معلومة

PTMs من البروتينات عبر المواصفات الجماعية؟

PTMs من البروتينات عبر المواصفات الجماعية؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أفهم أن مواصفات الكتلة تُستخدم على نطاق واسع لدراسة PTM مثل الارتباط بالجليكوزيل للبروتينات ، ولكن كيف يمكن لمواصفات الكتلة تحديد بنية PTM الصحيحة للارتباط بالجليكوزيل مثلاً إذا كان لبنيان من الجليكان نفس الكتلة ولكن ترتيبًا مختلفًا (أي متساوي الضغط)؟ أيضًا ، كيف يمكن لمواصفات الكتلة تحديد الفرق بين الأيزومرات الهيكلية؟


أنا لست خبيرًا في MassSpec ولكن هذا ما أفهمه من أساسيات التحليل الطيفي:

في مرض التصلب العصبي المتعدد (MS-MS) ، يخضع التحليل المتأين عمومًا أو يخضع لعملية التجزئة (الانقسام إلى أيونات أصغر). يسمح لك التجزئة بدراسة التفاصيل الدقيقة. كما أنه ضروري لتسلسل الببتيد de-novo. تنتج تقنيات التجزئة المختلفة ، مثل التفكك الناجم عن التصادم (CID) أو التجزئة الضوئية ، أنواعًا مختلفة من الأيونات الثانوية.

يمكنك أن تفهم حدسيًا أن تجزئة الأيزومرات الهيكلية ستنتج أنواعًا مختلفة من الأيونات الثانوية (باستخدام نفس تقنية التجزئة). يعتمد اختيار تقنية التجزئة على الطبيعة الجزيئية للتحليل. في المقالة التي ذكرتها سابقًا ، يستخدمون تقنية الليزر المستحثة في التفتيت الضوئي لفصل أيونات الجليكان.

حتى الجزيئات الصغيرة ، التي تمت دراستها بشكل كلاسيكي بواسطة MassSpec ، تخضع للأزمرة بعد التأين من أجل تثبيت الأيون. يمكن أن تحدث أيضًا ردود فعل مثل عكس Diels-Adler. قد يختلف نمط التفاعلات بين الايزومرات الهيكلية. للحصول على الأساسيات ، يمكنك الرجوع إلى كتاب عن تقنيات التحليل الطيفي من تأليف سيلفرشتاين


تحليل شامل لتعديلات Lysine Succinylome والبروتين في تطوير بذور الأرز

تم التعرف على succinylation ليسين كتعديل لاحق متعدية (PTM) في السنوات الأخيرة. من المعقول أن يكون للسكسينات تأثير وظيفي أوسع من الأسيتيل بسبب التغييرات الهيكلية الأكبر والاختلافات الأكثر أهمية في الشحنة على بقايا اللايسين المعدلة. في الوقت الحالي ، لا تزال كمية وهوية البروتينات المصابة بالسكسينيلات والوظائف المقابلة لها في نباتات الحبوب غير معروفة إلى حد كبير. في هذه الدراسة ، قدرنا أن نسبة إشغال السكسينات على اللايسين كانت بين 2٪ إلى 10٪ في تطوير بذور الأرز. تم تحديد ثمانمائة وأربعة وخمسين موقعًا من مواقع succinylation ليسين على 347 بروتينًا من خلال تحقيق شامل في تطوير بذور الأرز. تم الكشف عن ستة أشكال كتسلسل مفضل لتسلسل الأحماض الأمينية لمواقع السكسينات ، وتم تحديد تفضيل عزر جدير بالملاحظة في البروتينات المرتبطة بالعمليات البيولوجية والوظائف الجزيئية والمسارات والمجالات المختلفة. بشكل ملحوظ ، تم الكشف عن السكسينات الثقيلة في بروتينات تخزين البذور الرئيسية ، بالتزامن مع الإنزيمات الحرجة المشاركة في التمثيل الغذائي للكربون المركزي ومسارات التخليق الحيوي النشا لتطوير بذور الأرز. وفي الوقت نفسه ، أظهرت نتائجنا أن نمط التعديل في المختبر كانت بروتينات السكسينيلات غير الأنزيمية مختلفة عن تلك الموجودة في البروتينات المعزولة من الخلايا الموجودة في البقع الغربية ، مما يشير إلى أن السكسينات لا يتولد عن طريق التفاعل غير الأنزيمي في الخلايا ، على الأقل ليس تمامًا. باستخدام بيانات الأسيل التي تم الحصول عليها من نفس أنسجة الأرز ، قمنا بتعيين العديد من المواقع التي تحتوي على مادة السكسينات اللايسين ، والأستلة ، والمالونيل ، والتكوُّن ، و 2-هيدروكسيسوبوتيريل في بروتينات بذور الأرز. تبين أن عددًا مذهلاً من البروتينات ذات التعديلات المتعددة تشارك في الأحداث الأيضية الحرجة. بالنظر إلى أن شقوق التعديل هذه هي منتجات وسيطة لمسارات استقلاب خلوية متعددة ، فإن بقايا اللايسين المستهدفة قد تتوسط في الحديث المتبادل بين المسارات الأيضية المختلفة عن طريق التعديلات بواسطة شقوق مختلفة. تعرض دراستنا منصة لتحقيق مكثف للشبكات الجزيئية التي تدير تطوير بذور الحبوب والتمثيل الغذائي عبر PTMs.

الكلمات الدالة: أستيل ليسين succinylation مطياف الكتلة بيولوجيا النبات تعديلات ما بعد متعدية تعديل البروتين تخزين بذور الأرز المغذيات succinylome.


6.3 اعتبارات البحث في قاعدة البيانات

تحديد الببتيد من بروتين أو قاعدة بيانات جينومية مترجمة يعتمد على الاحتمالات. يتم ذلك عن طريق مقارنة طيف MS / MS المرصود مع الأطياف النظرية للببتيدات المحللة للبروتين المتوقعة (انظر الشكل 6.1) لجميع البروتينات في قاعدة البيانات. إذا تم النظر في أكثر من بضعة تعديلات في وقت واحد ، فإن وقت البحث يزداد بشكل كبير ، وتنخفض درجة الاحتمال إذا تم استخدام المزيد من التعديلات من أجل تحقيق & # x0201cmatch. & # x0201d

الشكل 6.1

رسم تخطيطي لطيف مرض التصلب العصبي المتعدد لبروتين مهضوم بتريبتيك.

عامل آخر مهم للبحث في قاعدة البيانات هو أن التعديل يجب أن يكون خاصًا ببعض الأحماض الأمينية فقط. تعديلات غير محددة ، على سبيل المثال ، التعديلات التي يمكن أن تتفاعل معها أي الأحماض الأمينية ، لا يمكن البحث عنها باستخدام بعض محركات البحث الشائعة في قواعد البيانات ، مثل Mascot & # x02122 (3).


تشمل تطبيقات قياس الطيف الكتلي للقسم ما يلي:

البروتينات العصبية: تقييم مجموعات البروتين و PTMs في الدماغ

يتمثل أحد أهداف علم البروتينات في تجاوز التحليل الاختزالي للأشكال الإسوية البروتينية التي تعمل بشكل فردي لدراسة كيفية تغير تكوين مجموعات البروتين استجابةً للمنبهات الطبيعية والضغوطات وحالات المرض والعلاجات الدوائية. وبالتالي ، فإن الهدف هو إجراء قياس شامل (عالمي) للكميات النسبية لمئات من البروتينات المختلفة التي تتفاعل لتوليد نتائج بيولوجية ، وتتجاوز أنشطة الناقلات العصبية الفردية وأنواع المستقبلات.

نقاط الاشتباك العصبي في الدماغ والجهاز العصبي المركزي (CNS) - الوصلات الديناميكية حيث تتبادل الخلايا العصبية الإشارات الكيميائية التي تشكل الأسس الجزيئية لظواهر مثل التعلم والذاكرة - هي موضوع التحليل الكمي والنوعي (PTM) البروتيني من قبل باحثي القسم و المتعاونين من علماء الأعصاب. على سبيل المثال:

تتبع التغييرات المنسقة في البروتين المشبكي أثناء تحفيز الجهاز العصبي المركزي

تم استخدام مرض التصلب العصبي المتعدد جنبًا إلى جنب مع وضع العلامات النظيرية للببتيدات لتحليل الاختلافات في الوفرة النسبية لما يقرب من 900 بروتين في كثافات ما بعد التشابك بالماوس (PSD) في فترات زمنية مميزة استجابة لتحفيز عقاقير الجهاز العصبي المركزي الواسع. الكثافة عبارة عن بنية غنية بالبروتين على الطرف المتلقي (طرف التغصنات) للاتصالات الكيميائية بين الخلايا العصبية عبر الشق المشبكي. تحتوي PSDs على تركيزات من المستقبلات التي تربط الناقلات العصبية بالإضافة إلى العديد من الإشارات المتشابكة والبروتينات المنظمة ، التي يتم تجميعها بواسطة مجموعة متنوعة من بروتينات السقالة.

