معلومة

سؤال حول الاستقراء IPTG

سؤال حول الاستقراء IPTG


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد وجدت المعلومات: "في حالة عدم وجود اللاكتوز ، يرتبط مثبط اللاكتوز بتسلسل المشغل على الحمض النووي ويثني الحمض النووي بمقدار 40 درجة. هذا يمنع وصول T7 RNA polymerase إلى موقع المروج وبالتالي يمنع النسخ المتسرب من الجين الخاص بك قبل الحث. أنا في حيرة من أمري حول حقيقة واحدة.

عندما أضفت IPTG ، لم يعد بإمكان بروتين مثبط اللاكتوز (من كروموسوم الإشريكية القولونية) أن يربط المشغل ويبدأ النسخ الأصلي لبوليميراز E.

لذلك إذا كان هناك بروتين IPTG و lac repressor (من كروموسوم الإشريكية القولونية) لم يعد بإمكانه ربط المشغل الذي يقف أمام جين بوليميريز T7 RNA ، فلماذا لا يزال بإمكان بروتين مثبط lac الارتباط بالمشغل الذي يقف أمام الجين المستهدف من البلازميد ؟


ما الذي يجعلك تعتقد أن مثبط lac سيظل مرتبطًا بالجين المستهدف؟

في سلالات مع هذا النوع من التكوين التنظيمي (عادةً مع DE3 في النمط الجيني) ، الفكرة هي أن تحريض IPTG يقوم بتشغيل التعبير عن بوليميريز T7 من محفز لاك على الكروموسوم ، ثم يقوم بوليميريز T7 هذا بنسخ الجين المستهدف على البلازميد. يضمن وجود IPTG أن القامع لن يرتبط في أي من الموقعين.

تكميلي:

أعتقد أنني أفهم لماذا أنت مرتبك الآن. تعتمد صورتك للطريقة التي يعمل بها هذا على فكرة أن المكبّر مغلق على المشغل حتى يأتي محفز مثل IPTG. في الواقع هناك توازن بين المقيد وغير المنضم:

المكبّر / المشغل <=> المكبّر + المشغل

وفي الفترات القصيرة التي لا يكون فيها المكبِط مرتبطًا ، يمكن لـ E. coli RNA polymerase ربط الأوبرا ونسخه. يُشار إلى هذا باسم "تخليق الهروب" ويفترض عمومًا أنه ذو صلة وظيفية في ضمان وجود مستويات منخفضة من تعبير lac permease في جميع الأوقات بحيث يمكن تناول اللاكتوز. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فكيف يمكن للمحرض الطبيعي (أحد مشتقات اللاكتوز) أن يحفز أوبرون اللاكتوز؟

في أنظمة التعبير عن البروتين ، يُعتبر بشكل عام أمرًا مرغوبًا فيه للحفاظ على تخليق البروتين الغريب عند الحد الأدنى بحيث لا يكون هناك اختيار يعمل على الجين لإبطال أي آثار ضارة لتعبيره. يساعد استخدام T7 بوليميراز كمستوى وسيط للتنظيم على تحقيق ذلك. حتى إذا كان هناك مستوى منخفض من تخليق الهروب لبوليميراز T7 ، فإن تركيز بوليميريز T7 سيكون منخفضًا جدًا في الحالة غير المستحثة (مقارنةً ببوليميراز الحمض النووي الريبي الداخلي) بحيث تكون كمية الهروب من البروتين المستهدف بسبب اكتساب بوليميراز T7 سيكون الوصول المثمر إلى مروج T7 على البلازميد ضئيلًا.

اقرأ المزيد هنا.


مجموعة علم الجراثيم

غالبًا ما يتم تحفيز الحث من خلال تلف الحمض النووي البكتيري وفي حالة الدعامات التي يتم دمجها في الكروموسوم البكتيري ، يتضمن التحريض أيضًا استئصال النتوء من الكروموسوم. لاحظ أن الحث اختصار لـ "تحريض prophage" وأنه يمكن أيضًا وصف تحريض prophage على أنه تحول جيني (كما هو الحال في التحول في الحالة الجينية من دورة lysognic إلى دورة lysognic أو ، بشكل عام ، عدوى منتجة).

في لامدا العاثية (& lambda) ، يرتبط الحث بانشقاق مثبط CI. والنتيجة هي إنتاج البروتين ، Cro ، الذي يثبط إنتاج مزيد من CI. الحث في lambda وكذلك مع العديد من lysogens الأخرى ، وبالتالي انقسام Cro ، عادة ما يكون استجابة لتلف الحمض النووي داخل البكتيريا المضيفة. يمكن وصف الحث الذي يحدث في غياب عوامل تحفيز معينة بأنه تلقائي ، كما هو الحال في "الحث التلقائي" أو "التبديل التلقائي".

تتضمن دورات حياة العاثيات المعتدلة عدة خطوات متعارضة في كثير من الأحيان مع كون خطوة الاستقراء واحدة تنقل العاثية من الحالة التي يرتبط فيها نجاحها ارتباطًا وثيقًا بمضيفها البكتيري ، على مدى أطر زمنية أطول ، إلى حالة تعمل فيها بدلاً من ذلك. صراحة كمضادات للبكتيريا.

لمزيد من المناقشة والمراجع ، انظر Little (2005) ، Ptashne (2004) ، إلخ.

لمزيد من المعلومات حول هذا الموضوع ، راجع Wikipedia و Google و PubMed. الاتصال بخبير الويب. العودة إلى الشروط.


إجراءات

"مقدمة في الهندسة الوراثية" هي دورة اختيارية مدتها 90 ساعة تُعطى لطلاب البيولوجيا الجامعيين الذين حضروا بالفعل دروسًا في الكيمياء الحيوية وعلم الأحياء الدقيقة وعلم الوراثة الجزيئية. يتألف الفريق من أستاذ الانضباط (منسق) ، وأستاذ مساعد ، واثنين من مساعدي الدراسات العليا ، أحدهم مشارك في برنامج معين في التدريس (PESCD / CAPES) ، 1 1 برنامج تدريب المعلمين الخاضع للإشراف (PESCD) هو برنامج بدعم من مؤسسة تمويل الأبحاث البرازيلية (مكتب التنسيق لتحسين الطلاب الجامعيين وطلاب الدراسات العليا [CAPES]) لتزويد طلاب الدراسات العليا بتدريب المعلمين. وستة طلاب جامعيين. تم تقسيم الأخيرة إلى مجموعتين في الجزء التجريبي من المقرر الدراسي.

