معلومة

ما هي آلية ربط كود هيستون مع التضفير البديل؟

ما هي آلية ربط كود هيستون مع التضفير البديل؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

هناك بعض الاعتبارات المعلوماتية الحيوية التي تظهر أن هناك ارتباطًا مهمًا للبعض بين كود هيستون والتضفير البديل ؛ لكن ما هي الفرضية حول الآليات الأساسية؟ هل هناك أي رؤية تجريبية في المشكلة؟


وفقًا للأدب ، يبدو أن علامات هيستون تؤثر على التضفير بشكل مباشر وغير مباشر.

يبدو أن التنظيم غير المباشر يرجع إلى عائق فيزيائي حيوي ، حيث يتسبب هيكل كروماتين معين في تباطؤ Pol-II ، مما يسمح لآلة الربط بأداء وظيفتها.

يبدو أن التنظيم المباشر يعتمد بشكل أساسي على H3K36me3 و H3K4me1 ، العلامات التي تم التعرف عليها بواسطة MRG15 ، والتي بدورها تقوم بتجنيد بروتين ربط المسالك بولي بيريميدين منظم الربط لمواقع لصق.

المرجع: Luco، R.F et al. تنظيم التضفير البديل عن طريق تعديلات هيستون. العلوم 4 فبراير 2010


العلم الحديث يدحض نظرية التطور

استنادًا إلى معاملات ارتباط بيرسون ، تم استنتاج العلاقات العرضية لتعديلات الهيستون في عملية تضفير الحمض النووي الريبي من خلال بناء شبكات بايز الخاصة بهم. تشير النتائج إلى أن إدراج أو استبعاد exons يتأثر بالأنماط التوافقية لتعديلات هيستون. تساهم بعض تعديلات هيستون بشكل مباشر في ربط الحمض النووي الريبي (على سبيل المثال ، H3K36me3 و H3K79me1) ، بينما تساهم تعديلات هيستون الأخرى بشكل غير مباشر في تضفير الحمض النووي الريبي.

تتفق النتيجة التي يمكن أن تؤثر على H3K36me3 و H3K79me1 في ربط الحمض النووي الريبي مع الدراسات السابقة التي أظهرت أن H3K36me3 و H3K79me1 يتم إثرائهما في exons المضمنة. يمكن لـ H3K36me3 تنظيم التضفير البديل من خلال التفاعل مع بروتين ربط المسالك بوليبيريميدين (PTB). من خلال التفاعل مع مجال Tudor لـ TP53BP1 ، تم الإبلاغ أيضًا عن تفاعل H3K79me1 مع الذي يتفاعل مع snRNP.

من خلال استرخاء بنية الكروماتين ، تم الإبلاغ أيضًا عن أسيتيل H3 و H4 لتنظيم إدراج أو استبعاد تخطي exon. إلى جانب تعديلات هيستون الموجودة في مناطق exon ، يمكن أن تؤثر تعديلات هيستون الموجودة في المناطق داخل الجين أيضًا على تضفير الحمض النووي الريبي من خلال تنظيم معدلات استطالة RNAPII ، أو عن طريق الارتباط المباشر بعوامل الربط وبالتالي التوسط في ارتباطها بـ pre-mRNA. "

تعليقي: كود هيستون هو قاعدة بيانات معقدة قادرة على تخزين المعلومات اللاجينية التي تؤثر بشدة على نسخ الحمض النووي ، وربط ما قبل الرنا المرسال وتعديلات ما بعد النسخ من الرنا المرسال. من الواضح أن كود هيستون ينظم خصائص الكائن الحي. باستخدام الواسمات اللاجينية هيستون تكون الخلايا قادرة على تحويل المعلومات الرقمية (علامة) إلى معلومات تمثيلية. رمز هيستون هو إشارة إلى الكود الذكي للحياة والمعلومات البيولوجية المعقدة التي صممها منشئنا. يتم الاحتفاظ برمز هيستون بواسطة الكتاب والقراء والمحايات التي تشير إلى التصميم الذكي. ومع ذلك ، لا توجد آلية للتطور ، لأن الآليات اللاجينية تنظم فقط المعلومات البيولوجية الموجودة مسبقًا. لا تضيع.


يكشف التعلم العميق للشفرة الوراثية (epi) عن آلية مرشح جديدة تربط تعديلات الهيستون بقرار مصير ESC

التضفير البديل (AS) هو معالجة ما قبل mRNA خاضعة للتنظيم وراثيًا وجينيًا لزيادة تنوع الترنسكربيتوم والبروتين. إن فك تشفير هذه الآليات التنظيمية بشكل شامل يبشر بالخير في الحصول على رؤى أعمق في مجموعة متنوعة من السياقات البيولوجية التي تنطوي على AS ، مثل التنمية والأمراض. قمنا بتجميع الشفرة الوراثية للربط (epi) ، DeepCode ، لتمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) من خلال دمج الميزات غير المتجانسة للتسلسلات الجينية ، و 16 تعديلًا للهيستون مع شبكة عصبية عميقة متعددة التسميات. مع مزايا الميزات اللاجينية ، يعمل DeepCode بشكل كبير على تحسين الأداء في التنبؤ بأنماط الربط وتغيراتها أثناء تمايز hESC. وفي الوقت نفسه ، يكشف DeepCode تفوق السمات اللاجينومية وأدوارها المهيمنة في فك أنماط AS ، مما يبرز ضرورة تضمين الخصائص اللاجينية عند تجميع كود ربط أكثر شمولاً. علاوة على ذلك ، يتيح DeepCode التنبؤات القوية عبر سلالات الخلايا ومجموعات البيانات. على وجه الخصوص ، حددنا حدثًا مفترضًا منظمًا لـ H3K36me3 يؤدي إلى اضمحلال mRNA بوساطة هراء لـ BARD1. ينتج عن تعبير BARD1 المنخفض توهين أنشطة إشارات ATM / ATR وزيادة تمايز hESC. تشير هذه النتائج إلى آلية مرشح جديدة تربط تعديلات هيستون بقرار مصير hESC. بالإضافة إلى ذلك ، عند التدريب في سياقات مختلفة ، يمكن توسيع DeepCode ليشمل مجموعة متنوعة من المجالات البيولوجية والطبية الحيوية.

© المؤلف (المؤلفون) 2017. تم النشر بواسطة مطبعة جامعة أكسفورد بالنيابة عن أبحاث الأحماض النووية.

الأرقام

عرض تخطيطي لـ DeepCode. (...

عرض تخطيطي لـ DeepCode. ( أ ) تم دمج العديد من البيانات عالية الإنتاجية من أجل ...

يعمل DeepCode على تحسين الأداء في ...

يعمل DeepCode على تحسين الأداء في أنماط فك التشفير. ( أ ) ميزات Epigenomic ...

يكشف DeepCode عن جوانب مختلفة من ...

يكشف DeepCode عن جوانب مختلفة من مساهمات السمات الجينية (epi). ( أ )…

أهم الميزات و DeepCode ...

أهم الميزات وتجميع DeepCode. ( أ ) الأداء التنبئي لـ ...

يظهر DeepCode المُجمَّع ارتفاعًا ...

يُظهر DeepCode المُجمَّع ارتباطات عالية مع الكود الجيني للربط المُجمَّع مسبقًا ...

يسمح DeepCode بالتنبؤ بـ ...

يسمح DeepCode بالتنبؤ بأنماط AS عبر الأنساب ومجموعات البيانات التطورية. (...

بدلا من ذلك تقسم BARD1 على ...

يتم تقسيم BARD1 بدلاً من ذلك على تمايز hESCs وربط H3K36me3 بمصير الخلية ...


خيارات الوصول

احصل على الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

جميع الأسعار أسعار صافي.
سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

جميع الأسعار أسعار صافي.


نقاش

يلعب AS دورًا مهمًا أثناء نمو الأنسجة وتمايز الخلايا (2 ، 38). تكشف الدراسات السابقة عن العديد من الآليات التنظيمية لـ AS ، بما في ذلك التعبير عن عوامل الربط واستهدافها وإثراء hPTMs (38). في هذه الدراسة ، سعينا إلى إجراء تحقيق شامل في الملاحظات السابقة للعلاقة بين hPTMs و AS أثناء تطور الأنسجة من خلال دمج بيانات ChIP-seq و RNA-seq من سبعة أنسجة جنينية مختلفة للماوس في ست نقاط زمنية تنموية. حددنا فئتين مختلفتين من exons لـ AS (تم تخطيه): exons المتخطى المرتبط بالتنمية وتخطي exons المرتبط باختيار الشكل الإسوي. وجدت التحليلات الوجودية أن الجينات من هاتين الفئتين يتم إثرائها في وظائف مختلفة. كان من المرجح أن يتم إثراء جينات AS المرتبطة بفئة الكسب / الخسارة التنموية في الدماغ الأمامي في الفئات الوظيفية ذات الصلة بالخلايا العصبية ، مثل إسقاط الخلايا العصبية ، وكثافة ما بعد المشبكي والهيكل الخلوي. يتوافق هذا مع تحليل الأنطولوجيا الجينية السابق لإكسونات التقسيم التفاضلي في تطوير القشرة الدماغية ، والتي تُظهر أن جينات الهيكل الخلوي موجودة بشكل مفرط في الفئران والبشر (41). من ناحية أخرى ، فإن جينات AS التي تنتمي إلى فئة عالية / منخفضة منتقاة هي تمثيل زائد في فئات وجودية متميزة مهمة للحفاظ على وظيفة الخلية أو هوية الأنسجة ، مثل دورة الخلية ونقل البروتين وربط الحمض النووي الريبي.

أظهرت النماذج الحسابية التي تم إنشاؤها استنادًا إلى إشارة ChIP-seq في المناطق المحيطة بالإكسونات التي تم تخطيها أن hPTMs مرتبطة بفئتي exon الذي تم تخطيه. تمشيا مع الدراسات السابقة ، وجدنا أن H3K36me3 أكثر تنبؤية لمجموعات exon التي تم تخطيها (37 ، 41). على وجه التحديد ، كان تخصيب H3K36me3 في المنطقة المحيطة 5 موقع لصق في اتجاه مجرى النهر وموقع لصق 3 أعلى المنبع من exon الذي تم تخطيه كان المؤشر الأفضل في جميع الأنسجة. كانت هذه النتيجة صحيحة أيضًا عندما قمنا بتصنيف الإكسونات حسب مستوى التعبير الجيني. في حين تباينت مساهمات hPTMs حسب فئة التعبير الجيني ، كان H3K36me3 دائمًا أفضل الميزات التنبؤية في جميع الأنسجة والنقاط الزمنية (الشكل 5 ، الشكل التكميلي S68 – S71). تم الإبلاغ عن هذه النتيجة مسبقًا في أنظمة أخرى. أولاً ، يُظهر التحليل الحسابي للإكسونات التي تم تخطيها استنادًا إلى 3 خطوط خلوية بشرية أن إثراء H3K36me3 في exon وفي اتجاه موقع لصق 3 يرتبط ارتباطًا وثيقًا بتضمين exon الذي تم تخطيه (43). ثانيًا ، وجد تحليل exons البشري و C. elegans أن H3K36me3 أكثر إثراءً عند نهاية 5 ′ من exons (47). أخيرًا ، يكشف تحليلنا السابق لنواة الفأر المتكئة أن H3K36me3 لديه أكبر إثراء في الأشكال الإسوية البديلة بالنسبة إلى hPTMs الأخرى (48). نهجنا هو تحسين على الأساليب السابقة على أساس التجميع (49) من خلال تحديد الارتباطات العالمية بين hPTMs و exon splicing ومساهماتهم. جنبًا إلى جنب مع النتائج التي توصلنا إليها ، تشير هذه التقارير السابقة إلى تنظيمية واحدة محتملة يساهم فيها إثراء H3K36me3 في اختيار exon البديل في AS.

