معلومة

هل يتم تنشيط بروتينات Hsp70 فقط استجابة للصدمة الحرارية؟

هل يتم تنشيط بروتينات Hsp70 فقط استجابة للصدمة الحرارية؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

بروتينات Hsp70 هي مرافقة تساعد في طي البروتين في كتابي في علم وظائف النبات ، حيث تقول إن بروتينات Hsp70 تم اكتشافها عن طريق إحداث صدمة حرارية. لكن هل تعمل فقط استجابة لإجهاد الصدمة الحرارية؟

أعلم أن هذه الأنواع من البروتينات توجد في العديد من الكائنات الحية ولكني مهتم بكيفية مساعدتها في طي البروتين أو الاستجابة للضغط في النباتات على وجه التحديد.


الحدود في علم وظائف الأعضاء

انتماءات المحرر والمراجعين هي الأحدث التي يتم توفيرها في ملفات تعريف بحث Loop وقد لا تعكس موقفهم في وقت المراجعة.


  • تحميل المادة
    • تحميل PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • تكميلي
      مادة
    • ملاحظة ختامية
    • مدير المراجع
    • ملف TEXT بسيط
    • BibTex


    مشاركه فى

    دور بروتينات الصدمة الحرارية في حماية الغشاء المخاطي في المعدة

    تعتبر بروتينات الصدمة الحرارية (HSP) ضرورية للحفاظ على التوازن الخلوي أثناء نمو الخلايا الطبيعي والبقاء على قيد الحياة أثناء وبعد الضغوط الخلوية المختلفة. الخلايا المخاطية السطحية للمعدة هي خط الدفاع الأول ضد الإهانات الناتجة عن تناول الأطعمة و هيليكوباكتر بيلوري عدوى. أظهرت المزارع الأولية للخلايا المخاطية السطحية للمعدة من الغدد القاعدية لخنزير غينيا استجابة نموذجية لصدمة الحرارة بعد التعرض لدرجة حرارة مرتفعة أو إهانات أيضية ، مثل الإيثانول وبيروكسيد الهيدروجين ، وتمكنوا من اكتساب مقاومة لهذه الضغوطات. أدى ضبط النفس وإجهاد الغمر المائي إلى تنشيط عامل الصدمة الحرارية 1 (HSF1) بسرعة في الغشاء المخاطي في المعدة في الفئران خلال 15 دقيقة وتسبب في تعبير HSP70 mRNA وتراكم البروتين فيه. يرتبط مدى التحريض عكسياً مع شدة الآفات المخاطية ، مما يشير إلى دور مهم لـ HSP70 في الدفاع عن الغشاء المخاطي في المعدة. يبدو أن استجابة الصدمة الحرارية هذه يتم توسطها بواسطة α1 أ-مستقبلات أدرينية. تعمل عائلة HSP70 كمرافق جزيئي وتقلل من التمسخ الناتج عن الإجهاد وتجميع البروتينات داخل الخلايا. بالإضافة إلى أنشطتها المرافقة ، تم اقتراح HSP70 لممارسة عملها الوقائي للخلايا من خلال حماية الميتوكوندريا والتدخل في برنامج موت الخلايا المبرمج الناجم عن الإجهاد. في الآونة الأخيرة ، قدمنا ​​geranylgeranylacetone كمحفز HSP70 غير سام. حفز هذا المركب بشكل ضعيف تحريض HSP70 في الخلايا المخاطية المعوية والغشاء المخاطي في المعدة عن طريق تنشيط HSF1 مباشرة وتحريض HSP70 المعزز بشكل ملحوظ استجابة للتعرض اللاحق للإجهاد. وبالتالي ، قد يكون لمحفزات HSP70 غير السامة فائدة محتملة للوقاية من قرحة الإجهاد وعلاجها.


    كيمياء

    تخليق مشتقات الكيرسيتين O-alkylated

    لتحديد أهمية مجموعات الهيدروكسيل الفردية في تثبيط تعبير HSP70 الناجم عن الحرارة والأنشطة البيولوجية الأخرى ، قمنا بتركيب مشتقات كيرسيتين أحادية الميثيل D2، D3، D4، D6، و د 7 وفقًا للإجراءات التي تم الإبلاغ عنها مسبقًا. 45 نظرًا لأننا نعتزم في النهاية إرفاق علامات تقارب مثل البيوتين بالكيرسيتين للمساعدة في تحديد هدف (أهداف) البروتين لنشاط كيرسيتين ، قمنا أيضًا بتجميع عدد من مشتقات الكربوكسيميثيل بنفس الطريقة الاصطناعية (المخطط 1). وهكذا ، تم بنزيلات كيرسيتين لإعطاء 20٪ من مشتق ثلاثي بنزيل 1 و 60٪ من مشتق رباعي البنزيل 2. كان مشتق ثلاثي بنزيل انتقائيًا كربوميثوكسي ميثيل عند 3 & # x02032-OH لإعطاء 4، في حين أن مشتق رباعي البنزيل كان كربوميثوكسي ميثيل عند 5-OH لإعطاء 3. تم إزالة البنزين من المنتجات باستخدام هيدروكسيد البلاديوم والهيدروجين للحصول على استرات الميثيل د 8 و D1 على التوالى.

    لمواقف carbomethoxymethylate 3 و 7، استخدمنا مشتق 3 & # x02032،4 & # x02032-diphenylmethylene من مركب كيرسيتين 5 (مخطط 2). تفاعل هذا المشتق مع methylbromoacetate في ظل الظروف الأساسية عند 3-OH ليعطي 6، والتي أعطت بعد ذلك مشتق الكربوكسيميثيل D5 بعد إزالة مجموعة ثنائي فينيل ميثيلين عن طريق إعادة التدفق بحمض الأسيتيك ، الذي يحلل الإستر أيضًا. للحصول على مشتق O7 ، 3-OH للمركب 5 تم البنزيلات لأول مرة ليعطيها 7 والذي تم بعد ذلك معالجة carbomethoxymethylated في الموضع السابع. تم إجراء إزالة مجموعتي البنزيل وثنائي فينيل ميثيلين على مرحلتين عن طريق التحلل الهيدروجيني باستخدام هيدروكسيد البلاديوم متبوعًا بالتحلل المائي بحمض الأسيتيك والماء الذي أدى أيضًا إلى تحلل الإستر بشكل غير متوقع إلى منتج كربوكسي ميثيل D9.

    محاولات عديدة للميثيل D9 لانتاج D10 لم تنجح ، ولذلك تم التحقيق في طرق اصطناعية أخرى. تضمنت أفضل هذه الطرق التي تم الإبلاغ عنها سابقًا طريقة ميثلة انتقائية أو بنزيل 7-OH من كيرسيتين عن طريق معالجة كيرسيتين بنتا أسيتات مع عامل ألكلة في وجود كربونات البوتاسيوم ويوديد البوتاسيوم في الأسيتون. 46 وبالتالي معالجة كيرسيتين بنتا أسيتات 47 في ظل هذه الظروف بمركب ينتج برومو أسيتات الميثيل 10 والتي يمكن نزع أسيتيلها في غلة عالية في ظل ظروف متعادلة باستخدام حمض N-methyl-2-dimethylaminoacetohydroxamic 48 لإعطاء D10 (مخطط 3). تم اختيار طريقة نزع الأسيتيل هذه كظروف أساسية أكثر ، مثل ميثوكسيد الصوديوم والميثانول عند 0 & # x000b0 درجة مئوية ، تميل إلى أكسدة الهواء للمنتج ، 49 والمزيد من الظروف الحمضية تؤدي إلى التحلل المائي لإستر الميثيل.

    التوصيف الهيكلي

    تم تأكيد مواقع الألكلة في جميع المركبات من خلال تحليل أنماط الاقتران في أطياف 1D 1 H NMR جنبًا إلى جنب مع الارتباطات في أطياف COZY و HMQC و HMBC. كتوضيح ، الحلقة B الهيدروجين H5 & # x02032 و H6 & # x02032 من D1 (الشكل 3) و D10 (الشكل 4) تم تعيينه بواسطة اقتران ortho كبير ، وذروة عرضية قوية في طيف COZY (الذروة المتقاطعة أ ، اللوحة أ). أدت هذه التخصيصات إلى تخصيص H2 & # x02032 من خلال اقتران التعريف مع H6 & # x02032 التي يمكن اكتشافها في طيف 1D 1 H NMR. يمكن بعد ذلك تخصيص الكربون المرتبط مباشرة بهذه البروتونات من خلال أطياف HMQC (اللوحة B). إشارة الهيدروجين عند 10 جزء في المليون في D1 يمكن بعد ذلك تعيينه إلى 4 & # x02032-OH من خلال وجود ارتباط طويل المدى بـ C5 & # x02032 عند 116 جزء في المليون (الشكل 3 ، الذروة المتقاطعة e) وإشارة الكربون الرباعي عند 146 جزء في المليون (الذروة المتقاطعة ب) مع الغياب من الارتباط بـ C2 & # x02032 في طيف HMBC (اللوحة C). لذلك يمكن تعيين الإشارة عند 146 جزء في المليون إلى C3 & # x02032 والتي أظهرت بدورها ارتباطًا بالهيدروجين & # x003b1 لمجموعة carbomethoxymethylene (ذروة متقاطعة d ، اللوحة C). موقع مجموعة carbomethoxymethylene في D10 يمكن تعيينه إلى O7 عبر ارتباط بين بروتونات الميثيلين & # x003b1 وإشارة الكربون الرباعي عند 162 جزء في المليون (الشكل 4 ، ذروة متقاطعة د في اللوحة C). يمكن تعيين الإشارة عند 162 جزء في المليون إلى C7 عبر ارتباطات رابطة متعددة مع البروتونات المزدوجة المترابطة في الحلقة A في طيف HMBC (القمم المتقاطعة b & # x00026 c في اللوحة C).