بدأت الدورة مع المنسق الذي أعطى الطلاب فصلًا نظريًا عن السيستاتين والنشاط المثبط لبروتياز السيستين. كما طُلب من الطلاب قراءة الأدبيات المحددة حول موضوع هذا الفصل [2 ، 4]. تم إعطاء فصول نظرية إضافية خلال الدورة لتوضيح التجارب ومناقشة المبادئ التي تنطوي عليها تقنيات البيولوجيا الجزيئية. أجرى الطلاب تجارب عملية بشكل أساسي ، بدءًا من البحث عن الجين المستهدف في قواعد بيانات NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) حتى استنساخه وتعبير البروتين في الإشريكية القولونيةوتنقية البروتين. يجب أن تكون متطلبات الجين الذي سيتم اختياره هي التدوين لجين معبر عنه بمستويات عالية في نبات يمكن الوصول إليه ، وله تسلسل كامل الطول معروف (كدنا) ، وله إطار قراءة مفتوح (ORF) 2 2 الاختصارات المستخدمة هي: ORF ، فتح إطار القراءة IPTG، isopropylthiogalactoside. لا تحتوي على أكثر من 700 زوج قاعدي لتسهيل تخليق [كدنا]. أخيرًا ، "في الجسم الحي"تم إجراء اختبار للتحقيق في نشاط بيولوجي لم يتم الإبلاغ عنه بعد للسيستاتين المختار.

تم توفير البروتوكولات الأساسية للطلاب ، الذين طُلب منهم تكييفها أثناء التجارب. قام الطلاب بإعداد تقارير عن كل خطوة تجريبية. يوضح الجدول الأول خطوات الدورة والتقنيات التجريبية المتضمنة في كل مرحلة ، بما في ذلك الجدول الزمني.


نتائج ومناقشة

عرضت المستعمرات البكتيرية التي تم تحويلها باستخدام pET28a-GFP مضانًا أخضر بعد يومين من طلاءها على وسط صلب LB. سمح فحص الألواح تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية بإثبات بسيط لمستوى منخفض من التعبير الأساسي من لاك المروج في حالة عدم وجود IPTG.

يوضح الشكل 1 تحليلًا في SDS-PAGE لتحريض GFP المؤتلف في بكتريا قولونية الخلايا. لوحظت زيادة تدريجية في نطاق البروتين ، حوالي 29 كيلو دالتون ، تحت تحريض IPTG ولكن لم يتم اكتشافها في الثقافة غير المستحثة (بدون IPTG). هذا البروتين له الحجم المتوقع لـ GFP (∼26.3 كيلو دالتون) ، بالإضافة إلى الببتيد الانصهار الذي يحتوي على His6 وموقع الثرومبين (∼ 3 كيلو دالتون). تم إظهار الدليل على الزيادة في تعبير GFP أيضًا من خلال زيادة تألق الثقافة المستحثة (مقارنة بالثقافة غير المستحثة) عند فحصها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.

تم الكشف عن البروتين المؤتلف في كل من الأجزاء القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان من الخلايا المستحثة (الشكل 1). قد يكون وجوده في الجزء غير القابل للذوبان ناتجًا عن اضطراب خلوي غير فعال أثناء صوتنة.

يوضح الشكل 2 تحليلًا للكسور المسترجعة أثناء تنقية البروتين بواسطة كروماتوجرافيا التقارب. تم إطلاق العديد من البروتينات غير النوعية التي لا تربط الراتينج في محلول التدفق ومع محلول الغسيل. تمت التصفية من البروتينات ذات الألفة المنخفضة لأيونات النيكل أو الكوبالت بتركيزات منخفضة من إيميدازول (على سبيل المثال 25 م م). بدأ GFP المؤتلف في التصفية في مجموعة من تركيزات إيميدازول ، بدءًا من 50 م M (الشكل 2).أ) أو 75 م م (الشكل 2ب). عند هذه التركيزات ، تم أيضًا التخلّص من بعض البروتينات الملوثة بالبروتين محل الاهتمام. في التركيزات الأعلى من إيميدازول ، تمت إزالة البروتين المؤتلف بشكل حصري تقريبًا. حدث مستوى استرداد عالٍ عند 100 متر M (الشكل 2أ) أو 250 م من إيميدازول (الشكل 2ب) ، اعتمادًا على تقارب GFP المؤتلف للمصفوفات من موردين مختلفين. تمت تنقية ما لا يقل عن 12 مجم من GFP لكل 250 مل من الثقافة البكتيرية (بمعنى آخر. 48 مجم لكل لتر). سمح الشطف باستخدام محاليل التدرج من الإيميدازول باسترداد أكثر انتقائية للبروتين الذي يحمل علامة His ، لأن البروتينات منخفضة التقارب تم استخلاصها في وقت سابق من البروتين المؤتلف. كما هو مبين في الشكل 2ج، يمكن تحديد الكسور المستخرجة التي تحتوي على GFP المنقى مباشرة بسبب التألق الطبيعي للبروتين.

مواضيع أخرى تمت مناقشتها

بعد الحصص ، تمت مناقشة الموضوعات التالية بالتفصيل مع الطلاب.

طي البروتين والتعديل الكيميائي -

تخضع سلسلة البولي ببتيد الوليدة المُصنَّعة على الريبوسوم للطي ، وتكتسب جميع جزيئات أي بروتين شكلًا واحدًا يسمى الحالة الأصلية ، بدلاً من العديد من المطابقات المحتملة الأخرى. معظم البروتينات الموجودة داخل الخلايا في شكلها الأصلي القابل للذوبان ، وهو أمر ضروري للنشاط البيولوجي المناسب.

يمكن لبعض الآليات الخلوية أن تمنع تكوين البروتينات المشوهة. Chaperones هي عائلة من البروتينات الموجودة في جميع الكائنات الحية ، من البكتيريا إلى البشر. توجد في كل مقصورة خلوية ، وتربط أنواعًا مختلفة من البروتين ، وربما تشارك في آلية عامة لطي البروتين. المرافقات الجزيئية ، التي تربط وتثبت البروتينات غير المطوية أو المطوية جزئيًا ، يمكن أن تمنع تحلل هذه البروتينات ، في حين أن المرافقات تسهل الطي بشكل مباشر [9].

مشكلة شائعة للتعبير غير المتجانسة في بكتريا قولونية هو طي البروتين غير المناسب ، مما يؤدي إلى تكوين مجاميع غير قابلة للذوبان تسمى أجسام التضمين. قد تتشكل هذه الركام بسبب تفاعل المجموعات الكارهة للماء مع مناطق مماثلة من الجزيئات الأخرى غير المطوية أو لتكوين روابط ثاني كبريتيد بين جزيئات متميزة.

يمكن أن تؤثر الظروف داخل الخلايا للخلايا البكتيرية على الطي الصحيح لبعض البروتينات حقيقية النواة. يمكن أن تؤثر حالة الأكسدة والاختزال المميزة للسيتوبلازم البكتيري مقارنة بخلايا الثدييات على تكوين روابط ثاني كبريتيد بطرق مختلفة وبالتالي طي البروتين وقابلية الذوبان.

عادةً ما يكون البروتين المراد تنقيته مرغوبًا للغاية إذا كان أقرب ما يكون إلى التشكل الأصلي قدر الإمكان. ومع ذلك ، فإن بعض التعديلات اللاحقة للترجمة مهمة لوظيفة البروتين وقابلية الذوبان في الخلايا حقيقية النواة (على سبيل المثال الارتباط بالجليكوزيل) غائب في بكتريا قولونية. ومع ذلك ، نادرًا ما يلعب الارتباط بالجليكوزيل دورًا رئيسيًا في في المختبر دراسات مع البروتين المؤتلف. علاوة على ذلك ، قد لا تكون البنية ضرورية إذا كان سيتم استخدام البروتين كمستضد لإنتاج الأجسام المضادة [10].