باستخدام نموذج الغابة العشوائية التكراري ، حددنا أيضًا التفاعلات بين العديد من hPTMs المرتبطة باختيار exon الذي تم تخطيه. كان التفاعل بين H3K36me3 و H3K4me1 في المناطق المرافقة لـ exon هو الميزة الأولى في كل من الكسب / الخسارة التنموية والمجموعة المختارة عالية / منخفضة الشكل. أشارت التفاعلات الأخرى ، مثل H3K27me3 و H3K36me3 و H3K27ac و H3K36me3 و H3K36me3 و H3K9me3 ، إلى أن hPTMs التنبؤية الأضعف نسبيًا قد تكون وظيفية فقط عندما تتحد مع تلك التنبؤية العالية. مفهوم تفاعل hPTM ليس جديدًا. وجدت العديد من الدراسات التأثير التوافقي لتعديلات الهيستون وارتباطها بنسخ الجينات والتمايز. على سبيل المثال هان وآخرون. علاقات تفاعل تعديل هيستون deciphers على exons على أساس شبكة Bayesian (23). ومن المثير للاهتمام ، وجدنا العديد من التفاعلات التي تحدث بين المناطق المحيطة المختلفة لتعديلات الهيستون المتشابهة أو المختلفة ، مثل التفاعلات بين H3K36me3 5 ′ upstream و H3K36me3 3 upstream وبين H3K36me3 5 downstream و H3K4me1 3 upstream. تشير هذه النتائج إلى أن hPTMs الموجودة في مواقع مختلفة في المنطقة المحيطة بإكسون قد تساهم بشكل مختلف في تخطي اختيار exon. يتماشى هذا مع نتيجة دراسة سابقة وجدت أن hPTMs مرتبطة بتخطي إدراج exon عبر أنماط محددة على طول المنطقة المرافقة لتلك exons (25). على وجه الخصوص ، يُظهر H3K36me3 ارتباطًا مهمًا بين المنبع والمصب للمناطق المرافقة exon لمعدل إدراج exon ، وهو ما يتسق مع النتائج التي توصلنا إليها.

علاوة على ذلك ، لاحظنا حدوث بعض hPTMs في العديد من exons المتخلفة الموجودة في الأنسجة التنموية العصبية من دراسة سابقة (38) ، مما يشير إلى وجود اتصال ميكانيكي محتمل بين تلك التعديلات وتطور الأنسجة مدفوعًا بـ AS (الجدول الإضافي S4). تحليل RNA-seq من Zhang وآخرون. يظهر أن exonN مدرج في القشرة المخية والمخيخ ولكنه مستبعد من الأنسجة غير العصبية. هذا يتوافق مع اكتشافنا أن مستوى تضمين FLNA exonN يزداد بشكل كبير في الدماغ الأمامي خلال وقت النمو ، ولكن ليس في الكبد والقلب والأطراف. ومن المثير للاهتمام ، أن إحدى الدراسات السابقة وجدت أن الطفرات التي تعطل موقع ربط بروتين بوليبيريميدين (PTBP1) لربط FLNA exonN في خلية السلف العصبية تسبب تشوهًا خاصًا بالدماغ في الإنسان ، مما يشير إلى الدور التنظيمي المحتمل بين PTBP1 وإدراج exonN (41). في هذه الدراسة ، لاحظنا أن إشارة H3K36me3 في المناطق المحيطة كانت مرتبطة بشكل كبير بإدراج FLNA exonN في الدماغ الأمامي (الشكل 7 أ ، ب) ، مما يشير إلى وجود صلة بين تعديلات هيستون وعوامل لصق وإدراج إكسون (الشكل 7 ج). تم تعزيز هذه الفكرة من خلال النتائج السابقة من Luco وآخرون.، أن H3K36me3 يمكن أن يتفاعل مباشرة مع مكونات spliceosome لتنظيم تعبير exon البديل في خطوط الخلايا البشرية (50). أخيرًا ، حدد تحليل إثراء الحافز في المناطق المحيطة بإكسونات الكسب / الفقد التنموي الزخارف التي تم تمثيلها بشكل مفرط في exons المقسمة بدلاً من ذلك بين الأنسجة المختلفة ، بما في ذلك PTBP1 في الأنسجة المرتبطة بالدماغ ، مما يشير إلى الارتباط المحتمل بين hPTM وأشكال الربط في تنظيم exon البديل المقسم (الشكل التكميلي S72).

اتصال ميكانيكي محتمل بين تعديلات هيستون وتطور الأنسجة. (أ) يُظهر عرض مستعرض الجينوم إثراء H3K36me3 وإدراج exonN في الدماغ الأمامي والقلب والكبد والأطراف. (ب) كان مستوى إدراج exonN في جين FLNA مرتبطًا بشكل كبير بتخصيب H3K36me3. (ج) رسم تخطيطي يصور آلية محتملة ينظم من خلالها H3K36me3 إدراج exonN. يمكن لـ H3K36me3 تجنيد عامل الربط PTBP1 ، والذي سيزيد من قمع إدراج exonN.

اتصال ميكانيكي محتمل بين تعديلات هيستون وتطور الأنسجة. (أ) يُظهر عرض مستعرض الجينوم إثراء H3K36me3 وإدراج exonN في الدماغ الأمامي والقلب والكبد والأطراف. (ب) ارتبط مستوى إدراج exonN في جين FLNA ارتباطًا كبيرًا بتخصيب H3K36me3. (ج) رسم تخطيطي يصور آلية محتملة ينظم بواسطتها H3K36me3 إدراج exonN. يمكن لـ H3K36me3 تجنيد عامل الربط PTBP1 ، والذي سيزيد من قمع إدراج exonN.

في السنوات الأخيرة ، تم أيضًا تطبيق نماذج التعلم العميق في تحديد العوامل اللاجينية المرتبطة بالربط البديل والتعبير الجيني (51 ، 52). تعد طرق التعلم العميق مفيدة بشكل خاص مع عدد كبير من الميزات والأمثلة ، ويمكن أن تساعد التقنيات التي تستخدم الاضطراب أو الانتشار العكسي (التراجع) (53) في تفسير النموذج. قد تستحوذ الأساليب القائمة على القلق بشكل أفضل على مساحة المدخلات التي يمكن أن تغير المخرجات ولكنها باهظة التكلفة من الناحية الحسابية ، في حين أن الطرق القائمة على الانتشار الخلفي فعالة ولكن من المحتمل أن تكون محدودة في قدرتها على تحديد مجموعة كاملة من الميزات المتعلقة بالمخرجات (53). باختصار ، تعد هذه الطرق منبئات قوية ولكنها قد لا تكون أكثر الطرق ملاءمة عندما يكون الهدف هو فهم سبب ارتباط أحد المدخلات بالمخرجات. هنا ، كان لدينا عدد قليل نسبيًا من الميزات ، لذلك قمنا بدراسة الارتباط بين hPTM والربط مع الانحدار اللوجستي ونماذج الغابة العشوائية التكرارية ، والتي تتماشى مع أهدافنا العلمية. يمكن أن تستفيد الدراسات المستقبلية ، خاصة تلك التي تركز بشكل أساسي على بناء نماذج تنبؤية من ميزات مستوى التسلسل الخام ، من التعلم العميق.

على الرغم من أن نموذجنا حدد الروابط المحتملة بين hPTM و exon splicing ، إلا أنه لا يزال به بعض القيود. أولاً ، بدون معلومات الإدخال ، يمكن أن يتأثر عدد قراءة ChIP ليس فقط بإثراء hPTM في بيانات ChIP-seq ، ولكن أيضًا بالعوامل الأخرى مثل سياق GC وإمكانية الوصول إلى الكروماتين في المنطقة. ومع ذلك ، فقد أشارت دراسات أخرى إلى أن تصحيح التأثير باستخدام إدخال ChIP-seq والإشغال النووي له تأثير ضئيل على النتيجة الأصلية ولا تزال النتائج الرئيسية قائمة (54). بالإضافة إلى ذلك ، في الوقت الحالي ، نركز على إثراء hPTM في المنطقة المحيطة بـ exon ، وهي تلك المنطقة التي من المرجح أن تكون ذات صلة في نموذج التوظيف المباشر. ومع ذلك ، فإن التخصيب hPTM أبعد من exons ، في المروج ، من exons مختلفة أو عبر الجين ، من المحتمل أن يساهم في التضفير أيضًا. ستدرج التحليلات الإضافية هذه الارتباطات البعيدة ، مما يتطلب معلمات إضافية للتحكم في الضوضاء وعدم اليقين المقدمين في النموذج. بشكل عام ، أجرينا تحليلًا شاملاً للتحقيق في أحداث الربط البديلة التي تتم بوساطة الكروماتين أثناء نمو الأنسجة. باستخدام النماذج الحسابية ، وجدنا أن تعديلات هيستون المحددة ، H3K36me3 و H3K4me1 ، لها أقوى الارتباطات في تخطي اختيار exon بين جميع الأنسجة ونقاط التطور الزمنية التي تم فحصها. حددنا أيضًا تفاعلات اثنين أو أكثر من hPTMs التي تتنبأ بشدة بـ AS. على سبيل المثال ، كان التفاعل بين H3K36me3 و H3K4me1 في المنطقة المرافقة لـ exon هو الميزة الأولى في كلتا فئتي exon التي تم تخطيها. زادت هذه النتائج من تعقيد تعريف تنظيم AS ، والذي سيوفر مزيدًا من الدراسات التجريبية حول الأهمية الوظيفية لهذه التعديلات للربط البديل.