    احالة هيكل D1. (أ) دافئ ، (ب) HMQC و (ج) HMBC من D1 في DMSO-d6

    احالة هيكل D10. (أ) دافئ ، (ب) HMQC و (ج) HMBC من D10 في DMSO-d6.


    العوامل والشروط التي تعمل على تعديل التعبير HSP70

    بعض المحفزات والظروف التي تعدل تعبير HSP70.

    تم توثيقه جيدًا أن المحفزات المتعددة يمكن أن تحفز التراكم في الجسم الحي لبروتينات HSP70. كما هو موضح في الشكل 1 ، تشمل هذه المحفزات ارتفاع الحرارة (28 ، 50 ، 51 ، 92) ، نقص التروية - ضخه (15 ، 69) ، نقص الأكسجة (22 ، 30 ، 44) ، استنفاد الطاقة (88) ، الحماض (104) ، وتشكيل ROS (103). نظرًا لأن هذه المحفزات تشبه التغيرات الأيضية المتكاملة المرتبطة بالتمرين ، فليس من المستغرب أن تكون التمارين الرياضية قد ثبت أنها تحفز HSPs.

    في إحدى التجارب الأولية على الحيوانات لمعالجة مسألة تحريض HSP مع التمرين ، لوك وآخرون. لاحظ (67) أن نوبة واحدة من المطحنة المرهقة التي تعمل في الفئران يمكن أن تزيد من تخليق Hsp70 في العضلات الهيكلية والخلايا الليمفاوية والطحال. أكدت الدراسات اللاحقة التي أجراها العديد من الباحثين أن التمارين الحادة تؤدي إلى زيادة مستويات Hsp70 في تقلص عضلات الهيكل العظمي وكذلك الأعضاء الحيوية مثل القلب والكلى والكبد (50 ، 66 ، 68 ، 85 ، 86 ، 92). من الصعب تحديد أي من المحفزات العديدة المتولدة أثناء التمرين الحاد تساهم ، وإلى أي درجة ، في الزيادات الملحوظة في تراكم Hsp70 الخلوي ، ويرجع ذلك جزئيًا إلى أن التمرين ينتج ارتفاعات في كل من Tج والأنسجة (على سبيل المثال ، تقلص العضلات الهيكلية) المتزامنة مع المحفزات الفسيولوجية الأخرى.

    للتحقيق فيما إذا كان التمرين يمكن أن يزيد من تعبير HSP70 بشكل مستقل عن التغييرات في T.ج، سكيدمور وآخرون. (92) تجربة مصممة تم فيها ممارسة الفئران في بيئة باردة لمنع T.ج من زيادة فوق مستويات الراحة. تمت زيادة تراكم HSP70 في العضلات الحركية الخلفية وأنسجة القلب بعد نوبة تمرين ، مما يشير إلى أن العوامل الأخرى غير الإجهاد الحراري قد تساهم في تراكم HSP70 أثناء التمرين الحاد. على الرغم من أنه من المحتمل أن تكون درجات الحرارة المحلية للعضلات الحركية مثل عضلة الساق والنعل مرتفعة أثناء الجري على جهاز المشي ، إلا أن البيانات من الدراسات السابقة تشير إلى أن درجة حرارة عضلات الهيكل العظمي المتقلصة في الفئران يمكن مقارنتها بـ Tج عند إنهاء تمارين مفرغة معتدلة الشدة (10). لذلك ، من المعقول أن نفترض أن المحفزات بخلاف ارتفاع درجة الحرارة تساهم أيضًا في زيادة مستويات HSP70 للهيكل العظمي والعضلات القلبية التي تصاحب التمرين.

    تعد الدراسات البشرية التي تقيم استجابات Hsp70 للتمرين أكثر ندرة وأقل ثاقبة ، ويرجع ذلك على الأرجح جزئيًا إلى الصعوبات في الحصول على العينات والظروف الصعبة لمعظم التصاميم التجريبية. ركزت هذه الدراسات في المقام الأول على التعبير عن بروتين الإجهاد في العضلات الهيكلية أو الكريات البيض المنتشرة. أثبتت دراستان منفصلتان أن نوبة واحدة من التمارين في موضوعات غير مدربة يمكن أن تؤدي إلى زيادة تركيزات Hsp70 mRNA في العضلة المتسعة الوحشية (26 ، 80). ومن المثير للاهتمام ، أنه تم تقييم مستويات البروتين Hsp70 بعد 3 ساعات من التمرين في إحدى هذه الدراسات وظلت دون تغيير عن مستويات التحكم (80). في المقابل ، Liu et al. وجد (65) أن التعبير عن Hsp70 قد زاد في العضلة الوحشية المتسعة للإنسان بعد 1-4 أسبوع من تدريب التجديف.

    هناك عدد قليل من الدراسات الإضافية التي قيمت استجابة Hsp70 للتمرين في كريات الدم البيضاء في الدم المحيطي. ريان وآخرون. (84) وجد زيادات طفيفة فقط في تعبير Hsp70 في الدم الذي تم الحصول عليه من الشباب الذين أجروا ساعتين من التمارين على جهاز المشي في ظروف دافئة ، في حين أن Fehrenbach et al. (27) قرر أن تمرين التحمل شديد الكثافة كان مرتبطًا بزيادة في تعبير Hsp70 في الكريات البيض. كان جانبًا فريدًا من هذه الدراسة هو الملاحظة التي تفيد بأن استجابة Hsp70 الناتجة عن التمرين كانت ضعيفة في الأشخاص الذين تم تدريبهم هوائيًا مقارنةً بالضوابط غير المدربة. في دراسة ذات نتائج متناقضة (16) ، وجد أن التمارين الرياضية واستبدال الإستروجين لدى النساء الشابات ليس لهن أي تأثير على مستويات الكريات البيض Hsp70 بعد عدة ساعات من نوبة تمرين معتدلة الشدة.

    بشكل عام ، لا يسمح العدد المحدود للدراسات المتاحة على البشر باستخلاص نتيجة نهائية فيما يتعلق بتأثير التمرين على استجابات Hsp70. من المحتمل أن تكون الاختلافات في كثافة ونوع بروتوكول التمرين المستخدم ، إلى جانب القضايا التي تتراوح من الجنس إلى حالة التدريب ، قد ساهمت في النتائج المتباينة في هذا المجال. مزيد من البحث ضروري لمعالجة القضايا المتعلقة بتنظيم Hsp70 في البشر ولتحديد ما إذا كانت هذه اللائحة متوافقة مع النتائج التي تم الحصول عليها في الحيوانات وأنظمة الخلايا المختبرية.

    الشيخوخة وتغيير تعبير Hsp70.

    كما هو مذكور أعلاه ، فإن الخلايا والأنسجة والكائنات الحية الكاملة لديها القدرة على أن تصبح مقاومة للضغوط مثل ارتفاع الحرارة بعد التعرض السابق للحرارة دون المميتة (أي التحمل الحراري المكتسب) ، ويبدو أن HSPs تلعب دورًا حاسمًا في هذه العملية. أحد السيناريوهات المهمة وذات الصلة سريريًا التي يتم فيها تقليل تحمل الإجهاد الحراري هو الشيخوخة. في البشر ، ترتبط عملية الشيخوخة بارتفاع معدلات المراضة والوفيات بسبب الضغوطات مثل التعرض للحرارة. على سبيل المثال ، يُعتقد أن الانخفاضات المرتبطة بالعمر في الاستجابة للضغط مرتبطة بزيادة معدل الوفيات التي تم الإبلاغ عنها للأفراد الأكبر سنًا الذين تعرضوا لموجات حر طويلة (39 ، 89). في مختبرنا ، لاحظنا أن الحيوانات الأكبر سنًا أقل مقاومة للحرارة ولديها معدلات وفيات أعلى من نظيراتها الأصغر سنًا عند تعرضها لتحديات الحرارة المتكررة (37).

