معلومة

تحديد ما إذا كانت العطريات تنشأ من مسار بولي كيتيد أو شيكيمات

تحديد ما إذا كانت العطريات تنشأ من مسار بولي كيتيد أو شيكيمات


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

هل هناك طريقة لتحديد ما إذا كان المركب العطري ينشأ من مسار polyketide أو shikimate من خلال النظر إلى هيكله؟ إذا كان الأمر كذلك ، فكيف؟


ينتج عن العطريات التي تنبع من مسار شيكيمات هيكل مثل هذا

في حين أن العطريات التي تنشأ من مسار Polyketide لها بنية بديلة في توزيع مجموعات OH.


إذا كان كلا المسارين ينتجان نفس الجزيء ، فلا يمكنك القول: إنه نفس الجزيء.

يمكنك التخلص من بعض الإنزيمات على كلا الجانبين ومعرفة أي منها يؤثر على الإنتاج. أو يمكنك رفع الخلايا بمقدمة ذات علامات إشعاعية لمسار واحد فقط ، ثم معرفة ما إذا كان الناتج قد تم تسميته أيضًا.

ومع ذلك ، تقول "من خلال النظر إلى هيكلها" ، لذلك أفترض أنه لا يمكن إجراء تجربة إضافية - ثم لا ، باستثناء الحالة البسيطة حيث ينتج الجزيء فقط أحد المسارات (في هذه الحالة من الواضح أنه جاء من ذلك واحد).


تطور مسار التمثيل الغذائي الثانوي من التمثيل الغذائي الأولي: shikimate و quinate التخليق الحيوي في النباتات

يقوم مسار shikimate بتركيب الأحماض الأمينية العطرية الضرورية للتخليق الحيوي للبروتين. إنزيم Shikimate dehydrogenase (SDH) هو إنزيم مركزي لهذا المسار الأيضي الأولي ، وينتج شيكيمات. Quinate المماثل من الناحية الهيكلية هو مستقلب ثانوي يتم تصنيعه بواسطة Quinate dehydrogenase (QDH). SDH و QDH تنتمي إلى نفس عائلة الجينات ، والتي تشعبت إلى قسمين من النشوء والتطور بعد التكرار الجيني المحدد قبل انقسام كاسيات البذور / عاريات البذور. النباتات غير البذرية التي تفرعت قبل هذا التكاثر تأوي جينًا واحدًا فقط من هذه العائلة. الممثلين الحاليين من الكلوروفيت (كلاميدوموناس رينهاردتي) ، بريوفيت (باتينز فيسكوميتريلا) و lycophytes (Selaginella Moellendorfii) بتشفير نشاط SDH بشكل حصري تقريبًا في المختبر. كما أن تسلسل أسلاف أعيد بناؤه يمثل العقدة قبل تكرار الجينات يشفر أيضًا نشاط SDH. تم اكتساب نشاط Quinate dehydrogenase فقط في نباتات البذور بعد تكرار الجينات. قم بإخماد نازعات الهيدروجين من عاريات البذور ، ممثلة هنا صنوبر تايدا، قد يكون تذكيرًا بالوسيطة التطورية لأنها تقوم بتشفير أنشطة SDH و QDH متساوية. النسخة الثانية في P. تايدا الحفاظ على خصوصية شيكيمات مماثلة للنشاط الموجود في كليد شقيقة كاسيات البذور SDH. أظهر الكودون لبقايا التيروزين داخل الموقع النشط توقيعًا على الاختيار الإيجابي في العقدة التي تحدد كليد QDH ، حيث تغيرت إلى جلايسين. كان استبدال التيروزين بالجليسين في كاسيات البذور SDH عالي الجودة من الشيكيمات كافياً للحصول على بعض وظائف QDH. وبالتالي ، كانت هناك طفرات قليلة جدًا ضرورية لتسهيل تطور QDH الجينات.


1 المقدمة

المركبات العطرية والمشتقة من المواد العطرية (ADC) هي مواد كيميائية ذات حجم كبير أو مواد كيميائية دقيقة مع عدد لا يحصى من التطبيقات المهمة. إنها بمثابة لبنات بناء للعديد من المركبات القيمة بما في ذلك البوليمرات مثل البلاستيك والراتنجات والألياف وتستخدم كمواد تشحيم وأصباغ ومبيدات حشرية. علاوة على ذلك ، فهي ضرورية لإنتاج المغذيات والأدوية التي لا غنى عنها. [1-4] يتم إنتاج الغالبية العظمى منهم من البترول في عمليات كثيفة الاستهلاك للطاقة وتلويث البيئة. أدى الطلب المتزايد ، ومحدودية الموارد الأحفورية ، والأزمة البيئية الحالية إلى جذب الانتباه المتزايد إلى التحول المطلوب بشدة نحو إنتاج مستدام قائم على أساس بيولوجي للوقود والمواد الكيميائية من المواد الأولية المتجددة. [5] بجانب الكيمياء الخضراء ، يعد التحفيز الحيوي الميكروبي استراتيجية واعدة لإنتاج المواد العطرية في درجات الحرارة والضغط المحيطين دون استخدام محفزات سامة ، وبالتالي تقليل استهلاك الطاقة وتوليد النفايات. [6] تمت مراجعة التقدم في هذا المجال مؤخرًا في العديد من المنشورات التي تقدم نظرة عامة واسعة على العديد من الكائنات المضيفة. [1-4 ، 7 ، 8] الاستعراض المقدم هنا يسلط الضوء على وجه التحديد على تطبيق مختلف الزائفة الأنواع كمصنع للخلايا الميكروبية لإنتاج العطريات الصناعية و ADC. وهذا يشمل توليف de novo لمثل هذه المواد الأولية المتجددة والمتوفرة بكثرة واستراتيجيات الهندسة الوراثية المرتبطة بها مما يتيح التحويل الحيوي الفعال. علاوة على ذلك ، تم توضيح مناهج التحول الأحيائي للركائز العطرية الطبيعية والمصنعة إلى منتجات ذات قيمة مضافة ، مع التركيز على مقاومة الإجهاد الفريدة لـ الزائفة تمكين استخدام المذيبات العضوية في عمليات التخمير ثنائية الطور. تتم أيضًا مناقشة تثمين المواد العطرية المشتقة من اللجنين والبلاستيك والتحول الأيضي للخلائط غير المتجانسة منها.