النتائج

يُظهر متغير التضفير لـ mUHRF1 التعريب الفرعي النووي المتغير والتجنيد في H3K9me3

أبلغت الدراسات السابقة عن نتائج متضاربة فيما يتعلق بآليات توظيف UHRF1 للكروماتين ومتطلبات مجالات UHRF1 المختلفة لمثيلة صيانة الحمض النووي. على سبيل المثال ، في حين تظهر العديد من الدراسات أن كلا من مجالات TTD الوظيفية و / أو PHD مطلوبة لربط الكروماتين ، والتوطين النووي البؤري ، ووظيفة مثيلة صيانة الحمض النووي للإنسان والفأر UHRF1 (7 ، 28 ، 30) ، لا يزال الأمر قيد المناقشة أي ليجند كروماتين متورط بالفعل في توظيف UHRF1: H3K9me2 / 3 أو TOP2A أو LIG1 أو غيرها (7 ، 8 ، 31 ، 58). علاوة على ذلك ، تشير النتائج التي تم الحصول عليها من دراسات أخرى إلى أن مجال SRA و DNA hemimethylated هما المحددان الأساسيان لتوطين الكروماتين UHRF1 ومثيلة صيانة الحمض النووي (12 ، 20 ، 59-61). أشار تقرير آخر إلى أن ربط الحمض النووي من خلال مجال SRA مهم لتوطين الكروماتين ، لكن قدرته على التعرف على الحمض النووي نصف الميثيل على وجه التحديد ليست كذلك (22). وجدت دراستان حديثتان أن TTD الوظيفي ليس مطلوبًا لصيانة مثيلة الحمض النووي في الفئران (61) أو الخلايا السرطانية البشرية (62). قد تكون هذه النتائج المتضاربة ناتجة جزئيًا عن الفئران UHRF1 (mUHRF1) والبروتينات البشرية UHRF1 (hUHRF1) التي تعتبر قابلة للتبادل وتتم دراستها في أنظمة خلايا مختلفة حيث لم تكن الأنواع متطابقة دائمًا (7 ، 12 ، 20 ، 28 ، 30 ، 31 ، 59). اكتشفنا أنه في الماوس ، يؤدي الربط البديل لـ exon 8 إلى ظهور نوعين مختلفين من mUHRF1 يختلفان فقط في منطقة mLinker 2 بين مجالات قارئ تعديل هيستون mTTD و mPHD. وفقًا لتسميات NCBI ، نشير إلى mUHRF1 V1 باعتباره المتغير الذي ، على حد علمنا ، تم استخدامه في جميع الدراسات السابقة. يحتوي mLinker 2 V1 على تسعة أحماض أمينية في مركزه مقارنة بالمتغير 2 (V2). على النقيض من ذلك ، يشبه mLinker 2 V2 إلى حد كبير hLinker 2 (الشكل 1 أ).

في حالة عدم وجود أجسام مضادة يمكنها التمييز بين بروتيني mUHRF1 ، قمنا بتحليل بيانات RNA-seq من مراحل نمو مختلفة للفأر بالإضافة إلى أنسجة بالغة مختلفة (فئران عمرها 8 أسابيع) لتحديد التعبير عن أربعة أنواع من الرنا المرسال المطابقة لمتغيري البروتين. يتم التعبير عن كلا المتغيرين في صورة اثنين من mRNA يختلف كل منهما في 5′UTR (mUHRF1 V1: Uhrf1–201 and -204، mUHRF1 V2: Uhrf1–202 and 203).وجدنا أن mUHRF1 V1 هو الشكل الإسوي المعبر عنه في الغالب ، سواء أثناء التطور الجنيني أو في الأنسجة البالغة (الشكل التكميلي S1). كما هو متوقع من دوره في الحفاظ على مثيلة الحمض النووي ، فإن تعبير mUHRF1 يكون أعلى في الأنسجة ذات الخلايا المنقسمة بشكل فعال وسريع: الأمعاء ، وأجزاء الجهاز المناعي (الغدة الصعترية ، ونخاع العظام ، والطحال) ، وكذلك الغدد التناسلية والأعضاء التناسلية (الغدة الثديية ، المشيمة). المعدة والاثني عشر هما العضوان الوحيدان اللذان يظهران تعبيرًا أعلى عن mUHRF1 V2 مقارنةً بـ V1. تظهر الخلايا المتمايزة نهائيًا (المخ ، وخلايا العضلات ، والكلى ، والكبد) مستويات منخفضة من الرنا المرسال إلى غير قابلة للاكتشاف لكل من متغيرات mUHRF1. بشكل ثابت ، تعبر جميع الأنسجة الجنينية المبكرة (E11.5 ، E14) عن مستويات عالية من mUHRF1 ، والتي تقل مع نضج الجنين وأعضائه (E14 ، E14.5 ، E18) (الشكل التكميلي S1).

نظرًا للاختلافات الملحوظة في ملامح تعبيرات متغيرات الربط mUHRF1 ، فقد اعتقدنا أنها قد تكون لها خصائص بيولوجية مميزة. قمنا أولاً بتحليل التوطين شبه النووي لمتغيرين UHRF1 الفئران والبروتين البشري ، بافتراض أن هذا قد يكشف عن وظائف متباينة. لقد عبرنا بشكل عابر عن hUHRF1 أو mUHRF1 V1 أو V2 أو LacI الموسومة بـ mCherry في خطوط خلايا بشرية وفأرية مختلفة. تم فحص التوطين المشترك للبروتينات التي تحمل علامات mCherry مع مناطق كثيفة DAPI و H3K9me3 في نواة هذه الخلايا باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر والتحليل اللاحق عبر مخططات كثافة فيجي (الشكل 1 ب ، الشكل التكميلي S2A). لاستبعاد تأثيرات التعبير المختلف على الاختلافات الملحوظة في التوزيع دون النووي ، قمنا بالتحقق من تركيزات البروتين المماثلة على مستوى مجموعات ثقافة الخلية عن طريق النشاف الغربي (الشكل التكميلي S2B) وفي الخلايا الفردية باستخدام تحليل التدفق الخلوي (الشكلان التكميليان S3 و S4). بغض النظر عن الاختلافات في كفاءة تعداء ومستويات التعبير العالمي للبروتينات الثلاثة في أنظمة الخلايا المختلفة ، وجدنا نمطًا قابلًا للتكرار في جميع خطوط الخلايا التي تم فحصها (الشكل 1 ب ، ج). في الساركوما العظمية U2OS البشرية ، وسرطان الثدي MCF7 البشري ، والغدة الثديية للفأر C127 والفأر NIH-3T3 ، أظهر جزء أصغر بكثير توطين مشترك لـ mCherry-hUHRF1 (13٪ ، 34٪ ، 19٪ و 13٪ ، على التوالي) و mCherry -mUHRF1 V2 (10٪ ، 21٪ ، 23٪ و 17٪ على التوالي) مع H3K9me3 بالمقارنة مع mCherry-mUHRF1 V1 (35٪ ، 71٪ ، 53٪ و 36٪ على التوالي). بناءً على هذه الملاحظات ، خلصنا إلى أن ارتباط الكروماتين لبروتيني UHRF1 الفأري والبشري الفردي متميز.

اقترحت الدراسات السابقة أن TTD و PHD المتصلين (وحدة TTD-PHD) ينظمان التوطين شبه النووي ونشاط UHRF1 في كل مكان. ومع ذلك ، لا تزال أهمية مجال TTD في استهداف الكروماتين لـ UHRF1 قيد المناقشة (7 ، 59 ، 61 ، 62). نظرًا لأننا وجدنا اختلافات كبيرة في التوطين دون النووي فيما يتعلق بـ H3K9me3 ، فقد قمنا بتحور القفص العطري في مجال mTTD (mTTD *: Y184A / Y187A) والإفراط في التعبير عن EGFP-mUHRF1 V1 و V2 WT و TTD * في خلايا C127 و NIH-3T3 ( الشكل 1 د ، الشكل التكميلي S5A). باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر ، قمنا بتحليل التوطين المشترك لـ EGFP مع H3K9me3 ووجدنا أن طفرة mTTD أدت إلى انخفاض التعريب المشترك لـ mUHRF1 V1 مع H3K9me3 إلى مستوى mUHRF1 V2 (الشكل 1E ، الشكل التكميلي S5B). عرض mUHRF1 V2 TTD * تعريبًا مشتركًا أقل مع H3K9me3 في كلا خطي الخلايا. أشارت هذه النتائج إلى أن مجال mTTD الوظيفي ضروري لتوطين mUHRF1 تحت النواة.

يعتمد التعرف على H3K9me3 على متغيرات mUHRF1 على السلوك المتميز للـ mTTD

لاكتساب مزيد من الأفكار حول الآلية الكامنة وراء الاختلافات الوظيفية بين mUHRF1 V1 و V2 و hUHRF1 ، أجرينا تجارب هيستون الببتيد المنسدلة باستخدام محللات الخلية من الخلايا المعبرة عن mCherry-mUHRF1 V1 و V2 و -hUHRF1 (U2OS و MCF7). قارنا استعادة بروتينات UHRF1 على ثلاثة ببتيدات معدلة بشكل مختلف تقابل المخلفات 1-20 من ذيل H3. استنادًا إلى ملاحظات أخرى (6 ، 7 ، 9 ، 61 ، 63-66) وملاحظاتنا السابقة (28) ، قمنا بترشيد أن الببتيد H3 غير المعدل يسترد فقط التفاعل المعتمد على PHD ، H3K9me3 يرتبط بـ TTD و PHD إما بشكل مستقل أو ثنائي التكافؤ مع أو بدون التآزر ، و H3R2me2sK9me3 يعيق ، ولكنه لا يمنع ارتباطًا كاملًا بـ PHD ، مع السماح بالتعرف على الببتيد المعتمد على المثيلة المعتمد على TTD. وجدنا hUHRF1 و mUHRF1 V1 مخصبين بشكل تفضيلي على الببتيد H3K9me3. في المقابل ، أظهر mUHRF1 V2 تفضيلًا أقل لهذا الببتيد على H3 غير المعدل و H3R2me2sK9me3 (الشكل 2 أ ، ب).

يعتمد التعرف على H3K9me3 على توفر TTD. (أ) تجربة تمثيلية منسدلة هيستون الببتيد باستخدام مقتطفات من mCherry-hUHRF1 أو -mUHRF1 معربًا عن خلايا U2OS و MCF7. تم تحليل المواد المسترجعة على الببتيدات المعطلة بواسطة لطخة غربية. يعمل HP1β كعنصر تحكم في ملف حسن النية بروتين رابط H3K9me3. (ب) التحديد الكمي لإشارات اللطخة الغربية المضادة لـ mCherry المقابلة للتجارب الموضحة في (أ) بالنسبة للببتيد المعطّل. يتم تقديم البيانات على أنها تعني و sd. من تجربتين (H3R2me2sK9me3) أو ثلاث (H3 غير معدل ، H3K9me3) تجارب مستقلة. (ج) تم تحليل سلسلة معايرة من ببتيدات H3 مختلفة مع بروتينات UHRF1 مؤتلفة ومُعَلمة بشكل فلوري بواسطة الرحلان الحراري المجهري. يتم رسم البيانات كمتوسط ​​لثلاثة أشرطة خطأ تجارب مستقلة تتوافق مع sd. (د) تعرضت بروتينات UHRF1 المؤتلفة لمقايسات E3 ubiquitin ligase باستخدام المؤتلف غير المعدل أو H3K9me3 mononucleosomes. تم تحليل ردود الفعل عن طريق النشاف الغربي (أعلى). تظهر إشارات UHRF1 وبروتينات هيستون على غشاء اللطخة الغربية الملطخة لعناصر تحكم التحميل (أسفل). يشار إلى المواضع الجارية لعلامات الوزن الجزيئي (على اليسار) والبروتينات المحددة المختلفة (على اليمين). (ه) القياس الكمي لإشارات اللطخة الغربية المضادة لـ FLAG التي تم الحصول عليها من أجل فحوصات التواجد في كل مكان كما هو موضح في (D). تم قياس القيم المطلقة باستخدام ImageJ وتطبيعها مع إشارة H3unmod nucleosome. يتم تقديم البيانات على أنها تعني و sd. من أربع تجارب (mUHRF1 V1 ، hUHRF1) واثنتان (mUHRF1 V2) مستقلتان. تلاميذ ر- تم إجراء اختبار (غير مزدوج ، ثنائي الذيل) لمقارنة العينات (**) ص & lt 0.01 ، (***) ص & lt 0.001.