    هناك العديد من الآليات المحتملة التي من المحتمل أن تسهم في تقليل تحمل الإجهاد مع تقدم العمر ، بما في ذلك التغييرات في تراكم HSP70 ووظيفته. قام الباحثون بفحص استجابة بروتين الإجهاد في الكائنات الحية المسنة لتحديد ما إذا كان النقص في HSP70 هو تفسير محتمل لانخفاض تحمل الحرارة لدى كبار السن (9 ، 25 ، 36 ، 64). أظهرت الدراسات في المختبر أن الخلايا الليفية البشرية (64) والجرذان (25) تستجيب للتدفئة مع انخفاض HSP70 mRNA ومستويات البروتين الكلية. تشير البيانات في الجسم الحي ، بشكل أساسي من الأنسجة المستخرجة من الحيوانات السليمة (8 ، 37 ، 51 ، 77) ، إلى أن التعبير عن HSP70 ودوره الوقائي المحتمل في الإجهاد الخلوي قد ينخفض ​​مع تقدم العمر. علاوة على ذلك ، حددت الدراسات التي استفادت من تقنية مصفوفة التعبير (كدنا) أن الشيخوخة تؤدي إلى تغيير التعبير الجيني استجابة للإجهاد الحراري الذي يشير إلى انخفاض التعبير عن بروتين الإجهاد (110).

    دراسة حديثة أجراها Hall et al. (37) تناول هذه المشكلة بمزيد من التفصيل من خلال التحقيق فيما إذا كان الانخفاض في القدرة الخلوية لتركيب استجابة بروتين إجهاد مناسبة في الحيوانات المسنة بعد تجارب التسخين المتتالية مرتبطًا بانخفاض التحمل الحراري. تعرضت الفئران الصغيرة والكبيرة فيشر فيشر 344 للإجهاد الحراري (T.ج من 41 درجة مئوية) مرتين ، يفصل بينهما 24 ساعة. تم الحصول على عينات من الكبد في عدة نقاط زمنية في فترة التعافي اللاحقة البالغة 48 ساعة ، ثم تم تقييم العينات التمثيلية لتعبير Hsp70. اقترحت عدة أدلة من هذه الدراسات أن هناك صلة وظيفية بين التناقصات المرتبطة بالعمر في تعبير Hsp70 والاستجابات الفيزيولوجية المرضية للإجهاد الحراري. أولاً ، أظهرت نتائج اللطخة المناعية والكيمياء المناعية أن حجم استجابة Hsp70 قد انخفض بشكل ملحوظ مع تقدم العمر. في الحيوانات الصغيرة ، كانت استجابة Hsp70 قوية في المنطقة المجاورة للوريد المركزي ، والتي ترتبط وظيفيًا بانخفاض تدفق الدم وانخفاض توتر الأكسجين. في المقابل ، كان للحيوانات الشائخة تعبير Hsp70 منخفض نسبيًا في هذه المنطقة (الشكل 2). ثانيًا ، أظهرت الحيوانات الأكبر سنًا إصابة كبدية واسعة النطاق في منطقة الوريد المركزية والتي تتوافق مع انخفاض استجابة Hsp70 في هذه المناطق وانخفاض القدرة على تحمل ضغوط الحرارة المتتالية. على العكس من ذلك ، كانت إصابة الكبد أقل بشكل ملحوظ في المجموعة الشابة. أخيرًا ، أظهرت مقارنة أنماط تعبير Hsp70 التي يسببها الإجهاد اختلافات واضحة في الفئتين العمريتين. استجابت الفئران الصغيرة للإجهاد الحراري بنمط قوي من التعبير النووي والهيولي Hsp70 الذي تم الحفاظ عليه لمدة 48 ساعة في خلايا الكبد الموجودة في مناطق الوريد المركزية (الشكل 2). في الحيوانات المسنة ، تأخر تعبير Hsp70 النووي والهيولي وانخفض ، على الرغم من وجود زيادة عابرة في تعبير Hsp70 في ساعتين من الانتعاش والتي تضاءلت لاحقًا في نقاط زمنية لاحقة. تشير هذه النتائج إلى أن استجابة بروتين الإجهاد الضعيف في الحيوانات الأكبر سنًا قد يكون لها عواقب وظيفية ترتبط بزيادة الإصابة الخلوية وتقليل تحمل الإجهاد المرتبط بتقدم العمر.

    الصورة 2.التوطين الخلوي والتوزيع النطاقي لبروتين Hsp70 المناعي في كبد الجرذان الصغيرة والكبيرة بعد الإجهاد الحراري (المرجع 37). تم جمع خزعات الكبد من الشباب (اليسار) وقديم (حق) فيشر 334 جرذًا بعد 12 ساعة من بروتوكول الإجهاد الحراري ، وكانت الأقسام ملطخة بجسم مضاد أحادي النسيلة خاص بـ Hsp70. لم يكن هناك أي دليل على Hsp70 المناعي في خلايا الكبد من حيوانات تحكم euthermic صغيرة أو قديمة (غير معروضة). ومع ذلك ، في 12 ساعة من التعافي من الإجهاد الحراري ، لوحظ تلطيخ حشوي قوي (أسهم صلبة) ونووي (أسهم مفتوحة) لمضاد Hsp70 في خلايا الكبد المحيطة بمنطقة الوريد المركزية في الفئران الصغيرة (أ). على العكس من ذلك ، في الفئران القديمة (ب) ، لوحظ فقط تعبير حشوي ضعيف (أسهم صلبة) في خلايا الكبد على مقربة من الوريد المركزي. التكبير = × 40.


    نهج الجينوم - hsp الجينات وتسلسل الأحماض الأمينية ب. موري

    تتكون عائلة HSP من بروتينات منتشرة في كل مكان ، والتي يتم حفظها نسبيًا من البكتيريا إلى الثدييات والنباتات (Craig 1985). تم تقسيمها إلى عائلات فرعية مثل HSP110 و HSP100 و HSP90 و HSP70 و HSP60 و HSP40 و HSP20 على أساس أوزانها الجزيئية (Nover and Scharf 1997 Gething 1998). على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن التعبير عن HSPs من سلالات مختلفة من دودة القز (الجدول 1) ، إلا أنه تم تمييز عدد قليل منها في ب. موري. في الآونة الأخيرة ، Landais et al. (2001) تميز cDNA بتشفير 90 كيلو دالتون HSP في ب. موري وقارنوها بـ Spodoptera frugiperda (كلا الحشرات قشريات الأجنحة). يشفر هذان cDNAs 716 aa (حمض أميني) و 717 aa بروتينات في ب. موري و S. frugiperda، على التوالي ، مع الكتلة الجزيئية المحسوبة 83 كيلو دالتون والتي تشبه ذبابة الفاكهة.

    ملف البروتين المشتق من الطور الخامس بومبيكس موري يرقات سلالة CSR2 ، صدمة الحرارة (HT) عند 40 درجة مئوية والتحكم غير المعالج (C). تشير الأسهم إلى التعبير عن بروتينات الصدمة الحرارية 84 و 60 و 62 و 47 و 42 و 33 كيلو دالتون. يشير M إلى علامة الوزن الجزيئي. أرقام عالية الجودة على شبكة الإنترنت.

    ملف البروتين المشتق من الطور الخامس بومبيكس موري يرقات سلالة CSR2 ، صدمة الحرارة (HT) عند 40 درجة مئوية والتحكم غير المعالج (C). تشير الأسهم إلى التعبير عن بروتينات الصدمة الحرارية 84 و 60 و 62 و 47 و 42 و 33 كيلو دالتون. يشير M إلى علامة الوزن الجزيئي. أرقام عالية الجودة على شبكة الإنترنت.

    على عكس الفقاريات ، hsp90 لا يحتوي على إنترونات وهو جين فريد في كل من ب. موري و S. frugiperda الجينوم. مقارنة تسلسلات أأ من ب. موري و S. frugiperda مع ذلك د.ميلانوجاستر ،الانسان العاقل، و S. cerevisiae كشفت عن نسبة عالية من علاقات التشابه والتطور (لمزيد من التفاصيل انظر لانديس وآخرون ، 2001). على ما يبدو ، هناك حاجة إلى دراسة مكثفة لتحديد تعبيرها في مراحل التطور المختلفة لسلالات دودة القز المختلفة حيث تم العثور على تعبير HSP90 في الأطوار المبكرة بدلاً من الأطوار المتأخرة (Vasudha et al. 2006) والتعبير عن بعض hsp تتغير الجينات أثناء التطور (Craig 1985). في د. ميلانوجاستر, hsc70-4 (تأسيسي hsp عائلة الجين) على مستوى عالٍ في الأجنة واليرقات والبالغين ، في حين أن HSC70-1 و HSC70-2 كان التعبير أعلى عند البالغين ولكن لم يتم اكتشافه في اليرقات. ال HSC70-1 تم التعبير عنها عند مستوى منخفض بينما لم يتم التعبير عن HSC70-2 لوحظ في الجنين. في Chironomus Tentans, HSC70 كان التعبير واضحًا في جميع مراحل النمو ولكنه أقل قليلاً في الجنين من المراحل الأقدم (Karouna-Renier et al.2003).