من خلال تحليل التغيرات في الكميات النسبية لبروتينات ما بعد التشابك ، وجدت الدراسة دليلاً على التنشيط المشترك التنظيم لمجموعات معينة. وهكذا كانوا قادرين على تحديد المجمعات الوظيفية الأساسية التي تُظهر فيها البروتينات نشاطًا منسقًا حتى عندما لا يكون معروفًا أنها تتفاعل جسديًا.

قياس الفسفرة المشبكية وتعبير البروتين عن طريق منطقة الدماغ

تم تطبيق القياس الكمي العالمي لمرض التصلب العصبي المتعدد ووضع العلامات النظيرية لفحص الاختلافات في تعبير البروتين والفسفرة عند كثافات ما بعد التشابك العصبي حسب منطقة الدماغ. اقترح تحليل أكثر من 2100 بروتين و 1500 موقع فسفرة في نموذج فأر أدوارًا للبروتينات التي لم يتم توضيحها سابقًا والتي يتجمع تعبيرها الأكبر مع مجمعات وظيفية معروفة.

كشفت هذه الدراسة أيضًا عن مواقع فسفرة على NMDA أكثر نسبيًا من مستقبلات AMPA ، وكلاهما مشارك في اللدونة المشبكية - تغييرات في فعالية الإرسال المتشابك التي تكمن وراء التعلم والذاكرة والظواهر العصبية الأخرى. في الواقع ، وجدت الدراسة ارتفاع متوسط ​​مستويات الإنزيمات المرتبطة بالفسفرة العكسية (كينازات ، فوسفاتازات) في قرن آمون ، وهي منطقة مرتبطة بتكوين الذاكرة والتوجه المكاني من بين أولى المناطق التي تعاني من تلف في مرض الزهايمر.

رسم بياني للوفرة النسبية لبروتين معين ، chapsyn-110 (كيناز مرتبط بالغشاء) في كثافات ما بعد التشابك حسب منطقة الدماغ ، يُظهر انتشاره الأكبر في القشرة ، منتصف الدماغ ، المخيخ ، والحصين. (يتم تمثيل الببتيدات الفردية بالنقاط ، ومتوسطات البروتين بواسطة قضبان أفقية.) نُشر هذا البحث في الأصل في Molecular & amp Cellular Proteomics. ترينيداد وآخرون ، التحليل الكمي للفسفرة المشبكية وتعبير البروتين. التعبير الجزيئي والبروتيني. 2008 المجلد 7: 684-696

يُظهر الرسم البياني تعبيرًا نسبيًا أعلى عن الإنزيمات المرتبطة بالفسفرة العكسية في الحُصين. نُشر هذا البحث في الأصل في Molecular & amp Cellular Proteomics. ترينيداد وآخرون ، التحليل الكمي للفسفرة المشبكية وتعبير البروتين. التعبير الجزيئي والبروتيني. 2008 المجلد 7: 684-696

أول رسم خرائط على نطاق واسع لتعديلات الكربوهيدرات الصعبة في البروتينات المشبكية

طبق علماء القسم الفصل اللوني السائل وتفكك نقل الإلكترون MS لإجراء أول دراسة واسعة النطاق تميز المواقع المحددة وهياكل المعدلات لأكثر من 2500 ببتيدات جليكوببتيدات فريدة مرتبطة بـ N و O من 453 بروتينًا في مشابك الفئران - أكياس مرتبطة بالغشاء من حويصلات من محطات عصبية عصبية.

الارتباط بالجليكوزيل خارج الخلية هو مجموعة شائعة ومعقدة من PTMs ذات الصلة من الناحية الهيكلية والتي يتم فيها ربط واحد أو أكثر من الكربوهيدرات (الجليكانات) بغشاء أو بروتين مُفرَز. يشير التعيين N- أو O- إلى النيتروجين أو الأكسجين في السلاسل الجانبية للأحماض الأمينية (البقايا) حيث يتم توصيل الجليكان. تساعد وحدات PTM هذه في ثبات عملية طي البروتين من بين وظائف أخرى.

تمثل هذه التحليلات تحديًا لأن الروابط الجليكوسيدية تتكسر بسهولة في عمليات الانفصام التي يسببها التصادم أكثر من روابط الببتيد الخاصة بـ PTMs التساهمية الأخرى. أيضًا ، هناك برنامج محدود لأتمتة تحديد أطياف تعديل الجليكان.

استخدم الباحثون هنا شكلين من كروماتوغرافيا التقارب (لكتين ، تيو2) لفرز وإثراء تركيز الببتيدات السكرية لتحديدها. بعد ذلك ، بعد أن حددوا سابقًا الآلاف من بروتينات المشابك ، ركزوا على البروتينات عبر الغشاء المشروح / المفرزة واستخدموا Protein Prospector الخاص بالمورد للبحث في تلك البروتينات ، مما يسمح بإجراء تعديلات بقيم كتلة محددة تتوافق مع مكونات الجليكان المحتملة. وبالتالي حددوا تعديلات الكربوهيدرات الأكثر شيوعًا ومطابقة كتلهم لهياكل السكر (قليل السكاريد).

حددت تحليلات MS هذه أيضًا عدد الجليكانات الفريدة لكل موقع ارتباط بالجليكوزيل مرتبط بـ N ، بما في ذلك موقع واحد مع 19 تعديلًا للجليكان.

الريادة في تحديد مواقع وأدوار PTM الشائعة والمهمة للسكر: O-GlcNAcylation

O-GlcNAcylation هو تعديل شائع وحيوي وقابل للعكس بعد الترجمة يحدث في جميع الحيوانات والنباتات (metazoans) ، في كل من النوى الخلوية والعصارة الخلوية. يستلزم تعديل بقايا السيرين والثريونين للبروتينات النووية والخلوية باستخدام N-acetylglucosamine واحد مرتبط بالأكسجين (GlcNAc). متورط في تعديل:

  • تنظيم الجينات (بما في ذلك عن طريق تعديل عوامل النسخ)
  • الاستجابات للإجهاد الخلوي ومستويات المغذيات ، بما في ذلك آثار هذا الأخير على الساعات الخلوية اليومية
  • استهداف البروتينات للتدمير بواسطة البروتيازوم
  • مسارات الإشارات داخل الخلية التي ينظمها الفسفرة (أكثر PTM خضوعًا للدراسة وعادة ما يكون مفتاح التشغيل-الإيقاف للبروتينات) - عبر الحديث المتبادل على المخلفات المعدلة بشكل مشترك أو التنافس على مواقع التعديل
  • أمراض مثل مرض السكري ومرض الزهايمر (الإنزيمات التي تضيف / تزيل O-GlcNAc يتم التعبير عنها بشكل كبير في الدماغ)

بينما تم اكتشاف PTM هذا قبل ثلاثة عقود ، كان التحديد التفصيلي لوظائفه البيولوجية مقيدًا بصعوبة التحديد الدقيق لبقايا السيرين أو الثريونين على البروتين الذي تم تعديله. يؤدي استخدام التفكك الناجم عن التصادم إلى تجزئة البروتينات إلى ببتيدات للتحليل عادةً على كسر روابط السكر والأكسجين الجليكوسيدية الأضعف قبل العمود الفقري للببتيد للبروتين المعدل ، وبالتالي فقد بيانات موقع التعديل.

في الوقت الذي كان يُعرف فيه أقل من 80 من المخلفات الدقيقة من O-GlcNAcylation على جميع البروتينات ، غالبًا عن طريق التشريح الكيميائي (تدهور Edman) ، ابتكر العلماء هنا منهجية جديدة ، تجمع بين كروماتوجرافيا تقارب الليكتين (تراص جرثومة القمح) مع تفكك نقل الإلكترون (ETD) ) ترادفي مرض التصلب العصبي المتعدد. تم تطبيق هذا على بروتينات خلايا دماغ الفأر ، حيث لوحظت معدلات عالية من O-GlcNAcylation. على وجه التحديد ، قام الباحثون بتحليل كثافات ما بعد التشابك - هياكل غنية بالبروتين في الطرف المتلقي (طرف التغصنات) للاتصالات الكيميائية بين الخلايا العصبية عبر الشق المشبكي.

عند تطبيق الطريقة الجديدة مبدئيًا ، حدد باحثو القسم 58 موقعًا للتعديل من تجربة واحدة ، بما في ذلك 28 موقعًا على الباسون - وهو بروتين في المنطقة النشطة المشبكية - يطابق عدد مواقع الفسفرة المعروفة آنذاك على هذا البروتين ويقترحون أن O-GlcNAcylation قد أن تلعب دورًا مكافئًا في تنظيم وظيفتها. في الواقع ، وجدت الدراسة أيضًا دليلًا إضافيًا على أن تعديل السكر قد يتفاعل (الحديث المتبادل) مع الفسفرة في المشبك ، حيث تم الإبلاغ سابقًا عن العديد من المواقع المعدلة بـ O-GlcNAc على الباسون على أنها معدلة الفوسفات.