المطالبات

1. طريقة لتحديد عامل الاختبار الذي يمكن أن يثبط واحدًا أو أكثر من الإنزيمات التي تشكل جزءًا من مسار shikimate ، وهي الطريقة التي تشتمل على إدخال عامل الاختبار في خميرة Saccharomyces المعدلة ، خميرة Saccharomyces المعدلة التي تشتمل على:

1) خلل في جين خميرة Saccharomyces الذاتية الذي يشفر إنزيم مسار shikimate ، و 2) جين إضافي يشفر إنزيم غير متجانس يكون متماثلًا مع الإنزيم المشفر بواسطة جين الخميرة Saccharomyces الذاتية حيث يتم تثبيط نمو الخميرة المعدلة Saccharomyces تشير نسبة إلى عنصر تحكم إلى أن عامل الاختبار يثبط إنزيم مسار الشيكيمات ، وحيث تشتمل السيطرة على نمو خميرة السكارومايس المعدلة التي يتم إدخال عامل الاختبار فيها ، وحيث يتم إجراء نمو خميرة السكارومايس المعدلة على وسط يتم تكميله بواحد أو أكثر من الأحماض الأمينية العطرية بحيث يكون نمو الخميرة المعدلة مستقلاً عن وظيفة الجين الإضافي.

2. الطريقة وفقًا لعنصر الحماية 1 ، حيث يتم إدخال عدد كبير من عوامل الاختبار المتميزة في مجموعة من مزارع خميرة الخميرة المتميزة.

3. الطريقة وفقًا لعنصر الحماية 2 ، حيث تكون مجموعة عوامل الاختبار عوامل اختبار متميزة.

4. طريقة الحماية 1 ، حيث يكون جين خميرة Saccharomyces الداخلي الذي تم تعطيله أو حذفه هو ARO1.

5. الطريقة وفقاً لعنصر الحماية 1 ، حيث يكون الجين الإضافي متماثلًا مع جين خميرة Saccharomyces الذاتية التي تم تعطيلها أو حذفها وهي من الأنواع المعدية للثدييات أو الحشرات أو الطيور أو الأسماك أو النباتات.

6. الطريقة وفقاً لعنصر الحماية 1 ، حيث يكون الجين الإضافي من مسببات الأمراض بدائية النواة.

7. الطريقة وفقاً لعنصر الحماية 1 ، حيث يكون الجين الإضافي من مسببات الأمراض حقيقية النواة.


العمارة التنظيمية للتخليق الحيوي للفينيل بروبانويد

نظرًا للمعلومات المكثفة المتاحة عن جيناته الهيكلية والتنظيمية ، فإن مسار فينيل بروبانويد يعمل كنظام ممتاز لتطوير فهم كيفية التلاعب الجيني بمسارات المنتجات الطبيعية المعقدة في النباتات. ومع ذلك ، ما زلنا نفتقر إلى المعلومات المهمة المتعلقة بنقاط التحكم في التدفق في وداخل مسارات الفروع المختلفة الموضحة في الشكل 1 والتقاطع المحتمل بين المسارات. من المهم أيضًا مدى تنظيم مجموعات التفاعلات في قنوات التمثيل الغذائي أو "الأيضات" ، مما يؤدي إلى عزل المواد الوسيطة من تجمعات العصارة الخلوية المنتشرة (Srere ، 1987). قد تؤثر كل هذه العوامل بقوة على نتيجة محاولات زيادة أو خفض مستوى مركب معين من خلال الأساليب المعدلة وراثيا. تتطلب معالجة هذه الأسئلة مناهج متعددة التخصصات تشمل البيولوجيا الجزيئية والخلوية والهيكلية.

لقد جاء فهمنا للتحكم في التدفق والتحدث المتبادل في التخليق الحيوي للفينيل بروبانويد في المقام الأول من الدراسات التي تم فيها التعبير عن إنزيمات معينة في المسار بشكل مفرط أو تقليل التنظيم في النباتات المحورة جينيا. أظهر مثل هذا النهج أن إنزيم نقطة الدخول PAL يحد بشكل مباشر من معدل إنتاج حمض الكلوروجينيك (CGA ، حمض الكافويل كينيك) في أوراق التبغ ، ولكن هذه العوامل بالإضافة إلى التحكم في تدفق PAL إلى مركبات الفلافونويد واللجنين (Howles) وآخرون. ، 1996). وقد تورط CGA في مقاومة كل من الميكروبات والحشرات (Yao وآخرون. ، 1995) ، على الرغم من أن PAL التي تفرط في التعبير عن النباتات ذات CGA المرتفعة تظهر مقاومة ضعيفة للحيوانات العاشبة للحشرات نتيجة للتداخل بين مسارات إشارة الساليسيلات والجاسمونيت (فيلتون وآخرون., 1999 ).

في درنات البطاطس ، أدى إنشاء حوض اصطناعي للتربتوفان من خلال التعبير الجيني لجين التربتوفان ديكاربوكسيلاز إلى انخفاض برك فينيل ألانين وانخفاض مستويات CGA واللجنين الناجم عن الجروح ، مما أدى إلى زيادة القابلية للإصابة إنفستان فيتوفثورا (ياو وآخرون، 1995). يتم أيضًا تقليل مستويات CGA في التبغ عن طريق التنظيم السفلي لـ C4H ، وهو الإنزيم الثاني في مسار phenylpropanoid ، ويصاحب ذلك تثبيط تغذية مرتدة لنشاط PAL ، ربما نتيجة لتثبيط التغذية المرتدة لتعبير PAL بواسطة السينامات أو بعض مشتقاته (بلونت وآخرون، 2000). في المقابل ، لم ينتج عن الإفراط في التعبير عن C4H باستمرار زيادة مستويات CGA (Blount وآخرون. ، 2000) ، مما يؤكد أن PAL بدلاً من C4H هي نقطة التحكم في التدفق في مسار فينيل بروبانويد في أوراق التبغ.

