفراد من هذا النوع حاضرين في الجيل التالي. مع استمرار الاختيار على مدى الجيل يعني أن حجم السكان قد يغيره. إنه الاختيار الاتجاهي الذي يحدث التطور في السكان. في الانتقاء الطبيعي ، سواء كان حجمه صغيرًا أو طويلًا ، سيكون الانتقاء الطبيعي نوعًا مزعجًا. ينتج ذروتين في توزيع السمات التي قد تؤدي إلى تطوير مجموعتين مختلفتين من السكان.

القسم ب
(أجب عن أي سؤالين)

السؤال 5.
(أ) أعط أربعة اختلافات تشريحية بين ورقة ديكوت وورقة أحادية. [4]
(ب) صف بإيجاز المرحلة الإفرازية للدورة الشهرية. [4]
(ج) حدد: [2]
(ط) مينارش
(2) التناظر الشعاعي
إجابة:
(أ)

ورقة ديكوت ورقة مونوكوت
(ط) ظهراني في الاتجاه (ط) وضعها عموديا
(2) الجانب العلوي من اللون الأخضر الداكن أكثر من الأسفل (2) كلا الجانبين أخضر على قدم المساواة
(3) الثغور هي أكثر في الجانب السفلي أو غير المحوري (3) الثغور موزعة بالتساوي على كلا الجانبين
(4) الثغور التي تحدها خلايا حراسة الكلى (4) الثغور يحدها خلايا حراسة على شكل حزام
(5) Mesophyll متباينة إلى حمة حاجز وإسفنجي (ت) ميسوفيل غير متمايز
(السادس) شبكي venation (السادس) التعظيم الموازي

(ب) تبدأ المرحلة الإفرازية بعد الإباضة. يفرز الجسم الأصفر بقايا جريب جرافيان تحت تأثير الهرمون اللوتيني البروجسترون والإستروجين. يساعد كل من LH والبروجسترون في زيادة نمو وسماكة بطانة الرحم وتصبح غدتها إفرازية لبطانة الرحم جاهزة تمامًا للارتباط والتغذية من الكيسة الأريمية. في حالة وجود نسبة عالية من البروجسترون يقلل من مستوى LH و FSH مما يؤدي إلى انخفاض تخليق البروجسترون. يتحلل بطانة الرحم ويتحرك للخارج على شكل مخاط ودم. يتحلل الجسم الأصفر إلى جسم أبيض يسمى الجسم الأبيض.

(ج) (ط) المنارة: وهي المرحلة التي تحيض فيها الفتاة لأول مرة.
(2) التناظر الشعاعي: عندما يمكن تقسيم الزهرة العادية إلى نصفين متساويين من خلال أي طائرة.

السؤال 6.
(أ) أعط تمثيلاً بيانيًا لدورة Hatch Slack أو C4.

(ب) أعط فرقتين مهمتين بين:
(ط) النتح والتمزق
(2) الكلوروفيل & # 8216a & # 8217 والكلوروفيل ب & # 8216

(ج) حدد ما يلي: [2]
(ط) بزل السلى
(2) تعدد الأجنة
إجابة:

تمثيل رسومي لدورة هاتش سلاك

النتح التمزق
(ط) فقدان الماء في شكل بخار
(2) يحدث من خلال الثغور العدسي والبشرة
(3) يحدث في جميع الأجزاء الهوائية
(4) الظروف الجافة تفضلها
(ط) الماء المفقود على شكل قطرات ماء
(2) يحدث من خلال الهيداثود
(3) يحدث في نهاية الوريد على هامش / طرف الأوراق
(4) يحدث في حالة رطبة ، لا تحبذ النتح

الكلوروفيل "أ" الكلوروفيل "ب"
(ط) وجود مجموعة الميثيل (-CH3) في ذرة الكربون 3 من pyrrolring 11.
(2) تشي. "أ" لها الصيغة الجزيئية ج55 ح72 ا5 ن4 ملغ
(3) اللون الأزرق والأخضر
(4) قابل للذوبان في الأثير البترولي
(5) صبغة التمثيل الضوئي الأولية
(1) بدلاً من مجموعة الميثيل ، توجد مجموعة CHO الحالية
(2) لدى Chi "b" الصيغة الجزيئية C 55 ح 70 ا 6 N4 ملغ
(3) الأصفر والأخضر
(4) قابل للذوبان في كحول الميثيل
(ت) صبغة التبعي

(ج) (ط) بزل السلى: وهي تقنية يتم فيها سحب السائل الأمنيوسي من رحم المرأة الحامل ، ويتم زراعة الخلايا التي يحيط بالجنين ودراستها من أجل الملاحظات الخلوية لتحديد أي تشوهات في الكروموسومات.
(2) تعدد الأجنة: تسمى ظاهرة وجود أكثر من جنين طبيعي في البذرة تعدد الأجنة. قد تكون الأجنة الإضافية نواة أو تكاملية في الأصل. على سبيل المثال ، فواكه برتقالية.

السؤال 7.
(أ) وصف آلية نقل الثغور K +. [4]
(ب) ارسم مخططًا أنيقًا معنونًا لـ L.S. من البويضة anatropous. [4]
(ج) التفريق بين ما يلي: [2]
(ط) تكوين الحيوانات المنوية والبويضات
(2) مبيض أبوكاربوس ومبيض مفصلي.
إجابة:
(أ) وفقًا للنظرية ، فإن التغيير في ضغط التمزق الذي يفتح ويغلق الثغور ناتج عن الامتصاص القابل للانعكاس وفقدان أيونات البوتاسيوم (K +). يرافق فتح الثغور الناجم عن الضوء نقل K + من الخلية الفرعية إلى الخلايا الحامية. إنها عملية تتطلب طاقة.

خلال النهار ، ينتج النشا التغيير إلى حمض الماليك الذي يتفكك في أنيون المالات ويتم تبادل H + في خلية الحراسة H + مع K + في الخلايا الفرعية. إنها عملية نشطة. تؤدي أيونات K + وأيونات مالات إلى زيادة الضغط الاسموزي ويتحرك الماء إلى الخلايا الحامية من الخلايا المحيطة. زيادة التورم ، يؤدي إلى فتح الثغور.
أثناء الليل ، انعكاس مضخة K + & # 8211 K & # 8211 ، وانخفاض الضغط الاسموزي لخلية الحراسة ، مما يؤدي إلى إغلاق الثغور من خلال الإفرازات الخارجية.

(ب) ل. البويضة Anatropous.

هيكل نموذجي. OVULE (البويضات الشبيهة)

(ج) (1) تكوين الحيوانات المنوية هو نوع خاص من الانقسام الاختزالي الذي يحدث في الخصيتين وينتج عنه إنتاج الحيوانات المنوية. تكوين البويضات هو نوع خاص من أقسام الاختزال التي تحدث في المبايض وتؤدي إلى تكوين البويضات / البويضات.
(2) عندما يكون هناك العديد من الكاربيل المجاني في زهرة مقلدة. عندما يتم دمج اثنين أو أكثر من اثنين من الكاربيل لتشكيل مركب واحد carpel- syncarpous.

السؤال 8.
(أ) شرح تعدد الأشكال بالإشارة إلى بيلة الفينيل كيتون.
(ب) اشرح آلية النسخ في خلية بدائية النواة.
(ج) اشرح عدم توافق عامل ريسس أثناء الحمل.
إجابة:
(أ) يتضمن تعدد الأشكال قدرة الجين على أن يكون له تأثيرات نمطية متعددة ، لأنه يؤثر على عدد من الشخصيات في وقت واحد. تسمى الجينات بالجينات متعددة الاتجاهات.

مثال :
ينتج جين متنحي متحور لاضطراب بيلة الفينيل كيتون تعبيرات نمطية متعددة - تخلف عضلي وانخفاض في تصبغ الشعر والجلد. يرجع سبب بيلة الفينيل كيتون إلى صفة جسمية متنحية. يفتقر إلى إنزيم لتحويل فينيل ألانين إلى تيروزين. يتراكم فينيل ألانين في الجسم. ينتج عن التراكم في الدماغ تخلف عقلي.