    تنتمي بروتينات الصدمة الحرارية الصغيرة (smHSPs أو sHSPs) إلى عائلة من الجينات التي تبدو أقل حفظًا مقارنةً بالبروتينات الرئيسية hsp عائلات الجينات ، ولكنها تحدث في كل مكان في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية. تشارك هذه البروتينات في موت الخلايا المبرمج بالإضافة إلى الحماية من الإجهاد الحراري (Arrigo 2005 Feder and Hofmann 1999). في ب. موري (سلالة p50) تم الإبلاغ عن ستة جينات ترميز sHSP19.9 و sHSP20.1 و sHSP20.4 و sHSP20.8 و sHSP21.4 و sHSP23.7 (Sakano وآخرون 2006) على الرغم من أن أدوارهم البيولوجية والتجارية لا تزال غير معروفة. بقايا الأحماض الأمينية المستخرجة من هذه sHSPs (الجدول 2) متشابهة تمامًا مع بعضها البعض. أشارت محاذاة CLUSTALW المتعددة إلى هوية 82 و 80 و 80٪ بين Pia25 و sHSP20.8 و sHSP20.8 و sHSP20.4 و sHSP20.4 و sHSP19.9 على التوالي. إلى جانب المجال البلوري ، يتم حفظ أشكال XXLXDQXFG N-terminal بشكل شائع في تسلسلات هذه HSPs (Sakano et al. 2006). علاوة على ذلك ، أظهر تحليل إنزيم النسخ العكسي - تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-PCR) عدم وجود اختلاف في مستويات التعبير عن smHSP الجينات في أعضاء مختلفة (Sakano وآخرون ، 2006) ، لكنها أشارت إلى زيادة كمية النسخ بعد الصدمة الحرارية في ب. موري سلالات p50 (Sakano وآخرون ، 2006) ، و Nistari و NB4D2 (Velu وآخرون ، 2008) ، والتي وجد أنها خاصة بالسلالة. BmHSPs (ب. موري تم حساب HSPs) مع كائنات أخرى باستخدام البيانات المتاحة في بنك بيانات المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) وعرضها في الجدول 3.

    بومبيكس موري أرقام مدخلات بروتينات الصدمة الحرارية (BmHSPs) ومعرفات البروتين والأحماض الأمينية المستخلصة.

    الأشخاص ذوو الحساسية العالية. الانضمام لا. . معرف البروتين لا. . مجموع لا. من .
    أحماض أمينية .
    إتش إس بي 90 AB060275 BAB41209 716
    Hsp70 DQ311189 ABD36134.1 676
    Chaperonin (Hsp60) NM_001079879 NP_001073348 545
    Hsp40 AB206400 BAD90846.1 351
    Hsp23.7 AB195973 BAD74198.1 209
    Hsp21.4 AB195972 BAD74197.1 187
    Hsp20.8 AF315317 AAG30944.1 186
    Hsp20.8A AF315319 AAG30946 186
    Hsp20.4 AF315318 AAG30945.2 181
    Hsp20.1 AB195971 BAD74196.1 178
    19.9 AB195970 BAD74195.1 177
    Hsp1 DQ443370.1 ABF51459 198
    α-crystallin1 AF309497.1 AAK06407 122
    α-crystallin2 AF309499.1 AAK06409 90
    الأشخاص ذوو الحساسية العالية. الانضمام لا. . معرف البروتين لا. . مجموع لا. من .
    أحماض أمينية .
    إتش إس بي 90 AB060275 BAB41209 716
    Hsp70 DQ311189 ABD36134.1 676
    Chaperonin (Hsp60) NM_001079879 NP_001073348 545
    Hsp40 AB206400 BAD90846.1 351
    Hsp23.7 AB195973 BAD74198.1 209
    Hsp21.4 AB195972 BAD74197.1 187
    Hsp20.8 AF315317 AAG30944.1 186
    Hsp20.8A AF315319 AAG30946 186
    Hsp20.4 AF315318 AAG30945.2 181
    Hsp20.1 AB195971 BAD74196.1 178
    19.9 AB195970 BAD74195.1 177
    Hsp1 DQ443370.1 ABF51459 198
    α-crystallin1 AF309497.1 AAK06407 122
    α-crystallin2 AF309499.1 AAK06409 90

    بومبيكس موري أرقام دخول بروتينات الصدمة الحرارية (BmHSPs) ومعرفات البروتين والأحماض الأمينية المستخلصة.

    الأشخاص ذوو الحساسية العالية. الانضمام لا. . معرف البروتين لا. . مجموع لا. من .
    أحماض أمينية .
    إتش إس بي 90 AB060275 BAB41209 716
    Hsp70 DQ311189 ABD36134.1 676
    Chaperonin (Hsp60) NM_001079879 NP_001073348 545
    Hsp40 AB206400 BAD90846.1 351
    Hsp23.7 AB195973 BAD74198.1 209
    Hsp21.4 AB195972 BAD74197.1 187
    Hsp20.8 AF315317 AAG30944.1 186
    Hsp20.8A AF315319 AAG30946 186
    Hsp20.4 AF315318 AAG30945.2 181
    Hsp20.1 AB195971 BAD74196.1 178
    19.9 AB195970 BAD74195.1 177
    Hsp1 DQ443370.1 ABF51459 198
    α-crystallin1 AF309497.1 AAK06407 122
    α-crystallin2 AF309499.1 AAK06409 90
    الأشخاص ذوو الحساسية العالية. الانضمام لا. . معرف البروتين لا. . مجموع لا. من .
    أحماض أمينية .
    إتش إس بي 90 AB060275 BAB41209 716
    Hsp70 DQ311189 ABD36134.1 676
    Chaperonin (Hsp60) NM_001079879 NP_001073348 545
    Hsp40 AB206400 BAD90846.1 351
    Hsp23.7 AB195973 BAD74198.1 209
    Hsp21.4 AB195972 BAD74197.1 187
    Hsp20.8 AF315317 AAG30944.1 186
    Hsp20.8A AF315319 AAG30946 186
    Hsp20.4 AF315318 AAG30945.2 181
    Hsp20.1 AB195971 BAD74196.1 178
    19.9 AB195970 BAD74195.1 177
    Hsp1 DQ443370.1 ABF51459 198
    α-crystallin1 AF309497.1 AAK06407 122
    α-crystallin2 AF309499.1 AAK06409 90

    نقاش

    نظرًا لأن HSF1 مسؤول عن استجابة الإجهاد في خلايا الثدييات (Morimoto et al. ، 45 ، 46 70) ، فقد تؤثر مستويات عامل النسخ هذا على حجم تحريض hsp70 بعد الإجهاد الحراري. في الفئران البالغة من العمر يومين ، توجد مستويات أعلى من بروتين HSF1 ونشاط ارتباط HSF-HSE في الكلى شديدة الحرارة مقارنة بمناطق الدماغ ، بما يتوافق مع حجم تحريض بروتين hsp70 بعد الإجهاد الحراري في هذه الأنسجة. في الفئران البالغة ، مستويات أعلى من

    يوجد بروتين HSF1 ونشاط ارتباط HSF-HSE في الدماغ شديد الحرارة مقارنة بالكلى ، بما يتوافق مع الحجم النسبي لتحريض بروتين hsp70 في هذين العضوين بعد الإجهاد الحراري. هناك مستويات قاعدية عالية من بروتين hsp70 في كلية الحيوانات الضابطة ، وبالتالي من المفترض أن تكون المستويات القاعدية عالية من hsp70 mRNA. نظرًا لأن الصدمة الحرارية تزيد بشكل ملحوظ من استقرار hsp70 mRNA (64) ، فإن استقرار كمية كبيرة نسبيًا من hsp70 mRNA في الكلية شديدة الحرارة قد يساهم في مستوى بروتين hsp70 في هذا النسيج. في الدماغ ، ليست كل أنواع الخلايا تحفز hsp70 بعد زيادة درجة حرارة الجسم ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية (براون ، 9 ، 7 40 12). على سبيل المثال ، تحفز الخلايا الدبقية قليلة التغصن وبعض الخلايا الدبقية الصغيرة hsp70 mRNA بعد الصدمة الحرارية ، في حين أن الخلايا العصبية الكبيرة والخلايا النجمية الإيجابية للبروتين الليفي الدبقي في الدماغ الأمامي لا تحفز (62 Foster and Brown، 23، 24). هذا على الرغم من الحقائق التي تشير إلى وجود مستويات وفيرة من HSF1 في الخلايا العصبية للدماغ الأمامي وأن HSF1 موضعي في نوى هذه الخلايا العصبية في كل من الحيوانات الضابطة والحيوانات شديدة الحرارة (11). بعد ارتفاع الحرارة ، تحفز الخلايا الحبيبية المسننة للحصين مستويات عالية من hsp70 mRNA ولكن القليل من بروتين hsp70 ، مما يشير إلى تنظيم ما بعد النسخ لتخليق البروتين (36).