تعديلات ما بعد الترجمة على البروتين المتشابك باسون ، والذي يتكون من 3940 من الأحماض الأمينية من نهايته N إلى C. يشار إلى مواضع 28 تعديل O-GlcNAC (أعلى) بالنسبة لمواقع الفسفرة (أسفل). تم الإبلاغ عن مواقع O-GlcNAc أيضًا كمواقع الفسفرة موضحة باللون الأحمر. من وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم ، تحديد مواقع بروتين O-GlcNAcylation باستخدام مطياف الكتلة لتفكك نقل الإلكترون على الببتيدات الأصلية ، Chalkley et al. ، المجلد 106 رقم. 22 ، 2009 ، 8894–8899

الجمع بين التوصيف العالمي لاثنين من التعديلات الرئيسية

تقترح العوامل التي تتضمن:

  • كلاهما يعدل بشكل عكسي السلاسل الجانبية لبقايا السيرين والثريونين
  • كلاهما شائع (قد يتم فسفرة معظم البروتينات الخلوية ، في حين أن الآلاف من مواقع O-GlcNAcylation معروفة الآن)
  • يؤدي التعديل في المختبر لمستويات الفسفرة العالمية إلى تغيير مستويات O-GlcNAcylation للعديد من البروتينات والعكس صحيح.

لفحص التفاعل بين هذين النوعين الشائعين من PTM ، طور الباحثون هنا نهجًا يسمح بالاكتشاف المشترك وتحديد الموقع لـ O-GlcNAcylatoin والفسفرة ، في نفس العينة البيولوجية. هذا يطبق كروماتوغرافيا التقارب (تفاعل ضعيف بين O-GlcNAc ولكتين ما هي الجرثومة agglutinin وكذلك بين الفوسفات وثاني أكسيد التيتانيوم) لإثراء O-GlcNAc والببتيدات المعدلة بالفوسفات مع تفكك الإلكترون / MS. تتضمن أمثلة توصيف PTM المزدوج ما يلي:

تحديد عالمي ، موقع O-GlcNAcylation والفسفرة في نفس عينات بروتين المشبك

طبق علماء القسم والمتعاونون معهم هذا النهج لاكتشاف كل من التعديلات ومواقعها على البروتينات في نفس العينات البيولوجية من مشابك الفئران - أكياس حويصلات مرتبطة بالغشاء من جانب التوصيل (المحاور المحورية) للاتصالات الكيميائية بين الخلايا العصبية عبر الشق المشبكي

حددت الدراسة أكثر من 6000 بروتين مع أي من التعديلات أو كليهما وأسفرت عن تقديرات بنسبة 19 ٪ و 63 ٪ من بروتينات المشابك على أنها O-GlcNAcylated أو فسفرة ، على التوالي. ووجدت أيضًا أن البروتينات التي تم تعديلها على نطاق واسع بواسطة O-GlcNAc كانت دائمًا مُفسفرة إلى حد مشابه أو أكبر ، مما يشير إلى أن O-GlcNAc-transferase (OGT ، الذي يحفز PTM) ، يستهدف بعض البروتينات المُفسفرة. بالإضافة إلى ذلك ، كانت الكينازات (التي تُفسفر البروتينات) هي فئة البروتينات الأكثر تعديلاً على نطاق واسع بواسطة O-GlcNAc ، مما يشير إلى شكل من أشكال الحديث المتبادل الذي ينظم فيه O-GlcNAcylation نشاط الإنزيمات.

تتفاعل O-GlcNAcylatoin مع الفسفرة في تنظيم الساعة البيولوجية

قدم المورد تحليل MS للتفاعل بين هذه التعديلات في تنظيم الساعات البيولوجية الخلوية على مدار 24 ساعة ، والتي تنسق العمليات البيولوجية في الكائنات الحية من البكتيريا إلى البشر. يمكن أن تتأثر إيقاعات الساعة بمستويات المغذيات وكذلك بالضوء.

وجدت دراسات سابقة أن O-GlcNAcylation لعوامل النسخ والبروتينات المرتبطة بالساعة البيولوجية تعمل كمستشعر للمغذيات وتؤثر على الساعات (تغيير طول الفترة في الفئران وذباب الفاكهة). أظهر تحليل MS للبروتينات المأخوذة من أدمغة الفئران والكبد من قبل علماء القسم أن OGT ، الإنزيم الذي يحفز O-GlcNAcylation ، يتم فسفرته وبالتالي يتم تنظيمه بواسطة كيناز (glycogen synthase Kinase 3β) ولكن يمكن أيضًا تعديل O-GlcNAc في نفس المواقع مثل أن الإنزيمين يتنافسان ويضبطان تأثيرات بعضهما البعض.

أ] طيف MS / MS لمنطقة مضاعفة معدلة O-GlcNAc من بروتين الدماغ PER2 ، والذي ينظم سرعة الساعة البيولوجية - أو وقت بداية النوم. B] MS / MS حددت مواقع تعديل O-GlcNAc لمجال ربط كيناز (CK1) (الأحماض الأمينية 557 إلى 771). السيرينات التي تم تحديدها (الأرقام 662 و 668 و 671) هي أيضًا مواقع الفسفرة CK1 التي تقترح تعديلات متنافسة. من عند استقلاب الخلية مستشعر الجلوكوز ا-GlcNAcylation ينسق مع الفسفرة لتنظيم الساعة اليومية ، Kaasik et. آل ، فبراير 2013 ، ص 291-302.

استخدمت نفس الدراسة تحليل MS الترادفي لتجد أن O-GlcNAcylation و phosphorylation تعديلين متنافسين أيضًا في منطقة معينة من بروتين الدماغ (PER2) الحاسمة لتنظيم "سرعة" الساعة - طفرة تقلل الفسفرة في المنطقة تؤدي إلى متلازمة بداية النوم في وقت مبكر من المساء.

فك رموز الوراثة اللاجينية: اكتشاف وتوصيف التعديلات على الهيستونات وبروتينات الكروماتين (DNA)

يوجد ما يقرب من 20000 جين مشفر للبروتين في كل خلية في أجسامنا. ومع ذلك ، يختلف التعبير الجيني ليس فقط حسب نوع الخلية ومرحلة النمو ، ولكن أيضًا أثناء الاستجابة الصحية للمثيرات والضغوط وعبر الاختلال الوظيفي والمرض ، وتحويل التركيب الجيني (النمط الجيني) إلى سمات يمكن ملاحظتها (النمط الظاهري).

تتمثل إحدى الطرق التي يتم بها تعديل التعبير الجيني بانتظام عن طريق ربط المجموعات الكيميائية والكربوهيدرات بالمركب المركب للحمض النووي والبروتينات المرتبطة به (الكروماتين) في نواة الخلية ، مما يؤدي إلى إعادة تشكيل مادي يغير إمكانية الوصول إلى الجين.

إن تحديد كيف وأين تحدث مثل هذه التعديلات هو مثال على علم التخلق - دراسة مثل هذه التغييرات غير المرتبطة بالتسلسل في التعبير الجيني التي يمكن أن ترثها الأجيال اللاحقة. يتم إجراء مجموعة فرعية رئيسية من التعديلات اللاجينية على الهيستونات - العديد من الأشكال الإسوية للبروتين التي تحزم وتثبت الحمض النووي بطريقة تشبه التخزين المؤقت (الوحدة الأساسية المتكررة تسمى الجسيم النووي هي جزء من الحمض النووي ملفوف حول ثمانية نوى هيستون). عند تعديل الهيستونات بواسطة مجموعات كيميائية متعددة (على سبيل المثال ، الأسيتيل ، الميثيل ، يوبيكويتين ، الفوسفات) ، عادةً على أطرافها N غير المهيكلة (التي يطلق عليها اسم "ذيول") ، فإنها تعيد تشكيل جزء من الكروماتين ، وتنظم التقاربات المرتبطة ببروتينات النسخ وفي النهاية تغيير التعبير الجيني.

طيف MS / MS لببتيد هيستون (H4) (GKGGKGLGKGGAKR) من الذرة (المعروف أيضًا باسم الذرة) يُظهر تعديلاته اللاحقة للترجمة بواسطة مجموعات الأسيتيل (ac) (أستلة). يشير M / Z إلى نسب الكتلة إلى الشحن.

لقد كان علماء القسم والمتعاونون معهم رائدين في تطبيق مطياف الكتلة لتعديلات الهيستون وكذلك التغيرات اللاجينية مثل مثيلة الحمض النووي. يمكن لمثل هذا البحث أن يساعد في فك رموز هيستون الافتراضية والشفرات اللاجينية - التي تقترح أن مجموعات معقدة من التعديلات المتعددة وتفاعلاتها (الكلام المتبادل) مرتبطة بالتغيرات في التعبير الجيني في الاستجابات المعدلة للمنبهات الذاتية والبيئية ، وعند تعطلها ، مع اختلال وظيفي. التعبير في المرض.

تمثل تعديلات هيستون نموذجًا صعبًا لتطبيق مطياف الكتلة لتحليل البروتينات السليمة ، نظرًا لتنوعها المعقد من التعديلات. تم العثور على أكثر من 60 وحدة بنائية على هيستونات النواة الأربعة لتكون عرضة لتعديل واحد أو أكثر. تسمح تقنيات نقل / تفكك الإلكترون من أعلى إلى أسفل بتحليل الببتيدات الأكبر ، ولكن يجب الكشف بدقة عن التعديلات على المواقع المختلفة وبكميات مختلفة (على سبيل المثال ، ثلاثي الميثيل) على الرغم من التباين في التردد والوفرة حسب أوامر الحجم.