(ب) النسخ هو عملية نسخ المعلومات الجينية من خيط إحساس الحمض النووي إلى الحمض النووي الريبي ، يتم نسخ جزء فقط من الحمض النووي بحيث يتم نسخ واحد فقط من الخيطين. في بدائيات النوى ، يحدث النسخ بالتلامس مع السيتوبلازم حيث يكمن الحمض النووي في السيتوبلازم. يتطلب النسخ إنزيم بوليميريز الحمض النووي الريبي المعتمد على الحمض النووي. تحتوي بدائيات النوى على بوليميريز واحد فقط من الحمض النووي الريبي الذي يصنع جميع أنواع الحمض النووي الريبي. يتضمن النسخ الخطوات التالية:

  1. تنشيط النيوكليوتيدات في النيوكليوبلازم من خلال الفسفرة. هذه هي ATP و GTP و UTP و CTP.
  2. يرتبط RNA واحد & # 8211 بوليميراز بموقع المروج / منطقة قالب الحمض النووي. يحدث فتح سلسلة من قطع الحمض النووي عن طريق فك اللفائف من موقع ارتباط البوليميراز.
  3. يحدث بدء النسخ عن طريق الاقتران التكميلي للنيوكليوتيدات المنشطة المجانية مع قواعد النيتروجين لقالب الحمض النووي.
  4. يعمل ثلاثي فوسفات الريبونوكليوتيد المنشط كركيزة ويوفر أيضًا طاقة للبلمرة على قالب يتبع قاعدة التكامل.
  5. عندما يبدأ تكوين سلسلة الحمض النووي الريبي ، ينفصل عامل سيغما (cr) لبوليميراز الحمض النووي الريبي. يتحرك بوليميراز الحمض النووي الريبي على طول منطقة الترميز لقالب الحمض النووي مما يتسبب في استطالة سلسلة الحمض النووي الريبي.
  6. يتوقف تخليق الحمض النووي الريبي بمجرد وصول البوليميراز إلى منطقة النهاية. عامل Rh (p) مطلوب لهذا الغرض. منطقة Terminator لها إشارة توقف.
  7. يساعد عامل Rh على إطلاق RNA الناشئ ، يسقط RNA polymerase. إنه إنهاء النسخ.
  8. في بدائيات النوى ، لا يتطلب تخليق / n-RNA أي معالجة لتصبح نشطة ويحدث كل من النسخ والترجمة في العصارة الخلوية نفسها.
  9. يمكن أن تبدأ الترجمة قبل أن يتم نسخ m-RNA بالكامل ، أنا. ه. ، النسخ والترجمة يمكن أن يقترن.

(ج) البشر الذين لديهم مستضد على كرات الدم الحمراء هم Rh + بينما الآخرون الذين ليس لديهم هم Rh. من خلال Rh + يهيمن على Rh- وهو متنحي.

في الزواج بين امرأة Rh & # 8211 و Rh + رجل ، عندما تصبح المرأة حاملاً ، تصبح حساسة أثناء حملها لطفل Rh + الأول داخل رحمها. وذلك لأن بعض كرات الدم الحمراء من الجنين النامي تدخل إلى مجرى دم الأم أثناء النمو مما يجعلها تنتج أجسامًا مضادة لـ Rh. الطفل الأول لهؤلاء الوالدين طبيعي ويتم تسليمه بأمان. ومع ذلك ، إذا حملت مثل هذه الأم مرة أخرى ، فسوف يتعرض الأجنة الناتجة عن عامل Rh + لأجسام مضادة لـ Rh التي تنتجها الأم.

نتيجة لذلك ، سيحدث ضرر خطير لكرات الدم الحمراء للجنين النامي مسبباً داء الكريات الحمر. يؤدي المرض إلى موت الجنين النامي قبل الولادة أو بعد الولادة.

السؤال 9.
(أ) مناقشة مختلف الاستراتيجيات داخل الموقع وخارجه لحفظ التنوع البيولوجي. [4]
(ب) ضع قائمة بأربعة تطبيقات لزراعة الأنسجة. [4]
(ج) اذكر العامل المسبب والتدابير الوقائية لكل مما يلي: [2]
(ط) السيلان
(2) الالتهاب الرئوي.
إجابة:
(أ) الحفظ في الموقع هو الحفظ في الموقع. يتم تنفيذه بواسطة
(ط) بساتين مقدسة
(2) البحيرات المقدسة
(3) المناطق المحمية - يوجد في الهند 89 متنزهًا وطنيًا ، و 492 محمية للحياة البرية ، و 13 محمية في المحيط الحيوي. تشمل المناطق المحمية المناطق الأرضية والأراضي الرطبة والنظام البيئي المائي.

يعتني مجلس التنمية البيئية للتشجير (NAEB) بالتشجير ،
(ط) غرس الأشجار واستعادة البيئة والتنمية الإيكولوجية للبلد ،
(2) يسمى الحفظ خارج الوضع الطبيعي أيضًا بالحفظ خارج الموقع. يتم تنفيذه بواسطة:

(أ) حديقة نباتية وحيوانية
(2) بنوك الجينات - تحافظ بنوك جينات البذور وبنوك الجينات الميدانية على الأصول الوراثية للنباتات والحيوانات المختلفة. متنزهات سفاري الحياة البرية
(3) تقنيات الحفظ بالتبريد للحفاظ على بيض الأنواع المهددة ،
(4) تقنية زراعة الأنسجة لإكثار النباتات.

(ب) تطبيقات زراعة الأنسجة:
(ط) التكاثر النسيلي السريع & # 8211 يستخدم النبات المستأصل لإنتاج العديد من النباتات من نفس النمط الجيني ،
(2) من الاختلاف somaclonal ، تم إنتاج عدد من الأصناف المفيدة ، على سبيل المثال ، طماطم عالية العمر الافتراضي ،
(3) النباتات الخالية من الفيروسات باستخدام ثقافة Meristem ،
(4) يمكن زراعة الأجنة التي لا تعيش عادة داخل البذور في زراعة الأنسجة. إنقاذ الأجنة مفيد في التهجين بين الأنواع.

(ج) (1) السيلان: هو مرض منقول جنسياً تسببه بكتيريا Diplococcus Neisseriagonorrhoeal. ينتقل عن طريق العلاقة الجنسية الحميمة. يتم منعه عن طريق:

  • تجنب ممارسة الجنس مع شركاء مجهولين ،
  • استخدم الواقي الذكري أثناء الجماع
  • استشر طبيب مؤهل للكشف المبكر والعلاج الكامل.

(2) الالتهاب الرئوي: يحدث بسبب Streptococcus أو Diplococcus pneumoniae أو المستدمية النزلية. ينتقل المرض عن طريق عدوى الرذاذ. يمكن الوقاية من المرض عن طريق تغطية الفم لمنع استنشاق الرذاذ عند زيارة شخص مصاب ، يجب تعقيم المواد التي يستخدمها المريض بشكل صحيح. التخلص السليم من بلغم الشخص المصاب.

السؤال 10.
(أ) قم بتسمية مكونات lac operon وناقش دورها.
(ب) اذكر أهمية الحيوانات المحورة جينيا.
(ج) أعط فرقًا واحدًا مهمًا بين:
(ط) Electroporation و Gene Gun.
(2) ECG و EEG
إجابة:
(أ) المكونات المختلفة لـ lac operon هي الجين المنظم ، وجين المروج ، وجين المشغل والجينات الهيكلية. تقوم الجينات التنظيمية بتركيب مادة كيميائية تسمى المكبّر والتي تتحد مع جين المشغل لإيقاف تشغيل الأوبون. في وجود محفز & # 8211 اللاكتوز ، يربط المثبط مع اللاكتوز لتحرير جين المشغل ويتم تشغيل الأوبون. الجين المروج هو موقع التعرف على بوليميراز الحمض النووي الريبي عند تشغيل المشغل. يمر بوليميراز الحمض النووي الريبي عبر جين المشغل ويصل إلى الجينات الهيكلية لنسخها. يتحكم جين المشغل في التعبير عن الأوبون عن طريق تشغيل وإيقاف الجينات الهيكلية التي تقوم بنسخ الحمض النووي الريبي متعدد الكرياتين. يحتوي أوبرون لاك على ثلاثة جينات هيكلية Z و Y و A. ينتج الحمض النووي الريبي المتعدد الكرياتين ثلاثة إنزيمات جالاكتوزيداز بيرميز (في وقت مبكر من اللاكتوز إلى بكتيريا) ، β-galactosidase (تكسر اللاكتوز إلى جلوكوز وجلاكتوزيداز) وجالاكتوزيد أسيتيلاز (نقل مجموعة الأسيتيل إلى β-galactosidase).