يعتمد التعرف على H3K9me3 على توفر TTD. (أ) تجربة تمثيلية منسدلة هيستون الببتيد باستخدام مقتطفات من mCherry-hUHRF1 أو -mUHRF1 معربًا عن خلايا U2OS و MCF7. تم تحليل المواد المسترجعة على الببتيدات المعطلة بواسطة لطخة غربية. يعمل HP1β كعنصر تحكم في ملف حسن النية بروتين رابط H3K9me3. (ب) التحديد الكمي لإشارات اللطخة الغربية المضادة لـ mCherry المقابلة للتجارب الموضحة في (أ) بالنسبة للببتيد المعطّل. يتم تقديم البيانات على أنها تعني و sd. من تجربتين (H3R2me2sK9me3) أو ثلاث (H3 غير معدل ، H3K9me3) تجارب مستقلة. (ج) تم تحليل سلسلة معايرة من ببتيدات H3 مختلفة مع بروتينات UHRF1 مؤتلفة ومُعَلمة بشكل فلوري بواسطة الرحلان الحراري المجهري. يتم رسم البيانات كمتوسط ​​لثلاثة أشرطة خطأ تجارب مستقلة تتوافق مع sd. (د) تعرضت بروتينات UHRF1 المؤتلفة لمقايسات E3 ubiquitin ligase باستخدام المؤتلف غير المعدل أو H3K9me3 mononucleosomes. تم تحليل ردود الفعل عن طريق النشاف الغربي (أعلى). تظهر إشارات UHRF1 وبروتينات هيستون على غشاء اللطخة الغربية الملطخة لعناصر تحكم التحميل (أسفل). يشار إلى المواضع الجارية لعلامات الوزن الجزيئي (على اليسار) والبروتينات المحددة المختلفة (على اليمين). (ه) القياس الكمي لإشارات اللطخة الغربية المضادة لـ FLAG التي تم الحصول عليها من أجل فحوصات التواجد في كل مكان كما هو موضح في (D). تم قياس القيم المطلقة باستخدام ImageJ وتطبيعها مع إشارة H3unmod nucleosome. يتم تقديم البيانات على أنها تعني و sd. من أربع تجارب (mUHRF1 V1 ، hUHRF1) واثنتان (mUHRF1 V2) مستقلتان. تلاميذ ر- تم إجراء اختبار (غير مزدوج ، ثنائي الذيل) لمقارنة العينات (**) ص & lt 0.01 ، (***) ص & lt 0.001.

لقد أظهرنا سابقًا أن hUHRF1 موجود في حالات ربط H3K9me3 مختلفة في أنظمة أصلية (أي محللة الخلية) مقابل الأنظمة المؤتلفة (28). لتقييم ما إذا كانت توجد اختلافات مماثلة لمتغيرات الفئران ، قمنا بمقارنة سلوك ربط الببتيد للبروتينات المؤتلفة في تجارب الرحلان الحراري المجهري الكمي (MST). على عكس hUHRF1 ، أظهرت بروتينات mUHRF1 V1 و V2 المؤتلفة نمط ربط ببتيد مماثل عند مقارنتها بالبروتينات الخلوية. أظهر Mouse V1 تفضيل ربط كبير لـ H3K9me3 على النظير غير المعدل (الشكل 2C) مما يشير إلى التعرف بواسطة mTTD (انظر الجدول التكميلي S1 للحصول على قائمة بجميع كد القيم المقاسة في هذه الدراسة). علاوة على ذلك ، أظهر ارتباطًا مخفضًا بمقدار 20 ضعفًا لببتيد H3R2me2sK9me3 مما يشير إلى أن mUHRF1 V1 يؤسس وضع ربط ثنائي التكافؤ وتآزري حيث يتفاعل كل من مجالات mTTD و mPHD مع الهدف. في المقابل ، لم يكن لدى mUHRF1 V2 تفضيل ملزم لـ H3K9me3 على الببتيد غير المعدل. كما أظهر انخفاضًا أقل بكثير في التفاعل مع H3R2me2sK9me3 مقارنة بالببتيد H3K9me3 (الشكل 2C). هذا يشير إلى أن مجالات mTTD و mPHD تعمل بشكل مستقل عن بعضها البعض في mUHRF1 V2. في هذه الاختبارات ، لم يُظهر hUHRF1 أي تفضيل كبير لعلامة H3K9me3 على تقارب غير معدل و 10 أضعاف أضعف إلى الببتيد المعدل بشكل مضاعف (H3R2me2sK9me3) مقارنة بـ H3K9me3 ، مما يؤكد وضع ربط يسيطر عليه hPHD.

تم تأكيد أنماط الربط المتميزة للبروتينات المؤتلفة الثلاثة في نظام فحص مستقل باستخدام ببتيدات H3 الفلورية المسمى N و C (استقطاب التألق ، الشكل التكميلي FP S6A). بالإضافة إلى ذلك ، قارنا نشاط E3 ligase من الفئران و UHRF1 البشري في في المختبر مقايسة الانتشار الشامل باستخدام ركائز جسيمية تحتوي إما غير معدلة أو K9me3 H3. كان mUHRF1 V1 أكثر نشاطًا في انتشار H3 في كل مكان في سياق النيوكليوسومات غير المعدلة مقارنةً بـ V2 و hUHRF1 (الشكل 2D). تم تحسين هذا النشاط لـ V1 بشكل أكبر على نيوكليوسومات H3K9me3 ، بينما لم يُظهر V2 و hUHRF1 مثل هذا التحفيز (الشكل 2D ، E). بشكل عام ، تشير النتائج التي توصلنا إليها من تجارب الربط مع البروتينات الخلوية المؤتلفة وكذلك اختبار الانتشار الشامل إلى أنه نظرًا للحالات الوظيفية المختلفة لمجالات TTD ، فإن البروتينات المتغيرة mUHRF1 V1 و V2 تختلف عن بعضها البعض ، وكذلك عن hUHRF1 فيما يتعلق بالتعرف على H3K9me3.

تحدد الآليات الجزيئية المختلفة الحالة الوظيفية لـ TTD في الفئران و UHRF1 البشري

في hUHRF1 ، تنظم المنطقة متعددة القواعد (hPBR) من hLinker 4 الحالة الوظيفية لـ hTTD عن طريق منع أخدود السطح المرتبط بالببتيد (28 ، 67). كشفت مقارنة التسلسل عن حفظ رقعة أساسية في PBR لبروتينات UHRF1 البشرية والفئران (الشكل التكميلي S6B). قارنا ربط H3K9me3 بنطاقات mTTD و hTTD في غياب ووجود ببتيدات PBR المقابلة. أظهرت TTDs المعزولة من كلا النوعين ارتباطًا مشابهًا لببتيد H3K9me3 (الشكل 3 أ ، الشكل التكميلي S6C). كما هو موضح سابقًا ، منع hPBR ربط hTTD بـ H3K9me3. في المقابل ، لم يكن لـ mPBR أي تأثير على تفاعل mTTD / H3K9me3 (الشكل 3 أ ، الشكل التكميلي S6D).

لا يتم تنظيم mTTD بواسطة mLinker 4 / mPBR. (أ) تم تحليل سلسلة معايرة من mTTD المؤتلف و hTTD مع ببتيد FAM-H3 (1-15) K9me3 مع وبدون فائض مضاعف من الببتيدات المتوافقة مع mPBR أو hPBR بواسطة الاستقطاب الفلوري. يتم رسم البيانات كمتوسط ​​لثلاثة أشرطة خطأ تجارب مستقلة تتوافق مع sd. (ب) تم تجميد بروتينات mPBR-RING و hPBR-RING المؤتلفة على خرز مغناطيسي واحتضانها باستخدام mTTD-PHD V1 أو V2 أو hTTD-PHD. تم تحليل مدخلات البروتين والمواد المسترجعة بواسطة لطخة غربية. يشار إلى المواضع الجارية لعلامات الوزن الجزيئي (على اليسار) والبروتينات المحددة المختلفة (على اليمين). (ج) تم تحليل سلسلة المعايرة من PI5P باستخدام mLinker 4 أو hLinker 4 المسمى الفلوريسنتلي أو hLinker 4 بواسطة الرحلان الحراري المجهري. يتم رسم البيانات كمتوسط ​​لثلاثة أشرطة خطأ تجارب مستقلة تتوافق مع sd. (د) ثوابت التفكك (كد) لربط الببتيد H3K9me3 في غياب ووجود فائض 100 ضعف من 16: 0 PI5P على بروتينات الفئران المؤتلفة والبروتينات UHRF1 البشرية على النحو الذي تحدده الرحلان الحراري المجهري. تمثل النتائج متوسطات ثلاثة أشرطة خطأ تجارب مستقلة على الأقل تتوافق مع sd.

لا يتم تنظيم mTTD بواسطة mLinker 4 / mPBR. (أ) تم تحليل سلسلة معايرة من mTTD المؤتلف و hTTD مع ببتيد FAM-H3 (1-15) K9me3 مع وبدون فائض مضاعف من الببتيدات المتوافقة مع mPBR أو hPBR بواسطة الاستقطاب الفلوري. يتم رسم البيانات كمتوسط ​​لثلاثة أشرطة خطأ تجارب مستقلة تتوافق مع sd. (ب) تم تجميد بروتينات mPBR-RING و hPBR-RING المؤتلفة على خرز مغناطيسي واحتضانها باستخدام mTTD-PHD V1 أو V2 أو hTTD-PHD. تم تحليل مدخلات البروتين والمواد المسترجعة بواسطة لطخة غربية. يشار إلى المواضع الجارية لعلامات الوزن الجزيئي (على اليسار) والبروتينات المحددة المختلفة (على اليمين). (ج) تم تحليل سلسلة المعايرة من PI5P باستخدام mLinker 4 أو hLinker 4 المسمى الفلوريسنتلي أو hLinker 4 بواسطة الرحلان الحراري المجهري. يتم رسم البيانات كمتوسط ​​لثلاثة أشرطة خطأ تجارب مستقلة تتوافق مع sd. (د) ثوابت التفكك (كد) لربط الببتيد H3K9me3 في غياب ووجود فائض 100 ضعف من 16: 0 PI5P على بروتينات الفئران المؤتلفة والبروتينات UHRF1 البشرية على النحو الذي تحدده الرحلان الحراري المجهري. تمثل النتائج متوسطات ثلاثة أشرطة خطأ تجارب مستقلة على الأقل تتوافق مع sd.

لتقييم التفاعل المباشر بين TTD-PHDs والمناطق الطرفية C لبروتينات UHRF1 المختلفة ، أجرينا تجارب الترسيب المناعي. وجدنا أنه بغض النظر عن أوجه التشابه في التسلسل ، فإن التفاعل القوي بين PBR-RING مع TTD-PHD موجود فقط في hUHRF1 ولكن ليس في mUHRF1 V1 و V2 (الشكل 3 ب). تتوافق هذه النتائج مع بقايا R649 البشرية ، والتي ثبت أنها تشغل الجيب R في أخدود سطح hTTD (67) ، ولا يتم حفظها في تسلسل mPBR (الشكل التكميلي S6B).