تتضمن أمثلة أبحاث القسم وتطبيقات منهجيات MS في التعديلات اللاجينية ما يلي:

قياس تأثيرات التعرض للزرنيخ المسرطنة على تعديلات الهيستون

طبق العلماء هنا التحليل الكمي لمرض التصلب العصبي المتعدد لتعديلات هيستون المقارنة على نموذج ثقافة الخلية لتطوير سرطان المثانة بسبب التعرض للزرنيخ. بينما من المعروف أن التعرض للزرنيخ ، خاصة من خلال المياه الجوفية الملوثة ، مرتبط بعدة أنواع من السرطانات لدى البشر ، إلا أن الآليات الكامنة كانت بعيدة المنال. من خلال العمل مع المتعاونين ، قام العلماء هنا بتحليل تعديلات الهيستون في خلايا الظهارة البولية البشرية (التي تبطن المسالك البولية) المعرضة لجرعات من الزرنيخ بمرور الوقت. اكتشفت الدراسة انخفاضًا في مستويات الأسيتيل في الأشكال الإسوية هيستون H3 و H4 في بقايا ليسين محددة. لاحظ مؤلفو الدراسة أن مثل هذه الاضطرابات اللاجينية يمكن أن تسكت الجينات الرئيسية التي تتحكم في النمو ، مما يؤدي إلى تطور الورم.

تقييم نزع الميثيل التنظيمي للجينات في مواقع النيوكليوسوم الرئيسية

باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة الترادفية MS لمراقبة إزالة مجموعات الميثيل (نزع الميثيل) من ركيزة هيستون بمرور الوقت ، تمكن الباحثون هنا من تطوير طريقة قابلة للتطبيق على نطاق واسع لتقييم إزالة الميثيل لمواقع معينة من النوكليوسومات. من خلال إعادة تشكيل العملية في المختبر ، نظرت الدراسة على وجه التحديد في معدلات التفاعل (الحركية) للمجال التحفيزي هيستون ديميثيلاز JMJD2A والذي ، من بين ركائز الهيستون المختلفة ، يزيل مجموعة الميثيل الثالثة من بقايا ليسين هيستون ثلاثي الميثيل (H3 K9). يمنع هذا التعديل النسخ عن طريق تغيير بنية الكروماتين لتعطيل الجينات. في حين شوهدت عملية إزالة الميثيل في موقع هيستون هذا في الجينات التي تم إسكاتها في السرطان ، فإن الإفراط في التعبير عن عائلة إنزيم JMJD2 متورط أيضًا في المرض ، مما يشير إلى أهمية التنظيم الدقيق لنزع الميثيل.


التحليل الطيفي الكتلي لأكثر التعديلات تكرارا بعد الترجمة

الفسفرة

الفسفرة منتشر على نطاق واسع وغالبا ما يدرس تعديل البروتين. يتم تعديل بقايا السيرين والثريونين والتيروزين تساهميًا عن طريق الإضافة الأنزيمية لمجموعة الفوسفات. الفسفرة هي عملية قابلة للانعكاس ، وعادة ما تستخدم لتشغيل وإيقاف العمليات البيولوجية المختلفة. يغير وجود المجموعة المحبة للماء المشحونة بنية البروتينات ، وينظم العمليات الكيميائية الحيوية المتعددة ، على سبيل المثال ، دورة الخلية ، والتمثيل الغذائي وتنظيم المستقبلات [41 ، 42].

عادةً ما تحدث الفسفرة في موقع معين فقط في جزء (صغير) من الجزيئات. لذلك ، يتطلب تحليل الفسفرة كلاً من تخصيص الهيكل (تحديد موقع الفسفرة) وتحديد نسبة النظائر الفسفرة وغير الفسفرة. تشكل البروتينات الفوسفورية جزءًا صغيرًا فقط من البروتين ، وبالتالي فإن استراتيجيات التخصيب ضرورية لتحليل ناجح. تم تطوير العديد من الطرق لهذا الغرض ، مثل كروماتوغرافيا الانجذاب المناعي ، وكروماتوجرافيا تقارب أيونات المعدن الثابت (IMAC) ، وكروماتوجرافيا تقارب أكسيد المعادن (MOAC) مثل ثاني أكسيد التيتانيوم (TiO)2) وثاني أكسيد الزركونيوم (ZrO2) اللوني [43،44،45،46]. تعتمد IMAC و MOAC على ألفة مجموعات الفوسفات لأيونات المعادن الانتقالية وأكاسيد المعادن. ومع ذلك ، تظهر هذه المواد أيضًا تقاربًا لمجموعات الكربوكسيل ، مما يؤدي إلى عزل المخلفات الحمضية مثل الغلوتامات والببتيدات المحتوية على الأسبارتات جنبًا إلى جنب مع المواد الفسفورية [47 ، 48]. تم تطوير العديد من الاستراتيجيات للتغلب على قضايا الخصوصية هذه. يقلل استرة مجموعات الكربوكسيل قبل التخصيب من احتباس الببتيدات الحمضية. يتم استخدام الأحماض العضوية التي لها ألفة أعلى للمرحلة الثابتة من مجموعات الكربوكسيل ولكن أقل من مجموعات الفوسفات كمستبعدات غير فوسفو ببتيد. يمكن أيضًا استخلاص الببتيدات الفوسفاتية تحديدًا من مادة IMAC باستخدام إزالة بيتا ، والتي تزيل الرابطة بين الببتيد ومجموعة الفوسفات [48]. على الرغم من أن MOAC يظهر أنه أكثر مقاومة للمركبات المتداخلة (مثل الأملاح والمنظفات) وأكثر انتقائية من IMAC في كثير من الحالات ، فقد تترابط بقايا الفسفرة المضاعفة بدرجة عالية من التقارب مع أكسيد الفلز ، مما يجعل من الصعب التخلص منها بشكل كبير. لذلك ، يوفر IMAC تغطية محسنة للببتيدات متعددة الفسفور ، كما أنه قادر على إثراء البروتينات الفسفورية كاملة الطول دون أي هضم مسبق للبروتين [48،49،50]. يستخدم كروماتوغرافيا الانجذاب المناعي في الغالب في إثراء البروتينات المفسفرة على بقايا التيروزين [51]. بالنظر إلى أن البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام طرق الإثراء المختلفة تتداخل جزئيًا فقط مع بعضها البعض (حوالي 30٪) ، يوصى بالجمع بين طرق متعددة لتحسين تغطية البروتينات الفوسفورية [52]. يمكن تجزئة العينات المخصبة لاحقًا قبل تحليل MS بطرق متعددة مثل كروماتوغرافيا التفاعل المحبة للماء (HILIC) و RP-HPLC و SCX [53،54،55].

هناك نوعان من القضايا الهامة التي تجعل توصيف الببتيد الفسفوري بواسطة MS غير بديهي. أولاً ، حساسية الفوسفوببتيد أقل بكثير من حساسية نظيره غير الفسفوري [56]. ثانيًا ، يتفتت الفوسفوببتيدات عادةً في CID بفقدان حمض الفوسفوريك ، وبالتالي ، قد يتم اختراق تحديد موقع الفسفرة [43]. استخدام ECD و ETD و / أو تقنيات MS / MS الخاصة (مثل MS 3) قد يخفف من هذه المشكلة ويسمح بتحليل التسلسل وتحديد موقع الفسفرة [57]. يمكن إجراء تحليل الفوسفوببتيد باستخدام الاشتقاق أيضًا. يتم تحويل بقايا الفوسفوسرين والفوسفوتريونين بشكل انتقائي إلى الانقسام المتماثل لليسين واللاحق للبروتين (باستخدام ، على سبيل المثال التربسين أو Lys-C) ينتج عنه ببتيدات جديدة [58]. يمكن استخدام تحديد هذه الببتيدات باستخدام MS / MS ومقارنتها بـ MS / MS للتناظرية غير المشتقة لتحديد موقع الفسفرة [46 ، 58].

أستلة

على مدى السنوات القليلة الماضية ، أصبحت دراسة أستلة البروتين قضية رئيسية في تحليل PTM. يمكن أسيتيل البروتينات عند الطرف N وفي المجموعة الأمينية ε من بقايا اللايسين ، وهذه الأخيرة لها صلة بيولوجية أكبر. تم وصف الأسيتيل على نطاق واسع لتنظيم الهيستونات ، وخلص إلى أنه يلعب دورًا مهمًا في عمليات دورة الخلية ، مثل التعبير الجيني وإصلاح الحمض النووي [59 ، 60].