    على الرغم من المستويات المنخفضة جدًا من HSF1 في الكلى البالغة ، إلا أن هذا العضو يمكنه مع ذلك إحداث كمية كبيرة من hsp70 بعد الصدمة الحرارية. لذلك ، لماذا من الضروري أن تحتوي مناطق الدماغ البالغة على مثل هذه المستويات العالية من HSF1؟ بسذاجة ، قد نتساءل عما إذا كان HSF1 مسؤولاً بالكامل عن تحريض hsp70 بعد الصدمة الحرارية. ومع ذلك ، أظهر Xiao et al. ، (73) ذلك hsf1(- / -) لا تستطيع الفئران تحفيز hsp70 بعد ارتفاع الحرارة. مستويات hsp90 و hsc70 في دماغ الفئران البالغة أعلى بكثير منها في الكلى (19 دراسة حالية ، الشكل 7 ب) ، وقد تثبط هذه البروتينات استجابة الصدمة الحرارية في الدماغ عند مستويات الإجهاد المنخفضة. قد يكون المستوى العالي من HSF1 في الدماغ ضروريًا لخفض عتبة استجابة الصدمة الحرارية في وجود كميات كبيرة من hsc70 و hsp90. الاحتمال الآخر هو أن المستويات العالية من HSF1 العصبية ضرورية لقمع الجينات غير hsp. هناك دليل على ذلك ذبابة الفاكهة يرتبط HSF بالعشرات من الجينات غير hsp ، وربما يمنع نسخها بعد الصدمة الحرارية (68). في حيدات الإنسان المصابة بالصدمة الحرارية ، يرتبط HSF1 المنشط بـ HSE في جين prointerleukin 1β ويقمع نسخ هذا الجين (14). قد يمنع HSF1 أيضًا التعبير عن طيف واسع من السيتوكينات الأخرى (33 73). قد يكون HSF1 متورطًا في قمع مجموعة من جينات الصدمة غير الحرارية الأخرى. في جميع مراحل النمو ، يتم نسخ نسبة أعلى من الحمض النووي غير المتكرر في دماغ الثدييات عنها في الكلى (8). يزداد تعقيد النسخ في الدماغ من حديثي الولادة إلى المرحلة التي تبلغ من العمر أسبوعين قبل أن يستقر في المرحلة البالغة من العمر 6 أسابيع (8). ومع ذلك ، يبدو أن تعقيد نسخ الحمض النووي الريبي في الكلى يتناقص مع نمو الحيوان (8). من المثير للاهتمام أن هذا النمط يطابق التعبير التطوري لبروتين HSF1 في تلك الأنسجة. لذلك ، قد تكون الوظيفة الإضافية لـ HSF1 هي إيقاف الجينات بعد الصدمة الحرارية.

    قد يقوم HSF1 بأداء وظائف أخرى أيضًا. على سبيل المثال ، قد يساعد HSF1 في تنظيم بروتين كيناز المعتمد على الحمض النووي (49) ، وقد يلعب دورًا في تنظيم دورة الخلية (13). قد يؤثر HSF1 على تطور الفئران بعد الولادة بطرق لا تتضمن تحريض جينات الصدمة الحرارية. الوظائف التنموية لـ ذبابة الفاكهة لا يتم التوسط في HSF من خلال تحريض جينات الصدمة الحرارية (34). كما تم ذكره سابقا، hsf1(- / -) الفئران بالضربة القاضية لديها تشوهات نمطية متعددة ، على الرغم من حقيقة أن تعبير hsp القاعدية لا يتغير بشكل ملحوظ (43 73). هذا يشير إلى أن HSF1 ، مثل ذبابة الفاكهة HSF ، قد يشارك في تنظيم الجينات المهمة الأخرى أو مسارات الإشارات (73).

    أثرت درجة الحرارة الأولية للفئران البالغة من العمر يومين التي تعرضت للصدمة الحرارية على مدة نشاط ربط HSF-HSE وفرط الفسفرة لـ HSF1. شهدت الفئران التي كانت عند 30 درجة مئوية قبل الصدمة الحرارية 40 درجة مئوية مدة أطول لنشاط ربط HSF-HSE من تلك التي كانت في البداية عند 35 درجة مئوية. تتفق هذه النتيجة مع نتيجة Abravaya et al. (1) ، الذي وجد أن خلايا هيلا التي نمت عند 35 درجة مئوية شهدت قدرًا أكبر ومدة ارتباط HSF-HSE بعد الصدمة الحرارية مقارنة بالخلايا التي نمت عند 37 درجة مئوية. أيضًا ، أظهرت الفئران البالغة من العمر يومين والتي كانت في البداية عند 30 درجة مئوية فسفرة واضحة ناتجة عن الإجهاد لـ HSF1 ، في حين أن الفئران التي كانت في البداية عند 35 درجة مئوية لم تفعل ذلك.

    تنخفض مستويات بروتين HSF2 في الدماغ والكلى أثناء نمو الفئران بعد الولادة. قد تشير حقيقة أن مستويات HSF2 أعلى في الفئران غير الناضجة إلى دور تنموي لـ HSF2. ومع ذلك ، يوجد بعض HSF2 في أنسجة البالغين ، مما يشير إلى أن HSF2 له وظيفة في الحيوان الناضج. مستويات HSF2 أعلى في الدماغ منها في الكلى. على الرغم من أن مستويات HSF2 مرتفعة في الفئران البالغة من العمر يومين ، إلا أنه لا يوجد نشاط أساسي مرتبط بـ HSF-HSE في المخيخ أو الكلى بعمر يومين ، مما يشير إلى أن HSF2 لا يشارك في نسخ الجينات في هذا الوقت. علاوة على ذلك ، قامت دراسة سابقة في مختبرنا بالتحقيق في التغيرات التنموية في المستويات القاعدية لـ hsp90 و hsp70 و hsc70 و hsp60 في دماغ الفئران والكلى (19) ، وهذه التغييرات لا توازي انخفاض مستويات HSF2 التي لوحظت في الدراسة الحالية. وبالمثل ، رالو وآخرون. (54) لم يجد أي ارتباط واضح بين أنماط التعبير عن hsps الرئيسية وأنماط HSF2 أثناء التطور الجنيني للفأر. ومع ذلك ، تم العثور مؤخرًا على عامل صدمة حراري آخر ، HSF4b ، والذي يمكن أن يعمل كمنشط لجينات الصدمة الحرارية في ظل الظروف العادية ، في الثدييات (63).

    كما ذكرنا سابقًا ، قد يعمل الشكل الإسوي الأصغر لـ HSF2 ، HSF2-، كمنظم سلبي لنشاط HSF2 أثناء تمايز كرات الدم الحمراء بوساطة خلايا K562 (37). يوجد الشكل الإسوي HSF2-β بكميات أعلى من الشكل الإسوي HSF2α في دماغ ما بعد الولادة. قد يفسر هذا عدم وجود أي تنشيط لـ HSF2 في الدماغ البالغ من العمر يومين ، على الرغم من المستويات العالية من بروتين HSF2. تظهر الكيمياء المناعية لدماغ الجرذ أن HSF2 مترجمة إلى نوى الخلايا العصبية في اليوم الثاني وفي السيتوبلازم في اليوم 30 (11).

    في الآونة الأخيرة ، تبين أن HSF2 يتم تنشيطه عندما يتم تثبيط مسار يوبيكويتين-بروتيازوم (41). من المعروف أن العديد من الأمراض العصبية التنكسية ، بالإضافة إلى الشيخوخة الطبيعية ، تتميز بتراكم البروتينات المنتشرة في الخلايا العصبية وبعض الخلايا الدبقية (2). قد تكون الخلايا العصبية حساسة بشكل خاص لخلل في المسار المعتمد على يوبيكويتين / ATP (2). من الممكن أن الكميات العالية نسبيًا من بروتين HSF2 في الدماغ تحمي من تراكم البروتينات في كل مكان. أيضًا ، قد يؤثر HSF2 على تطور الفئران من خلال تأثيره الذي تمت مناقشته مسبقًا على نشاط PP2A. سيؤدي إنشاء HSF2 (- / -) - الماوس الناقص إلى توضيح وظيفة HSF2.

    باختصار ، تزداد مستويات HSF1 في مناطق الدماغ وتنخفض في الكلى أثناء نمو الفئران بعد الولادة. في كل من الجرذان حديثي الولادة والبالغين ، تتناسب مستويات بروتين HSF1 في الدماغ والكلى مع مستويات نشاط ارتباط HSF-HSE وحجم تحريض بروتين hsp70 بعد الإجهاد الحراري. يبدو أن هناك المزيد من بروتين HSF1 في أدمغة البالغين اللازمة للتعبير الناجم عن الإجهاد عن hsp70 ، مما يشير إلى أن HSF1 قد يكون له وظائف أخرى بالإضافة إلى دوره كمنشط محفز للإجهاد لجينات الصدمة الحرارية. تنخفض مستويات بروتين HSF2 أثناء نمو الفئران بعد الولادة في مناطق الدماغ والكلى ، مما يشير إلى دور HSF2 في التطور. ومع ذلك ، يُظهر تحليل تحول حركة الهلام أن HSF2 ليس في شكل ربط الحمض النووي في دماغ وكلى الأطفال حديثي الولادة ، مما يشير إلى أن HSF2 قد لا يكون متورطًا في التعبير التأسيسي لـ hsps في ذلك الوقت. لا توجد علاقة واضحة بين مستويات بروتين HSF2 والمستويات القاعدية لـ hsp90 و hsp70 و hsc70 و hsp60.