لقد أظهرنا من قبل أن فوسفاتيديلينوسيتول 5-فوسفات (PI5P) يحرر hTTD من خلال التفاعل مع hPBR. يمكّن هذا H3K9me3 من التعرف على hUHRF1 (28). لاختبار ما إذا كانت آلية تنظيمية مماثلة موجودة في mUHRF1 V1 و V2 ، قمنا بقياس ارتباط PI5P بـ Linker 4 المحتوي على PBR للبروتينات المختلفة باستخدام MST. hLinker 4 منضم PI5P مع ملف كد 1.4 ميكرومتر (الشكل 3 ج). أدت إضافة PI5P إلى تحسين ربط H3K9me3 بشكل كبير لـ hUHRF1 ، مما يشير إلى إلغاء حظر hTTD المصاحب للتآزر مع وحدة hTTD-PHD (الشكل ثلاثي الأبعاد). مقارنةً بالبروتين البشري ، أظهر mLinker 4 تقاربًا ضعيفًا فقط مع PI5P (كد & GT 80 ميكرومتر ، الشكل 3C). أيضًا ، لم يكن للفوسفوليبيد أي تأثير على التعرف على علامة H3K9me3 بواسطة mUHRF1 V1 و V2 (الشكل ثلاثي الأبعاد). علاوة على ذلك وعلى النقيض من hUHRF1 (22 ، 60) ، وجدنا ارتباط ببتيد H3 لـ mUHRF1 ليس (V1) أو بشكل معتدل (V2) يتأثر بالحمض النووي الميثيل (لا تظهر البيانات). استنادًا إلى هذه النتائج ، خلصنا إلى أن التعرف على علامة H3K9me3 المستند إلى TTD في متغيرات mUHRF1 تم إنشاؤه بشكل مختلف مقارنةً بـ hUHRF1.

الربط البديل لـ mLinker 2 كتل ربط mTTD H3K9me3 في mUHRF1 V1

نظرًا لأن متغيرين mUHRF1 يختلفان فقط عن بعضهما البعض في إدخال تسعة أحماض أمينية في mLinker 2 (الشكل 1 أ) ، يجب أن يكون هذا هو سبب سلوك ربط ذيل H3 المختلف. لتحديد تأثير mLinker 2 على تفاعل mTTD و mPHD مع ببتيدات H3 ، قمنا بإعداد قياسات FP الكمية باستخدام C- أو N- فلوروفور نهائي (FAM) - المسمى ببتيدات H3 غير المعدلة / K9 ثلاثي الميثيل. بينما يسمح ببتيد H3 المسمى C (H3unmod / K9me3-FAM) بربط كل من PHD و TTD (اعتمادًا على حالة المثيلة الثلاثية K9) ، فإن الببتيد H3K9me3 المسمى N (FAM-H3K9me3) يتيح المراقبة ملزم المعتمد على TTD بشكل مستقل عن مساهمة الدكتوراه (7 ، 28). نظرًا لأن mLinker 4 لا يشارك في تنظيم الحالة الوظيفية لـ mTTD ، فقد ركزنا على وحدة mTTD-PHD المعزولة للتحقيق في سلوكيات ربط H3K9me3 المختلفة لـ mUHRF1 V1 و V2. كما هو متوقع ، ربط mTTD-PHD V1 الببتيدات المسمى طرفية C مع تفضيل H3K9me3 على غير معدل (كدق عند 4.9 و 14.3 ميكرومتر ، على التوالي). في المقابل ، ربط mTTD-PHD V2 كلا الببتيدات المسمى طرفية C مع تقارب مماثل (الشكل 4 أ). بينما تفاعل mTTD-PHD V2 و hTTD-PHD مع الببتيد FAM-H3K9me3 المسمى N بقوة مماثلة (كدs عند 12.3 و 16.2 ميكرومتر ، على التوالي) ، أظهر mTTD-PHD V1 ارتباطًا ضعيفًا جدًا فقط (كد & GT 300 ميكرومتر ، الشكل 4 ب). على ما يبدو ، فإن الإدراج في mLinker 2 V1 كافٍ لمنع ربط H3K9me3 المعتمد على mTTD المعزول / المستقل عن mPHD.

الربط البديل لـ mLinker 2 كتل ربط mTTD H3K9me3 في mUHRF1 V1. (أ) تم تحليل سلسلة المعايرة لببتيدات mTTD-PHD V1 المؤتلف (يسار) و mTTD-PHD V2 (يمين) مع H3 (1-15) غير معدل- FAM أو H3 (1-15) K9me3-FAM ببتيدات استقطاب مضان. يتم رسم البيانات كمتوسط ​​لثلاثة أشرطة خطأ تجارب مستقلة تتوافق مع sd. (ب) تجارب ربط الاستقطاب الفلوري كما في (أ) للبروتينات المؤتلفة المشار إليها مع ببتيد FAM-H3 (1-15) K9me3. (ج) تجارب ربط الاستقطاب الفلوري كما في (أ) من mTTD-PHD V1 TTD * مع H3 (1-15) غير معدل- FAM ، H3 (1-15) K9me3-FAM أو FAM-H3 (1-15) K9me3 الببتيدات.

الربط البديل لـ mLinker 2 كتل ربط mTTD H3K9me3 في mUHRF1 V1. (أ) تم تحليل سلسلة المعايرة لببتيدات mTTD-PHD V1 المؤتلف (يسار) و mTTD-PHD V2 (يمين) مع H3 (1-15) غير معدل- FAM أو H3 (1-15) K9me3-FAM ببتيدات استقطاب مضان. يتم رسم البيانات كمتوسط ​​لثلاثة أشرطة خطأ تجارب مستقلة تتوافق مع sd. (ب) تجارب ربط الاستقطاب الفلوري كما في (أ) للبروتينات المؤتلفة المشار إليها مع ببتيد FAM-H3 (1-15) K9me3. (ج) تجارب ربط الاستقطاب الفلوري كما في (أ) من mTTD-PHD V1 TTD * مع H3 (1-15) غير معدل- FAM ، H3 (1-15) K9me3-FAM أو FAM-H3 (1-15) K9me3 الببتيدات.

لاختبار ذلك بشكل أكبر ، أدخلنا إدخال الأحماض الأمينية التسعة لـ mLinker 2 V1 في وحدة hTTD-PHD (hTTD-PHD ، mLinker2 V1 *). مقارنةً بالنوع البري hTTD-PHD ، أظهر البروتين الهجين انخفاضًا كبيرًا في ارتباط الببتيد FAM-H3K9me3 (كد & GT 100 ميكرومتر ، الشكل 4 ب). في المقابل ، لم يتأثر التفاعل مع ببتيدات H3 التي تحمل علامة C (الشكل التكميلي S7A ، B).

للتحقق من أن mTTD الوظيفي متورط في ربط الببتيد mTTD-PHD V1 المرصود ، قمنا بتحليل متحولة من قفصه العطري (Y184A / Y187A). كما هو متوقع ، فشل mTTD-PHD V1 TTD * في إظهار ارتباط أقوى مع H3K9me3-FAM عبر H3unmod-FAM.أيضًا ، فقد التفاعل المنخفض مع الببتيد FAM-H3K9me3 الذي لا يمكنه ربط mPHD تمامًا (الشكل 4C). بشكل جماعي ، اقترحت هذه النتائج أن إدخال mLinker 2 في mUHRF1 V1 يمنع التعرف المستقل على mPHD لببتيد H3K9me3 بواسطة mTTD ولكن في نفس الوقت يتم إعداد حالة مطابقة لوحدة mTTD-PHD التي تسمح بالربط التآزري مع الببتيد H3K9me3 .

تعرض وحدات mTTD-PHD V1 و V2 ترتيبات مجال مختلفة وسلوكيات ديناميكية

للحصول على مزيد من الأفكار حول الترتيبات المطابقة المختلفة لوحدات mTTD-PHD V1 و V2 المستمدة من في المختبر تجارب الربط ، شرعنا في إجراء دراسات هيكلية باستخدام تشتت الأشعة السينية بزاوية صغيرة (SAXS) والتحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي. لاحظنا سابقًا أن وحدة hTTD-PHD المعزولة لها حركة ديناميكية جوهرية بوساطة hLinker 2 المرنة وتفاعلها العابر مع أخدود سطح hTTD وجيب R (68). اعتمادًا على التقاط بقايا R296 من hLinker 2 في الجيب R ، تمت ملاحظة وضع ربط ببتيد H3 تآزري (R296 مرتبط بجيب R) أو مستقل (R296 مجاني) (7 ، 65 ، 68) .

بالنظر إلى الاختلافات الرئيسية في تسلسل وطول Linker 2 في بروتينات UHRF1 البشرية والفأرية المختلفة ، تناولنا ما إذا كان هذا يؤدي إلى ظهور خصائص هيكلية وديناميكية مختلفة لوحدات TTD-PHD الخاصة بها. أجرينا تحليل SAXS لـ mTTD-PHD V1 و V2 (الشكل التكميلي S7C ، D ، الجدول S2) ، وقارننا ملفات تعريف التشتت الخاصة بهم مع تلك الخاصة بـ hTTD-PHD (68). استخدمنا نهج المجموعة حيث تم تركيب منحنيات SAXS مقابل الهياكل المشتقة من النمذجة الجزيئية لتحديد مجموعة فرعية من مطابقة TTD-PHD التي كانت متوافقة مع البيانات التجريبية. تم إنشاء عدة آلاف من المطابقات للوحدات النمطية باستخدام محاكاة الديناميكيات الجزيئية ونمذجة الجسم الصلبة لتقريب مساحة التشكل المتاحة. ثم تم استخدام طريقة SES (55) للعثور على المجموعة "المثلى" للمطابقات التي كانت متوافقة مع ملفات تعريف التشتت. في حالة mTTD-PHD V1 ، تتكون المجموعة المثالية بالكامل من المطابقات المدمجة ، حيث يرتبط mLinker 2 بشكل مفترض بأخدود السطح mTTD (الشكل 5A). بالنسبة إلى mTTD-PHD V2 و hTTD-PHD ، على النقيض من ذلك ، أدت مجموعاتها المثلى إلى ظهور ثنائي النسق. صز التوزيعات ، مع دليل على كل من المطابقة المدمجة والممتدة التي يتم فيها وضع الرابط خارج أخدود mTTD.