نظرًا لأن الأستلة تحدث عادةً عند قياس العناصر المتفاعلة جدًا ، فإن إثراء البروتينات والببتيدات المعدلة له أهمية حاسمة. تعتبر الأجسام المضادة الخاصة بالأسيتيلليسين ذات قيمة عالية لهذا الغرض ، وتستخدم كخطوة تنقية أولية للعينات المعقدة للغاية [61،62،63]. ومع ذلك ، فإن الطريقة تعمل بشكل صحيح فقط مع الببتيدات ، حيث إن إمكانية الوصول إلى بقايا الأحماض الأمينية الأسيتيل محدودة في حالة البروتينات السليمة. علاوة على ذلك ، لا يوجد جسم مضاد متاح لإثراء الأسيتلة الطرفية N [64]. يمكن الوصول إلى عدد من الطرق لتقسيم الهستونات بما في ذلك كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) و SDS-PAGE و CE [65،66،67]. يزيد الأسيتيل من طبيعة البروتينات الكارهة للماء ويزيل الشحنة الموجبة من المجموعة الأمينية N-terminal. وبالتالي ، يمكن فصل البقايا المستخلصة من الأسيتيل عن نظيراتها غير الأسيتيلية بناءً على كره الماء (RP-HPLC) ، أو التفاعلات الكهروستاتيكية (SCX) ، أو كليهما (كروماتوجرافيا سائلة تفاعلية محبة للماء ، ZIC-HILIC) [64 ، 68]. تمتلك HILIC أيضًا قيمة مضافة تتمثل في قدرتها على فصل الهيستونات الميثيل والأسيتيل ، مما يقلل بشكل كبير من تعقيد العينة [69]. هناك إمكانية أخرى لتقليل تعقيد العينة وهي الاشتقاق بواسطة أنهيدريد البروبيونيك ، والذي يحول بقايا الليسين ومجموعة الأمينية الطرفية N إلى أميدات بروبيونيل مما يوفر إزاحة جماعية + 56 دا وحماية من الهضم الإنزيمي [37 ، 70].

يعتبر أسيتيل اللايسين عبارة عن PTM مستقر تحت تحليل قياس الطيف الكتلي ، أي يتم الاحتفاظ بالمجموعة الوظيفية على البروتين باستخدام CID عالي الطاقة [23]. يمكن تحديد الأستلة من خلال تحول كتلة 42.01 Da ، على عكس المتغير غير المعدل. على الرغم من أن هناك تعديلًا آخر يسمى ليسين ثلاثي الميثيل له وزن مشابه جدًا (42.04 Da) لأسيتيل ليسين ، إلا أن مقاييس الطيف الكتلي عالية الدقة قادرة على التفريق بين هذه التعديلات [71]. نظرًا لأن الأستلة تحيد الشحنة الموجبة لبقايا اللايسين وتمنع الانقسام التربيعي ، فإن غياب هذا الانقسام المميز يمكن أن يكون علامة أخرى على الأستلة [72].

O / N الجليكوزيل

تقريبًا ، أكثر من نصف البروتينات البشرية تحمل سلاسل جانبية بسيطة أو معقدة من الجليكان ، مما يؤثر على ثبات البروتين وثباته [73 ، 74]. هناك نوعان رئيسيان من السلاسل الجانبية للجليكان: (1) الجليكانات المرتبطة بـ O المرتبطة بمجموعة الهيدروكسي من السيرين ، الثريونين ، التيروزين ، بينما (2) الجليكانات المرتبطة بـ N مرتبطة بالنيتروجين في سلاسل الأسباراجين الجانبية. على النقيض من تخليق الأحماض النووية والبروتينات ، فإن عمليات الارتباط بالجليكوزيل ليست موجهة حسب النموذج ، مما يوفر عدم تجانس كبير لمقترنات الجليكوكون. وبالتالي ، فإن البروتين السكري هو خليط من الأشكال الإسوية للبروتين (الأشكال السكرية) ، بدلاً من أن يكون كيانًا كيميائيًا محددًا جيدًا [75].

يتطلب التوصيف الكامل للبروتينات السكرية والببتيدات السكرية طرقًا تحليلية متعددة. في أحد الأساليب ، يتم تحرير سلاسل الجليكان الجانبية من البروتين عن طريق تطبيق إنزيم (مثل الببتيد ن-glycosidase F ، PNGase F) أو عن طريق الإزالة الاختزالية. يمكن استخدام الأول في حالة النكليكان ، والأخير بالنسبة لـ O-glycans [76،77،78،79]. عندما يتم إطلاق السكريات ، عادة ما يتم فصلها عن خليط البروتين ومشتقاتها. استبدال جميع الهيدروجين التفاعلي بمجموعات الميثيل (permethylation) هو الطريقة الأكثر انتشارًا لهذا الغرض ، والتي تتيح التحديد الهيكلي التفصيلي للجليكانات المعقدة (مثل المواقع المتفرعة ، والروابط بين الجليكوسيد ، والأيزومرات التكوينية) [82]. نظرًا لأن الإجراء يثبت بقايا حمض السياليك ، تظهر المشتقات البيرميثيلية تأينًا أكثر فعالية وخصائص تجزئة أكثر قابلية للتنبؤ مقارنة بنظيراتها الأصلية [80،81،82،83،84]. غالبًا ما يتم تحليل الجليكانات البيرميثيل بواسطة MALDI-MS. يتم وضع علامات حمض أنثرانيليك (2-aminobenzoic acid ، 2-AA) على الكربوهيدرات المختزلة في ظروف معتدلة ، وبالتالي ، يمكن تجنب عملية desialylation غير مرغوب فيها [85]. 2-AA tag improves both chromatographic and mass spectrometric (in negative ion mode) detectabilities of glycans by acting as a chromophore, fluorophore and adding a negative charge to all the molecules. It also provides more informative fragments facilitating sequential analysis of saccharides [81, 85,86,87,88]. The derivatives can be subsequently separated by a number of methods, such as HILIC and CE prior to mass spectrometric analysis. CE is capable of separating positional isomers as well as differently linked glycans with high resolution and short analysis time, while HILIC tends to yield better retention time repeatability [89, 90]. It is also demonstrated that the techniques show notable complementarity in the glycoform profiling of therapeutic proteins [91].

An alternative to release glycan analysis is digestion of the protein (mixture) with proteolytic enzymes (e.g. trypsin). This yields a mixture of peptides and glycopeptides, and can be analyzed by CID- or ECD-based tandem mass spectrometry. Enzymatic digestion is often followed by enrichment techniques prior to the MS analysis. Glycopeptides may be enriched by boronate affinity chromatography, lectin affinity chromatography, HILIC, and electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography (ERLIC) [75, 92,93,94,95,96]. Boronate affinity chromatography is able to capture glycan moieties through formation of borate diesters with vicinal diols of the sugar residues. This ensures selective enrichment of glycopeptides, even in complex mixtures. In contrast to boronate affinity chromatography, lectin affinity chromatography allows the enrichment of unique glycoproteins/peptides having specific glycan structure, which may be exceptionally useful in the exploration of disease-related, abnormal glycosylation pattern [97]. As glycosylation increases hydrophilicity of proteins and peptides, glycopeptides can be easily separated from non-glycosylated ones by HILIC. ERLIC, in which positively charged functional groups are attached to the stationary phase, can be considered as a combination of hydrophilic interaction and ion-exchange chromatography. Sialylated moieties with negative charge are, therefore, highly retained, while positively charged peptides are easily eluted [98]. It is also reported that certain gradient HILIC methods can be converted into isocratic separations by ERLIC [99].

There are various mass spectrometric approaches for glycopeptide analysis, identifying the glycan structure, the glycosylation site and also the abundance ratio of various glycoforms. CID fragmentation often cleaves off the sugar residue, while ECD and ETD can yield information on the peptide sequence [75]. Ion mobility–mass spectrometry (IM-MS) is also a promising analytical tool in this field with the added value of being able to separate analytes based on their size. This technique has been successfully applied for the separation and characterization of isobaric polysaccharides and glycopeptides [100, 101].

Amidation

Approximately, half of the endocrine and neural peptides bear C-terminal amidation [102]. The presence of such modification is indispensable for signal transduction and receptor recognition [102, 103]. Furthermore, derivatization of amidated peptides with glycosylphosphatidylinositol is responsible for anchoring peptides and proteins to the cell membrane [104].

As in most cases in the field of PTMs, proteins that are presumably amidated at the C terminus can be separated or enriched by specifically engineered approaches based on the affinity of such proteins. For a long time, only radioimmunoassay (RIA) and immunoprecipitation (IP) have been applied for identification of amidated proteins [105, 106]. Separation of amidated peptides from their precursors can be carried out with RP-HPLC [105]. Weak cation-exchange chromatography (WCX) has been reported to be able to separate the α-amidated heavy chain of immunoglobulin G1 from other isoforms [107].

Amidation of a carboxyl group manifests in a 1 Da mass shift, which is very difficult to identify. The situation can be further complicated when the C-terminal amino acid is glutamine or asparagine, which cannot be distinguished from the amidated form of glutamate or aspartate, except when an auxiliary chemical or enzymatic procedure is performed. An approach has been developed for detecting C-terminal amidation by a combination of chemical derivatization and MALDI-TOF/TOF MS [86]. First step is the derivatization of the free carboxyl group at the C terminal, resulting in a methylamide structure [108, 109]. This results in a 13 Da mass increment observable in the spectrum, enabling the distinction between the amidated and the unmodified peptides. This method was shown to be able to distinguish isobaric residues at the C terminal, such as Gln-OH and Glu-NH2 or Asn-OH and Asp-NH2, suggesting a wider application to investigate modified and unmodified C terminals of proteins [104].