ملحوظة: المحرض عبارة عن مادة كيميائية بشكل عام ، حيث ترتبط الركيزة بضاغط لتحرير عامل التشغيل & # 8216 الجين.

(ب) الحيوانات المعدلة وراثيا لها أهمية كبيرة
(ط) لدراسة علم وظائف الأعضاء والتطور الطبيعي ، وعمل الجينات ، وتنظيمها ، إلخ.
(2) تم العثور على دراسة قابلية الإصابة بالأمراض للأمراض المختلفة للحيوانات المعدلة وراثيا الخاضعة للرقابة الوراثية لدراسة كيفية مشاركة الجينات في تطور الأمراض ،
(3) عن طريق إدخال الجينات لبعض المنتجات البيولوجية الهامة وخاصة الحيوانات الحلوب ، يمكن استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا للزراعة الجزيئية أو الحصاد الجزيئي ، على سبيل المثال ، بروتين a-1 المضاد للتربسين لعلاج انتفاخ الرئة ، اللاكتوفيرين (بقرة) ،
(4) اختبار سلامة اللقاحات على الحيوانات المحورة جينيا قبل التسويق ،
(5) اختبار السلامة الكيميائية ،
(6) الماشية المعدلة وراثيا مع الجين الإضافي لهرمون النمو والقيصينات تعطي إنتاجية عالية جدا من الحليب.أنتجت البقرة المعدلة وراثيا روزي لبنًا يحتوي على نسبة عالية من البروتين يحتوي على ألفا لاكتالبومين بشري وهو نظام غذائي متوازن من الناحية التغذوية للأطفال الرضع.

(ج) (1) التثقيب الكهربائي: طريقة لزيادة امتصاص الحمض النووي بواسطة البروتوبلاست من خلال التعرض المسبق للجهد العالي الذي ينتج عنه تكوين مؤقت لمسام صغيرة في غشاء الخلية.

Gene Gun: هو النقل غير النواقل للجين حيث يتم قصف التنغستن أو جزيئات الذهب المغطاة بالجينات المرغوبة في الخلايا بقوة كبيرة. و

(2) ECG (تخطيط القلب الكهربائي): يعطي معلومات حيوية حول

(3) مخطط كهربية الدماغ (EEG): يمثل النشاط الكهربائي العفوي للدماغ. يختلف شكل الموجات اختلافًا كبيرًا اعتمادًا على درجة الأنشطة في الدماغ نفسه.
أو
هو جهاز يستخدم لتسجيل توليد النبضات الكهربائية ونقلها عبر الأنسجة الموصلة لعضلات القلب.


مقدمة

على مدى عقود ، كان مهندسو التمثيل الغذائي وعلماء الأحياء الاصطناعية يحاولون تطوير مبادئ للهندسة البيولوجية من "الألف إلى الياء" للسماح بالبناء العقلاني للدوائر والأنظمة المعقدة مع التعبير المتوازن للجينات باستخدام لبنات البناء المناسبة. يجب أن تظهر هذه الدوائر والأنظمة التركيبية تحكمًا زمنيًا ومكانيًا ويجب أن تكون متعامدة ، ولا تقتصر على الآلية التنظيمية للخلية المضيفة. يتم نقل المعلومات الجينية في الخلية من DNA إلى RNA ومن RNA إلى البروتين عن طريق النسخ والترجمة ، على التوالي. تؤثر العديد من العناصر الهيكلية ، مثل المروجين ، ومواقع الربط الريبوزومية (RBS) ، والمُنهي ، والمناطق غير المترجمة 5′ و 3′ (UTRs) ، على كفاءة هذه العمليات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن عددًا لا يحصى من البروتينات التنظيمية والـ RNAs الصغيرة غير المشفرة (على سبيل المثال ، المحولات الريبية ، الريبوزيمات) تتحكم في التعبير عن الجين. وبالتالي ، هناك حاجة إلى فهم دقيق لتنظيم التعبير الجيني على المستويات المذكورة أعلاه وتفاعل العناصر الجينية التنظيمية. لتحقيق هذا الهدف ، فإن مكتبات من عناصر التحكم الطبيعية والاصطناعية التي تؤثر على التعبير الجيني على مستويات مختلفة في الإشريكية القولونية و خميرة الخميرة تمت دراستها ، ويتم تطوير العديد من وحدات التحكم الاصطناعية 1،2،3،4،5. ومع ذلك ، هناك نقص في اللبنات الأساسية الموصوفة أعلاه للبكتيريا الأقل دراسة ولكن ذات الأهمية الصناعية العالية ، مثل البكتيريا الشعاعية.

مع ظهور تقنيات التسلسل من الجيل التالي ، أصبح من الواضح أن إمكانات التخليق الحيوي للبكتيريا الشعاعية قد تم التقليل من شأنها ، لأن جينوماتها تحتوي على ثروة خفية من مجموعات جينات الأيض الثانوية الصامتة 6،7،8. ترتبط مشكلة وجود مجموعات جينية نائمة أو غير معلنة بشكل أساسي بالشبكات التنظيمية المعقدة والضيقة التي تنسق بدقة إنتاج المستقلب في البكتيريا وتستجيب للإشارات البيئية وداخل الخلايا المختلفة 9،10. تتمثل إحدى الاستراتيجيات للتغلب على هذه العقبة في فصل التخليق الحيوي للمستقلب عن الشبكات التنظيمية الموجودة في الخلية عن طريق وضع الجينات في مجموعة تحت سيطرة المروجين التكويني أو المتعامد المحرض. تم بذل الكثير من الجهد لتطوير العناصر الهندسية التي تحكم التعبير عن الجينات على مستوى النسخ 11 ، 12 ، 13 ، 14 ، 15 ، 16 ، 17 ، 18 ، 19. ومع ذلك ، فإن عناصر التحكم ، مثل RBSs ، و terminators وعلامات التدهور ، التي تؤثر على الجوانب المتبقية من العملية ويمكن استخدامها لموازنة التعبير ، وبالتالي التحكم في الإخراج ، ظلت مهملة في Actinobacteria. ينتج تعقيد مجموعات الجينات المستقلب الثانوي 20،21 عن وجود اختناقات تتطلب التعبير عن منتجات جينية متعددة من مجموعات الجينات التي يتم التحكم فيها بشكل فردي ، وبالتالي ، هناك طلب على مكتبات المروجين ، و RBSs و terminators. بالإضافة إلى ذلك ، هناك حاجة إلى التسلسلات ذات الحد الأدنى من الهوية لتجنب إعادة التركيب المتماثل مع الأوبرونات الاصطناعية وما يترتب على ذلك من عدم الاستقرار الجيني. أحد العقبات الإضافية التي يجب أخذها في الاعتبار أثناء تصميم مجموعات الجينات الأيضية هو السياق الجيني ، والذي قد يؤثر على نشاط عناصر مثل المحفزات و RBSs 22،23. لذلك ، هناك حاجة ماسة إلى عناصر تنظيمية متنوعة ، مثل المروجين ، و RBSs ، و terminators ، والأدوات الوراثية التي ستسمح للباحثين بقياس وتوصيف واختيار عناصر التحكم المناسبة للجين ذي الأهمية في Actinobacteria.

هنا ، نُبلغ عن تطوير أداة وراثية - أ في الجسم الحي محدد RBS - لاختيار أفضل RBS اصطناعي لأي جين مهم ، مما يتيح التحكم المنطقي في مستوى التعبير البروتيني. تسمح المنهجية المصممة بتجربة واحدة لاختبار نشاط عدد كبير من RBS المركبة عشوائيًا واختيار أفضل RBS مع النشاط المطلوب المناسب لجين معين. علاوة على ذلك ، توفر هذه الأداة إمكانية اختيار RBS الأمثل للجين المعني بالاقتران مع أي محفز ، نظرًا لحقيقة أن السياق الجيني للعنصر الأخير قد يؤثر على نشاط الأول. باستخدام هذه الأداة ، أنشأنا مكتبة من RBS الاصطناعية لـ gusA الجين 24 ، مما أدى إلى وجود عدد من المراسلين يتمتعون بنقاط قوة تعبير مختلفة ، وبالتالي نطاق ديناميكي مرن. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطوير أداة وراثية للقياس الموثوق به لكفاءة الإنهاء ومكتبة من النهايات الجوهرية التي تلعب دورًا مهمًا في تنظيم النسخ من أجل ستربتوميسيس. لأول مرة ، تم استخدام علامة تدهور طرفية مكونة من 11 حمضًا أمينيًا لتنظيم التعبير الجيني على مستوى ما بعد الترجمة في ستربتوميسيس، وتم إنشاء العديد من المتغيرات لمراسل GusA غير المستقر. في الختام ، فإن مجموعة عناصر التحكم الموضحة أعلاه توفر إمكانية التنظيم المكاني والزماني والكمي للتعبير الجيني عند مستويات النسخ و / أو الترجمة ، مما يسهل القدرة على التغلب على الاختناقات والحصول على كميات أكبر من المركبات وكذلك السامة و بروتينات غير ضارة. الميزات الموصوفة تجعل هذه الأدوات واعدة جدًا للهندسة الأيضية والتكنولوجيا الحيوية ستربتوميسيس والبكتيريا الشعاعية الأخرى.