التحليل الإنشائي لوحدات mTTD-PHD V1 و V2. (أ) توزيع لل صز تم تحديده بواسطة النمذجة الجزيئية بالاقتران مع ملفات تعريف SAXS لـ mTTD-PHD V1 (يسار) و mTTD-PHD V2 (وسط) و hTTD-PHD (يمين). يشير الخط المتقطع إلى المجموعة الأولية من الهياكل المشتقة من الخط الصلب للنمذجة الجزيئية يشير إلى المجموعات المجهزة بـ SAXS لمطابقة TTD-PHD. (ب) تراكب أطياف HSQC (1 H - 15 N) (تكبير مركزي) لـ mTTD-Linker 2 V1 (أحمر) و V2 (أخضر). تم تعيين الرنين لبروتين V1 (85 ٪ كامل وإيداعه في BMRB (معرف 30704)). يتم تقديم تراكب طيفي كامل في الشكل التكميلي S8B. (ج) مقارنة التحولات الكيميائية للأميد في أطياف HSQC (1 H - 15 N) من mTTD-Linker 2 V1 و mTTD-Linker 2 V2. يتم تعيين الرنين المتداخل (باللون الأزرق) على هيكل mTTD-Linker 2 V1. هذه مترجمة خارج واجهة linker-groove و TTDن–TTDج تقاطع طرق. (د) مجموعات NMR الهيكلية لـ mTTD-Linker 2 V1 (يسار ، PDBID: 6VEE) و hTTD-Linker 2 (يمين ، PDBID: 6VED) تُظهر الموضع النسبي لمناطق Linker 2 فيما يتعلق بـ TTD. (ه) هيكل مشتق من NMR لـ mTTD-Linker 2 V1 مع تمثيل سطحي لـ mTTD باللون الرمادي و mLinker 2 V1 باللون الأخضر. R298 (تمثيل أرجواني - عصا) لـ mLinker 2 V1 مثبت في الجيب R (سماوي). التصحيح P (أي P293 و P294 و P295) ملون باللون الأحمر. mLinker 2 V2 (وردي) في حالة تدفق فيما يتعلق بسطح mTTD ، يظهر تمثيل لقطة مشتق من النمذجة الجزيئية ، مع R293 (تمثيل برتقالي - عصا) أعلى الجيب R. (F) بنية الرنين المغناطيسي النووي للتفاعل بين mLinker 2 V1 (الأخضر ، المخلفات المسمى باللون الأسود) و mTTD (الرمادي ، المخلفات المسمى باللون الأزرق). يظهر تمثيل السطح مع بقايا كارهة للماء (سماوي) وحمضية (وردية) تشكل الجيب R الذي يشغله R298 المميز على اليسار. روابط هيدروجينية (خطوط سوداء متقطعة) تعمل على استقرار تفاعل mLinker 2 V1-mTTD (المنبع من التصحيح P: Nأ 288–أوN134، نY136–أوL286، نس 292–أوS289 ومصب التصحيح P: NH2R298–OD1D138، NH2R298–OD2D138، نR298- OE2E149، NH1R298–أوW147، نT300- OE2E186) في تمثيلات العصا في المنتصف واليمين. (جي) (1 H - 15 N) معايرة HSQC لـ mTTD-Linker 2 V1 (يسار) و V2 (يمين) مع 4-benzylpiperidine-1-carboximidamide (BPC) غير المسمى (BPC) بنسب مولارية مختلفة.

التحليل الإنشائي لوحدات mTTD-PHD V1 و V2. (أ) توزيع لل صز تم تحديده بواسطة النمذجة الجزيئية بالاقتران مع ملفات تعريف SAXS لـ mTTD-PHD V1 (يسار) و mTTD-PHD V2 (وسط) و hTTD-PHD (يمين). يشير الخط المتقطع إلى المجموعة الأولية من الهياكل المشتقة من الخط الصلب للنمذجة الجزيئية يشير إلى المجموعات المجهزة بـ SAXS لمطابقة TTD-PHD. (ب) تراكب أطياف HSQC (1 H - 15 N) (تكبير مركزي) لـ mTTD-Linker 2 V1 (أحمر) و V2 (أخضر). تم تعيين الرنين لبروتين V1 (85 ٪ كامل وإيداعه في BMRB (معرف 30704)). يتم تقديم تراكب طيفي كامل في الشكل التكميلي S8B. (ج) مقارنة التحولات الكيميائية للأميد في أطياف HSQC (1 H - 15 N) من mTTD-Linker 2 V1 و mTTD-Linker 2 V2. يتم تعيين الرنين المتداخل (باللون الأزرق) على هيكل mTTD-Linker 2 V1. هذه مترجمة خارج واجهة linker-groove و TTDن–TTDج تقاطع طرق. (د) مجموعات NMR الهيكلية لـ mTTD-Linker 2 V1 (يسار ، PDBID: 6VEE) و hTTD-Linker 2 (يمين ، PDBID: 6VED) تُظهر الموضع النسبي لمناطق Linker 2 فيما يتعلق بـ TTD. (ه) هيكل مشتق من NMR لـ mTTD-Linker 2 V1 مع تمثيل سطحي لـ mTTD باللون الرمادي و mLinker 2 V1 باللون الأخضر. R298 (تمثيل أرجواني - عصا) لـ mLinker 2 V1 مثبت في الجيب R (سماوي). التصحيح P (أي P293 و P294 و P295) ملون باللون الأحمر. mLinker 2 V2 (وردي) في حالة تدفق فيما يتعلق بسطح mTTD ، يظهر تمثيل لقطة مشتق من النمذجة الجزيئية ، مع R293 (تمثيل برتقالي - عصا) أعلى الجيب R. (F) بنية الرنين المغناطيسي النووي للتفاعل بين mLinker 2 V1 (الأخضر ، المخلفات المسمى باللون الأسود) و mTTD (الرمادي ، المخلفات المسمى باللون الأزرق). يظهر تمثيل السطح مع بقايا كارهة للماء (سماوي) وحمضية (وردية) تشكل الجيب R الذي يشغله R298 المظلل على اليسار. روابط هيدروجينية (خطوط سوداء متقطعة) تعمل على استقرار تفاعل mLinker 2 V1-mTTD (المنبع من التصحيح P: Nأ 288–أوN134، نY136–أوL286، نس 292–أوS289 ومصب التصحيح P: NH2R298–OD1D138، NH2R298–OD2D138، نR298- OE2E149، NH1R298–أوW147، نT300- OE2E186) في تمثيلات العصا في المنتصف واليمين. (جي) (1 H - 15 N) معايرة HSQC لـ mTTD-Linker 2 V1 (يسار) و V2 (يمين) مع 4-benzylpiperidine-1-carboximidamide (BPC) غير المسمى (BPC) بنسب مولارية مختلفة.

(1 H - 15 N) أظهرت أطياف TROSY NMR المكونة من 15 mTTD-PHD V1 و V2 المسمى N اختلافات كبيرة في مواضع الذروة الإجمالية (الشكل التكميلي S8A). لا يمكن أن تُعزى أطياف TROSY غير المتشابهة إلى التأثيرات الهيكلية المحلية الناتجة عن الإدخال في mLinker 2 V1 ولكنها أشارت إلى وجود اختلافات عالمية في مطابقة mTTD-PHD V1 و V2. أدى الحجم الكبير لوحدات mTTD-PHD ، وميلها للتجميع بتركيزات مطلوبة لتجارب الرنين المغناطيسي النووي (200 ميكرومتر) إلى جودة طيفية رديئة نسبيًا ولم تكن قابلة لتخصيصات الرنين الكامل. للمساعدة في ترشيد أطياف mTTD-PHD ، قمنا بإعداد 15 رابط mTTD 2 المسمى N من V1 و V2 (الشكل 5B ، الشكل التكميلي S8B ، C) ، وكذلك mPHD (الشكل التكميلي S8D ، E) ، والذي قمنا بتعيينه بالكامل . مقارنة أطياف mTTD-PHD و mTTD-Linker 2 و mPHD (الشكل التكميلي S8D ، E ، G ، H) لوحظ اتجاهان: (1) تغيرت ملامح ذروة mPHD قليلاً في mTTD-PHD مقابل mPHD و (2) mTTD- تغيرت ملفات تعريف ذروة الرابط 2 قليلاً في سياق mTTD-PHD مقابل mTTD-Linker 2. أشارت هذه الملاحظات إلى أن mPHD لا يتفاعل مع mTTD أو mLinker 2 في وحدات mTTD-PHD وأن تفاعل Linker 2 مع mTTD محفوظ في كل من سياق mTTD-Linker 2 و mTTD-PHD. لاحظنا اتجاهًا مشابهًا عند مقارنة أطياف hTTD-Linker 2 و hPHD و hTTD-PHD (التي تم تحديد تخصيصات العمود الفقري لها مسبقًا (68)) (الشكل التكميلي S8I). أظهرت مقارنة أطياف H-15 N HSQC لـ mTTD-Linker 2 V1 و V2 اختلافات كبيرة مع & lt50 ٪ من القمم في مواضع متداخلة (الشكل 5 ب ، الشكل التكميلي S8B ، C). يتم ترجمة الرنينات التي تتداخل بشكل خاص خارج واجهة linker-groove و TTDن–TTDج مفرق (الشكل 5 ج). مرة أخرى ، يشير هذا إلى أن mLinker 2 V1 و V2 يعرضان أنماطًا مختلفة من التفاعل مع mTTD مما يؤدي إلى خصائص هيكلية وديناميكية مختلفة لوحدات mTTD-PHD ذات الصلة.

تمكنا من تعيين العمود الفقري وسلسلة الرنين الجانبية لـ mTTD-Linker 2 V1 بالكامل ، وتحديد هيكل حالة الحل (PDBID: 6VEE ، الشكل 5D-F ، الشكل التكميلي S8L ، الجدول S3). يشبه هيكل mTTD إلى حد كبير الهياكل البلورية المشتقة من الرنين المغناطيسي النووي التي تم الإبلاغ عنها سابقًا لـ hTTD ((6) PDBID: 2L3R). يتم الحفاظ على المخلفات العطرية الرئيسية التي تشكل قفص ربط K9me3 ، بالإضافة إلى الجيب R الحمضي العميق الموجود في الأخدود السطحي عند تقاطع مجالي تيودور (الشكل 5F). ومن المثير للاهتمام ، أننا لاحظنا العديد من NOEs بعيدة المدى في أطياف NOESY بين صدى mLinker 2 V1 و mTTD (الشكل التكميلي S8J ، K). تظهر المجموعة الهيكلية الناتجة تفاعلًا محددًا جيدًا بين mLinker 2 V1 و mTTD على وجه التحديد ، يتم وضع R298 في R-pocket (الشكل 5D-F). نظرًا لقضايا التجميع ، لم نتمكن من تعيين أصداء mTTD-Linker 2 V2 بالكامل وتحديد هيكلها. ومع ذلك ، كنقطة إضافية للمقارنة ، قمنا بتعيين hTTD-Linker 2 بالكامل وحساب هيكل الحل الخاص به (PDBID: 6VED ، اللوحة اليمنى الشكل 5D ، الشكل التكميلي S8L ، الجدول S3). على عكس mTTD-Linker 2 V1 ، لاحظنا عددًا قليلاً جدًا من NOEs بعيدة المدى بين hLinker 2 و hTTD (الشكل التكميلي S8J). عرضت المجموعة الهيكلية hLinker 2 المتوترة والمضطربة فيما يتعلق بأخدود سطح hTTD ، بما يتوافق مع الدراسات السابقة لـ hTTD-PHD (68).

لتأكيد ديناميكيات Linker 2 التفاضلية في mUHRF1 V1 و V2 ، أجرينا معايرة HSQC لبروتينات mTTD-Linker 2 مع 4-benzylpiperidine-1-carboximidamide (BPC). تم تحديد BPC في شاشة مركبة hUHRF1 ، ووجد أنه يتفاعل مع R-pocket (68). أشارت بيانات المعايرة بوضوح إلى مستويات مختلفة من تفاعلات الأخدود السطحي mTTD-Linker 2 لـ V1 و V2. أظهر صدى mTTD-Linker 2 V1 عدم وجود اضطرابات في التحول الكيميائي (CSPs) عند إضافة BPC ، مما يؤكد أن R298 يتبنى وضعًا ثابتًا في الجيب R الذي يمنع الارتباط المركب (الشكل 5G). في المقابل ، لوحظت CSPs بسبب ارتباط BPC بـ mTTD-Linker 2 V2 مما يعني أن هناك مجموعة من المطابقة حيث يتعرض أخدود السطح وجيب R.