Hydroxylation

Although hydroxylation can take place on several amino acids including lysine, histidine, asparagine, aspartate, and aromatic residues, the most commonly hydroxylated amino acid is proline, which makes up almost one-third of collagen protein [110,111,112]. Hydroxylation generally takes place at the γ-C atom, yielding 4-hydroxyproline (4-Hyp), which has the ability to stabilize the secondary structure of the protein by the powerful electronegative effect of the hydroxy group [112]. Hyp is also associated with the decreased availability of oxygen in the cellular environment, as the alpha subunits of hypoxia-induced factor (HIF) contain hydroxylated proline residues [113].

Mass spectrometric investigation of collagenous proteins is intricate due to the large number of proline residues and the high abundance of hydroxylation. These structural features result in a vast number of isobaric but differently modified peptides in a typical proteomic workflow, which usually co-elute during chromatographic separation and provide chimeric spectra troublesome to elucidate. Moreover, the nominal mass of Hyp is 113 Da, which is the same as leucine and isoleucine. To overcome such difficulties, a mass spectrometer with high mass accuracy and abundant product ions from the tandem MS experiment are required [114, 115]. Unfortunately, MS ن sequence analysis is ruined by the abnormal fragmentation of Pro- and Hyp-rich proteins and peptides. These residues promote characteristic and dominant cleavages instead of those nonselective ones, which may provide sequence information. This phenomenon is the so-called “proline-effect”, by which the identification of collagens and other proline-rich proteins are greatly hampered [114, 116, 117]. An approach has been suggested that is based on the application of five different proteolytic enzymes to increase sequence coverage of collagenous proteins. Thereafter, the analytes were separated by nano-LC and introduced into a linear ion trap–orbitrap instrument. Differently modified peptides with the same sequence were eluted and ionized together producing chimeric mass spectra. As ETD-induced fragmentation did not yield sufficient amount of data, additional dissociation techniques (CID and HCD) were also applied. In general, multistage activation made the identification of PTM-carrying residues possible, however, in some cases, the exact localization of the modification has remained unknown [114].

Table 2 summarizes the separation/enrichment techniques, fragmentation methods, and commonly used derivatization methods of modified peptides and proteins.


مراجع

Csizmok, V. & Forman-Kay, J. D. Complex regulatory mechanisms mediated by the interplay of multiple post-translational modifications. Current opinion in structural biology 48, 58–67 (2018).

Santos, A. L. & Lindner, A. B. Protein posttranslational modifications: Roles in aging and age-related disease. الطب التأكسدي وطول العمر الخلوي 2017 (2017).

Ubersax, J. A. & Ferrell, J. E. Mechanisms of specificity in protein phosphorylation. Nature reviews. Molecular cell biology 8, 530–541 (2007).

Tsiatsiani, L. & Heck, A. J. R. Proteomics beyond trypsin. The FEBS journal 282, 2612–2626 (2015).

Swaney, D. L., Wenger, C. D. & Coon, J. J. Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics. Journal of proteome research 9, 1323–1329 (2010).

Giansanti, P., Tsiatsiani, L., Low, T. Y. & Heck, A. J. R. Six alternative proteases for mass spectrometry-based proteomics beyond trypsin. Nature protocols 11, 993–1006 (2016).

Casanovas, A., Gallardo, O., Carrascal, M. & Abian, J. Tcellxtalk facilitates the detection of co-modified peptides for the study of protein post-translational modification cross-talk in t cells. Bioinformatics (Oxford, England) (2018).

Liu, Y., Wang, M., Xi, J., Luo, F. & Li, A. Ptm-ssmp: A web server for predicting different types of post-translational modification sites using novel site-specific modification profile. International journal of biological sciences 14, 946–956 (2018).

Li, F. وآخرون. Quokka: a comprehensive tool for rapid and accurate prediction of kinase family-specific phosphorylation sites in the human proteome. Bioinformatics (Oxford, England) 34, 4223–4231 (2018).

Li, G. X. H., Vogel, C. & Choi, H. Ptmscape: an open source tool to predict generic post-translational modifications and map modification crosstalk in protein domains and biological processes. Molecular omics 14, 197–209 (2018).

Patrick, R., Lê Cao, K.-A., Kobe, B. & Bodén, M. Phosphopick: modelling cellular context to map kinase-substrate phosphorylation events. Bioinformatics (Oxford, England) 31, 382–389 (2015).

He, W., Wei, L. & Zou, Q. Research progress in protein posttranslational modification site prediction. Briefings in functional genomics (2018).

Chen, Z. وآخرون. Large-scale comparative assessment of computational predictors for lysine post-translational modification sites. Briefings in bioinformatics (2018).

Xu, Y., Yang, Y., Wang, Z., Li, C. & Shao, Y. A systematic review on posttranslational modification in proteins: Feature construction, algorithm and webserver. Protein and peptide letters 25, 807–814 (2018).

Wang, D., Liang, Y. & Xu, D. Capsule network for protein post-translational modification site prediction. المعلوماتية الحيوية ( Oxford, England ) (2018).

Eisenhaber, B. & Eisenhaber, F. Prediction of posttranslational modification of proteins from their amino acid sequence. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 609, 365–384 (2010).

Hui, E. وآخرون. T cell costimulatory receptor cd28 is a primary target for pd-1-mediated inhibition. Science (New York, N.Y.) 355, 1428–1433 (2017).

Venne, A. S., Kollipara, L. & Zahedi, R. P. The next level of complexity: crosstalk of posttranslational modifications. البروتيوميات 14, 513–524 (2014).

Wiese, H. وآخرون. Comparison of alternative ms/ms and bioinformatics approaches for confident phosphorylation site localization. Journal of proteome research 13, 1128–1137 (2014).

Collins, M. O., Wright, J. C., Jones, M., Rayner, J. C. & Choudhary, J. S. Confident and sensitive phosphoproteomics using combinations of collision induced dissociation and electron transfer dissociation. Journal of proteomics 103, 1–14 (2014).

Imanishi, S. Y. وآخرون. Reference-facilitated phosphoproteomics: fast and reliable phosphopeptide validation by microlc-esi-q-tof ms/ms. Molecular & cellular proteomics: MCP 6, 1380–1391 (2007).

Consortium, T. U. Uniprot: the universal protein knowledgebase. أبحاث الأحماض النووية 45, D158–D169 (2017).

Hornbeck, P. V. وآخرون. Phosphositeplus, 2014: mutations, ptms and recalibrations. أبحاث الأحماض النووية 43, D512–D520 (2015).

Bezanson, J., Edelman, A., Karpinski, S. & Shah, V. B. Julia: A fresh approach to numerical computing. SIAM Review 59, 65–98, http://julialang.org/publications/julia-fresh-approach-BEKS.pdf (2017).

Pont, F. & Fournié, J. J. Sorting protein lists with nwcompare: A simple and fast algorithm for n-way comparison of proteomic data files. البروتيوميات 10, 1091–1094 (2010).


A High Resolution Mass Spectrometry Study Reveals the Potential of Disulfide Formation in Human Mitochondrial Voltage-Dependent Anion Selective Channel Isoforms (hVDACs)

The voltage-dependent anion-selective channels (VDACs), which are also known as eukaryotic porins, are pore-forming proteins, which allow for the passage of ions and small molecules across the outer mitochondrial membrane (OMM). They are involved in complex interactions that regulate organelle and cellular metabolism. We have recently reported the post-translational modifications (PTMs) of the three VDAC isoforms purified from rat liver mitochondria (rVDACs), showing, for the first time, the over-oxidation of the cysteine residues as an exclusive feature of VDACs. Noteworthy, this peculiar PTM is not detectable in other integral membrane mitochondrial proteins, as defined by their elution at low salt concentration by a hydroxyapatite column. In this study, the association of tryptic and chymotryptic proteolysis with UHPLC/High Resolution nESI-MS/MS, allowed for us to extend the investigation to the human VDACs. The over-oxidation of the cysteine residues, essentially irreversible in cell conditions, was as also certained in VDAC isoforms from human cells. In human VDAC2 and 3 isoforms the permanently reduced state of a cluster of close cysteines indicates the possibility that disulfide bridges are formed in the proteins. Importantly, the detailed oxidative PTMs that are found in human VDACs confirm and sustain our previous findings in rat tissues, claiming for a predictable characterization that has to be conveyed in the functional role of VDAC proteins within the cell. Data are available via ProteomeXchange with identifier PXD017482.

الكلمات الدالة: Cysteine over-oxidation Orbitrap Fusion Tribrid hydroxyapatite mitochondria mitochondrial intermembrane space outer mitochondrial membrane post-translational modification.

بيان تضارب المصالح

الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.