العوامل الأخرى المشاركة في التعبير عن البروتين -

العديد من العوامل التي تمنع أو تزعج تعبير البروتين في بكتريا قولونية بالإضافة إلى بعض الاستراتيجيات للتغلب عليها تمت مناقشتها في الفصول الدراسية.

بعض البروتينات ، خاصة تلك التي يقل حجمها عن 10 كيلو دالتون ، ليست مستقرة في بكتريا قولونية ويمكن أن تتحلل بسرعة بسبب البروتياز [11]. قد يتغلب الاندماج مع بروتين أكبر مثل الجلوتاثيون S-ترانسفيراز على هذه المشكلة. أيضًا ، العديد من البروتينات غير القابلة للذوبان تصبح قابلة للذوبان في بكتريا قولونية عندما يتم التعبير عنه في الاندماج مع الجلوتاثيون S-ترانسفيراز ويمكن تنقيته بسهولة عن طريق كروماتوجرافيا التقارب ، باستخدام عمود يحتوي على الجلوتاثيون المعطّل. بدلاً من ذلك ، يمكن إذابة البروتينات غير القابلة للذوبان باستخدام عوامل شوتروفية مثل SDS أو اليوريا متبوعًا بإعادة تشكيلها إلى الشكل الأصلي عن طريق السحب التدريجي لهذه العوامل.

يمكن أن يؤدي إبطاء معدل التعبير أيضًا إلى تحسين قابلية ذوبان البروتين ، ويمكن تحقيق ذلك عن طريق خفض تركيز العامل المحرض (على سبيل المثال IPTG) أو خفض درجة حرارة الاستقراء. يمكن أيضًا اعتماد هذه الأساليب عند التعبير عن البروتين غير المتجانسة بـ بكتريا قولونية سام للخلية.

وجود أكواد وفيرة وغير عادية في الجين المراد التعبير عنها بكتريا قولونية يمكن أن تسبب ترجمة سيئة بسبب توقف الريبوسوم مؤقتًا [12]. لأن النسخ والترجمة مرتبطان ارتباطًا وثيقًا بـ بكتريا قولونية، يمكن أن يحدث إنهاء مبكر للنسخ. ال في المختبر استبدال هذه الكودونات بالطفرة مع الكودونات الأكثر استخدامًا لها بكتريا قولونية قد تتغلب على هذه المشكلة. يمكن أن تتأثر ترجمة البروتين أيضًا بوجود الهياكل الثانوية في الرنا المرسال ، والتي تمنع ارتباط الريبوسوم بموقع الارتباط بالريبوسوم.


عدم وجود تعبير في استنساخ pQE30 - (يوليو / 17/2008)

لقد قمت أخيرًا باستنساخ تسلسل الحمض النووي المحسن في الكودون الخاص بي في مواقع تقييد SphI و HindIII في متجه تعبير pQE30 بواسطة Qiagen. التسلسل في الإطار عند التسلسل وقد تحولت إلى M15 و JM109 E.coli لأغراض التعبير.

لقد نشرت أيضًا سؤالًا أجاب عنه Andriy بخصوص استنساخي في منتدى الاستنساخ الجزيئي. لقد ذكر استفسارًا حول استخدام SphI قال مشرفي إنه لن يمثل مشكلة.

ولكن عند التعبير الأولي في JM109 و M15 ، لم يكن هناك نطاق معبر مكثف يُنظر إليه حيث كانت ملامح البروتين مماثلة لتلك الخاصة بعناصر التحكم المستخدمة والتي كانت السلالات التي تم تحويلها إلى ناقل pQE30. لقد استخدمت 1mM وأحدثت expresison في OD600nm 0.6.
ثم كررت التعبير في كلا السلالتين عن طريق خفض تركيز IPTG إلى 0.5 ملي مولار ويبدو أن المظهر الجانبي هو نفسه.
هل يجب علي زيادة تركيز IPTG الخاص بي إلى 5 ملي مولار كما اقترح البعض أو ربما أقل إلى 0.005 ملي مولار؟ كما أخبرني أحد كبار السن أن أخفض درجة حرارة النمو إلى 25 درجة مئوية. لكنني اعتقدت أنها فقط لأغراض الذوبان؟
كنت أفكر في الكشف باستخدام لطخة ويسترن ولكن لا يوجد جسم مضاد 6xHis.

لقد قمت أخيرًا باستنساخ تسلسل الحمض النووي المحسن في الكودون الخاص بي في مواقع تقييد SphI و HindIII في متجه تعبير pQE30 بواسطة Qiagen. التسلسل في الإطار عند التسلسل وقد تحولت إلى M15 و JM109 E.coli لأغراض التعبير.

لقد نشرت أيضًا سؤالًا أجاب عنه Andriy بخصوص استنساخي في منتدى الاستنساخ الجزيئي. لقد ذكر استفسارًا حول استخدام SphI قال مشرفي إنه لن يمثل مشكلة.

ولكن عند التعبير الأولي في JM109 و M15 ، لم يكن هناك نطاق معبر مكثف يُنظر إليه حيث كانت ملامح البروتين مماثلة لتلك الخاصة بعناصر التحكم المستخدمة والتي كانت السلالات التي تم تحويلها إلى ناقل pQE30. لقد استخدمت 1mM وأحدثت expresison في OD600nm 0.6.
ثم كررت التعبير في كلا السلالتين عن طريق خفض تركيز IPTG إلى 0.5 ملي مولار ويبدو أن المظهر الجانبي هو نفسه.
هل يجب علي زيادة تركيز IPTG الخاص بي إلى 5 ملي مولار كما اقترح البعض أو ربما أقل إلى 0.005 ملي مولار؟ كما أخبرني أحد كبار السن أن أخفض درجة حرارة النمو إلى 25 درجة مئوية. لكنني اعتقدت أنها فقط لأغراض الذوبان؟
كنت أفكر في الكشف باستخدام لطخة ويسترن ولكن لا يوجد جسم مضاد 6xHis.

هذا هو ملف تعريف التعبير الخاص بمحلل الخلية الكلي

كما هو موضح باللون الأخضر ، فإن p11 المظلل باللون الأحمر هو p14 والأصفر أو c (0) أو c (3) عناصر تحكم.
تلك التي بها [] أقواس هي كسور 1 مل.
بخلاف [] ، تم تطبيع الخلايا إلى T = 0 ساعة.

تم إحداث التعبير عن جميع الثقافات عند OD 600 نانومتر = 0.7.
نمت الثقافات عند 250 دورة في الدقيقة ، 37 درجة مئوية.
لقد جربت أولاً مع 1mM IPTG ثم كررته مرة أخرى عن طريق خفض مستوى IPTG إلى 0.5mM معتقدًا أنه ستكون هناك بعض التغييرات ولكن الملفات الشخصية تبدو متشابهة.

أستطيع أن أخبرك أنه لا يمكن رؤية جميع البروتينات في الفاصلة كما هو مستحث مقارنة بالبروتينات غير المستحثة.