    دور HSP فيما يتعلق بالسمات التجارية

    حتى الآن ، تم التركيز بشكل كبير على HSP70 و HSP90 كمرافقات جزيئية تساعد الكائنات الحية على التعامل مع ضغوط الطبيعة الداخلية والخارجية. لم تكشف المناهج الحديثة فقط عن أهمية HSP90 في النمو الطبيعي وتطور حقيقيات النوى والطفيليات (المتصورة المنجلية) النمو في كريات الدم الحمراء البشرية (Banumathy وآخرون 2003) ، ولكن أيضًا أوضحت العلاقة بين HSPs وسمات تاريخ الحياة مع التركيز على الأهمية البيئية والتطورية (Sorensen et al. 2003 Sorensen and Loeschcke 2007). بالتزامن مع ذلك ، تمت دراسة العلاقة بين الصدمة الحرارية وتعبير HSPs والسمات التجارية بتفصيل كبير في حالة ب. موري (فاسودا وآخرون ، ٢٠٠٦). Notably, an increased cocoon weight of 17.52 vs. 13.48%, and increase in shell weight of 19.44 vs. 13.45% in NB4D2 over its control was observed following heat shock at 35 and 40 o C, respectively. Concurrently, CSR2 also exhibited a 13.11 vs. 6.44% increase in cocoon weight and 16.26 vs. 5.03% increase in shell weight at 35 and 40 o C heat shock over their respective controls. The increased cocoon and shell weight observed in heat shock induced bivoltine silkworm strains compared to controls would be due to expression of HSPs at larval stage. While Joy and Gopinathan (1995) did not observe any heat shock effects on commercial traits, Lohmann and Riddiford (1992) reported that of the nine animals heat shocked at 44° C for 1 h, only 5 resumed feeding, while 3 spun cocoons. Commercial traits of these animals were not evaluated and compared with that of controls. Consequently, as a novel strategy, heat shocked larvae (whole organisms) were allowed to grow under natural environmental conditions and they spun better quality cocoons than the non heat shocked larvae reared in natural environmental conditions ( Vasudha et al. 2006). These investigations highlighted the fact that knowledge obtained from model organisms under normal laboratory conditions does not always reflect what happens out in the field, where conditions are continuously changing and unpredictably hostile. Interestingly, the increased cocoon weight and shell weight over control, reflects the positive correlation between heat shock responses and silk protein content in the cocoon. Abramova et al. (1991) reported suppression of fibroin synthesis in the silk gland following heat shock, but recently Zhang et al. (2006) identified HSP90, HSP70, and HSP60 in the silk glands of B. mori, offering the opportunity for further systematic investigation in different breeds of silkworm. None of the larvae recovered from heat shock at 45° C ( Vasudha et al. 2006) and 46° C ( Lohmann and Riddiford 1992), were able to spin cocoons. However, the observed differences between cocoon weight, shell weight, and shell ratio among various silkworm strains will require further investigations to determine species-specific responses to heat shock. Altogether, these observations clearly indicate that mild heat shock between 35 and 40° C for 2 h facilitates bivoltine silkworm larvae to respond and overcome the fluctuating natural environmental conditions in succeeding instars. The practical application of this phenomenon will need to be explored positively and systematically (using multivoltine and bivoltine silkworm strains) in laboratory and field conditions in order to achieve stabilized sericulture farming in tropical countries like India.


    نتائج

    Identification of conserved Hsp and cis-regulatory HSEs

    We recovered conserved Hsps from all of the major gene families (Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp40, small Hsps Table 1). Three paralogues within the Hsp90 gene family (trap1, gp93، و hsp83) were found across all surveyed insects. We recovered five of the six ذبابة الفاكهة سوداء البطن Hsp70 homologues (CG2918, hsc70-3 (BIP), hsc70-4, hsc70-5، و hsp70CB Table 1) for Hymenoptera. فيما عدا ناسونيا فيتريبينيس, the Hymenopteran taxa all lacked the heat-inducible orthologue hsp70 (الجدول 1). For all species, we recovered two paralogues of Hsp60 (Table 1). Hsp40 gene families are one of the most diverse Hsps, but we narrowed our search to DnaJ-1, which is the known heat-inducible paralogue of D. melanogaster (الجدول 1). We did not recover a DnaJ-1 paralogue from any of the insects surveyed and found the best BLAST match to be D. melanogaster CG5001 (الجدول 1). Forward BLAST searching for D. melanogaster sHsps (hsp22, hsp23, hsp26, hsp27) yielded no reciprocal BLAST hits instead, the closest match was lethal 2 essential for life (l(2)efl), for which there were 3–9 copies in the Hymenoptera, and 1–17 copies in other members of the outgroup (Table 1).

    Of the Hsp homologues, eight were quantifiable by qPCR and were subsequently searched for cis-regulatory HSEs (Table 1, indicated with asterisks). Local alignment of the promoter regions of hsp83, hsc70-4 (h1 and h2), and hsp40 across species indicated conserved location, conformation, and arrangement of cis-regulatory HSEs (Figs. 1, 2 and 3), whereas hsc70-3 (BIP), hsc70-5, hsp60, و l(2)efl had less conserved HSEs (Additional file 1: Figures S1, Additional file 2: Figures S2, Additional file 3: Figures S3 data not shown for l(2)efl). For Hsps with conserved HSEs, 193 HSE motifs were annotated, including 114 head types (‘nGAAn’) and 79 tail types (‘nTTCn’ Figs. 1, 2 and 3). Across all sampled insects, we found no consistent preference for head or tail motifs in hsp83 (exact binomial test, ص = 0.055), significant preference for the head motif in hsc70-4 (ص < 0.001), and significant preference for the tail motif in hsp40 (ص & lt 0.05).

    Evolutionary gains and losses in hsp83 within Hymenoptera, followed by diversification in cis-regulatory HSEs. Relationships of homologous hsp83 were reconstructed with PhyML for 17 insect species (rooted with A. pisum) using a JTT substitution model with 1000 bootstrap replicates (>90 bootstrap support indicated left). Branches of the outgroup taxa are colored in blue and black, while well-supported paralogues of Hymenopteran branches are colored in orange (h1) and red (h2). Statistically significant episodic diversifying selection using Branch-Rel is indicated along the branch (+ corresponds to ص < 0.05 * = ص < 0.01 ** = ص & lt 0.001). Cis-regulatory HSEs in the promoter region spanning 400 bps from the transcription start site (TSS right) are mapped onto the phylogeny and are annotated by their length and motif type

    Evolutionary conservation of two copies of hsc70-4 within Hymenoptera, but both copies harbor an extraordinary amount of diversity in cis-regulatory HSEs. Relationships of homologous hsc70-4 were reconstructed with PhyML for 17 insect species (rooted on A. pisum) using a JTT substitution model with 1000 bootstrap replicates (>90 bootstrap support indicated left). Branches of the outgroup taxa are colored in blue, while well-supported paralogues of Hymenopteran branches are colored in orange (h1) and red (h2). Statistically significant episodes of positive selection identified with Branch-Rel are indicated along the branch(+ corresponds to ص < 0.05 * = ص < 0.01 ** = ص & lt 0.001). Cis-regulatory HSE elements in the promoter region spanning 570 bps from the transcription start site (TSS right side) are mapped onto the phylogeny and are annotated by their length and motif type

    Evolutionary conservation of hsp40 copy number and cis-regulatory HSEs. Relationships of homologous hsp40 were reconstructed with PhyML for 17 insect species (rooted on A. pisum) using a JTT substitution model with 1000 bootstrap replicates (>90 support indicated). The outgroup and Hymenopteran branches are indicated in blue and red, respectively. Statistically significant episodes of positive selection using Branch-Rel are indicated along the branch (+ corresponds to ص < 0.05 * = ص < 0.01 ** = ص & lt 0.001). Cis-regulatory HSE elements in the promoter region spanning 370 bps from the transcription start site (TSS right side) are mapped onto the phylogeny and are annotated by their length and motif type. S. invicta did not provide enough sequence information for the identification of cis-regulatory HSEs

    Heat shock protein (Hsp) and cis-regulatory heat shock element (HSE) evolution

    Hsp83

    Phylogenetic reconstruction of hsp83 revealed multiple duplications and losses in both the outgroup and Hymenoptera (Fig. 1). An early duplication event in a common ancestor of the Hymenoptera generated two paralogues of hsp83 (h1 and h2 in Fig. 1). Although both paralogues are present in bees and wasps, only one paralogue (h2) exists in ants, indicating a secondary loss. A second duplication of the h2 orthologue occurred in Linepithema humile. Selection analysis along the length of the gene sequence indicated that most sites (608/714 and 625/714, Single likelihood ancestor counting (SLAC) and Relative effects likelihood (REL) analyses, respectively, Table 2) identified purifying selection there was no evidence for episodic diversifying selection in branches leading to Hymenopteran paralogues (Branch-REL, ص > 0.5 Fig. 1).