يحفز إيزوميراز Chalcone (CHI) تفاعلًا محدود الانتشار يمكن أن يحدث أيضًا بشكل تلقائي عند درجة الحموضة الخلوية ، وبالتالي لا يُنظر إليه عمومًا على أنه إنزيم محتمل للحد من المعدل للتخليق الحيوي للفلافونويد. ومع ذلك ، فإن الإفراط في التعبير عن CHI في قشر فاكهة الطماطم يؤدي إلى زيادة 80 ضعفًا في مستويات الفلافونول (Muir وآخرون. ، 2001) ، ويمكن الحصول على زيادات ثلاثة أضعاف في مستويات الفلافونول عن طريق التعبير عن CHI البرسيم في أرابيدوبسيس (CJ Liu و RA Dixon ، نتائج غير منشورة). لذلك يبدو أن CHI هو أحد مكونات التحكم في التدفق في فرع الفلافونويد للتخليق الحيوي للفينيل بروبانويد.

يقدم مسار فينيل بروبانويد بعضًا من أفضل الأمثلة المميزة للقنوات الأيضية في استقلاب النبات. تتضمن القنوات الأيضية التنظيم الفيزيائي للإنزيمات المتتالية في المسار الأيضي إلى مجمعات يتم من خلالها توجيه وسيطة المسار دون انتشار في الجزء الأكبر من العصارة الخلوية (Srere ، 1987). ومع ذلك ، فإن مثل هذه المجمعات فضفاضة ، والعديد من الإنزيمات المعنية قد تكون قابلة للذوبان عمليًا. تسمح المجمعات بالتحكم الفعال في التدفق الأيضي ، وحماية الوسائط غير المستقرة من الانهيار غير المنتج أو الوصول إلى الإنزيمات من المسارات المتنافسة المحتملة. قد تتضمن مثل هذه المجمعات تفاعلات فيزيائية مباشرة بين الإنزيمات المختلفة ، كما هو موضح مؤخرًا لأنزيمات التخليق الحيوي للفلافونويد في أرابيدوبسيس (Winkel-Shirley ، 1999) ، أو قد يكون مرتبطًا بتجميع الإنزيمات على الأغشية أو الأسطح الأخرى (Liu and Dixon ، 2001). في كلتا الحالتين ، يمكن إثبات القناة عن طريق وضع العلامات المزدوجة أو تجارب تخفيف النظائر التي تكون فيها المواد الوسيطة المطبقة خارجيًا هي سلائف أقل كفاءة للمنتجات النهائية من ركائزها الأولية. أكدت هذه المعايير التوجيه بين PAL و C4H عند نقطة الدخول إلى مسار فينيل بروبانويد (شيشي وكيندل ، 1975 هرازدينا وجنسن ، 1992 هرازدينا وفاجنر ، 1985 راسموسن وديكسون ، 1999) ، وبين سينثيز إيسوفلافون (IFS) و IOMT في نقطة الدخول إلى مسار فيتواليكسين إيسوفلافونويد (ليو وديكسون ، 2001). في كلتا الحالتين ، يجب ملاحظة تورط إنزيم السيتوكروم P450 المرتبط بالغشاء (C4H أو IFS) ، والذي قد يعمل على "تثبيت" المركب في الشبكة الإندوبلازمية.

يمكن أن يؤثر التوجيه الأيضي على استجابات دفاع النبات بطريقتين. أولاً ، من الممكن أن يتم توجيه المواد الوسيطة المقدر أن تصبح منتجًا نهائيًا استقلابيًا معينًا ، مثل phytoalexin المشتق من فينيل بروبانويد ، بطريقة تستخدم `` تجمعات '' مختلفة من الإنزيمات الأيضية مقارنة بالمنتجات الأخرى التي قد تشترك في بعض نفس خطوات التخليق الحيوي. يمكن تحقيق ذلك من خلال استخدام أشكال متوازنة مختلفة لأنزيمات المسار المختلفة في مجمعات مختلفة. قد يتنبأ مثل هذا النموذج بأن الجينات المتعددة للعديد من إنزيمات المسار الموصوفة أدناه قد يكون لها وظائف مميزة ومتداخلة ، وهي فرضية لا يزال يتعين اختبارها. إذا كان هذا صحيحًا ، فإن قياس التغييرات في نسخ الجينات ، باستخدام مجسات لا تميز بين جميع الأشكال الممكنة للإنزيم المشفر ، قد يؤدي إلى نتائج لا ترتبط بعملية التمثيل الغذائي للدفاع ، كما لوحظ في دفاعات الفلافونويد / أيزوفلافونويد في البرسيم المصاب بالبكتيريا (صلود وآخرون. ، 1997). ثانيًا ، على الرغم من أن التوجيه الأيضي قد يحسن من كفاءة الدفاعات المستحثة ، إلا أنه يمثل أيضًا حاجزًا محتملاً أمام الهندسة الأيضية الفعالة ، حيث قد لا يمكن الوصول إلى المواد الوسيطة الموجهة إلى منتجات إنزيم الجينات المحورة التي تم إدخالها من أجل تحويل المسار إلى تكوين مركب حيوي جديد.


معلومات الكاتب

ساهم هؤلاء المؤلفون بالتساوي: جين تشيوان هوانغ ، شين فانغ.