كما قلت ، إذا لم تكن متأكدًا ، فإن أفضل شيء هو استخدام W.B مع علامة Ab.

يبدو ملف تعريف UR التعريفي جيدًا (لا تقم بتغيير IPTG conc.). يجب أن يكون U أيضًا وقتًا أطول للتحريض 6 ساعات أو أكثر من الحث الليلي.

شكرا لك على الرد.
انا جديد جدا في هذا
ليس كل البروتينات يمكن رؤيتها في كوماسي؟ هل تقترح أن أفعل الفضة؟

هل لي أن أسأل عن IPTG؟ إذا قمت بزيادته ، فهل سيحدث فرقًا؟ لقد حاولت زيادته ولكن الملف الشخصي هو نفسه تمامًا & # 33 IPTG ليس كميًا ، أليس كذلك؟

سأحاول بين عشية وضحاها اليوم وأرى ما إذا كنت سأحصل على شيء.
شكرا جزيلا لك =)

ما قصدته عندما أقول ذلك & quot ؛ لا يمكن رؤية جميع البروتينات في Coomasie & quot ، هو أنه من الصعب أحيانًا رؤيتها وتحديدها

شريط واضح من البروتين المستحث عند مقارنته بالجزء غير المستحث (بسبب البروتينات الملوثة أو فقط

مسحة البروتين). كما قلت ، فإن أفضل طريقة للتأكد ، هي أن تفعل لطخة غربية (لا تنس التحكم الإيجابي) ، لا أعرف كيف

فيما يتعلق بتركيز IPTG - 1 مم مقبول حيث & quot كفاية التركيز & quot للتحريض. لا أعتقد ذلك

زيادة IPTG من شأنه أن يساعدك.

ما يمكنك تغييره هو: 1) التعريفي OD- 0.8-1 بدلاً من 0.6 2) ما هو المخزن المؤقت الذي تستخدمه لاختبار عينات الكسور 3) هل

تحميل ما يكفي من الثقافة (البروتينات الكلية) على هلام الاغاروز؟ 4) هل تأخذ OD في نهاية الحث (تأكد من أن الخلايا

بالمناسبة JM109 ليست خلايا تعبير (بقدر ما أعرف) تستخدم كخلايا نسخ للبلازميدات.

ما قصدته عندما أقول ذلك & quot ؛ لا يمكن رؤية جميع البروتينات في Coomasie & quot ، هو أنه من الصعب أحيانًا رؤيتها وتحديدها

شريط واضح من البروتين المستحث عند مقارنته بالجزء غير المستحث (بسبب البروتينات الملوثة أو فقط

مسحة البروتين). كما قلت ، فإن أفضل طريقة للتأكد ، هي أن تفعل لطخة غربية (لا تنس التحكم الإيجابي) ، لا أعرف كيف

فيما يتعلق بتركيز IPTG - 1 مم مقبول كنسبة تركيز كافية & quot للاستقراء. لا أعتقد ذلك

زيادة IPTG من شأنه أن يساعدك.

ما يمكنك تغييره هو: 1) التعريفي OD- 0.8-1 بدلاً من 0.6 2) ما هو المخزن المؤقت الذي تستخدمه لاختبار عينات الكسور 3) هل

تحميل ما يكفي من الثقافة (البروتينات الكلية) على هلام الاغاروز؟ 4) هل تأخذ OD في نهاية الحث (تأكد من أن الخلايا

بالمناسبة ، JM109 ليست خلايا تعبير (بقدر ما أعرف) تستخدم كخلايا نسخ للبلازميدات.

أود أيضًا أن أفعل الغرب للتحقق. مشكلتي هي أنني لا أستطيع تحديد البروتين المستحث.
شكرًا لك على توضيح تركيز IPTG. أنا حقا أقدر مساهمتك حتى الآن. لقد كنت حقا مفيدا جدا =)

1) لقد غيرت طريقة الاستقراء اليوم ولا يوجد فرق حتى الآن.
2) يمكنني استخدام المخزن المؤقت للتفكك SDS-PAGE 1x إلى بيليه الخلية المغسولة وتحميل 14 ميكرولتر في كل بئر.
3) على النحو الوارد أعلاه. أقوم بتطبيع الخلايا مع خلايا T = o hr من الاستقراء لأن كبار السن لديّ لديهم مشاكل في الإجابة على استعلام محتوى البروتين في Viva & # 39s الخاصة بهم. اقترح لي المشرف Ergo أن أفعل ذلك كمرجع لإنتاج الخلايا & # 39 Single & # 39.
4) أتناول OD في كل ساعة لتطبيع الخلايا. يصل إلى مرحلة ثابتة مع عدم وجود نمو غير مستقر.

أستخدم JM109 لمقارنة التعبير وملف تعريف البروتين المراد كتابته في أطروحتي ، الفرق بين استخدام خلية مضيفة استنساخ وخلية مضيفة تعبير لـ & # 39thicken & # 39 حتى مناقشتي.

فيما يتعلق باقتراحك السابق ، لقد أخذت OD وعينة في T = 6 ساعات وصباح الغد في T = 20 ساعة للمختبر مغلق بينهما. بالنظر إلى أن الأمبيسلين غير مستقر ، هل سيكون ملف البروتين الخاص بي على ما يرام؟ أنا أتساءل أيضًا ، نظرًا لأن الإدخال هو كودون محسّن للتعبير ، فإن استنساخي عديم الفائدة إلى حد ما نظرًا لأنه لا يكاد يتم التعبير عنه وإذا حدث بعد هذه الساعات الطويلة ، أليس كذلك؟

ما قصدته عندما أقول ذلك & quot ؛ لا يمكن رؤية جميع البروتينات في Coomasie & quot ، هو أنه من الصعب أحيانًا رؤيتها وتحديدها

شريط واضح من البروتين المستحث عند مقارنته بالجزء غير المستحث (بسبب البروتينات الملوثة أو فقط

مسحة البروتين). كما قلت ، فإن أفضل طريقة للتأكد ، هي أن تفعل لطخة غربية (لا تنس التحكم الإيجابي) ، لا أعرف كيف

فيما يتعلق بتركيز IPTG - 1 مم مقبول كنسبة تركيز كافية & quot للاستقراء. لا أعتقد ذلك

زيادة IPTG من شأنه أن يساعدك.

ما يمكنك تغييره هو: 1) التعريفي OD- 0.8-1 بدلاً من 0.6 2) ما هو المخزن المؤقت الذي تستخدمه لاختبار عينات الكسور 3) هل

تحميل ما يكفي من الثقافة (البروتينات الكلية) على هلام الاغاروز؟ 4) هل تأخذ OD في نهاية الحث (تأكد من أن الخلايا

بالمناسبة JM109 ليست خلايا تعبير (بقدر ما أعرف) تستخدم كخلايا نسخ للبلازميدات.