محتويات

  • ال لاك يتكون Operon من 3 جينات هيكلية ، ومُحفِّز ، ومُنهي ، ومنظم ، وعامل. الجينات الهيكلية الثلاثة هي: لاكز, لاسي، و لاكا.
    • لاكز يشفر β-galactosidase (LacZ) ، وهو إنزيم داخل الخلايا يشق السكاريدلاكتوز إلى الجلوكوز والجالاكتوز.
    • لاسي بتشفير بيرمياز بيتا جالاكتوزيد (LacY) ، وهو عبارة عن جهاز عبر الغشاء يضخ β-galactosides بما في ذلك اللاكتوز في الخلية باستخدام تدرج بروتون في نفس الاتجاه. يزيد Permease من نفاذية الخلية إلى β-galactosides.
    • لاكا يرمز β-galactoside transacetylase (LacA) ، وهو إنزيم ينقل مجموعة الأسيتيل من acetyl-CoA إلى β-galactosides.

    فقط لاكز و لاسي يبدو أنه ضروري لتقويض اللاكتوز.

    تحرير التسمية الجينية

    تستخدم الاختصارات المكونة من ثلاثة أحرف لوصف الأنماط الظاهرية في البكتيريا بما في ذلك بكتريا قولونية.

    • لاك (القدرة على استخدام اللاكتوز) ،
    • له (القدرة على تصنيع هيستيدين الأحماض الأمينية)
    • موت (حركة السباحة)
    • SM R (مقاومة المضاد الحيوي الستربتومايسين)

    في حالة Lac ، فإن الخلايا البرية هي Lac + وهي قادرة على استخدام اللاكتوز كمصدر للكربون والطاقة ، بينما لا يمكن لمشتقات Lac- المتحولة استخدام اللاكتوز. عادةً ما تُستخدم الأحرف الثلاثة نفسها (أحرف صغيرة ، مائلة) لتسمية الجينات المشاركة في نمط ظاهري معين ، حيث يتم تمييز كل جين مختلف أيضًا بحرف إضافي. ال لاك الجينات ترميز الإنزيمات لاكز, لاسي، و لاكا. الرابع لاك الجين لاسي، ترميز مثبط اللاكتوز - "أنا" تعني الحث.

    يمكن للمرء أن يميز بين الهيكلي الجينات التي تشفر الإنزيمات ، والجينات المنظمة التي تشفر البروتينات التي تؤثر على التعبير الجيني. يوسع الاستخدام الحالي تسمية النمط الظاهري لتطبيقه على البروتينات: وبالتالي ، فإن LacZ هو المنتج البروتيني لـ لاكز الجين ، β-galactosidase. تؤثر التسلسلات القصيرة المختلفة التي ليست جينات أيضًا على التعبير الجيني ، بما في ذلك لاك المروجين، لاك ص، و ال لاك المشغل أو العامل، لاك س. على الرغم من أنه ليس استخدامًا قياسيًا تمامًا ، إلا أن الطفرات تؤثر لاك س يشار إليها باسم لاك س ج ، لأسباب تاريخية.

    تحكم محدد في لاك تعتمد الجينات على توفر ركيزة اللاكتوز للبكتيريا. لا تنتج البكتيريا البروتينات عندما لا يتوفر اللاكتوز كمصدر للكربون. ال لاك يتم تنظيم الجينات في أوبرون ، أي أنها موجهة في نفس الاتجاه المجاور للكروموسوم مباشرة ويتم نسخها إلى جزيء مرنا متعدد الكريات واحد. يبدأ نسخ جميع الجينات بربط إنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي (RNAP) ، وهو بروتين مرتبط بالحمض النووي ، والذي يرتبط بموقع ارتباط محدد للحمض النووي ، وهو المحفز ، مباشرة من الجينات. يتم دعم ربط بوليميريز الحمض النووي الريبي بالمحفز بواسطة بروتين المنشط المرتبط بـ cAMP (CAP ، المعروف أيضًا باسم بروتين مستقبل cAMP). [4] ومع ذلك ، فإن لاسي الجين (الجين التنظيمي لـ لاك operon) ينتج بروتينًا يمنع بروتين RNAP من الارتباط بمشغل المشغل. لا يمكن إزالة هذا البروتين إلا عندما يرتبط به اللاكتوز ويثبط نشاطه. البروتين الذي يتكون من لاسي يُعرف الجين باسم مثبط اللاكتوز. نوع التنظيم الذي لاك يُشار إلى الأوبرا على أنه محرض سلبي ، مما يعني أن الجين قد تم إيقافه بواسطة العامل التنظيمي (لاك مثبط) ما لم يتم إضافة جزيء (اللاكتوز). بسبب وجود ال لاك مثبط البروتين ، المهندسين الوراثي الذين يحل محل لاكز سيتعين على الجين الذي يحتوي على جين آخر أن ينمي البكتيريا التجريبية على أجار مع توفر اللاكتوز عليه. إذا لم يفعلوا ذلك ، فلن يتم التعبير عن الجين الذي يحاولون التعبير عنه لأن البروتين المثبط لا يزال يمنع RNAP من الارتباط بالمحفز ونسخ الجين. بمجرد إزالة القامع ، يبدأ RNAP بعد ذلك في نسخ جميع الجينات الثلاثة (لاكزيا) في مرنا. كل من الجينات الثلاثة الموجودة على شريط mRNA له تسلسل Shine-Dalgarno الخاص به ، لذلك تتم ترجمة الجينات بشكل مستقل. [5] تسلسل الحمض النووي لـ بكتريا قولونية لاك أوبرون لاكزيا مرنا و لاسي الجينات متوفرة من GenBank (عرض).

    آلية التحكم الأولى هي الاستجابة التنظيمية للاكتوز ، والذي يستخدم داخل الخلايا البروتين التنظيمي دعا مثبط اللاكتوز لعرقلة إنتاج β-galactosidase في حالة عدم وجود اللاكتوز. ال لاسي الترميز الجيني للقمع يقع بالقرب من لاك أوبرون ويتم التعبير عنه دائمًا (التأسيسي). إذا كان اللاكتوز مفقودًا من وسط النمو ، فإن المكبِط يرتبط بإحكام شديد بتسلسل DNA قصير في اتجاه مجرى المروج بالقرب من بداية لاكز دعا مشغل lac. يتداخل القامع المرتبط بالمشغل مع ربط RNAP بالمُعزز ، وبالتالي فإن ترميز mRNA لاكز و LacY يتم فقط عند مستويات منخفضة جدًا. عندما تنمو الخلايا في وجود اللاكتوز ، فإن مستقلب اللاكتوز المسمى allolactose ، مصنوع من اللاكتوز بواسطة منتج لاكز الجين ، يرتبط بالقمع ، مما يتسبب في حدوث تحول خيفي. وبالتالي ، بعد تغييره ، يتعذر على المكبّر الارتباط بالمشغل ، مما يسمح لـ RNAP بنسخ ملف لاك الجينات وبالتالي يؤدي إلى مستويات أعلى من البروتينات المشفرة.

    آلية التحكم الثانية هي الاستجابة للجلوكوز ، والذي يستخدم جهاز homodimer بروتين منشط الهدم (CAP) لزيادة إنتاج β-galactosidase بشكل كبير في غياب الجلوكوز. أحادي فوسفات الأدينوزين الدوري (cAMP) هو جزيء إشارة يتناسب انتشاره عكسياً مع انتشار الجلوكوز. إنه يرتبط بـ CAP ، والذي بدوره يسمح لـ CAP بالربط بموقع ربط CAP (تسلسل DNA 16 نقطة أساس في المنبع للمروج على اليسار في الرسم البياني أدناه ، حوالي 60 نقطة أساس في المنبع من موقع بدء النسخ) ، [6 ] مما يساعد RNAP في الارتباط بالحمض النووي. في حالة عدم وجود الجلوكوز ، يكون تركيز cAMP مرتفعًا ، كما أن ارتباط CAP-cAMP بالحمض النووي يزيد بشكل كبير من إنتاج β-galactosidase ، مما يمكّن الخلية من تحلل اللاكتوز وإطلاق الجالاكتوز والجلوكوز.