    In spite of overall sequence conservation, Hymenopteran hsp83 h2 differs in genomic structure and cis-regulation from Hymenopteran hsp83 h1 and from outgroup species in three ways. First, Hymenopteran hsp83 h1 and most outgroup species completely lack introns, whereas hsp83 h2 has two introns Apis mellifera hsp83 h1 is the exception, with one intron in hsp83 h1 (Additional file 4: Figure S4). Second, Hymenopteran hsp83 h2 has a split HSE arrangement (4–6 and 3 HSE motifs), whereas both hsp83 Hymenopteran h1 and the outgroup have a contiguous HSE arrangement (6–9 HSE motif length) at the proximal end of the molecule (30–100 bps upstream TSS Fig. 1). Third, there is a preference in head-type motifs only in Hymenopteran hsp83 h2 (Fisher’s Exact Test, ص <0.001 Fig. 1).

    Hsc70-4

    Phylogenetic reconstruction of hsc70-4 indicates multiple duplication events both within species (C. quinquefasciatus و A. pisum) and in a common ancestor of the Hymenoptera, leading to two paralogues (h1 and h2 Fig. 2). Each paralogue forms a strongly supported clade, with the exception of the two بومبوس species, in which the h1 paralogue is nested within the h1 clade but the second copy does not group with either Hymenopteran paralogue (Fig. 2). There is evidence of episodic diversifying selection along the branch preceding the hsc70-4 duplication in the Hymenoptera and also in the Hymenopteran hsc70-4 h2 lineage (Branch-REL, ص <0.001 in both cases Fig. 2), even though most individual sites (608/710 and 610/710, SLAC and REL analyses, respectively) were under purifying selection (Table 2).

    Hymenopteran hsc70-4 differs in genomic structure and cis-regulatory HSEs from that of D. melanogaster. The orthologue of hsc70-4 في D. melanogaster lacks introns and cis-regulatory HSEs (Additional file 5: Figure S5 Fig. 2). In contrast, Hymenopteran hsc70-4 h1 has one intron, with the exception of N. vitripennis, which has two introns. Hymenopteran hsc70-4 h2 also has two introns, with the exception of بومبوس (Additional file 5: Figure S5). مقارنة مع hsc70-4 in members of the outgroup (Fig. 2, حق), both Hymenopteran hsc70-4 paralogues showed high diversification in cis-regulatory HSEs, particularly at the more distal positions ( >120 bps upstream TSS). At the proximal position (30–115 bps upstream TSS), however, HSEs of Hymenopteran hsc70-4 aligned locally with the inducible D. melanogaster hsp70 gene (data not shown).

    Hsp40

    Both sequence and copy number of hsp40 were phylogenetically conserved across all insect species (Fig. 3). Most sites were under purifying selection (Table 2), and there was no evidence of episodic diversifying selection along branches leading to the Hymenoptera (Fig. 3). Cis-regulatory HSEs of hsp40 were concentrated in one conserved proximal block of 3–7 HSE subunits that were located 35–100 bps upstream of the TSS, although in D. melanogaster HSEs were located 255–285 bps upstream (Fig. 3). However, the genetic structure appears less conserved, ranging from zero to three introns (Additional file 6: Figure S6).

    Inducible Hsp expression

    We tested whether the presence or absence of conserved cis-regulatory HSEs successfully predicted Hsp gene induction in response to experimental heat shock. The four Hsp genes with conserved HSEs were all significantly up-regulated in response to increasing temperature treatments (hsp83 (F5,12 = 8.48 ص < 0.01), hsc70-4 h1 (F5,12 = 3.74 ص < 0.05), hsc70-4 h2 (F5,12 = 10.6 ص < 0.001), and hsp40 (F5,12 = 6.97, ص < 0.01) Fig. 4a–d). The other four Hsps, which lacked conserved HSEs, were not significantly up-regulated after heat shock (hsc70-5 (F5,12 = 2.17 ص = 0.13), hsc70-3 (F5,12 = 1.91 ص = 0.17), hsp60 (F5,12 = 2.86 ص = 0.063), and l(2)efl (F5,12 = 0.223 ص = 0.946) Fig. 5a–d).

    Relative fold increase in gene expression (+/− SD) for four inducible HSPs in A. picea و P. barbatus across different temperature treatment. التعبير النسبي عن hsp83 (أ), hsc70-4 h1 (ب), hsc70-4 h2 (ج)، و hsp40 (د) were normalized to the 18 s rRNA and β-actin, 18 s rRNA and GAPDH في A. picea (ن = 4 per treatment) and P. barbatus (ن = 3 per treatment), respectively. Significant up-regulation from 25 °C (A. picea) and 30 °C (P. barbatus) is denoted by ‘*’ from آخر مخصص Tukey tests (ص & lt 0.05)

    Relative fold change in gene expression (+/− SD) for four non-inducible Hsps in A. picea و P. barbatus across different temperature treatment. التعبير النسبي عن hsc70-5 (أ), hsc70-3 (ب), hsp60 (ج)، و l(2)efl (د) were normalized to the 18 s rRNA and β-actin and 18 s rRNA and GAPDH for A. picea (ن = 4 per treatment) and P. barbatus (ن = 3 per treatment), respectively

    Species comparisons

    We then tested whether variation in thermal tolerances between two ant species was accompanied by changes in Hsp inducibility. The median lethal temperature 50 (LT50) of the warm-climate P. barbatus (median LT50 = 46.9 °C) was significantly higher than the LT50 of the cool-climate A. picea (median LT50 = 38.78 °C generalized linear model (GLM) with a binomial response variable: influence of species, ص < 0.001 Additional file 7: Figure S7). These survivorship differences were matched by patterns of Hsp gene expression: P. barbatus shifted its expression profile toward higher temperatures than did A. picea for all inducible Hsps (Fig. 4a–d). ل hsp83, hsc70-4 h1، و hsc70-4 h2, P. barbatus showed peak expression at 43 °C, whereas A. picea showed peak expression at 35–38.5 °C (Fig. 4a–c). ل hsp40, peak expression was 40 and 35 °C for P. barbatus و A. picea, respectively (Fig. 4d). P. barbatus exhibited significantly higher constitutive expression of hsc70-4 h1 (ANOVA, F1,5 = 87.8, ص < 0.01) and l(2)efl (F1,5 = 6.92, ص < 0.05), and significantly lower constitutive expression of hsc70-3 (F1,5 = 596, ص < 0.01), hsc70-5 (F1,5 = 24.3, ص < 0.001), and hsp60 (F1,5 = 31.2, ص < 0.01) than did A. picea (Fig. 6). Among the inducible Hsps, there was a positive relationship between relative basal expression levels and relative inducibility (linear regression, r 2 = 0.918, ص < 0.05 Fig. 7).

    Relative basal heat shock gene (target) expression (+/− SD) between P. barbatus(ن = 3) and A. picea (ن = 4). Relative gene expression was normalized with the geometric mean of 18 s rRNA and β-actin as the calibrator (* = ص < 0.05** = ص < 0.01 *** = ص < 0.001 levels of significance) and fold change was calculated as P. barbatus على صلة قربى ب A. picea was calculated as follows: 2 Target(Pbar-Apic) /2 Calibrator(Pbar-Apic) (Pbar = P. barbatus, Apic = A. picea). -1 was divided by values less than one to calculate negative relative basal expression. Significant up-regulation in P. barbatus و A. picea are colored in red and blue, respectively

    The positive relationship between the log ratios of basal expression levels (P. barbatus/A. picea) at rearing temperatures and max induction (β1 slope = 0.2398, r 2 = 0.918, ص & lt 0.05)


    مناقشة

    In the present study, we expanded the concept that HSP70 is a role player in vascular physiology, as we show, for the first time, that proper vascular (hbox ^<2+>) handling stimulated by PE requires this protein. Our findings are of utmost importance because (hbox ^<2+>) is the chief mediator of vascular contraction and fluctuations in its intracellular levels modulate the contractile phenotype of blood vessels 1 . Therefore, notwithstanding the limitations of our study, it fills in a knowledge gap in vascular biology and it will, in turn, guide future research in this field, particularly due to the emergent link between HSP70 and cardiovascular/renal diseases 25,26,27,28,29 .