الانتماءات

مختبر الولاية الرئيسي لعلم الوراثة الجزيئية النباتية ، مركز CAS للتميز في علوم النباتات الجزيئية ، معهد شنغهاي لفيزيولوجيا النبات والبيئة ، جامعة CAS ، الأكاديمية الصينية للعلوم ، شنغهاي ، الصين

جين تشيوان هوانغ ، وشيو تيان ، وبينغ تشين ، وجيا لينغ لين ، وشياو شيانغ قوه ، وجيان شو لي ، وزين فان ، ووي مينج سونغ ، وفانغ يان تشن ، وروزا آهاتي ، ولينج جيان وانغ ، وأمبير شياو يا تشين

مختبر الدولة الرئيسي للكيمياء النباتية والموارد النباتية في غرب الصين ، معهد كونمينغ لعلم النبات ، الأكاديمية الصينية للعلوم ، كونمينغ ، الصين

كلية علوم وتكنولوجيا الحياة ، جامعة ShanghaiTech ، شنغهاي ، الصين

مختبر شنغهاي الرئيسي للجينوميات والموارد الوظيفية للنبات ، حديقة شنغهاي شينشان النباتية ، مركز أبحاث علوم النبات في شنغهاي شينشان ، الأكاديمية الصينية للعلوم ، شنغهاي ، الصين


1 المقدمة

يعتبر التحلل الأولي للجزيئات العطرية الصغيرة خطوة محورية في التخليق الحيوي للعديد من المنتجات الطبيعية. إن ارتباط سلائف الأيزوبرينويد ، المشتقة من ميفالونات أو مسار فوسفات ميثيل إريثريتول ، مع السلائف العطرية ، المستمدة في الغالب من مسار البوليكيتيد أو الشيكيمات ، قد وفر الأساس لتطور تنوع مثير للإعجاب من المستقلبات الثانوية في البكتيريا والفطريات والنباتات.

في الآونة الأخيرة ، تم اكتشاف فئة جديدة من الإنزيمات التي تحفز عملية التحلل الأولي للمركبات العطرية في بكتيريا التربة Streptomy-cetes إيجابية الجرام والتي تعد منتجة غزيرة للمنتجات الطبيعية الهامة [1]. تشتمل فئة الإنزيم هذه على CloQ و NovQ ، والتي تربط سلسلة جانبية من ثنائي ميثيل الأليل بـ C-3 من 4-هيدروكسيفينيل بيروفات في التخليق الحيوي لمضادات حيوية أمينوكومارين [2] ، و Orf2 من التخليق الحيوي النافتربين ، والذي يربط سلسلة جانبية من الجيرانيل بمركبات فينولية مختلفة [3]. الركيزة الأصلية لـ Orf2 غير معروفة حتى الآن.

أثبتت تحقيقات التصوير البلوري بالأشعة السينية أن إنزيمات هذه الفئة تعرض نوعًا جديدًا من المضاد المتوازي & # x003b2 ، & # x003b1 برميل أضعاف. على النقيض من برميل TIM ، يُظهر البرميل prenyltranferase 10 خيوط مضادة (وليس متوازية) & # x003b2 تشكل برميلًا مركزيًا مملوءًا بالمذيبات يحتوي على مواقع الربط للركائز العطرية والأيزوبرينويد [3،4]. اقترحت دراسات النمذجة أن بروتينًا افتراضيًا سابقًا من Streptomyces coelicolor A3 (2) ، المسمى HypSc ، يشترك في نفس بنية البروتين ، ويمكن بالفعل إثبات نشاط prenyltransferase لهذا البروتين [3]. أعضاء فئة الإنزيم هذه عبارة عن محفزات حيوية أحادية قابلة للذوبان تظهر اختلاطًا غير عادي لركائزها العطرية. لقد تمت الإشارة إلى أن اكتشاف هذه الفئة قد يكون له تأثير كبير على تخليق المركبات العطرية سابقة التأسيس حيث يمكن استخدام هذه الإنزيمات لإنشاء مكتبات من المركبات العطرية سابقة المعالجة لتطوير الأدوية [5،6].

نبلغ هنا عن إنزيم جديد من هذه الفئة ، Fnq26 ، والذي يحفز ج- و ا-برينيلاتيون من ركائز فينولية مختلفة. على عكس Orf2 للتخليق الحيوي naphterpin ، فإن تفاعل Fnq26 مستقل عن أيونات Mg 2+ ، وكأول عضو في هذه الفئة ، Fnq26 قادر على تنفيذ & # x02018 & # x02018reverse & # x02019 & # x02019 prenylation ، أي مرفق C-3 بدلاً من C-1 من geranyl diphosphate إلى الركيزة العطرية. يتوافق مثل هذا الإنزيم العكسي مع الدور المفترض لـ Fnq26 في التخليق الحيوي للفورانونافثوكينون الأول (FNQ I) (الشكل 1) ، وهو منتج طبيعي من أصل مختلط من الأيزوبرينويد / متعدد الكيتيدات من ستربتوميسيس سينامونينسيس DSM 1042 [7].

التخليق الحيوي لـ FNQ I و naphterpin.


قامت SW و XZ بتصميم وتصميم التجارب. أجرى SW تجارب ، وحلل البيانات التجريبية ، وصاغ المخطوطة. ساعد CF و KL و JC في العمل التجريبي وكتابة المخطوطات. ساهم كل من HH و WW في الكواشف & # x00026 من المواد. قام XZ بمراجعة المخطوطة. ساهم جميع المؤلفين في الورقة النهائية.

تم تمويل هذا العمل من قبل المشاريع الوطنية للبحوث العلمية الرئيسية (المنحة رقم 2019YFA09004302) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 31670033).