    في الآونة الأخيرة ، تم عرض استبعاد المحرض لمنع التعبير عن لاك أوبرون عند وجود الجلوكوز. يتم نقل الجلوكوز إلى الخلية عن طريق نظام إنزيم فسفوتانسفيراز المعتمد على PEP. يتم نقل مجموعة الفوسفات من phosphoenolpyruvate عبر سلسلة فسفرة تتكون من بروتينات HPr و EIA وبروتينات PTS الخاصة بالجلوكوز EIIA Glc و EIIB Glc ، المجال السيتوبلازمي لناقل الجلوكوز EII. يصاحب نقل الجلوكوز فسفرته بواسطة EIIB Glc ، مما يؤدي إلى تصريف مجموعة الفوسفات من بروتينات المواد السمية الثابتة الأخرى ، بما في ذلك EIIA Glc. يرتبط الشكل غير الفسفوري لـ EIIA Glc بـ لاك ويمنعه من إدخال اللاكتوز إلى الخلية. لذلك ، في حالة وجود كل من الجلوكوز واللاكتوز ، فإن نقل الجلوكوز يمنع نقل محفز لاك أوبرون. [7]

    تحرير هيكل القامع

    إن lac repressor عبارة عن بروتين مكون من أربعة أجزاء ، وهو رباعي الأجزاء ، مع وحدات فرعية متطابقة. تحتوي كل وحدة فرعية على شكل حلزون دوراني (HTH) قادر على الارتباط بالحمض النووي. موقع المشغل حيث يرتبط القامع هو تسلسل DNA مع تناظر متكرر معكوس. يرتبط نصفي الحمض النووي للمشغل معًا باثنين من الوحدات الفرعية للقمع. على الرغم من أن الوحدتين الفرعيتين الأخريين للقمع لا تفعل أي شيء في هذا النموذج ، إلا أن هذه الخاصية لم يتم فهمها لسنوات عديدة.

    في النهاية تم اكتشاف أن هناك مشغلين إضافيين متورطين في لاك اللائحة. [8] واحد (O3) تقع حول −90 نقطة أساس في المنبع من O1 في نهاية لاسي الجين ، والآخر (O2) حوالي +410 نقطة أساس في المصب من O1 في الجزء الأول من لاكز. لم يتم العثور على هذين الموقعين في العمل المبكر لأن لهما وظائف زائدة عن الحاجة والطفرات الفردية لا تؤثر على القمع كثيرًا. الطفرات الفردية لأي من O2 أو س3 لها تأثير 2 إلى 3 أضعاف فقط. ومع ذلك ، تتضح أهميتها من خلال حقيقة أن طفرة مزدوجة معيبة في كل من O2 و O3 تم إلغاء قمعه بشكل كبير (بحوالي 70 ضعفًا).

    في النموذج الحالي ، لاك repressor مرتبط في وقت واحد بكل من المشغل الرئيسي O1 وإما O2 أو س3. ينفصل الحمض النووي المتداخل من المجمع. تشير الطبيعة الزائدة عن الحاجة إلى المشغلين الصغيرين إلى أنه ليس من المهم وجود مجمع حلقي محدد. تتمثل إحدى الأفكار في أن النظام يعمل من خلال الربط إذا كانت إصدارات القامع المقيدة من O1 للحظات ، الارتباط بعامل صغير يبقيه في الجوار ، بحيث يمكن أن يعاود الالتفاف بسرعة. هذا من شأنه أن يزيد من تقارب القامع لـ O1.

    آلية الحث تحرير

    المكبِط هو بروتين خيفي ، أي يمكنه أن يفترض أحد شكلين مختلفين قليلاً ، يكونان في حالة توازن مع بعضهما البعض. في أحد الأشكال ، سيرتبط المكبِط بالحمض النووي للمشغل بخصوصية عالية ، وفي الشكل الآخر فقد خصوصيته. وفقًا للنموذج الكلاسيكي للحث ، فإن ارتباط المحرض ، سواء أكان الألولاكتوز أو IPTG ، بالمُثبِّت يؤثر على توزيع المثبط بين الشكلين. وهكذا ، يستقر المكبِط مع المحفز في التشكل غير المرتبط بالحمض النووي. ومع ذلك ، لا يمكن أن يكون هذا النموذج البسيط هو القصة الكاملة ، لأن القامع مرتبط بثبات تام بالحمض النووي ، ومع ذلك يتم إطلاقه بسرعة عن طريق إضافة المحفز. لذلك ، يبدو من الواضح أن المحفز يمكنه أيضًا الارتباط بالقمع عندما يكون القامع مرتبطًا بالفعل بالحمض النووي. لا تزال الآلية الدقيقة للربط غير معروفة تمامًا. [9]

    دور تحرير الربط غير المحدد

    يلعب الارتباط غير المحدد للقمع بالحمض النووي دورًا مهمًا في قمع وتحريض لاك أوبرون. موقع الربط المحدد لبروتين Lac-repressor هو المشغل. يتم التوسط في التفاعل غير المحدد بشكل أساسي من خلال تفاعلات الشحن والشحن بينما يتم تعزيز الارتباط بالمشغل عن طريق التفاعلات الكارهة للماء. بالإضافة إلى ذلك ، هناك وفرة من تسلسلات الحمض النووي غير المحددة التي يمكن أن يرتبط بها القامع. بشكل أساسي ، يعتبر أي تسلسل ليس عامل التشغيل غير محدد. أظهرت الدراسات أنه بدون وجود ارتباط غير محدد ، لا يمكن أن يحدث الحث (أو عدم الضغط) لـ Lac-operon حتى مع المستويات المشبعة من المحرض. لقد تم إثبات أنه بدون ربط غير محدد ، يكون المستوى الأساسي للتحريض أصغر بعشرة آلاف مرة مما لوحظ في العادة. وذلك لأن الحمض النووي غير النوعي يعمل كنوع من "الحوض" للبروتينات المثبطة ، مما يشتت انتباهها عن المشغل. التسلسلات غير المحددة تقلل من كمية المكثف المتاح في الخلية. وهذا بدوره يقلل من كمية المحرض المطلوب لإلغاء ضغط النظام. [10]


    أساليب

    المواد النباتية

    Solanum lycopersicum تم استخدام "Moneymaker" كمصدر للمواد النباتية. نمت الشتلات في مزرعة أجار لمدة 21 يومًا. لجمع الجذور ، نمت الشتلات على طول ورق ترشيح Whattman وتم تغذيتها ب 0.5 MS وسط لمدة 28 يومًا. بالنسبة للعينات الأخرى ، تم زراعة النباتات في الدفيئة وتم حصاد الأنسجة أو الأعضاء التالية: أوراق ممددة بالكامل ، أزهار عند تخليق ، أزهار بعد يومين من تخليق ، ثمار بقطر 5 مم ، ثمار بقطر 18 مم ، خضراء ناضجة الثمار ، الثمار في مرحلة الكسر ، الثمار في مرحلة التحول والثمار في مرحلة النضج الأحمر. تم تجميد المواد النباتية في نيتروجين سائل وطحن باستخدام IKA A11basic (Staufen ، ألمانيا). تم تخزين المادة في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