    Throughout this study, we applied a well-established, yet indirect, protocol to investigate (hbox ^<2+>) changes in the presence of VER155008, which functions as an ATP-competitive inhibitor 30 . To overcome this limitation and strengthen our claims, a biochemical assay kit was also used to evaluate the free levels of this cation. In Fig. 1B, we specifically show that inhibition of HSP70 decreases the total levels of free (hbox ^<2+>) , which ultimately, reduces the force of contraction. Here, it is important to recognize some pitfalls of this method. In recent years, researchers have evaluated (hbox ^<2+>) fluctuations with a fluorescent indicator, such as fura-2, and since the concentration of (hbox ^<2+>) rapidly change in vascular structures, it is considered a more accurate measurement for this cation. Additionally, in order to perform the biochemical assay, samples need to be homogenized and it might include mitochondrial (hbox ^<2+>) , which does not affect vascular smooth muscle contraction. Still, we argue that the claim that blockade of HSP70 impairs vascular contraction by affecting (hbox ^<2+>) handling mechanisms are based on our collective findings, which include not only the indirect measurement of the free levels of (hbox ^<2+>) , but also an extensive and well-detailed set of functional studies as well as evidence from previous studies. The literature shows a complex interaction between HSP70 and (hbox ^<2+>) . In fact, the ATPase domain of HSP70 binds two (hbox ^<2+>) ions 9 and changes in the intracellular concentration of this cation modulates the expression of HSP70 10,11 . Additionally, the genetic deletion of this protein impairs (hbox ^<2+>) homeostasis in cardiac and skeletal muscle 7,8 . Thus, our data elegantly builds upon previous knowledge as it uncovers a new biological process where HSP70 interacts with (hbox ^<2+>) .

    It is known that phasic contraction in response to PE in the aorta involves IP3r-mediated (hbox ^<2+>) release from the SR 12,15 . We previously demonstrated that, in vessels stimulated with this (alpha -1) agonist when HSP70 is blocked, there is a reduction in the amplitude of the fast component 4 . However, it was yet-to-be-determined if a direct relationship exists with the IP3r. Here, we confirmed that blockade of HSP70 also weakens PE-induced phasic contraction in aorta under 0[ (hbox ^<2+>) ] Krebs’ solution (Fig. 2A). Similar results were also detected in samples incubated with 2-APB, an inhibitor of the IP3r (Fig. 2D). Interestingly, we found that the combination of VER155008 and 2-APB does not augment the latter’s inhibitory effect (Fig. 2E vs. D). Such findings indicate both inhibitors acting upon similar mechanisms. Corroborating this statement, we also detected that, if we block HSP70 after PE-mediated IP3r-induced phasic (hbox _>) , the impact of VER155008 is abolished (Fig. 2A,C), which strongly suggests that HSP70 contributes to PE-induced phasic contraction via IP3r-mediated (hbox ^<2+>) release. In a counterintuitive manner, it has been previously demonstrated that upregulation of HSP70 reduces IP3r protein levels following ischemia/reoxygenation in PC12 cells 31 . Here, it is important to consider that (hbox ^<2+>) overload can occur during ischemia/reoxygenation 32 , and as discussed by the authors, the ultimate outcome observed was that HSP70 contributes to maintaining (hbox ^<2+>) homeostasis in these cells 31 . In this sense, our results align with the previous literature as we also show that the precise control of (hbox ^<2+>) handling requires HSP70.

    Next, we turned our attention to try at understanding the mechanism(s) by which HSP70 affects vascular tonic contraction. A previous study demonstrated that PE-induced tonic contraction includes (hbox ^<2+>) influx via voltage-dependent and independent channels 12 . While there is limited information about an interaction between HSP70 and LTCC, it has been suggested that HSP70 might act by inhibiting voltage-gated (hbox ^<2+>) channel to prevent (hbox ^<2+>) overload, and consequently, apoptosis 33 . However, as highlighted by the authors experimental evidence was lacking. Here, we found that the HSP70 inhibitor potentiates the inhibitory effect of an LTCC blocker (Fig. 4B vs. A), but not of a non-selective inhibitor of voltage-independent (hbox ^<2+>) channels (Fig. 5B vs. A). Therefore, our data corroborate the idea that HSP70 contributes to tonic contraction by acting upon voltage-independent (hbox ^<2+>) channel-facilitated (hbox ^<2+>) influx. In support of this statement, we also confirmed that VER155008 reduces tonic contraction independently of the moment it is added to the chamber (i.e., whether it was before or after IP3r-mediated phasic contraction) (Fig. 2). Noteworthy, we used 2-APB to target voltage-independent (hbox ^<2+>) channels, which has an inhibitory effect towards NSCC and CRAC channels 12,34 . Consequently, we are unable to pinpoint the exact channel targeted by the HSP70 inhibitor. Another possibility one should consider in this context is the fact that a previous study has demonstrated that the constitutive HSP70 interacts with lipid membranes leading to the generation of a functional ATP-dependent cationic pathway 35 . Therefore, further studies are required to uncover the precise mechanism by which HSP70 targets (hbox ^<2+>) influx in PE-stimulated aorta.

    Subsequently, we focused on determining the contribution of Rho-kinase, which promotes (hbox ^<2+>) sensitization, and therefore, affects the contractile phenotype of vascular structures 19,20 . From our data, it is clear that the combination of VER155008 with Y27632 amplifies the hyporesponsive pattern observed in the aorta in comparison with blocking these proteins independently (Fig. 6). Given our findings regarding the role of HSP70 in (hbox ^<2+>) influx, one can argue that these results were to be expected, especially because Rho-kinase impacts vascular contraction by inhibiting the myosin light chain phosphatase, which, in turn, prevents relaxation 36,37 . Therefore, it appears that two different mechanisms were targeted in this set of experiments. Corroborating this statement, a previous study found that heat shock-mediated vascular hypercontractility does not directly involve Rho-kinase 38 .

    Finally, we investigated a potential interaction between HSP70 and the SERCA pump, which mediates (hbox ^<2+>) re-uptake by the SR 22 . In this study, we used the SERCA pump inhibitor, cyclopiazonic acid (CPA), which does not affect phasic contraction 15 . In fact, it has been demonstrated that it increases the intracellular concentration of (hbox ^<2+>) without changing the force of contraction 12 . Interestingly, in the presence of CPA, there is a shift in the contractile phenotype of vascular smooth muscle to rely mainly on (hbox ^<2+>) influx via voltage-independent (hbox ^<2+>) channels 12 . Here, as showed by others, we confirmed that CPA does not impact PE-induced phasic contraction (Fig. 7). More interestingly, we found that, under the conditions examined in this study, it disrupts the ability of the vessel to elicit tonic contraction following re-addition of (hbox ^<2+>) (Fig. 7). It is important to consider the importance of (hbox ^<2+>) re-uptake by the SR, as the influx of this ion is gated by its depletion from the SR 16 . When we combined the HSP70 inhibitor with CPA, we observed a complete impairment of the vessels’ ability to elicit contraction, which could be due to (a) the effects of CPA upon (hbox ^<2+>) re-uptake and/or (b) the effects of VER155008 on voltage-independent (hbox ^<2+>) channels, which was, under this condition, the main source of (hbox ^<2+>) influx. While, to the best of our knowledge, data regarding an interplay between HSP70 and the SERCA pump in vascular structures are nonexistent, the literature shows that this chaperone has a protective role towards this protein 33 . For example, in cardiomyocytes, the deletion of HSP70 associates with a decrease in the expression of SERCA2a 7 whereas, in PC12 cells, overexpression of HSP70 increases the levels of SERCA2a and SERCA2b 31 . Importantly, it has been demonstrated that, in HEK-293 cells, HSP70 prevents thermal inactivation of SERCA2a, potentially by decreasing its oxidation and nitrosylation 39 . Likewise, HSP70 prevents the thermal inactivation of SERCA1a in fast-twitch skeletal muscle 40 . Nevertheless, these studies differ in many aspects from our work, especially the fact that we aimed at investigating this interaction in the absence of a pathological condition.

    In summary, we showed that blockade of HSP70 affects (hbox ^<2+>) handling mechanisms in aorta stimulated with PE via crosstalk with (a) IP3r-mediated (hbox ^<2+>) release from the SR (phasic) and (b) voltage-independent (hbox ^<2+>) channels-facilitated (hbox ^<2+>) influx (tonic) (Fig. 8). There are, however, many points to enlighten, including the molecular aspects guiding this process. Here, we took an indirect approach to evaluate the role of HSP70 in vascular contraction, and therefore, further studies employing in situ enhancement of HSP70 in vascular smooth muscle are still required, since they could shed much light on the exact mechanisms involved in HSP70-mediated arterial contraction. A striking question arising at this point is whether the interaction between HSP70 and (hbox ^<2+>) remains in vascular diseases, such as diabetes and hypertension. Nevertheless, such a development in our understanding shifts the way one might approach disease-associated vascular complications, especially because we provided evidence that, under the conditions evaluated in this study, HSP70 contributes to vascular (hbox ^<2+>) dynamics, and (hbox ^<2+>) is a key player in healthy and diseased states.


    شاهد الفيديو: البروتين G يفعل قناة أيونية (قد 2022).


تعليقات:

  1. Devlyn

    بيننا ، لم أكن لأفعل.

  2. Telemachus

    أنا أشارك رأيك بالكامل. يوجد شيء في هذا وأعتقد أن هذه فكرة رائعة. اتفق معك تماما.

  3. Akilar

    هناك شيء في هذا. شكرا لمساعدتكم في هذه المشكلة. لم أكن أعلم أنه.

  4. Bickford

    إنها معلومات قيمة للغاية



اكتب رسالة