أود أيضًا أن أفعل الغرب للتحقق. مشكلتي هي أنني لا أستطيع تحديد البروتين المستحث.
شكرًا لك على توضيح تركيز IPTG. أنا حقا أقدر مساهمتك حتى الآن. لقد كنت حقا مفيدا جدا =)

1) لقد غيرت طريقة الاستقراء اليوم ولا يوجد فرق حتى الآن.
2) يمكنني استخدام المخزن المؤقت للتفكك SDS-PAGE 1x إلى بيليه الخلية المغسولة وتحميل 14 ميكرولتر في كل بئر.
3) على النحو الوارد أعلاه. أقوم بتطبيع الخلايا مع خلايا T = o hr من الاستقراء لأن كبار السن لديّ لديهم مشاكل في الإجابة على استعلام محتوى البروتين في Viva & # 39s الخاصة بهم. اقترح لي مشرف Ergo أن أفعل ذلك كمرجع لإنتاج الخلايا & # 39 Single & # 39.
4) أتناول OD في كل ساعة لتطبيع الخلايا. يصل إلى مرحلة ثابتة مع عدم وجود نمو غير مستقر.

أستخدم JM109 لمقارنة التعبير وملف تعريف البروتين المراد كتابته في أطروحتي ، الفرق بين استخدام خلية مضيفة استنساخ وخلية مضيفة تعبير لـ & # 39thicken & # 39 حتى مناقشتي.

فيما يتعلق باقتراحك السابق ، لقد أخذت OD وعينة في T = 6 ساعات وصباح الغد في T = 20 ساعة للمختبر مغلق بينهما. بالنظر إلى أن الأمبيسلين غير مستقر ، هل سيكون ملف البروتين الخاص بي على ما يرام؟ أنا أتساءل أيضًا ، نظرًا لأن الإدخال هو كودون محسّن للتعبير ، فإن استنساخي عديم الفائدة إلى حد ما نظرًا لأنه لا يكاد يتم التعبير عنه وإذا حدث بعد هذه الساعات الطويلة ، أليس كذلك؟

ولكن ، لماذا البروتين أكبر من النطاق الذي توقعته. يبلغ حوالي 20 كيلو دالتون بينما يجب أن يكون البروتين الخاص بي 18 كيلو دالتون والبروتين 6x هو 0.84 كيلو دالتون.
هل لديها أي فكرة؟

إذا سألت أي شخص ، فسوف يقولون لك أنك & quotalways & quot الحصول على البروتين الخاص بك ليس بالحجم المتوقع (عادة ما يكون أقل من كيلو دالتون أكبر)

يمكنك تشغيل سلّم بروتينين في وقت واحد وستلاحظ فرقًا في تشغيلهما

مبروك على تعبيرك ، تذكر أن تعتز بهذه اللحظة.

إذا سألت أي شخص ، فسوف يقولون لك أنك & quotalways & quot الحصول على البروتين الخاص بك ليس بالحجم المتوقع (عادة ما يكون أقل من كيلو دالتون أكبر)

يمكنك تشغيل سلّم بروتينين في وقت واحد وستلاحظ فرقًا في تشغيلهما

مبروك على تعبيرك ، تذكر أن تعتز بهذه اللحظة.

تمام. Heehee شكرا جزيلا لك مرة أخرى ، Amtash.
هل هناك سبب معين لماذا يعبر بشكل أكبر قليلاً؟ الإشريكية القولونية لها تعديلات منخفضة بعد الترجمة إن لم تكن قريبة من أي تعديلات ، أليس كذلك؟

لقد فعلت ذلك بالضبط ، قمت بتشغيل علامة 7 - 175kDa مع علامة 2 - 212kDa الخاصة بي اليوم. سوف أتحقق وأرى مرة أخرى ..

شكرا لك. إنه حقًا يستحق كل هذا العناء لأنني كنت أحاول استنساخه لمدة 8 أشهر وشهر للتعبير عنه وهذا مجرد مشروع بحثي للطلاب الجامعيين

لقد أرفقت صورة الهلام هنا حيث M هو علامة البروتين NEB & # 39s 2 - 212 كيلو دالتون والثاني من النطاق السفلي هو شريط 20 كيلو دالتون. الممرات 1-3 هي خلايا خلوية من خلايا M15 بينما الباقي هي خلايا JM109. كلها من الساعة 6 - 7 عند الاستقراء


كيف يعمل X gal و IPTG؟

انقر لقراءة الإجابة المتعمقة. في هذا الصدد ، ماذا تفعل X gal؟

X-فتاه هو ركيزة كروموجينية مستخدمة على نطاق واسع لـ & بيتا غالاكتوزيداز. ينتج عنه ترسب أزرق غامق في موقع النشاط الأنزيمي. X-فتاه مفيد للعديد من تطبيقات البيولوجيا الجزيئية والكيميائية النسيجية ، بما في ذلك الكشف عن نشاط اللاكز في الخلايا والأنسجة.

قد يتساءل المرء أيضًا ، كيف أحصل على لوحات Iptg X gal؟ (أو 2 و microl X-فتاه محلول (100 مجم / مل) لكل 1 مل من الوسائط). أضف 10 ميكرول IPTG (100 ملم) لكل 1 مل من الوسائط لتركيز نهائي قدره 1 ملم. أضف مضاد حيوي من اختيارك (أمبيسلين ، كاناميسين ، كاربينيسيلين ، إلخ). يصب لوحات واتركه يبرد حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة (عادة ما لا يقل عن 30 دقيقة) قبل الاستخدام.

يجب أن تعرف أيضًا ، ما هي أدوار IPTG و X gal عند إجراء اختيار أزرق أبيض؟

ل تحري المستنسخات التي تحتوي على الحمض النووي المؤتلف ، وهو ركيزة كروموجينية تعرف باسم X-فتاه يضاف إلى لوحة أجار. آيزوبروبيل وبيتا- D-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيد (IPTG) يستخدم جنبًا إلى جنب مع X-فتاه ل أزرق-فحص أبيض. IPTG هو نظير غير قابل للتمثيل الغذائي للجالاكتوز الذي يحفز التعبير عن جين lacZ.

كم تضيف لوحات IPTG؟

يضيف 40 ميكرول 100 ملم IPTG و 120 ومايكرول X-Gal (20 مجم / مل) على سطح كل منهما طبق وتنتشر على السطح بأكمله.


نتائج ومناقشة

جيل تين5ف ، تينيسي5 ينقّل مع محفز مواجه للخارج. أداة وراثية واحدة لا تزال بحاجة إلى تطوير فيشيري كانت طريقة لإدخال محفز محفز بشكل عشوائي في الجينوم. لتطوير هذه الأداة ، اخترنا استخدام المروج القابل للقمع LacI A1 / 34 [1]. يحتوي هذا المروج على موقعين لربط LacI ، أحدهما بين مواقع -35 و -10 والآخر يتداخل مع موقع بدء النسخ (الشكل. & # x200B 1 1 ) ، وقد ثبت سابقًا أنه يعمل كمروج قوي في فيشيري عندما تم إدخاله مباشرة في المنبع من الأوبرون [1]. ثم قمنا بتصميم mini-Tn5 ناقل التوصيل pEVS170 [31] لاحتواء هذا المروج داخل العنصر القابل للنقل في موضع مواجه للخارج ، تم تأكيد إدخال المحفز بالتسلسل. سيشار إلى هذا الينقول باسم Tn5P ، لـ Tn5 بالإضافة إلى ف روموتر.