    تحديد تسلسل TCP والاستنساخ

    من أجل تحديد جينات الطماطم المشفرة افتراضيًا لعوامل نسخ TCP ، تم البحث في قاعدة بيانات شبكة الجينوم Solanaceae (SGN) -Unigene (لـ ESTs) وكذلك متواليات BAC المودعة بواسطة مشروع تسلسل الطماطم الدولي باستخدام خوارزمية TBLASTN مع بروتينات Arabidopsis TCP أو مجالات TCP كتسلسل استعلام. بالنسبة للجينات التي تم تحديدها ، تم الحصول على استنساخ EST ، عند توفرها ، من معهد Boyce Thompson لأبحاث النبات في جامعة كورنيل (إيثاكا ، نيويورك) وأعيد ترتيبها لتأكيد الهوية وإثبات وجود أو عدم وجود 5 'و 3' نهايات إطار قراءة مفتوح. في حالة عدم وجود أحد طرفي إطار القراءة المفتوح أو كليهما أو في حالة عدم توفر EST ، تم تمديد تسلسل mRNA بمقدار 5 'و / أو 3' RACE ، كما حدث لثلاثة متواليات cDNA الجزئية المودعة سابقًا في GenBank (AAO45726 ، AAO45727 ، AAO45728 [31]). لثلاثة مفترض TCP تسلسل الجينات الموجود في تسلسل BAC فقط ، تم أخذ تسلسل الحمض النووي الجيني كقالب لتصميم بادئات RACE.لهذا الغرض ، تم عزل الحمض النووي الريبي من قشرة فاكهة الطماطم في 7 مراحل نمو (7 أيام بعد التلقيح حتى تنضج حمراء). تم عزل mRNA باستخدام RNAeasy Plant MiniKit (50) (QIAGEN). تم خلط جميع الحمض النووي الريبي معًا بكميات متساوية. 5 و 3 مكتبات cDNA جاهزة لـ RACE تم صنعها من RNA باستخدام مجموعة تضخيم Clontech SMART RACE (Westburg B.V. ، Leusden ، هولندا). تم تضخيم إطارات القراءة المفتوحة كاملة الطول بواسطة PCR باستخدام ESTs (عند احتواء الجسم بالكامل) ، أو استنساخ RACE 5 و 3 ، أو الحمض النووي الجيني. تم عزل الحمض النووي الجينومي من الأوراق باستخدام طريقة موصوفة سابقًا [48]. يتم سرد جميع قوالب تضخيم إطار القراءة المتسلسلة والمفتوحة ، وكذلك الاشعال المستخدمة في RACE PCR وإطار القراءة المفتوح PCR في الملف الإضافي 2: الجدول S4 و S5. تم تضخيم إطارات القراءة المفتوحة باستخدام مواد أولية بامتداد CACC 5 بوصة ، وتنقيتها باستخدام QIAquick PCR Purification Kit أو تمت تنقيتها من الجل باستخدام مجموعة استخراج هلام QIAquick (Qiagen) وربطها بين GATEWAY AttL1 و Attمواقع L2 في pENTR / D-TOPO باستخدام مجموعات استنساخ Invitrogen pENTR ™ Directional TOPO® (http://www.lifetechnologies.com) ، مما ينتج متجهات دخول GATEWAY. تم تحويل المنتجات المرتبطة إلى بكتريا قولونية DH5α الخلايا المختصة بالتثقيب الكهربائي. تم فحص جميع استنساخ الدخول عن طريق تحليل التسلسل (مجموعة تسلسل BigDye ، النظم الحيوية التطبيقية). (مجموعة تسلسل دورة DYEnamic ET Terminator (Dett) من Amersham Biosciences ، GE Healthcare). تم إيداع تسلسلات الحمض النووي الريبي المرسال لأول 24 SlTCPs في GenBank تحت أرقام الانضمام المدرجة في الجدول 1.

    تحليلات النشوء والتطور

    تمت مقارنة متواليات بروتين TCP في البندورة مع جميع الـ 24 A. thaliana بروتينات TCP. تم إجراء محاذاة تسلسل متعددة باستخدام Muscle [49] كما هو مطبق في MEGA v5.10 [50]. تم الحصول على إعادة البناء الوراثي من خلال طريقة NJ (الانضمام إلى الجوار) [51] باستخدام نموذج استبدال Jones-Taylor-Thornton (JTT) بمعدلات توزيع غاما (5 فئات) بين المواقع مع تحليل التمهيد باستخدام 500 مكرر.

    تحليل التعبير الجيني

    تم إجراء استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام كاشف TriPure (Roche Diagnostics ، إنديانابوليس ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم إجراء علاج DNAase باستخدام DNAase I (Invitrogen ، بريدا ، هولندا) وفقًا للبروتوكول. تم استخدام أعمدة RNeasy (Qiagen ، Venlo ، هولندا) لتنقية الحمض النووي الريبي. تم إجراء قياسات التركيز الكمية والنوعية باستخدام مقياس الطيف الضوئي Nanodrop ND-1000 (تقنيات NanoDrop ، ديلاوير ، الولايات المتحدة الأمريكية).

    لتحديد تركيزات النص ، تم إجراء RT-PCR في الوقت الحقيقي الكمي في نسختين بيولوجيتين. باختصار ، تم استخدام 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي لتخليق (كدنا) باستخدام مجموعة كواشف النسخ العكسي TaqMan (أنظمة روش الجزيئية ، برانشبرغ ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تصميم المواد الأولية باستخدام Beacon Designer (Biosoft International ، Palo Alto ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم شراؤها من Biolegio (Nijmegen ، هولندا). تم إجراء PCR في الوقت الحقيقي في نظام اكتشاف PCR أحادي اللون MyIQ (Bio-Rad ، Veenendaal ، هولندا) باستخدام البرنامج التالي: 3 دقائق تمسخ عند 94 درجة مئوية ، 40 دورة من 15 ثانية عند 94 درجة مئوية و 30 ثانية عند 60 درجة مئوية ، متبوعًا بتدرج منحنى ذوبان لتحليل خصوصية أزواج التمهيدي لجين معين. لم يتم استخدام عناصر تحكم في القوالب كفراغات وتم استخدام β-Actin كجين مرجعي بناءً على أقل اختلاف لوحظ في أنسجة الطماطم الـ 11. للطفرات الناضجة ، Cnr, رين, ولا، والهدم SlAP2a، تم عزل RNA من Breaker + 7 باستخدام مجموعة صغيرة من InviTrap® Spin Plant RNA (http://www.invitek.de). تم فحص جودة الحمض النووي الريبي على الجل وتم تصنيع (كدنا) باستخدام كواشف النسخ العكسي TaqMan (Invitrogen ™) مع 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي. تم إجراء qRT-PCR على BIORAD iQ5 باستخدام صبغة مضان خضراء SYBR. البرنامج المستخدم كان كما هو موصوف من قبل في TCPs qRT-PCR.

    يتم سرد تسلسل أزواج التمهيدي المستخدمة في ملف إضافي 2: الجدول S6. جر- تم قياس قيم 11 عينة بشكل مزدوج ومتوسط ​​، متبوعًا بحساب التعبير الجيني النسبي باستخدام طريقة 2 -Ct للتعبير عن SlTCP النصوص في أعضاء الطماطم المختلفة وطريقة 2 -Ct [52] للتعبير عن SlTCPs في المسوخ الناضج. تم إجراء تحليل كفاءة التفاعل باستخدام برنامج LinRegPCR [53].