تتبنى PHDs في الماوس والإنسان UHRF1 هياكل متشابهة جدًا. لقد حددنا بنية حل mPHD (PDBID: 6VFO ، الشكل التكميلي S8F ، الجدول S3) وقارنوه بالهيكل المشتق من الرنين المغناطيسي النووي الذي تم الإبلاغ عنه مسبقًا لـ apo-hPHD (64). تتميز كل من أجهزة PHD الخاصة بالماوس والبشر بمنطقة ربط هيستون مدمجة C- الطرفية والتي تنسق بين أيوني الزنك (الشكل التكميلي S8F) والعمود الفقري RMSD لـ hPHD و mPHD فوق هذه المنطقة هو ∼1.3 Å. تحتوي أيضًا PHDs في كلا الكائنين على منطقة حلقة طرفية مرنة N ، تسمى "ما قبل PHD" ، والتي تبدو غير ضرورية لربط هيستون ، والتي تنسق أيون الزنك الثالث (الشكل التكميلي S8F).

في ختام تحليلنا الهيكلي ، أوضحنا أن R298 من mLinker 2 V1 يرتبط بإحكام بجيب mTTD R. علاوة على ذلك ، أظهر هيكل mTTD-Linker 2 V1 أن البرولينات الثلاثة (P-patch: P293 و P294 و P295) لإدراج mLinker 2 تشكل شبكًا يجعل جهات اتصال إضافية مع أخدود سطح mTTD (الشكل 5E ، F). في المقابل ، يتفاعل mLinker 2 V2 بشكل عابر فقط مع أخدود السطح mTTD ، مما يؤدي إلى قدر أكبر من الحرية المطابقة لوحدة mTTD-PHD الخاصة به. كما هو الحال مع R296 في hUHRF1 ، لا يشغل R293 المقابل لـ mLinker 2 بثبات الجيب R (الشكل 5E).

يعد P-patch و R298 في mLinker 2 V1 ضروريين لمنع ربط H3K9me3 المعتمد على TTD

لقد قررنا سابقًا أن ارتباط H3 بـ hTTD بمعزل عن الطبيعة المركبة مع (1) القفص العطري hTTD المرتبط بـ K9me3 و (2) ربط الأخدود السطحي / R-pocket بـ K4 (6). إذا كان الجيب R مسدودًا أو مشغولاً ، فإن تفاعل hTTD مع الببتيد H3K9me3 يتم تخفيفه بشكل كبير (6 ، 28). للتأكد من أن السلوك الديناميكي لـ mLinker 2 V1 و V2 مسؤول عن سلوك ربط mTTD H3 التفاضلي ، أجرينا تحليل NMR. أظهرت معايرة mTTD-Linker 2 V1 مع ببتيد H3K9me3 عدم وجود CSPs مهم (الشكل 6 أ). كان هذا بالاتفاق مع الارتباط الوثيق لـ mLinker 2 V1 مع الأخدود السطحي لـ mTTD والموضع المستقر لـ R298 في R-pocket وبالتالي منع الوصول إلى H3K4 والقضاء على إمكانية التفاعل المركب (الشكل 6 ب). ومع ذلك ، لوحظت CSPs البارزة عندما تمت معايرة mTTD-Linker 2 V2 باستخدام الببتيد H3K9me3 (الشكل 6 أ). أكدت النتائج أيضًا أنه في هذا السياق ، يمكن الوصول إلى جيب mTTD R بشكل عابر لربط الببتيد المركب.

يمنع mLinker 2 V1 أخدود السطح والجيب R لـ mTTD. (أ) (1 H - 15 N) معايرة HSQC لـ mTTD-Linker 2 V1 (يسار) و V2 (يمين) المكتسبة في وجود ببتيد H3 (1-15) K9me3 غير المسمى بنسب مولارية مختلفة. (ب) هيكل مشتق من NMR لـ mTTD-Linker 2 V1 مع تمثيل سطحي لـ mTTD باللون الرمادي و mLinker 2 V1 باللون الأخضر. يتم تلوين P-patch (أي P293 و P294 و P295) لـ mLinker 2 V1 باللون الأحمر. الجيب R (السماوي) مشغول بـ R298 (تمثيل أرجواني - عصا). يُظهر النموذج الموضع المفترض للذيل H3K9me3 (أصفر) على سطح mTTD ، كما هو مشتق من تحليل مجمع hTTD / H3K9me3 ((6) PDBID: 2L3R). ستحتل بقايا ذيل H3 K9me3 القفص العطري و H3K4 الجيب R. ومع ذلك ، نظرًا لأن R298 الخاص بـ mLinker 2 V1 (الأخضر) مرتبط بثبات بالجيب R وأن الأخدود السطحي مشغول ، يتم حظر ربط H3K9me3 بواسطة mTTD المعزول في mUHRF1 V1. (ج) سلسلة معايرة للبروتينات المتحولة mTTD-PHD V1 WT و R298A المؤتلف (R298 *) و P293A / P294A / P295A (P-patch *) و K302A / S303A (K302 / S303 *) مع FAM-H3 (1-15 ) تم تحليل الببتيد K9me3 عن طريق الاستقطاب الفلوري. يتم رسم البيانات كمتوسط ​​لثلاثة أشرطة خطأ تجارب مستقلة تتوافق مع sd. (د) تجارب ربط الاستقطاب الفلوري كما في (C) ولكن باستخدام المؤتلف mUHRF1 V1 WT أو R298 * أو P-patch * أو K302 / S303 * أو P293A / P294A / P295A / L297A / R298A (P-patch / R *) ، R298A / N299A / T300A / G301A / K302A / S303A (RS *) ، P293A / P294A / P295A / R298A / N299A / T300A / G301A / K302A / S303A (P-patch / RS *) و P293A / P294A / P29829 / L29829 بروتينات N299A / T300A / G301A / K302A / S303A (mLinker 2 V1 *).

يمنع mLinker 2 V1 أخدود السطح والجيب R لـ mTTD. (أ) (1 H - 15 N) معايرة HSQC لـ mTTD-Linker 2 V1 (يسار) و V2 (يمين) المكتسبة في وجود ببتيد H3 (1-15) K9me3 غير المسمى بنسب مولارية مختلفة. (ب) هيكل مشتق من NMR لـ mTTD-Linker 2 V1 مع تمثيل سطحي لـ mTTD باللون الرمادي و mLinker 2 V1 باللون الأخضر. يتم تلوين P-patch (أي P293 و P294 و P295) لـ mLinker 2 V1 باللون الأحمر. الجيب R (السماوي) مشغول بـ R298 (تمثيل أرجواني - عصا). يُظهر النموذج الموضع المفترض للذيل H3K9me3 (أصفر) على سطح mTTD ، كما هو مشتق من تحليل مجمع hTTD / H3K9me3 ((6) PDBID: 2L3R). ستحتل بقايا ذيل H3 K9me3 القفص العطري و H3K4 الجيب R. ومع ذلك ، نظرًا لأن R298 الخاص بـ mLinker 2 V1 (الأخضر) مرتبط بثبات بالجيب R وأن الأخدود السطحي مشغول ، يتم حظر ربط H3K9me3 بواسطة mTTD المعزول في mUHRF1 V1. (ج) سلسلة معايرة للبروتينات المتحولة mTTD-PHD V1 WT و R298A المؤتلف (R298 *) و P293A / P294A / P295A (P-patch *) و K302A / S303A (K302 / S303 *) مع FAM-H3 (1-15 ) تم تحليل الببتيد K9me3 عن طريق الاستقطاب الفلوري. يتم رسم البيانات كمتوسط ​​لثلاثة أشرطة خطأ تجارب مستقلة تتوافق مع sd. (د) تجارب ربط الاستقطاب الفلوري كما في (C) ولكن باستخدام المؤتلف mUHRF1 V1 WT أو R298 * أو P-patch * أو K302 / S303 * أو P293A / P294A / P295A / L297A / R298A (P-patch / R *) ، R298A / N299A / T300A / G301A / K302A / S303A (RS *) ، P293A / P294A / P295A / R298A / N299A / T300A / G301A / K302A / S303A (P-patch / RS *) و P293A / P294A / P29829 / L29829 بروتينات N299A / T300A / G301A / K302A / S303A (mLinker 2 V1 *).

كما هو متوقع من الدراسات الهيكلية ، نتج عن طفرة R298 (R298 *: R298A) و P-patch (P-patch *: P293A / P294A / P295A) مكاسب كبيرة في ربط mTTD-PHD V1 بببتيد FAM-H3K9me3 مقارنة بالبروتين من النوع البري كما تم قياسه بواسطة FP (الشكل 6C) ويقترح زيادة إمكانية الوصول إلى أخدود السطح / R- الجيب الملزم للببتيد mTTD. في المقابل ، لم يكن لطفرة المخلفات K302 / S303 المجاورة (K302 / S303 *: K302A / S303A) المحفوظة في Linker 2 من mUHRF1 V1 و V2 و hUHRF1 (الشكل 1A) أي تأثير. عند اختبار نفس الطفرات في سياق كامل الطول mUHRF1 V1 ، كانت هذه التأثيرات أقل وضوحًا (الشكل 6 د). ومع ذلك ، فإن طفرات المخلفات الإضافية في mUHRF1 V1 Linker 2 مكّنت ربط FAM-H3K9me3. تم تحقيق ذلك ليس فقط من خلال طفرة الإدراج الكامل (mLinker 2 V1 *: P293A / P294A / P295A / L297A / R298A / N299A / T300A / G301A / K302A / S303A) ولكن أيضًا من خلال بعض التغييرات الأقل خطورة ، مثل RS * ( R298A / N299A / T300A / G301A / K302A / S303A) ، P-patch / R * (P293A / P294A / P295A / L297A / R298A) و P-patch / RS * (P293A / P294A / P295A / R298A / N299A / T300A / R298A / N299A / G301A / K302A / S303A) (الشكل 6 د). استنتجنا من هذه الملاحظات أن التصحيح P و R298 ضروريان وإن لم يكن كافيًا لوضع mLinker 2 بثبات على سطح mTTD ولحجب ربط H3K9me3.

يسهل إدخال Linker 2 التعرف على H3K9me3 التآزري بواسطة وحدة mTTD-PHD

لتحديد ما إذا كان الارتباط المستقر لـ mLinker 2 V1 مع mTTD يدفع بالفعل وضع ربط الببتيد H3K9me3 التآزري ، قمنا بقياس التفاعل بين الببتيدات H3 التي تحمل علامة FAM غير المعدلة و H3K9me3 ذات الطول الكامل mUHRF1 V1 و V2 و V1 Linker 2 المسوخ. لقد توقعنا أن طفرة إدخال Linker 2 التي تزيحه من سطح mTTD ستلغي خصوصية ربط H3K9me3 لـ mUHRF1 V1. في الواقع ، أظهرت طفرات R298 * و P-patch / R * و R-S * ارتباطًا أضعف بببتيد H3K9me3-FAM مقارنة ببروتين WT. في الوقت نفسه ، لم يتأثر التفاعل مع الببتيد H3unmod-FAM (الشكل 7 أ). بالتوافق مع الارتباط المنخفض بذيل K9me3 H3 ، تم أيضًا تقليل نشاط الانتشار الشامل لبروتينات متحولة mUHRF1 V1 إلى مستوى mUHRF1 V2 (الشكل 7 ب). دعمت النتائج فكرة أن الإدخال في mLinker 2 V1 يوجه التآزر بين mTTD و mPHD. يؤدي تعطيل ارتباط mTTD-Linker 2 إلى فصل mTTD عن mPHD مما يؤدي إلى أوضاع مستقلة للتعرف على الببتيد (كما هو موضح في mUHRF1 V2).