بناء الينقولات Tn5P. أ) يحتوي Tn5 من pEVS170 على جين مقاومة الاريثروميسين وأصل النسخ المتماثل (السهم الأزرق والصندوق) داخل نهايات Tn5 (المستطيلات الحمراء). تم تعديل pEVS170 لاحتواء مروج خارجي ، قابل للقمع / IPTG ، PA1 / 34 (السهم الأخضر) [1]. (ب) منطقة المروج PA1 / 34 (مائلة) تحتوي على موقعي ربط لاسي (غامق). يعيق ربط LacI بهذه المواقع الوصول إلى مواقع -35 و -10 (الخضراء) ، وبالتالي قمع النسخ. يحتوي الطرف Tn5 (الأحمر) على كودون البداية (تحته خط).

إدراج ملف لاسي الجين فيشيري وتقييم النمط الظاهري. فيشيري لا يحتوي على لاك أوبرا أو لاسي الجين القامع. لذلك ، للتحكم في التعبير من المروج داخل Tn5ف ، كان من الضروري إدخال لاسي الجين فيشيري. موقع واحد يستخدم تقليديا لإدخال الجينات داخل فيشيري الجينوم هو Tn7 الموقع ، الذي يقع بين سنة و glmS (تين. & # x200B 2 2 ) [15 ، 33]. ومع ذلك ، نظرًا لاستخدام هذا الموقع بشكل كبير لتكملة نسخة واحدة (على سبيل المثال. ، [34]) ، اخترنا ترك هذا الموقع سليماً للتلاعب في المستقبل. بدلاً من ذلك ، استهدفنا إدخال أنا ف ، أليل أكثر نسخًا من لاسي الجين ، إلى منطقة مجاورة مباشرة لـ Tn7 موقع (بين سنة و Tn7 الموقع) (الشكل. & # x200B 2 2 ). كانت النتيجة سلالة ، KV6576 ، تحتوي على أنا ف ، يحتفظ Tn سليمة7 الموقع ، ولا يزال بدون علامات ، مما يسمح باستخدام علامة مقاومة المضادات الحيوية في التلاعبات المستقبلية.

مع جيل لاسي ف - تحتوي على فيشيري، نشأ سؤالان: (ط) هو لاسي q أليل وظيفي (على سبيل المثال. ، هل يتحكم في التعبير الجيني في فيشيري؟) و (2) هو Tn7 الموقع المجاور لموقع إدخال أنا ف الجين ، لا يزال يسمح لأحداث الإدراج؟ لتقييم ما إذا كان أنا ف كان allele في KV6576 وظيفيًا ، وقد بحثنا في قدرة هذه السلالة على التأثير في التعبير عن a لاك الجين الذي يتحكم فيه المروج. على وجه التحديد ، قدمنا ​​إلى KV6576 بلازميد ، pCLD46 ، يحتوي على rscS الجين الذي يحركه لاك المروج ، أو pVSV105 ، المتجه الفارغ الذي اشتُق منه pCLD46. عندما يتم إدخال pCLD46 في النوع البري فيشيري، يصنع بروتين RscS ويحث على تكوين الأغشية الحيوية [13]. أحد الأنماط الظاهرية للغشاء الحيوي الذي يمكن تقييمه بسهولة هو تكوين مستعمرات مجعدة. توقعنا ذلك ، إذا كان لاسي كانت q allele في KV6576 وظيفية ، ثم يقوم LacI بقمع التعبير عن rscS، مما يؤدي إلى إجهاد إما أن يفشل في تكوين مستعمرات مجعدة أو يفعل ذلك بعد تأخير. في الواقع ، وجدنا أن هذه السلالة فشلت في التجعد بعد 24 ساعة من النمو في غياب IPTG (الشكل. & # x200B 3 3 ). علاوة على ذلك ، عندما نمت الضغط في وجود IPTG ، والذي يجب أن يعطل LACI ، تطورت المستعمرات المجعدة مع توقيت لا يمكن تمييزه عن المجموعة الضابطة (الشكل. & # x200B 3 3 والبيانات غير معروضة). تشير هذه البيانات إلى أن LacI الوظيفي تم إجراؤه واستجابته لـ IPTG. نلاحظ ، مع ذلك ، أن قمع rscS لم يكن التعبير من pCLD46 مكتملًا: في أوقات لاحقة ، أظهرت السلالة نمطًا ظاهريًا متواضعًا للتجاعيد في غياب IPTG (الشكل 1 ب). & # x200B 3 3 ). نعزو هذه النتيجة إلى عدم قدرة LacI المعبر عنها من الكروموسوم لقمع المروج الموجود على بلازميد متعدد النسخ بشكل كامل.

لاك تشكيل بيوفيلم يحركه المروج بواسطة WT و لاسي معربا عن سلالات. ثقافات من النوع البري (ES114) و أنا ف (KV6576) سلالات تحتوي إما على ناقلات فارغة pVSV105 أو RscS التعبير البلازميد pCLD46 نمت في LBS التي تحتوي على سم. تم تخفيف قسامات إلى OD600 من 0.2 ، تم رصده على وسط LBS-Cm يحتوي أو يفتقر إلى 1.75 ملي مولار IPTG ، وحضنت في درجة حرارة الغرفة. تم تقييم تكوين مستعمرة التجاعيد في 20 و 50 ساعة بعد التلقيح.

للتحقق من أن Tn7 موقع بالقرب من موقع أنا ف ظل الإدراج في KV6576 قابلاً للتلاعب ، استخدمنا pEVS107 ، وهو Tn7 ناقل التسليم الذي يستهدف Tn7 الموقع [15] ، لإدخال شريط مقاومة Erm في ذلك الموقع. يحتوي pEVS107 على كاسيت مقاومة Erm داخل Tn7 ينتهي وكاسيت مقاومة كانامايسين بالخارج. تم عزل السلالات المقاومة للإريثروميسين بسهولة وأظهرت حساسية للكاناميسين ، كما هو متوقع عندما7 إدراج الكاسيت في Tn7 الموقع (البيانات غير معروضة).