الملخص

ترتبط الحيوانات المختلفة بكائنات دقيقة تعايشية داخلية معينة تزود المضيف بالعناصر الغذائية الأساسية أو توفر الحماية ضد الأعداء الطبيعية. كشفت التحليلات الجينومية للعديد من التعايش الداخلي الموجود في الحشرات النصفية التي تتغذى على عصارة النبات عن اقتناء مستقل - وبدائل عرضية - للتعايش الداخلي ، بحيث أن العديد من هذه التعايش الداخلي تشمل اثنين أو أكثر من الشركاء الميكروبيين. في هذا الاستعراض ، أناقش كيف أن تقسيم القدرة الجينية لوظيفة التمثيل الغذائي بين المتعايشين الداخليين المختلفين قد حافظ على الوظيفة التغذوية في التعايش الداخلي متعدد الشركاء ، وكيف يمكن تشكيل السمات المظهرية لهؤلاء المتعايشين الداخليين من خلال التفاعلات التطورية المشتركة مع كل من الميكروبات المتزامنة. الأصناف والمضيف ، اللذان يعملان غالبًا على نطاقات زمنية تطورية طويلة.


نتائج ومناقشة

يحتوي مسار حمض شيكيميك الابتنائي على سبع خطوات [معلومات داعمة (SI) مخطط 1] ، والتي يمكن تحفيزها بواسطة سبعة عديد ببتيدات مختلفة أو عن طريق عدد أقل من الببتيدات متعددة الوظائف (22). إن إنزيمات خمس من خطوات التخليق الحيوي متماثلة في جميع الكائنات الحية التي تمتلك المسار. بالنسبة لخطوتين من هذه الخطوات ، هناك نوعان من الإنزيمات المختلفة المعروفة لكل منهما ، وكل كائن حي يعبر عن المسار له مثيل لأحد هذه الإنزيمات. علاوة على ذلك ، هناك اعتباران إضافيان في الكشف عن الجينات التي تشفر إنزيمات مسار حمض الشيكيميك في N. vectensis: (أنا) سيكون الأصل التطوري للجينات غير مؤكد بحيث قد تكون التسلسلات قد تباعدت بشكل كبير عن أي تسلسلات مقارنة مستخدمة و (ثانيا) قد يحتوي التسلسل الجيني على إنترونات.

للحصول على أكبر حساسية للاستجواب ، تم استخدام مجموعة برامج HMMER (23) للبحث عن تسلسل البروتين المتوافق باستخدام ملفات تعريف نموذج ماركوف المخفية. توفر هذه الطريقة وزناً أكبر للمخلفات المحفوظة التطورية ، وتكشف الملامح المحلية عن شظايا البروتين في exons المشفرة. تسلسل الجينوم N. vectensis تمت ترجمته في جميع إطارات القراءة الستة وبحثها باستخدام تسعة ملفات تعريف تغطي جميع الإنزيمات السبعة لمسار حمض الشيكيميك الذي تم الحصول عليه من قاعدة بيانات Pfam (24). تم العثور على محاذاة اثنين ("يضرب") في سقالات كبيرة باستخدام HMMER باستخدام أرو و aroB ملفات شخصية (SI Dataset 1). ال أرو حدث إصابة في scaffold_33 (1.4 ميجا بايت في الثانية). عندما تم استخدام تسلسل البروتين المتوقع لبحث BLAST ، فإنه يتماشى مع مورا منتج جيني لمجموعة متنوعة من البكتيريا مع هوية الأحماض الأمينية ≈40٪. هذا الجين البكتيري يشفر UDP-ن- أسيتيل جلوكوزامين 1-كاربوكسي فينيل ترانسفيراز (SI Dataset 2) ، وهو إنزيم متعلق بـ أرو (3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase) ، بينما يشارك إنزيم MurA في التخليق الحيوي لجدار خلية الببتيدوغليكان. اقترح هذا الاكتشاف في البداية أن التسلسل المحاذي قد ينشأ من التلوث الجرثومي. ومع ذلك ، أظهر الفحص الدقيق لنتائج HMMER أن البروتين المتوقع يفتقر إلى 20 من الأحماض الأمينية المحفوظة في الطرف C ، وأن تسلسل الأحماض الأمينية المفقودة كان يقع عند ≈1 كيلو بايت في اتجاه مجرى النهر في السقالة. كشفت المقارنة المرئية للتسلسل الجيني مع تسلسل الإجماع لإنترونات الفقاريات عن مواقع لصق معقولة (AGGTRA و AGG ، على التوالي) من شأنها أن تنتج ترميز mRNA بطول كامل. مورا متجانسة لها تناسب وثيق مع ملف البحث الشخصي. وبالتالي فإن وجود الإنترونات يلغي مسألة الملوثات البكتيرية أو المتعايشات كمصدر قريب لهذا الجين.

سقالة 1.4 ميجا بايت تحتوي على ملف أروتمت ترجمة -like homolog في جميع إطارات القراءة الستة وتم مسحها ضوئيًا باستخدام HMMER مع مكتبة Pfam بأكملها. أظهرت هذه العملية وجود مجموعة متنوعة من المجالات حقيقية النواة النموذجية بما في ذلك النسخ العكسي ، و EGF ، ومجال EGF المرتبط بالكالسيوم ، والببتيد الشبيه بالديفينسين ، والأكتين ، ومجال الرأس الشوكة ، مما يدعم مرة أخرى فكرة أن أرو-مثل متماثل موجود في N. vectensis الجينوم نفسه. تم استخدام تسلسل البروتين المتوقع لبناء شجرة النشوء والتطور للمقارنة مع أقرب التسلسلات البكتيرية الموجودة في بحث بلاست ومع Tenacibaculum ص. MED152 و الإشريكية القولونية W3110 (الشكل 1). ال أرومثل تسلسل N. vectensis لم يتجمع مع متماثلات من أي مجموعة من البكتيريا التي تم اختبارها ، ولكنه أظهر تباعدًا في التسلسل من التسلسل البكتيري يمكن مقارنته مع تلك الموجودة في مورا الجينات بين المجموعات البكتيرية المختلفة. سواء كان هذا الجين في N. vectensis يوجه التخليق الحيوي لوسطاء مسار الببتيدوغليكان أو الشيكيمات غير معروف حتى الآن.