الأرقام

Sequence coverage map of hVDAC1…

Sequence coverage map of hVDAC1 obtained by tryptic and chymotryptic digestion. The gray…

MS/MS spectrum of the doubly…

MS/MS spectrum of the doubly charged molecular ion at m/z 1083.9756 (calculated 1083.9754)…

MS/MS spectrum of the triply…

MS/MS spectrum of the triply charged molecular ion at m/z 812.0634 (calculated 812.0635)…

Sequence coverage map of hVDAC2…

Sequence coverage map of hVDAC2 obtained by tryptic and chymotryptic digestion. Gray solid…

Sequence coverage map of hVDAC3…

Sequence coverage map of hVDAC3 obtained by tryptic and chymotryptic digestion. The gray…

Scheme of the cysteine localization…

Scheme of the cysteine localization in the aligned sequences of human VDAC isoforms.…


The basics of mass spectrometry

Since their inception in 1912, mass spectrometers have undergone continuous development, and these sophisticated bioanalytical instruments have now reached unrivalled detection limits, speed and diversity in applications. They detect the presence and abundance of peptides (or other biomolecules such as metabolites, lipids and proteins) using fundamental properties of molecules, such as mass, and net charge. When peptides obtain a net charge (usually through gain of protons), they are referred to as peptide ions.

All mass spectrometers have three fundamental components: an ion source, mass analyser and detector (Figure 1A). As mass spectrometers can only analyse gaseous ions, methods such as electrospray ionization (ESI) are needed to convert peptides from the liquid phase to gaseous ions. The liquid containing the peptides is pumped through a micrometre-sized orifice held at a high voltage (2–4 kV). Upon reaching this emitter, the steady stream of liquid disintegrates into extremely small, highly charged and rapidly evaporating charged droplets, leaving peptide ions in the gas phase. Even 20 years after John Fenn received the Nobel Prize for this discovery, the exact mechanisms are not completely understood. We know that the abundance of gaseous peptide ions is proportional to their original concentration, making it beneficial to use the lowest flow rates possible, thereby maximizing sensitivity. It is common in proteomics to separate peptide mixtures using high-performance liquid chromatography (HPLC) systems with flow rates of only a few hundred nanolitres per minute rather than millilitres in conventional HPLC.

Overview of sample preparation and instrumentation used in MS-based proteomics. (أ) Proteins are digested into peptides using sequence-specific proteases. Optionally, post-translational modification (PTM)-containing peptides can be enriched using beads with specific surface chemistry or coupled antibodies. High-performance liquid chromatography (HPLC) separates peptides based on hydrophobicity, and they are subsequently analysed by a TOF mass spectrometer. (ب) Alternatively, peptides can be analysed by an Orbitrap mass spectrometer, which is a mainstream instrument in proteomics.

The principal role of a mass analyser is to separate ions by their mass-to-charge ratios (m/z). Fundamentally, all ions are separated by modulating their trajectories in electrical fields. Mass analysers differ in the principle they use for separating ions, and this defines their preferred application areas. Quadrupoles, usually combined with time-of-flight (TOF) or Orbitrap analysers, are the most common in proteomics. Quadrupole mass analysers separate ions using an oscillating electrical field between four cylindrical rods in a parallel arrangement, where each pair of rods produces a radio frequency electrical field with a phase offset. The resulting electrical fields define a pseudo-potential surface that is configured to allow the transmission of all ions, or to selectively transmit ions of a specific m/z window.

TOF mass analysers separate ions based on the differences in velocities after acceleration to about 20 kV and subsequent different arrival times at the detector. A TOF can measure mass differences of one part per million (ppm) by detecting time differences of sub-microseconds. In contrast, the Orbitrap mass analyser distinguishes ions based on their oscillation frequencies. Ions are tangentially injected and then trapped in the Orbitrap, and they move along the length axis of a central metal spindle (Figure 1B). Although an Orbitrap is only a few centimetres long, the ions can rapidly travel up to several kilometres, enabling very high resolution (typically tens of thousands) and low ppm mass accuracy.

In proteomics, the quadrupole element is normally followed by a ‘collision cell’, which is a quadrupole where the ions can be fragmented. Either intact peptide ions or fragment ions enter the final stage that also contains the detector – the resulting spectra are called MS 1 or precursor ion spectra in the former case and MS 2 or product or MS/MS spectra in the latter. TOF instruments have microchannel plate (MCP) detectors, where each individual ion ejects electrons from a surface that are then amplified. Individual ions can be readily measured with MCPs, but this exquisite sensitivity comes with the caveat that the detector can easily saturate in case of high signals. In Orbitrap analysers, the ‘image current’ induced by the rapidly oscillating ions is measured, and it represents a quantitative readout of the strength of the individual ion packages. The current is recorded in the time domain and is converted into the frequency domain using Fourier transformation. Advances in signal processing algorithms have repeatedly doubled the achievable resolution with a given transient time of the signal, but these are still orders of magnitude slower than those of TOF analysers (tens to hundreds of milliseconds vs typically 100 microseconds for a single TOF pulse).

How do the MS instruments sequence or identify peptides? Precursor ions with a specific m/z are first isolated by the quadrupole and fragmented through collision with inert gases such as N2, He or Ar. This causes them to break apart at the lowest energy bonds – typically, some of the amide bonds (peptide bonds) connecting the amino acid residues – and leaves MS/MS spectra with incomplete ladders of peaks differing by amino acid masses. This information is incredibly specific and is used for identification of the peptide sequence. A sequence of just a few amino acids and the flanking masses – a peptide sequence tag – is sufficient for identifying a peptide from the entirety of human proteome. More usually, database identification involves generating all possible fragmentation spectra and then statistically scoring them against the experimental spectra.

The chromatographic retention time is an important level of information when matching a dataset against a previous measurement and is key to ‘targeted proteomics’ technologies. Furthermore, ion mobility analysis, an additional dimension of separation of peptide ions, has recently become mainstream. Ions are either filtered based on their cross-section (FAIMS, field asymmetric ion mobility spectrometry) or actually separated during their analysis (T-Wave or TIMS, trapped ion mobility spectrometry). TIMS is the basis of the parallel accumulation–serial fragmentation (PASEF) technology, which multiplies sequencing speed 10-fold while improving sensitivity.


الملخص

Protozoan parasitic infections are health, social and economic issues impacting both humans and animals, with significant morbidity and mortality worldwide. Protozoan parasites have complicated life cycles with both intracellular and extracellular forms. As a consequence, protozoan adapt to changing environments in part through a dynamic enzyme-catalyzed process leading to reversible posttranslational modifications (PTMs). The characterization by proteomics approaches reveals the critical role of the PTMs of the proteins involved in host-pathogen interaction. The complexity of PTMs characterization is increased by the high diversity, stoichiometry, dynamic and also co-existence of several PTMs in the same moieties which crosstalk between them. Here, we review how to understand the complexity and the essential role of PTMs crosstalk in order to provide a new hallmark for vaccines developments, immunotherapies and personalized medicine. In addition, the importance of these motifs in the biology and biological cycle of kinetoplastid parasites is highlighted with key examples showing the potential to act as targets against protozoan diseases.


Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation—a 25 year update. اتجاهات Biochem. علوم. 25, 596–601 (2000).

Tyers, M. & Jorgensen, P. Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy. بالعملة. رأي. جينيه. ديف. 10, 54–64 (2000).

Carr, S.A. et al. Protein and carbohydrate structural analysis of a recombinant soluble CD4 receptor by mass spectrometry. J. بيول. تشيم. 264, 21286–21295 (1989).

Ling, V. et al. Characterization of the tryptic map of recombinant DNA-derived tissue plasminogen activator by high-performance liquid chromatography–electrospray ionization mass spectrometry. شرجي. تشيم. 63, 2909–2915 (1991).

Roepstorff, P. Mass spectrometry in protein studies from genome to function. بالعملة. رأي. التكنولوجيا الحيوية. 8, 6–13 (1997).

Aebersold, R. & Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. طبيعة سجية، in press (2003).

Jensen, O.N. Modification-specific proteomics: strategies for systematic studies of post-translationally modified proteins. في Proteomics: A Trends Guide (eds. Blackstock, W. & Mann, M.) 36–42 (Elsevier Science, London 2000).

McLachlin, D.T. & Chait, B.T. Analysis of phosphorylated proteins and peptides by mass spectrometry. بالعملة. رأي. تشيم. بيول. 5, 591–602 (2001).

Sickmann, A. & Meyer, H.E. Phosphoamino acid analysis. البروتيوميات 1, 200–206 (2001).

Mann, M. et al. Analysis of protein phosphorylation using mass spectrometry: deciphering the phosphoproteome. اتجاهات التكنولوجيا الحيوية. 20, 261–268 (2002).

Loughrey Chen, S. et al. Mass spectrometry-based methods for phosphorylation site mapping of hyperphosphorylated proteins applied to Net1, a regulator of exit from mitosis in yeast. مول. Cell Proteomics 1, 186–196 (2002).

Gorg, A. et al. The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. الكهربائي 21, 1037–1053 (2000).

Rabilloud, T. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: old, old fashioned, but it still climbs up the mountains. البروتيوميات 2, 3–10 (2002).

Fey, S.J. & Larsen, P.M. 2D or not 2D. Two-dimensional gel electrophoresis. بالعملة. رأي. تشيم. بيول. 5, 26–33 (2001).

Larsen, M.R., Larsen, P.M., Fey, S.J. & Roepstorff, P. Characterization of differently processed forms of enolase 2 from خميرة الخميرة by two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. الكهربائي 22, 566–575 (2001).