    فحوصات الخميرة ثنائية الهجين

    تم إعادة تجميع جميع ORFs TCP من استنساخ الإدخال في ناقل الطعم pBDGAL4 (pDEST ™ 32 ، Invitrogen) ومتجه الفريسة pADGAL4 (pDEST ™ 22 ، Invitrogen). تم تحويل نواقل الطعم إلى سلالة الخميرة PJ69-4α (حصيرةα) وجميع نواقل الفريسة في سلالة PJ69-4a (حصيرةأ [54]) وتم اختيارها على لوحات SD تفتقر إلى Leu و Trp ، على التوالي. بعد ذلك ، نمت الثقافات بين عشية وضحاها (30 درجة مئوية ، 300 دورة في الدقيقة) من مستعمرات مفردة لكل محول في وسط SD انتقائي وتزاوجت بشكل منهجي مع بعضها البعض عن طريق اكتشاف 5 ميكرولتر قطرات من الثقافات السائلة فوق بعضها البعض على لوحات SD كاملة (Nunc) Omnitray VWR International ، أمستردام ، هولندا) يحتوي على جميع الأحماض الأمينية الأساسية. بالإضافة إلى ذلك ، تم رصد بعض مجموعات التحكم السلبية ، والتي تم استخدام الماء فيها بدلاً من الطعم أو مزرعة الفريسة. بعد ذلك ، تم تحضين الصفائح عند 30 درجة مئوية لمدة 16 ساعة ، وبعد ذلك تم نقل الخميرة إلى ألواح SD تفتقر إلى كل من Leu و Trp لاختيار الخميرة ثنائية الصبغة التي تحتوي على كلا البلازميدات. بعد يومين من النمو عند 30 درجة مئوية ، تم نقل الخميرة إلى أربع لوحات اختيار مختلفة تحتوي على وسط SD يفتقر إلى Leu و Trp و Ade (-LTA) و SD تفتقر إلى Leu و Trp و His (-LTH) ، مكملًا بـ 5 ، 10 ، أو 15 ملي 3-أمينو-1،2،4-تريازول (3-AT) ، على التوالي. تم اختبار استنساخ الطعم من أجل التنشيط الذاتي في حالة عدم وجود بروتين فرائس متفاعل عن طريق الطلاء على SD الذي يفتقر إلى Leu وتكميله بتركيزات متزايدة من 3-AT. بالنسبة لتجارب التفاعل اللاحقة ، تم تسجيل النمو فقط على الوسائط الانتقائية (إن وجدت) ، حيث لم يحدث نمو في الحيوانات المستنسخة ذات التنشيط التلقائي. تم تحضين هذه الأطباق عند 20 درجة مئوية وسجلت لنمو الخميرة وبالتالي أحداث تفاعل البروتين والبروتين بعد 5 أيام. تم إجراء الفحص في ثلاث نسخ. في حالة التنشيط الذاتي لأحد البروتينين ، تم الحصول على أربع نقاط بيانات فقط للمجموعة المحددة. ظهرت كفاءة التزاوج بنسبة 100٪ ، وحيث تم استخدام الماء للتزاوج ، إما بدلاً من زراعة الطُعم أو بدلاً من مزرعة الفريسة ، لم يتم الحصول على نمو على الوسط المختار لوجود البلازميدات أو على الوسائط المختارة التفاعلات. هذا يدل على عدم حدوث تلوث متبادل نتيجة للإجراء الذي اتبعت. تم تسجيل المجموعة على أنها تفاعل حقيقي عندما نتج عنها نمو لواحد على الأقل من علامتي الاختيار (Adenine أو Histidine) في ثلاث تجارب على الأقل من أصل أربع. المجموعات التي نمت فقط على وسيط انتقائي واحد تم تمييزها على هذا النحو في عرض النتائج.

    مقايسة الخميرة الهجين الواحد

    تم تحديد تفاعلات بروتين الحمض النووي بين عوامل نسخ الأرابيدوبسيس وبروتينات الطماطم المفردة TCP12 و TCP15 و TCP18 وتمييزها باستخدام مقايسة الخميرة الهجينة الأولى ، والتي استندت إلى نظام Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid (Y1H) الخاص بـ Clontech (http: // www. .clontech.com). يستخدم هذا النظام مقاومة Aureobasidin A للمضادات الحيوية كمراسل. تم استخدام سلالة الخميرة PJ69-4A لطعوم عامل النسخ و PJ69-α لتركيبات مراسل المروج TCP12 و -15 و -18. تم استنساخ شظايا المروج الفردي في ناقل مراسل pAbAi ، مما جعل البوابة متوافقة. يمكن رؤية الاشعال المستخدمة لاستنساخ عناصر المروج في الملف الإضافي 2: الجدول S7. يتكون بناء المراسل لـ TCP12 من 568-bp (المنطقة SL1.03sc00008: 1785048..1785615) ، TCP15 - 500-bp (المنطقة SL2.31sc04133: 30626689..30627956) و TCP18 - من 473-bp (المنطقة SL1. 03sc01076: 4199969..4200441). لكل جزء من المروج ، تم إجراء اختبار تنشيط ذاتي بتركيزات Aureobasidin A تتراوح من 0 إلى 500 نانوغرام / مل. تم إجراء فحوصات Y1H بتركيز 75 نانوغرام / مل Aureobasidin A لكل مراسل ، وهو أدنى تنشيط في الخلفية تم اكتشافه. تم زراعة مستنسخات الخميرة واختيارها لوجود البلازميد لمدة 2 إلى 3 أيام على وسط انتقائي عند 30 درجة مئوية. تم تزاوج طُعم عوامل النسخ واستنساخ مراسل برنامج التعاون الفني على وسط كامل SD بين عشية وضحاها ثم نقلها إلى وسط اختيار الطعم / المراسل لمدة 3 أيام. تم نقل الخمائر المتزاوجة المختارة بالوسائط إلى 100 ميكرولتر من ماء MilliQ المعقم ورُصدت قطرات 5 ميكرولتر على أطباق تحتوي على aureobasidin. تم تحضين الألواح عند 20 درجة مئوية وسجلت بعد 5 إلى 7 أيام.

    تحتوي مكتبة عوامل النسخ (TFs) (مكتبة REGIA TF ORF) المستخدمة في شاشة الخميرة أحادية الهجين على مجموعة من نبات الأرابيدوبسيس thaliana عامل النسخ إطارات القراءة المفتوحة (ORFs) [41]. بعد تحديد الارتباط بالبروتين والحمض النووي ، تم تصنيف مجموعات نباتات نبات الأرابيدوبسيس ، التي وجد أنها تربط بشدة محفز بروتينات TCP للطماطم المدروسة ، على أنها جينات مرشحة. استند اختيار TFs المرشحة للطماطم إلى أقرب متماثل لها من نبات الأرابيدوبسيس ، والتي تتميز بالبحث عن انفجار البروتين والنيوكليوتيدات في قاعدة بيانات شبكة الجينوم SOL. تم اختيار واستنساخ بعض جينات الطماطم المرشحة ، والتي كان لها تعبير أثناء نمو الثمار والنضج (بناءً على بيانات تعبير EST و Unigene) ومتماثلات الطماطم لأقوى مجموعات أرابيدوبسيس المرتبطة (ملف إضافي 4: الجدول S3).

    استنساخ TFs المرشحة للطماطم المستخدمة في شاشة الخميرة أحادية الهجين

    تم تضخيم ORFs من TFs مرشح الطماطم الفردي واستنساخها بشكل مستقل في ناقل pCR ™ 8 / GW / TOPO (Invitrogen). تم التحكم في جميع الحيوانات المستنسخة عن طريق تحليل التسلسل ، ثم تم دمجها في ناقل pADGAL4 (pDEST ™ 22 ، Invitrogen) وتحويلها إلى سلالة خميرة PJ69-4A [55]. باختصار ، تم استنساخ 40 إطار قراءة مفتوحًا للطماطم (ملف إضافي 2: الجدولان S5 و S8). تم إجراء تجربة الخميرة الهجين الواحد في ثلاث نسخ باستخدام TFs الطماطم.

    Cytoscape - تكامل بيانات الشبكة وتحليلها وتصورها

    تم استخدام Cytoscape v3.0.2 [56] لتوليد شبكة من التفاعلات الهجينة الخميرة الأولى ولدمج بيانات التعبير عن SlTCP12, -15 و -18 في المسوخ الناضج Cnr, رين و ال SlAP2a نباتات ضربة قاضية. تم استخدام الإعدادات الافتراضية مع نمط الشبكة المتداخلة.

    تم استخدام المكون الإضافي BiNGO 2.8 لـ Cytoscape [57] لتحليل التخصيب بمصطلح GO. في البحث عن التمثيل الزائد استخدمنا الإعدادات القياسية: Benjamini-Hochberg FDR ، مستوى الأهمية 0.05.

    توافر البيانات الداعمة

    يتم تضمين مجموعات البيانات التي تدعم نتائج هذه المقالة في المقالة وملفاتها الإضافية (أشكال وجداول إضافية).


    نقاش

    استراتيجية متعددة الجوانب لـ N للتغلب على Rho

    يحتوي البروتين الصغير المضاد للفصل N على ثلاث مناطق متفاعلة (الشكل التكميلي S1A). يتفاعلون مع بندق موقع على mRNA (12) ، مع امتداد بندق-NusA (13) ومع RNAP (13). هنا ، نوضح أن N تستخدم جميع وحدات التفاعل الثلاثة هذه لاستخدام استراتيجية متعددة الجوانب للتغلب على إجراء Rho.

    يشكل N-NusA-Rho معقدًا ثلاثيًا في الجوز / شبق الموقع (الشكل 5) ، وهذا التكوين يعطل Rho (الشكل 4) ، والذي بدوره يؤدي إلى إبطاء الانتقال وحركية إطلاق RNA لـ Rho (الشكل 3). على الأرجح ، فإن وجود N و NusA في بندق يؤثر الموقع على الموضع المناسب للـ RNA المصب في الفتحة المركزية لـ Rho hexamer (الآلية 1 في الشكل 1 أ). هذا التثبيط لوظيفة Rho في بندق لا يتطلب الموقع تعديلًا مستحثًا بـ N للمفوضية الأوروبية (الجدول 1).