شجرة النشوء والتطور توضح علاقة تسلسل البروتين المتوقع لـ N. vectensis aroAمثل الجين المتوقع مورا تسلسل البروتين لأفضل سبع نتائج في تحليل بلاست وتلك الموجودة في بكتريا قولونية و Tenacibaculum. تم حساب المسافات من محاذاة CLUSTAL W باستخدام مصفوفة Jones-Taylor-Thornton ، وتم إنشاء الشجرة باستخدام خوارزمية ربط الجوار في برامج حزمة PHYLIP (الإصدار 3.63). المسافة هي نسبة بدائل الأحماض الأمينية.

المحاذاة الثانية المتعلقة aroB، كان حاضرًا على سقالة -85 (0.8 ميجا بايت في الثانية). عندما تم استخدام تسلسل البروتين المتوقع لبحث BLAST (SI Dataset 3) ، كان أقرب تطابق مع دينوفلاجيلات أوكسيريره مارينا (66٪ هوية تسلسل الأحماض الأمينية). في هذا الدينوفلاجيلات ، فإن aroB إنزيم (3-dehydroquinate synthase) موجود في البلاستيدات الخضراء ويندمج في ا- ميثيل ترانسفيراز (25). عندما تسلسل بروتين الانصهار الكامل من يا مارينا تم استخدامه في بحث بلاست ضد الحمض النووي المترجم لـ N. vectensis، كان من الواضح أن جين بروتين الاندماج كان موجودًا أيضًا في N. vectensis (SI Dataset 4). يحتوي هذا الجين على خمسة إنترونات. عندما aroB تم استخدام جزء من الجين لبناء شجرة النشوء والتطور مع أقرب ضربات بلاست (الشكل 2) ، N. vectensis ظهر التسلسل باعتباره الأقرب إلى تلك الخاصة بسوطين دينوفلاجيليين (يا مارينا و Heterocapsa Triquetra) أن كل منها يمتلك جين الاندماج الكامل. مرة أخرى ، يمكن أن يشارك هذا الجين في تخليق السلائف التي تؤدي إلى مستقلبات ثانوية مشتقة من مسار shikimate ، وأبرزها 3-dehydroquinate ، نقطة التفرع الوسيطة المفترضة للتخليق الحيوي MAA (5).

شجرة النشوء والتطور توضح علاقة تسلسل البروتين المستنتج لـ aroB جزء من AroB-ا- بروتين ميثيل ترانسفيراز N. vectensis لبروتينات دينوفلاجيلات متماثلة. تمت محاذاة التسلسلات مع CLUSTALW وتم إنشاء الشجرة باستخدام خوارزمية ربط الجوار بمسافات مشتقة من نموذج Jones-Taylor-Thornton (باستخدام PHYLIP الإصدار 3.63). تم تجذير الشجرة باستخدام أنابينا فريبليس كمجموعة خارجية. المسافات هي نسبة بدائل الأحماض الأمينية ، ويتم عرض قيم التمهيد بناءً على 100 عينة.

نظرًا لأن الدينوفلاجيلات التكافلي الداخلي غالبًا ما ترتبط مع الكائنات المجوفة ، فقد كان لابد من اعتبار أن هناك دينوفلاجيلات غير مكتشف يلوث N. vectensis تسلسل. تسلسل البروتين المتوقع المشتق من الجينات المجاورة على جانبي aroBتم استخدام متماثل (ترميز بروتين شبيه بـ RuvB وسينثاز مالات محتمل (MS) ، على التوالي] في عمليات البحث بلاست. كانت المحاذاة الأقرب مع الفقاريات المختلفة وتسلسلات من قنفذ البحر Strongylocentrotus بوربوراتوس، مما يجعل من غير المحتمل أن تكون جينات المسار الشيكيات هذه في جينوم ميتازوان المضيف ناتجة عن تلوث بجينوم دينوفلاجيلات مرتبط (SI Dataset 5). بالإضافة إلى ذلك ، هناك ثلاثة متواليات بروتينية مفترضة [β-tubulin ، وبروتين الصدمة الحرارية 90 (HSP-90) ، ومستضد نواة الخلية المتكاثرة (PCNA)] من يا مارينا تم استخدامها لعمليات البحث بلاست ضد N. vectensis. تم استخدام أفضل النتائج لبناء شجرة النشوء والتطور ، ولم يكن N. vectensis و يا مارينا متواليات وثيقة الصلة (الشكل 3). ومع ذلك ، يجب التأكيد على أن الأدلة الإضافية ضرورية لتحديد الوظيفة المفترضة لهذه الجينات ولإثبات اكتسابها عن طريق نقل الجينات الأفقي (HGT) في N. vectensis، لا سيما لأن الكائنات المجوفة يحافظون على الجينات التي ورثوها من أسلاف غير ميتازون (26). على الرغم من أن أهمية HGT في تطور حقيقيات النوى لا تزال مثيرة للجدل ، إلا أن هناك دليلًا مستقلًا على حدوث حدث HGT آخر في N. vectensis. كشف الفحص الجينومي المقارن لأنزيمات دورة الجليوكسيلات عن احتمال نقل لياز إيزوسيترات ثنائي الوظيفة (ICL) ومرض التصلب العصبي المتعدد ، المشفر بواسطة جين ICL-MS مدمج من سلائف بكتيرية ، إلى N. vectensis الجينوم (27). النتائج التي توصلنا إليها مماثلة لتلك التي توصلنا إليها من قبل الآخرين الذين أبلغوا عن دليل على نقل الجينات إلى cnidarian المياه العذبة (العدار) أنواع من شركاء حقيقيين النواة أسلاف متعددين (18 ، 28).