Knebel, A., Morrice, N. & Cohen, P. A novel method to identify protein kinase substrates: eEF2 kinase is phosphorylated and inhibited by SAPK4/p38δ. EMBO J. 20, 4360–4369 (2001).

MacDonald, J.A., Mackey, A.J., Pearson, W.R. & Haystead, T.A. A strategy for the rapid identification of phosphorylation sites in the phosphoproteome. مول. Cell Proteomics 1, 314–322 (2002).

Covey, T.R., Shushan, B.I., Bonner, R., Schroder, W. & Hucho, F. LC/MS and LC/MS/MS screening for the sites of post-translational modifications in proteins. في Methods in Protein Sequence Analysis (eds Jörnvall, H., Höög, J.O. & Gustavsson, A.M.). 249–256 (Birkhäuser Verlag, Basel, 1991).

Bateman, R.H. et al. A novel precursor ion discovery method on a hybrid quadrupole orthogonal acceleration time-of-flight (Q-TOF) mass spectrometer for studying protein phosphorylation. جيه. شركة كتلة الطيف. 13, 792–803 (2002).

Wilm, M., Neubauer, G. & Mann, M. Parent ion scans of unseparated peptide mixtures. شرجي. تشيم. 68, 527–533 (1996).

Carr, S.A., Huddleston, M.J. & Annan, R.S. Selective detection and sequencing of phosphopeptides at the femtomole level by mass spectrometry. شرجي. بيوتشيم. 239, 180–192 (1996).

Steen, H., Kuster, B., Fernandez, M., Pandey, A. & Mann, M. Detection of tyrosine-phosphorylated peptides by precursor ion scanning quadrupole TOF mass spectrometry in positive ion mode. شرجي. تشيم. 73, 1440–1448 (2001).

Steen, H., Kuster, B., Fernandez, M., Pandey, A. & Mann, M. Tyrosine phosphorylation mapping of the epidermal growth factor receptor signaling pathway. J. بيول. تشيم. 277, 1031–1039 (2002).

Hinsby, A.M., Olsen, J.V., Bennett, K.L. & Mann, M. Signaling initiated by overexpression of the fibroblast growth factor receptor-1 investigated by mass spectrometry. مول. زنزانة. البروتيوميات, in press (2003).

Mann, M. & Wilm, M.S. Error-tolerant identification of peptides in sequence databases by peptide sequence tags. شرجي. تشيم. 66, 4390–4399 (1994).

Eng, J.K., McCormack, A.L. & Yates, J.R.I. An approach to correlate MS/MS data to amino acid sequences in a protein database. جيه. شركة كتلة الطيف. 5, 976–989 (1994).

Perkins, D.N., Pappin, D.J., Creasy, D.M. & Cottrell, J.S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. الكهربائي 20, 3551–3567 (1999).

MacCoss, M.J., Wu, C.C. & Yates, J.R. Probability-based validation of protein identifications using a modified SEQUEST algorithm. شرجي. تشيم. 74, 5593–5599 (2002).

Creasy, D.M. & Cottrell, J.S. Error-tolerant searching of uninterpreted tandem mass spectrometry data. البروتيوميات 2, 1426–1434 (2002).

Marshall, A.G., Hendrickson, C.L. & Jackson, G.S. Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry: a primer. كتلة الطيف. القس. 17, 1–35 (1998).

Martin, S.E., Shabanowitz, J., Hunt, D.F. & Marto, J.A. Subfemtomole MS and MS/MS peptide sequence analysis using nano-HPLC micro-ESI Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. شرجي. تشيم. 72, 4266–4274 (2000).

Zubarev, R.A. وآخرون. Electron-capture dissociation for structural characterization of multiply charged protein cations. شرجي. تشيم. 72, 563–573 (2000).

Stensballe, A., Jensen, O.N., Olsen, J.V., Haselmann, K.F. & Zubarev, R.A. Electron-capture dissociation of singly and multiply phosphorylated peptides. التواصل السريع. كتلة الطيف. 14, 1793–1800 (2000).

Shi, S.D. وآخرون. Phosphopeptide/phosphoprotein mapping by electron-capture dissociation mass spectrometry. شرجي. تشيم. 73, 19–22 (2001).

Kelleher, N.L. وآخرون. Localization of labile posttranslational modifications by electron-capture dissociation: the case of γ-carboxyglutamic acid. شرجي. تشيم. 71, 4250–4253 (1999).

Kjeldsen, F., Haselmann, K.F., Budnik, B.A., Soerensen, E.S. & Zubarev, R.A. Complete characterization of post-translational modification sites in the bovine milk protein PP3 by tandem mass spectrometry with electron-capture dissociation as the last stage. شرجي. تشيم., in press (2003).

Sze, S.K., Ge, Y., Oh, H. & McLafferty, F.W. Top-down mass spectrometry of a 29-kDa protein for characterization of any posttranslational modification to within one residue. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 99, 1774–1779 (2002).

Soskic, V., Gorlach, M., Poznanovic, S., Boehmer, F.D. & Godovac-Zimmermann, J. Functional proteomics analysis of signal transduction pathways of the platelet-derived growth factor-β receptor. الكيمياء الحيوية 38, 1757–1764 (1999).

Yamagata, A. et al. Mapping of phosphorylated proteins on two-dimensional polyacrylamide gels using protein phosphatase. البروتيوميات 2, 1267–1276 (2002).

Stensballe, A., Andersen, S. & Jensen, O.N. Characterization of phosphoproteins from electrophoretic gels by nanoscale Fe(iii) affinity chromatography with off-line mass spectrometry analysis. البروتيوميات 1, 207–222 (2001).

Pandey, A. et al. Analysis of receptor signaling pathways by mass spectrometry: identification of Vav-2 as a substrate of the epidermal and platelet-derived growth factor receptors. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 97, 179–184 (2000).

Gronborg, M. et al. A mass spectrometry-based proteomic approach for identification of serine/threonine-phosphorylated proteins by enrichment with phospho-specific antibodies: identification of a novel protein, Frigg, as a protein kinase A substrate. مول. زنزانة. البروتيوميات 1, 517–527 (2002).

Peng, J. & Gygi, S.P. Proteomics: the move to mixtures. ياء كتلة الطيف. 36, 1083–1091 (2001).

MacCoss, M.J. et al. Shotgun identification of protein modifications from protein complexes and lens tissue. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 99, 7900–7905 (2002).

هو ، واي وآخرون. التحديد المنهجي لمجمعات البروتين في خميرة الخميرة بواسطة مطياف الكتلة. طبيعة سجية 415, 180–183 (2002).

جافين ، إيه سي وآخرون. التنظيم الوظيفي لبروتين الخميرة عن طريق التحليل المنهجي لمجمعات البروتين. طبيعة سجية 415, 141–147 (2002).

Andersson, L. & Porath, J. Isolation of phosphoproteins by immobilized metal (Fe 3+ ) affinity chromatography. شرجي. بيوتشيم. 154, 250–254 (1986).

Posewitz, M.C. & Tempst, P. Immobilized gallium(iii) affinity chromatography of phosphopeptides. شرجي. تشيم. 71, 2883–2892 (1999).

Ficarro, S.B. وآخرون. Phosphoproteome analysis by mass spectrometry and its application to خميرة الخميرة. نات. التكنولوجيا الحيوية. 20, 301–305 (2002).

Salomon, A.R. وآخرون. Profiling of tyrosine-phosphorylation pathways in human cells using mass spectrometry. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 100, 443–448 (2003).

Zhou, H., Watts, J.D. & Aebersold, R. A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation. نات. التكنولوجيا الحيوية. 19, 375–378 (2001).

Oda, Y., Nagasu, T. & Chait, B.T. Enrichment analysis of phosphorylated proteins as a tool for probing the phosphoproteome. نات. التكنولوجيا الحيوية. 19, 379–382 (2001).

Steen, H. & Mann, M. A new derivatization strategy for the analysis of phosphopeptides by precursor ion scanning in positive ion mode. جيه. شركة كتلة الطيف. 13, 996–1003 (2002).

Medzihradszky, K.F. وآخرون. The characteristics of peptide collision-induced dissociation using a high-performance MALDI-TOF/TOF tandem mass spectrometer. شرجي. تشيم. 72, 552–558 (2000).

Gygi, S.P. et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. نات. التكنولوجيا الحيوية. 17, 994–999 (1999).

Oda, Y., Huang, K., Cross, F.R., Cowburn, D. & Chait, B.T. Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 96, 6591–6596 (1999).

Stemmann, O., Zou, H., Gerber, S.A., Gygi, S.P. & Kirschner, M.W. Dual inhibition of sister chromatid separation at metaphase. زنزانة 107, 715–726 (2001).

Ong, S.E., Kratchmarova, I. & Mann, M. Properties of 13 C-substituted arginine in stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC). J. بروتيوم الدقة., in press (2003).

Blagoev, B. et al. A proteomics strategy to elucidate functional protein–protein interactions applied to EGF signaling. نات. التكنولوجيا الحيوية. 21, 315–318 (2003).


شاهد الفيديو: طريقة حسبة احتياجك اليومي من البروتين. مع الامثلة (قد 2022).