    يتفاعل N-CTD مع RNAP بالقرب من قناة خروج RNA وقد يستخدم هذه القناة لاختراق جزء من & # x02018thread-like & # x02019 CTD في داخل EC (16،17). يصبح هذا التفاعل مهمًا لمنع إجراء Rho عندما يتحرك EC بعيدًا عن بندق موقع يسمح لـ Rho بالارتباط بحرية والانتقال على طول الحمض النووي الريبي الناشئ الموجود بين بندق الموقع والمفوضية الأوروبية (الجدول 1 ، الشكل 1 ب). على الرغم من عدم إثبات ذلك ، يمكن أن تكون قناة خروج RNA هي المنطقة المحتملة التي يكتسب Rho من خلالها الوصول إلى RNAP. قد يعمل وجود N-CTD و NusA-NTD (11) بالقرب من قناة الخروج كغطاء لنقطة وصول Rho ويمنع / يؤخر تفاعل Rho-RNAP المفترض (الآلية الثانية ، الشكل 1 ب).

    أدى الاعتماد غير المعتاد لـ E134K Rho على NusA من أجل الإنهاء الفعال (الشكل 7) ونشاط قمعه لوظيفة N (الشكل 6) إلى اقتراح أن Rho و N يتنافسان على نفس جزيء NusA المرتبط بـ بندق موقع. يزيل تفاعل N-NusA NusA من مسار الإنهاء المعتمد على Rh ويجعل العملية الأخيرة أقل كفاءة على أجهزة الإنهاء التي تشبه tR1 (الآلية III ، الشكل 1 C).

    NusG يحفز نشاط N. في المختبر (29) وتبين أنه جزء من في الجسم الحي عملية منع الإنهاء (39). من ناحية أخرى ، يتفاعل Rho مع المجال الطرفي C لـ NusG (22،40) ، وهذا التفاعل ضروري لإنهاء فعال. لاحظنا ذلك في الجسم الحي، لم يكن لطفرات NusG-CTD المعيبة لربط Rho (22) أي تأثير على وظيفة N (الجدول التكميلي S3). ومن ثم ، خلصنا إلى أن وظائف N مستقلة عن تفاعل Rho-NusG CTD. ومع ذلك ، فإن دمج NusG في آلية N-anti-termination يمكن أن يغير تفاعلات حلزونات المشبك NusG-NTD - & # x003b2 ، والتي بدورها قد تزعج تكوين مركب Rho-NusG.

    NusA-remodeling ، كآلية ممكنة لمنع الإنهاء لمضاد الإنهاء ، N

    تتفاعل NusA مع RNAP وأيضًا مع RNA الناشئ من المجموعة الأوروبية (41،42). إنه مكون مهم لكل من عمليات الإنهاء ومنع الإنهاء. تعمل NusA على تحسين كفاءة الإنهاء المعتمد على منعطف الشعر على الأرجح عن طريق تثبيت دبابيس الشعر RNA الخاصة بالمعدات النهائية (42،43،44). كما أنها تشارك في الإنهاء المعتمد على Rho (37،42،45). من ناحية أخرى ، فإن مضادات الإنهاء مثل وظائف N و Q تعتمد بشكل كبير على NusA (11 ، 42). N تجعل NusA أكثر تحديدًا لـ بندق الموقع (14) وأيضًا يغير طريقة تفاعله مع RNAP (19) ، بينما في وجود بروتين Q ، تشكل NusA درعًا عند قناة خروج RNA (46). يؤدي التفاعل المحدد لـ N مع NusA إلى & # x02018NusA-remodeling & # x02019 ، وقد تكون إزالته اللاحقة من مسار الإنهاء بالوسائل التالية.

    كمواقع ربط Rho و NusA (& # x02018فاصل& # x02019 المنطقة أيضًا الشكل 5) في nutR / شبق تداخل ، تفاعل N-NusA عالي التقارب في بندق قد يجعل الموقع NusA غير متاح لـ Rho أثناء تحميله وتنشيطه بواسطة بندق RNA.

    يمكن أن يكون تفاعل NusA - & # x003b2-flap بالقرب من قناة خروج RNA مفيدًا في مساعدة Rho على الوصول إلى الجزء الداخلي من EC. من المحتمل أن تؤثر التغييرات المقترحة المستحثة بـ N (19) في تفاعل NusA-RNAP على تفاعل Rho-RNAP المفترض أو طي دبوس الشعر النهائي عند قناة خروج RNA.

    نقترح أن & # x02018NusA-remodeling & # x02019 يمكن أن تكون آلية مهمة تستخدمها N للتغلب على كل من الإنهاءات المعتمدة على Rho والمستقلة بالإضافة إلى تثبيت النسخ ECs.

    ما هو دور NusA في الإنهاء المعتمد على Rh؟

    تورط مشاركة NusA في الإنهاء المعتمد على Rho في تقارير مختلفة (37،45،47،48). دور NusA في هذه العملية لا يزال غير معروف. هنا ، ولأول مرة ، أبلغنا عن متحولة Rho ، E134K ، التي تعتمد وظيفتها بشكل كبير على NusA وليس على NusG (الشكل 7). تعمل NusA على تحسين كفاءة إنهاء E134K عن طريق زيادة معدل إطلاق RNA وتحفيز وظيفة NusG. نقترح أن يتم تصحيح عيب ربط الحمض النووي الريبي الثانوي لـ E134K (الشكل 7 C و D) بواسطة مرافقة NusA بوساطة RNA في القناة الثانوية ، وقد يؤدي تثبيت RNA في الفتحة المركزية أيضًا إلى تحفيز وظيفة NusG. بناءً على هذه النتائج ، نقترح أن دور NusA مهم لمجموعة فرعية من عوامل الإنهاء المعتمدة على Rho ، حيث يكون تحميل Rho على RNA وخطوة (خطوات) التنشيط اللاحقة يحد من المعدل. في هذه النهايات ، نظرًا للقيود الهيكلية ، لا يمكن وضع الحمض النووي الريبي الناشئ بشكل صحيح في الفتحة المركزية لـ Rho السداسي ، مما يؤثر على & # x02018open & # x02019 to & # x02018 close & # x02019 خطوة (خطوات) الأزمرة ومعدل البدء من التحلل المائي ATP. بشكل مشابه لدور NusA في الإنهاء المستقل عن Rho مع دبابيس شعر RNA غير كاملة ، تصورنا أنه يعمل أيضًا كمرافق RNA لتوجيه RNA الناشئ إلى الفتحة المركزية لـ Rho السداسي.

    العلاقة المكانية بين N و NusA و NusG و Rho على RNAP

    تشير المناقشة المذكورة أعلاه إلى علاقة مكانية بين عوامل الإنهاء وآلية منع الإنهاء على EC ، والتي من المحتمل أن تمكن كل من N و Rho من التنافس على نفس جزيئات NusA و NusG المرتبطة بسطح RNAP واستخدامها كمركبات للوصول إلى داخل RNAP. عند التفاعل مع هذين العاملين ، من المرجح أن يقوم Rh و N بتغيير مطابقة مجال & # x003b2-flap بالقرب من قناة خروج RNA و & # x003b2'-clamp helices بالقرب من الشريط غير القالب في المركز النشط. لا يساعد تفاعل Rho-NusG CTD على تجنيد Rho في المفوضية الأوروبية فحسب ، بل قد يغير أيضًا تفاعلات حلزونات المشبك NusG-NTD & # x003b2. من ناحية أخرى ، من المحتمل أن يغير N المطابقات في قناة خروج RNA من خلال التفاعل المباشر مع NusA وإحداث تعديلات في مجال الرفرف. لذلك ، من المحتمل أن هذين العنصرين البنيويين لـ RNAP بمفردهما والتحدث المتبادل بينهما يلعبان أدوارًا محورية في كل من عمليات الإنهاء ومنع الإنهاء.



تعليقات:

  1. Kigabei

    إعادة صياغة إرضاء الرسالة

  2. Jonas

    منحت ، هذا هو متعة المعلومات

  3. Ekerd

    يمكنني أن أقترح زيارتك لك موقعًا ، مع وجود كمية كبيرة من المقالات حول موضوع مثير للاهتمام.

  4. Juri

    الرد رائع :)



اكتب رسالة