شجرة النشوء والتطور لتسلسلات بروتين PCNA. تسلسل بروتين PCNA لـ يا مارينا تم استخدامه لإجراء بحث بلاست مقابل التسلسلات الجينومية المترجمة لـ N. vectensis. تم استخدام محاذاة BLAST لتجميع تسلسل البروتين من N. vectensis. تم استخدام التسلسلات من النوعين في عمليات البحث بلاست لـ GenBank ، وتم استخدام مجموعة مختارة من أفضل النتائج لكل نوع لإنشاء شجرة النشوء والتطور باستخدام خوارزمية الانضمام إلى الجوار في برامج حزمة PHYLIP (الإصدار 3.63). المسافة هي نسبة بدائل النوكليوتيدات.

التعدين الجينومي لدينا من N. vectensis كشفت مفاجأة أخرى تتجاوز نقل الجينات من بكتيريا ودينوفلاجيل إلى جينوم الكائنات الحية الدقيقة. وجدنا سبع محاذاة تسلسل جيدة تقابل خمسة جينات محتملة لمسار حمض الشيكيميك. من بين هذه كانت أربعة محاذاة قوية جدا تتوافق مع الجينات أرو, aroB, aroC، و أرو من بكتريا قولونية (SI Dataset 6). تم استخدام تسلسل البروتين المتوقع لهذه الجينات في استعلامات بحث BLAST (29) ضد قاعدة بيانات GenBank للمركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI) للكشف عن التسلسلات ذات الصلة. في جميع الحالات الأربع ، كانت أفضل المطابقات هي جينات مسار حمض الشيكيميك في Flavobacteria ، التي تحتوي على ≈70٪ هوية حمض أميني (SI Dataset 7). في معظم الحالات Tenacibaculum ص. MED152 ، الذي يتم ترتيب تسلسل الجينوم الخاص به (www.moore.org/marine-micro.aspx) ، كان أفضل تطابق ، على الرغم من أن التشابه الصارم قد يتأثر بانحياز قاعدة البيانات لهذه البكتيريا. الجين الخامس في N. vectensis يتوافق مع aroF-H جينات بكتريا قولونية، الذي يشفر نظائر الإنزيمات لـ 3-deoxy- d -arabinoheptulosonate-7-phosphate synthase (DAHPS). ومع ذلك ، أظهرت عمليات البحث بلاست أن أفضل النتائج (90٪ هوية الأحماض الأمينية) هي kdsa هذه الجينات من Flavobacteria ترمز الإنزيمات المتشابهة الأخرى من عائلة DAHPS التي تشارك في تخليق عديدات السكاريد الدهنية.

التشابه الكبير بين N. vectensis يمكن تفسير تسلسل الجينات إلى تلك الموجودة في مسار shikimate البكتيري إما عن طريق حدث HGT حديث أو تلوث الحمض النووي البكتيري في N. vectensis تسلسل الجينوم. كان استخدام الكودون مشابهًا لـ Tenacibaculum بدلا من N. vectensis. تم تحديد تسلسلين يبدو أنهما شظايا مهمة من جينات الرنا الريباسي 16S البكتيرية. تسلسل واحد من 16S rRNA (985 bp SI Dataset 8أ ) أظهر تشابهًا أقرب إلى الزائفة التسلسلات. ومع ذلك ، لأنها لا تنتمي إلى سقالة تحتوي على متواليات بكتيرية أخرى ولم يكن هناك غيرها الزائفة- مثل التسلسلات الجينومية المكتشفة ، فمن المحتمل أنها مشتقة من ملوث متسلسل. نظرًا لأن بيانات تسلسل البندقية الأصلية لم تكن متاحة لنا ، لم نتمكن من تحليل N. vectensis الجينوم باستخدام إصدار تم إصداره مؤخرًا من أداة التعليقات التوضيحية الجينية Glimmer (http://cbcb.umd.edu/software/glimmer المرجع. 30) ، والتي كانت ستكون طريقة مفيدة لتحديد النسبة المئوية للهولوغينوم المشفر على سقالات صغيرة ومن المحتمل ، بالتالي ، أن تكون من بكتيريا حية.

ينتمي تسلسل الرنا الريباسي 16S الآخر إلى سقالة ، والتي تحتوي أيضًا على متواليات 23S rRNA في ترتيب نموذجي لأوبونات الرنا الريباسي (720 نقطة أساس SI Dataset 8).ب ) ، وأظهرت شجرة النشوء والتطور لجزء الرنا الريباسي 16S (الشكل 4) أنها جاءت من فلافوباكتيريوم ، ولكن لا يمكن تخصيصها لجنس معروف. كما تم إنشاء أشجار النشوء والتطور من أجل أرو, aroB, aroC، و أرو متواليات ، مع نتائج مماثلة. كان هناك اعتبار آخر هو أن الكثير من جينوم N. vectensis تم تنظيمها في سقالات كبيرة ، في حين أن شظايا الرنا الريباسي 16S هذه كانت موجودة في سقالات صغيرة تم من خلالها تسلسل contigs القصير ، بحيث تم الكشف عن التسلسلات الجينية غير المكتملة فقط. أعطت هذه النتيجة أول إشارة إلى أن شظايا الرنا الريباسي 16S قد تكون ناتجة عن تلوث جرثومي وليس من الحمض النووي الجيني لـ N. vectensis بالمعنى الدقيق للكلمة. ال Tenacibaculum حدد مشروع الجينوم معظم جيناته ، واستخدمت 2679 تسلسلًا بروتينيًا متوقعًا من التعليق التوضيحي الجينومي لإجراء بحث بلاست مقابل الترجمة. N. vectensis الحمض النووي. عند استخدام قيمة متوقعة صارمة تبلغ & lt10 30 ، تم استخدام 509 من Tenacibaculum تسلسل (19٪) أعطت نتائج إيجابية. ومع ذلك ، فإن القطع الأقل صرامة (10 10) أعطى 1،563 (58٪) نتيجة. في العديد من هذه الحالات ، ارتبطت القيم المرتفعة المتوقعة بالتسلسلات الجزئية ، حيث كانت النتائج في سقالات أصغر ذات كونتينات صغيرة مع العديد من القواعد في السقالات التي لم يتم تحديدها. في الواقع، فإن أرو و kdsa كانت الجينات في نهايات contigs بحيث تم اقتطاع تسلسلها وتفتقر إلى آخر 40 أو 25 aa ، على التوالي. على الرغم من التلوث العرضي للأصل N. vectensis لا يمكن استبعاد القالب ، والاحتمال المثير هو أن التسلسلات تأتي من زميل غير متوقع سابقًا للبكتيريا المفلطحة Tenacibaculum.