تحديد المسوخ الحركية. بياناتنا أعلاه تشير إلى أن لاسي الجين الذي يتم إدخاله في الكروموسوم وظيفي لقمع نسخ a لاك الجين الذي يتحكم فيه المروج. ومع ذلك ، بقي السؤال ، هل لاسي q نسخ التحكم في الأليل من PA1 / 34 المروج الواردة في تينيسي5ف؟ على وجه التحديد ، تساءلنا عما إذا كان بإمكاننا حث السكان الأصليين أو قمعهم فيشيري الجينات في KV6576 التي تحتوي على إدخالات من Tn5P. لمعالجة هذا السؤال ، اخترنا تقييم النمط الظاهري القابل للتقييم بسهولة ، الحركية. فيشيري يحتوي على عدد من الجينات المعروفة [35-38] أو يتوقع [39] تأثيرها على الحركة. افترضنا أن Tn5يمكن أن يؤدي إدخال P في المنبع لمثل هذه الجينات إلى سلالات ذات حركية محفزة أو قابلة للقمع. وهكذا قدمنا ​​Tn5P إلى KV6576 وتقييم الحركة المتحولة على ألواح أجار ناعمة تحتوي على IPTG أو تفتقر إليه. من شاشة تضم حوالي 2000 طفرة ، حددنا حوالي 20 سلالة ذات أنماط حركية محتملة تعتمد على IPTG وأكدنا الأنماط الظاهرية لمجموعة فرعية من هذه المسوخات. من بين هؤلاء ، تم توجيه تركيزنا إلى سلالتين ذات أنماط ظاهرية متعارضة (الشكل. & # x200B 4 4 ). سلالة واحدة ، KV7432 ، لديها حركية IPTG قابلة للقمع: لقد أظهرت حركية قريبة من النوع البري في غياب IPTG ولكنها تضاءلت بشكل كبير في وجود IPTG (الشكل. & # x200B 4B 4B ). في المقابل ، لم يؤثر IPTG على حركية سلالة التحكم (الشكل. & # x200B 4A 4A ). السلالة الثانية من الاهتمام ، KV7433 ، لديها حركية محفزة IPTG: كانت غير متحركة في غياب IPTG ولكنها استعادت النمط الظاهري للحركة من النوع البري في وجود IPTG (الشكل 1 ب). & # x200B 4C 4C ). نظرًا لأنماطها الظاهرية القوية والمضادة ، اخترنا هاتين السلالتين لتوصيف إضافي.

هجرة سلالات متحولة على أجار ناعم. KV6576 (أ) ، KV7432 (ب) و KV7433 (ج) بين عشية وضحاها في LBS. تم تخفيف الثقافات إلى OD600 0.4 قبل التلقيح على وسط حركي TB-SW الذي يحتوي أو يفتقر إلى 1.75 ملي مولار من IPTG. تصور الصور الهجرة بعد 5.5 ساعة من الحضانة عند 28 & # x000b0C.

We first identified the sites of insertion of Tn5P as described in Materials and Methods. The mutant with IPTG-repressible motility, KV7432, contained an insert within the intergenic region between VF_A0340 و VF_A0341, with the promoter of Tn5P oriented toward VF_A0341 (تين. ​ 5A 5A ). In this orientation, the promoter appears positioned to drive expression of the nearby three-gene operon consisting of VF_A0342, VF_A0343، و VF_A0344. These three genes are predicted to encode proteins with GGDEF or EAL domains. These domains are found in diguanylate cyclase and phosphodiesterase proteins, which synthesize and degrade, respectively, the second messenger cyclic-di-GMP (c-di-GMP) [40]. High levels of cellular c-di-GMP inhibit motility in a variety of bacteria [41]. Therefore, we hypothesize that IPTG-mediated expression from the transposon promoter increases the levels of c-di-GMP in the cell and thus, inhibits motility. It also remains possible that expression from the Tn5P promoter decreases the expression of VF_A0341, which encodes a hypothetical protein with no conserved domains.

The location and orientation of the Tn5P insertions in two motility mutants. The insertion in KV7432 is located in the intergenic region between VF_A0340 و VF_A0341 with the A1/34 promoter oriented toward VF_A0341 (أ). The insertion in KV7433 is located within the 5’ end of cheZ with the A1/34 promoter oriented toward cheA (ب).

The mutant with IPTG-inducible motility, KV7433, carried the Tn5P insertion within the cheZ gene, with the transposon’s promoter oriented with the che operon (Fig. ​ 5B 5B ). In the absence of IPTG, the transposon insertion should interrupt transcription of cheZ as well as the downstream che genes which coordinate chemotaxis and are required for motility in فيشيري [38]. Thus, it was not surprising that, in the absence of IPTG, this mutant exhibited a motility defect. Given that the Tn insertion was within the cheZ gene, however, it was unexpected that the addition of IPTG would restore near wild-type motility (Fig. ​ 4 4 ). Upon closer investigation of the insertion site, we noted that (1) the Tn is inserted near the beginning of cheZ, and (2) an ATG start codon within the Tn5P transposon end is in frame with the cheZ open reading frame (Fig. ​ 1B 1B and data not shown). Based on these observations, we hypothesize that expression from the transposon’s promoter and translation from the ATG within the transposon end results in the production of a hybrid CheZ protein with an altered N-terminus that is functional to promote motility.

Assessment of IPTG Induction. Our previous experiments used a single concentration of IPTG, 1.75 mM, to induce transcription from the Tn5P promoter. However, it was unclear whether this high amount of IPTG was necessary to obtain full repression/induction of motility by our strains. Thus, to determine the sensitivity of the Tn5P promoter to IPTG, we assessed the mutants’ motility phenotypes in the presence of a range of IPTG concentrations. KV7433 exhibited a dose-dependent increase in motility within a wide range of IPTG concentrations between 3.5 µM and 175 µM IPTG that was not further increased with additional IPTG (Fig. ​ 6 6 ). The other mutant, KV7432, similarly exhibited a dose-dependent change. In this case, the impact on motility required higher IPTG concentrations, above 35 µM at the highest amount tested, 1.75 mM, motility was not fully repressed (Fig. ​ 6 6 ). These data further support our conclusion that expression from the Tn5P promoter is induced by the addition of IPTG. Additionally, because we obtained different ranges of IPTG addition required for a transition from the motile to non-motile phenotype in the two strains, we conclude that it may be necessary to experimentally determine the optimal expression of a particular gene obtained using this experimental set-up (لاسي q /Tn5P) by titrating the concentration of IPTG in the medium against the phenotype being tested.

Dependence of mutant motility phenotypes on IPTG. Motility mutants KV7432 and KV7433 were grown at 28ଌ in TB-SW motility medium containing the indicated concentrations of IPTG. The average diameter of migration of triplicate samples after 5 hours is shown. Standard deviation is indicated by error bars. Error bars smaller than the plotted points are occluded by the points and not visible.


IPTG (dioxane free)

IPTG (isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside) induces the transcription of genes from the لاك و tac operons in bacteria, notably the hydrolase enzyme beta-galactosidase (ß-Gal). Once expressed, ß-Gal hydrolyzes beta-galactoside and lactose sugars into monosaccharides. IPTG is commonly used in the beta-galactosidase assay, wherein cells transfected with vector carrying the بكتريا قولونية-derived لاكز gene, which encodes ß-Gal, are lysed and analyzed via the reaction substrate O-nitrophenyl-beta-D-galactopyranoside (ONPG). The ONPG substrate used in the beta-galactosidase assay turns yellow upon cleavage by ß-Gal, allowing quantitation of the transfected ß-Gal in cells and its use as a transfection control.

IPTG (isopropyl beta- D -1-thiogalactopyranoside) induces the transcription of genes from the لاك و tac operons in bacteria, notably the hydrolase enzyme beta-galactosidase (ß-Gal). Once expressed, ß-Gal hydrolyzes beta-galactoside and lactose sugars into monosaccharides. IPTG is commonly used in the beta-galactosidase assay, wherein cells transfected with vector carrying the بكتريا قولونية-derived لاكز gene, which encodes ß-Gal, are lysed and analyzed via the reaction substrate O-nitrophenyl-beta-D-galactopyranoside (ONPG). The ONPG substrate used in the beta-galactosidase assay turns yellow upon cleavage by ß-Gal, allowing quantitation of the transfected ß-Gal in cells and its use as a transfection control.