شجرة النشوء والتطور تظهر العلاقة بين تسلسل الجين 16S rRNA الموجود في N. vectensis تسلسل الجينوم (جزء 720 نقطة أساس في الإدخال c429301624.Contig1 من StellaBase ، http://evodevo.bu.edu/stellabase SI Dataset 8أ ) إلى تسلسل أقرب سلالات النوع في مشروع قاعدة بيانات الريبوسوم الثاني (الإصدار 9.52 http://rdp.cme.msu.edu). تم حساب المسافات من محاذاة CLUSTAL W باستخدام نموذج F84 ، وتم إنشاء الشجرة كما في الشكل 3.

هناك دعم مستقل لادعاءنا بأن التسلسلات السابقة في الجينوم المنشور لها N. vectensis قد تأتي من البكتيريا المرتبطة بمراحل النمو المبكرة لشقائق النعمان. مؤلفو ذكرت Nematostella vectensis الجينوم (20) ، في مادتهم الداعمة عبر الإنترنت (الملحق S2 في www.sciencemag.org/cgi/content/full/317/5834/86/DC1) ، ذكروا صراحة أنهم أعدوا الحمض النووي الجيني من اليرقات لتجنب التلوث من قبل اليرقات. المتعايشات أو المتعايشين التي تم الإبلاغ عنها للبالغين ، على الرغم من أنهم لم يشروا إلى البيان الأخير فيما يتعلق بمثل هؤلاء الشركاء. Despite this precaution, there are separate findings that DNA isolates from embryos and early planula larvae of this sea anemone contain 16S rRNA sequences obtained from PCR amplicons attributed to bacteria, including those of the same groups (Flavobacteria and الزائفة) that we report here (H. Marlow and M. Q. Martindale, personal communication).

Bacterial associates of cnidarians have been known for at least 30 years (e.g., refs. 31 and 32), and most recently they have been visualized microscopically as epibionts and endosymbionts in two species of freshwater العدار (33) and as envelope-wrapped aggregates in caverns between ectodermal cells of the nominally nonsymbiotic sea anemone Metridium senile (34). Such an intimate association with metazoan cells lacking an external physical barrier lends itself to direct host–microbe interactions manifested variously as pathogenicity in corals (35), the development of the immune response in Cnidaria (33), and a close symbiotic integration culminating in HGT from bacteria to host cnidarian as demonstrated here. Virtually nothing is known of the biosynthetic or other metabolic function of bacteria symbiotic with cnidarian hosts, a topic that, like so many others in modern marine microbiology, warrants investigation.

HGT between bacteria and certain metazoans (ecdysozoans, including insects and nematodes) was recently demonstrated by Baldo وآخرون. (36) to be more widespread than suspected. They noted that bacterial sequences have been regarded previously as contamination and systematically excluded by eukaryotic genome sequencing projects, possibly masking the importance of such transfer in diverse invertebrates. Earlier, the genome sequence of the bacterial endosymbiont كارسونيلا رودي found in aphids was made public (37, 38). Comparison of this genome sequence with that of another bacterial endosymbiont of aphids, Buchnera aphidicola, showed that both genomes had undergone considerable deletion, including loss of some genes encoding essential metabolic pathways. One such missing pathway leading to the formation of the aromatic amino acid tryptophan in C. ruddii caught our attention. According to dogma (10), precursors for this essential amino acid should be synthesized via the shikimic acid pathway in the commensal bacteria. Again, we searched global sequence alignments for genes encoding enzymes of the shikimic acid pathway in these bacterial genomes. We found one gene encoding a putative 5-اينولpyruvylshikimate-3-phosphate phospholyase in C. ruddii (although whether this gene would transcribe a functional product is debatable owing to the large number of stop codons in the sequence), and only three (those encoding shikimate 5-dehydrogenase, 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate phospholyase, and 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase) of the seven genes for the pathway were apparent in the B. aphidicola genome (SI Dataset 9). Taken together with our findings for the putative Tenacibaculum-like symbiont and its host N. vectensis, this evidence strongly suggests that the loss of essential metabolic function in the endosymbiont is an ongoing process of gene transfer and deletion in the evolution of symbioses that could ultimately lead to extinction of the symbiont by progressive assimilation of its genetic material into the host genome (37, 38).

The elucidation of “shared metabolic adaptations,” where the production of essential metabolites involves input by the partners of a symbiosis (even if one is degenerate), will require further genomic dissection of the unique organization and molecular functioning of invertebrate-microbial symbioses. This is highlighted by our finding that two of the genes for enzymes of the shikimic pathway, classically said to be absent from “animals,” are encoded in the metazoan host's genome. The extent to which such HGT, or the involvement of unsuspected bacterial consorts, may account for the apparent metabolic anomalies in cnidarians described in the Introduction, warrants further investigation. Understanding these processes may additionally provide critical insight into the cause of metabolic dysfunction evoked by climate change and environmental stress, particularly in the fragile symbioses of tropical corals and other marine cnidarians.


شاهد الفيديو: خلال عام انجاز تاريخي في جراحات مجري البول (قد 2022).