IPTG is also commonly used in blue/white screening experiments to determine the presence or absence of bacterial recombinant vectors following transformation. If the insert of interest is cloned into the vector's لاكز gene, it disrupts ß-Gal and prevents its expression. Bacterial colonies are grown on media containing X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl- beta-D-galactopyranoside), a substrate for ß-Gal that turns into an insoluble blue product upon being cleaved by the enzyme. Without ß-Gal, bacterial colonies exposed to X-gal cannot process the substrate and remain white, evidence that they are transformed with recombinant vector and not non-recombinant vector. These white bacterial colonies can be selected for subsequent recombinant vector amplification.

Many regulatory elements of the لاك operon are used in inducible recombinant protein systems IPTG is an effective inducer when used in the concentration range of 100 micromolar to 1.5 millimolar. Inducer concentration depends on the required strength of induction as well as the cell or plasmid genotype for example, if the organism genotype includes lacI q , a mutation that results in the overproduction of the lac repressor, then a higher concentration of IPTG may be necessary.


IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside), Dioxane-Free ≥ 99% (HPLC), ≤ 0.1% Dioxane, Crystalline Powder, Non-Ionic, Molecular Biology Grade

IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside) is a non-metabolizable analog of galactose that is commonly used as a molecular biology reagent during cloning procedures that require induction of β-galactosidase activity. IPTG mimics the lactose metabolite allolactose, which triggers transcription of the lac operon by inactivation of the tetrameric lacl repressor by allosterically altering its conformation which prompts the synthesis of β-galactosidase, a hydrolase enzyme that catalyzes the hydrolysis of β-galactosides into monosaccharides. It is utilized in sync with X-Gal or Bluo-Gal for the purpose of blue-white screening of recombinant bacterial colonies that induce expression of the lac operon in E. coli and also Magenta-Gal for red-white colony screening of bacterial colonies. Allolactose is hydrolyzable by β-galactosidase, but cannot hydrolyze IPTG due to the chemical bond formed with the sulfur atom and as a result it's concentration remains constant during experimentation.

Uptake by E. coli may be independent of lactose permease depending on the concentration of IPTG as there are other transport pathways. At high concentrations which are typically established for protein induction, IPTG enters the cell independent of lactose permease while at low concentrations IPTG enters the cell via lactose permease. Though different concentrations may be utilized depending on the specific use case, IPTG is commonly used with a final concentration ranging from 100 uM - 3 mM. We recommend preparing a stock solution by dissolving IPTG in water and then utilizing a 0.22 um (micron) sterile filter to prepare a 0.1 M IPTG stock solution. The final concentration of IPTG for use in indicator plates should be 0.2 mM. The required induction strength and cell genotype may serve as a key factors in determining the final concentration. IPTG is commonly utilized for its induction efficacy associated with protein expression where a protein of interest is encoded downstream in association with the IPTG and subsequently induced in cell culture which can then be lysed and the resulting protein purified via His-Tag or FST purification systems for proteins with ligand tags. IPTG also has widespread use in blue-white and red-white screening of bacterial colonies.

Redoxica's IPTG is manufactured with high quality materials, the latest instrumentation and manufacturing best practices to ensure an ultrahigh purity end product with reliability and reproducibility at the center of our quality assurance processes. Redoxica's IPTG is manufactured synthetically, from non-animal origin, dioxane-free.

تحديد

Unit of Measure جي
Shelf Life 60 MONTHS
InChI Key BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N
Empirical Formula C9H18O5S
Molecular Weight 238.3
CAS# 367-93-1
Functionality Inducer
مظهر خارجي White to off-white, powder
Odor Odorless
استمارة Solid, fine crystalline powder
رتبة Molecular Biology Grade
ماء ≤ 2.00 %
Melting Point (MP) 121°C
مصدر Synthetic, Animal-Free
نقاء ≥ 99% (HPLC)
MDL Number MFCD00063273
PubChem CID 656894
Suitability Suitable for recombinant protein expression and analysis of bacterial induction behavior.
EC Number 206-703-0
UNII X73VV2246B
Isomeric SMILES CC(C)S[[email protected]]1[[email protected]@H]([[email protected]]([[email protected]]([[email protected]](O1)CO)O)O)O
Canonical SMILES CC(C)SC1C(C(C(C(O1)CO)O)O)O
Formulation 1S/C9H18O5S/c1-4(2)15-9-8(13)7(12)6(11)5(3-10)14-9/h4-13H,3H2,1-2H3/t5-,6+,7+,8-,9+/m1/s1
مكونات (2R,3R,4S,5R,6S)-2-(hydroxymethyl)-6-propan-2-ylsulfanyloxane-3,4,5-triol
Microbial Sterility Test -1.26
0 نعم
1 115 A2
2 AAADceBwOABAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAkAAAAAAAAAAAAAAAAGgQACAAACBSkwAKCAAAABggAAAAAAAAAAAAAABAAAAAAAAABEAIgAAACQAAFAAAjAAHAYAQAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA==
3 ماء
4 4631
5 Dioxane (≤ 0.1%)
6 Clear, colorless
المرادفات IPTG, Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, Isopropyl β-D-thiogalactoside, 1-Thio-beta-D-galactopyranoside Isopropyl, Isopropyl 1 Thio beta D galactopyranoside, Isopropyl 1-Thio-beta-D-galactopyranoside, Isopropyl Thiogalactoside, Thiogalactoside Isopropyl,

Q. How much is shipping and handling? A. US customers receive free ground shipping! If you are located outside of the United States, shipping and handling costs will vary based on location and order size. Additional customs/duties/VAT charges may be incurred for international orders.

Q. How do I place an order? A. All Redoxica products are fulfilled by our exclusive global distribution partner, Labscoop. You can place an order via Labscoop.com, submit your PO by email to [email protected], by fax at 1.800.316.3081 or by phone at 1.800.316.3081.

Q. How do I find pricing and availability? A. The latest pricing and availability is displayed on our website. This is updated in real-time and is the exact same information that our support team and distributors have access to. If you need a formal quotation, please submit a quote request.

Q. Do you offer any discounts? A. We conduct an extensive price analysis on each product we release, so you can be confident that you are getting a great price when comparing the quality of our products, the quantity, and S&H charges. For bulk orders (quantities over 5), please submit a bulk quote request and in most cases we will be able to offer some discounts. For quantities under 5, unfortunately we do not offer any additional discounts.


شاهد الفيديو: أساسيات تفاعل الـ PCR (قد 2022).


تعليقات:

  1. Michelle

    المؤلف لديه مقطع رائع للغاية

  2. Edmond

    أتفق معها تمامًا. في هذا لا شيء هناك وأعتقد أن هذه فكرة جيدة للغاية. أتفق معها تمامًا.

  3. Abba

    ارتكاب الاخطاء. نحن بحاجة إلى مناقشة.

  4. Caleb

    يمكننا القول أن هذا استثناء :) من القواعد

  5. Gokazahn

    إنها متوافقة ، العبارة المفيدة



اكتب رسالة