يعمل إدخال mLinker 2 V1 على تسهيل التعرف على H3K9me3 التآزري بواسطة وحدة mTTD-PHD V1. (أ) سلسلة معايرة mUHRF1 V1 WT ، R298A (R298 *) ، P293A / P294A / P295A (P-patch *) ، P293A / P294A / P295A / L297A / R298A (P-patch / R *) ، R298A / N299A / T300 / G301A / K302A / S303A (RS *) و mUHRF1 V2 WT مع H3 غير معدل- (يسار) و H3K9me3-FAM (يمين) تم تحليل الببتيدات بواسطة الرحلان الحراري المجهري. يتم رسم البيانات كمتوسط ​​لثلاثة أشرطة خطأ تجارب مستقلة تتوافق مع sd. (ب) تعرضت البروتينات المؤتلفة لـ (A) لمقايسات E3 ubiquitin ligase باستخدام H3K9me3 mononucleosomes المؤتلف. تم تحليل ردود الفعل عن طريق النشاف الغربي (أعلى). تظهر إشارات UHRF1 وبروتينات هيستون على غشاء اللطخة الغربية الملطخة لعناصر تحكم التحميل (أسفل). يشار إلى المواضع الجارية لعلامات الوزن الجزيئي (على اليسار) والبروتينات المحددة المختلفة (على اليمين). (ج) صور متحد البؤر التمثيلية لخلايا الفئران NIH-3T3 التي تعبر عن بروتينات mUHRF1 V1 و V2 WT ذات علامات EGFP مختلفة (EGFP ، القناة الخضراء). تم إجراء تلطيخ التألق المناعي لـ H3K9me3 (القناة الحمراء). يصبغ DAPI الحمض النووي (القناة الزرقاء). تظهر الصور المدمجة جميع القنوات الثلاث في وقت واحد. شريط النطاق: 10 ميكرومتر. (د) تم تقييم التوطين المشترك للبروتينات التي تحمل علامات EGFP كما هو موضح في (C) مع H3K9me3 والمناطق كثيفة DAPI بصريًا وتم رسمها بالنسبة إلى العدد الإجمالي للخلايا الإيجابية لـ EGFP (ن & GT 70).

يعمل إدخال mLinker 2 V1 على تسهيل التعرف على H3K9me3 التآزري بواسطة وحدة mTTD-PHD V1. (أ) سلسلة معايرة mUHRF1 V1 WT ، R298A (R298 *) ، P293A / P294A / P295A (P-patch *) ، P293A / P294A / P295A / L297A / R298A (P-patch / R *) ، R298A / N299A / T300 / G301A / K302A / S303A (RS *) و mUHRF1 V2 WT مع H3 غير معدل- (يسار) و H3K9me3-FAM (يمين) تم تحليل الببتيدات بواسطة الرحلان الحراري المجهري. يتم رسم البيانات كمتوسط ​​لثلاثة أشرطة خطأ تجارب مستقلة تتوافق مع sd. (ب) تعرضت البروتينات المؤتلفة لـ (A) لمقايسات E3 ubiquitin ligase باستخدام H3K9me3 mononucleosomes المؤتلف. تم تحليل ردود الفعل عن طريق النشاف الغربي (أعلى). تظهر إشارات UHRF1 وبروتينات هيستون على غشاء اللطخة الغربية الملطخة لعناصر تحكم التحميل (أسفل). يشار إلى المواضع الجارية لعلامات الوزن الجزيئي (على اليسار) والبروتينات المحددة المختلفة (على اليمين). (ج) صور متحد البؤر التمثيلية لخلايا الفئران NIH-3T3 التي تعبر عن بروتينات mUHRF1 V1 و V2 WT ذات علامات EGFP مختلفة (EGFP ، القناة الخضراء). تم إجراء تلطيخ التألق المناعي لـ H3K9me3 (القناة الحمراء). يصبغ DAPI الحمض النووي (القناة الزرقاء). تظهر الصور المدمجة جميع القنوات الثلاث في وقت واحد. شريط النطاق: 10 ميكرومتر. (د) تم تقييم التوطين المشترك للبروتينات التي تحمل علامات EGFP كما هو موضح في (C) مع H3K9me3 والمناطق كثيفة DAPI بصريًا وتم رسمها بالنسبة إلى العدد الإجمالي للخلايا الإيجابية لـ EGFP (ن & GT 70).

أخيرًا ، سألنا عما إذا كان تعطيل التآزر بين mTTD و mPHD بواسطة طفرة mLinker 2 V1 كافٍ للتأثير على الاستهداف الخلوي لـ mUHRF1 V1 إلى H3K9me3. لقد قمنا بإفراط في التعبير بشكل عابر عن EGFP-mUHRF1 V1 WT و R298 * و P-patch / R * و R-S * ، وكذلك EGFP-mUHRF1 V2 WT في خلايا C127 و NIH-3T3. باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر ، وجدنا أنه في كلا سطري الخلايا ، تسببت جميع الطفرات الثلاثة في mLinker 2 V1 في انخفاض توطين بؤر mUHRF1 V1 إلى H3K9me3 ، مما يحاكي توطين mUHRF1 V2 (الشكل 7C ، D ، الشكل التكميلي S9 – S11). خلصنا إلى أن ارتباط هيستون التآزري بواسطة mTTD و mPHD ، والذي تم إنشاؤه بواسطة إدخال mUHRF1 V1 Linker 2 ، ضروري لدفع التوطين النووى الفرعي لـ mUHRF1 V1. تسبب غياب التآزر ، إما من خلال عدم وجود الإدراج (mUHRF1 V2) أو طفرة R298 ، في توطين أكثر انتشارًا لـ mUHRF1 ، والذي لا يركز على H3K9me3. بشكل مثير للاهتمام وعلى عكس P-patch / R * و R-S * ، عطل R298 * التآزر بين mTTD و mPHD ، لكنه لم يحرر أخدود سطح mTTD لربط H3 (الشكلان 6D و 7A). يشير هذا إلى أن الاختلافات في التوطين دون النووي ناتجة حقًا عن الاقتران التآزري بين mTTD و mPHD في mUHRF1 V1 ولكن ليس V2.


الملخص

الساعات اليومية هي آليات داخلية تترجم الإشارات البيئية إلى معلومات زمنية لتوليد إيقاعات 24 ساعة في التمثيل الغذائي وعلم وظائف الأعضاء. تعتمد وظيفة الساعة البيولوجية على التنظيم الدقيق للتعبير الجيني الإيقاعي في قلب المذبذب ، والذي يعدل مؤقتًا نشاط نسخ الجينوم في جميع الكائنات متعددة الخلايا تقريبًا التي تم فحصها حتى الآن. تشير الدلائل الناشئة في النباتات إلى وجود تفاعل متطور للغاية بين أنماط الساعة البيولوجية للتعبير الجيني والتغيرات الإيقاعية في إعادة تشكيل الكروماتين وتعديلات الهيستون. تم تعريف الربط البديل للحمض النووي الريبي (pre-mRNA) مؤخرًا على أنه ركيزة أساسية في النظام اليومي ، مما يوفر المرونة المطلوبة والخصوصية لضبط الساعة اليومية. تسلط هذه المراجعة الضوء على العلاقة بين الساعة البيولوجية للنبات وكل من إعادة تشكيل الكروماتين والربط البديل وتقارن أوجه التشابه والاختلاف مع الدراسات المماثلة في أنظمة الساعة البيولوجية الحيوانية.

يسلط الضوء

► التفاعل بين التعبير الجيني اليومي والتغيرات الإيقاعية في إعادة تشكيل الكروماتين. ► يوفر الربط البديل اللدونة والخصوصية لضبط الساعة اليومية. تسلط الأدلة الناشئة الضوء على الآليات الجديدة المسؤولة عن التنظيم قبل ، والمشاركة ، وبعد النسخ للتعبير الجيني اليومي.


تتحكم تعديلات هيستون التي يسببها النشاط في الربط بين Neurexin-1 mRNA والحفاظ على الذاكرة

تنظم الآليات اللاجينية تكوين الذكريات وتوحيدها وإعادة توحيدها. ومع ذلك ، فإن مسار الإشارات من التنشيط العصبي إلى التعديلات اللاجينية داخل دائرة الدماغ المرتبطة بالذاكرة لا يزال غير معروف. لقد أبلغنا أن التعلم يؤدي إلى تعديلات طويلة الأمد للهيستون في الخلايا العصبية التي تنشط الذاكرة في الحصين لتنظيم استقرار الذاكرة. يؤدي النشاط العصبي إلى حدوث تحول متأخر في اختيار الشكل الإسوي Nrxn1 في موقع الربط 4 عن طريق تجميع علامة هيستون القمعية ، H3K9me3 ، لتعديل عملية الربط. تقوم الفسفرة المعتمدة على النشاط لـ p66α عبر كيناز البروتين المنشط بـ AMP بتجنيد HDAC2 و Suv39h1 لإنشاء علامات هيستون القمعية وتغيير اتصال الخلايا العصبية المنشطة. ألغت إزالة Suv39h1 التحول المعتمد على النشاط في اختيار الشكل الإسوي للوصلة Nrxn1 وقللت من استقرار الذكريات الثابتة. نكشف عن عملية ذاتية الخلية لحفظ الذاكرة ، حيث تبدأ الخلايا العصبية المرتبطة بالذاكرة في بداية التخفيض المتأخر لقدراتها على إعادة الأسلاك من خلال تعديلات هيستون التي يسببها النشاط.


دور ديناميكي لعلامات هيستون في الربط البديل المعتمد على EMT

(الكسندر سيجيل وجان فيليب فيلمين)

خلال EMT ، هناك تغييرات معروفة في التضفير البديل يمكن أن تحدث مبكرًا في EMT ، أو لاحقًا في المراحل النهائية من عملية إعادة البرمجة. علاوة على ذلك ، وجدنا أن العديد من هذه الجينات التي يتم تقطيعها بشكل بديل يتم تنظيمها من خلال تعديلات الكروماتين ، مما يثير التساؤل حول ما هو التفاعل الديناميكي بين الطبقتين التنظيميتين. في هذا المشروع ، سنجمع بين بيانات الوراثة اللاجينية على مستوى الجينوم وبيانات النسخ مع المزيد من منهجيات البيولوجيا الجزيئية الكلاسيكية ، لتحديد وربط التغييرات في الكروماتين و lncRNAs في الوقت المناسب بالتغييرات في الربط أثناء EMT. كدليل نهائي على دور علامات الهيستون هذه في الربط المعتمد على EMT ، سنقوم بتكييف نظام CRISPR / dCas9 لتحرير الإيبيجينوم على وجه التحديد واختبار التأثير على الربط البديل.

من خلال الارتباط بالوقت (أيام T0 ، T1 ، T6 ، T21) التغييرات على مستوى الجينوم في الربط البديل ، ومستويات التعبير lncRNAs ومستويات إثراء تعديل هيستون أثناء إنشاء وصيانة برنامج الربط الجديد الخاص بـ EMT ، سنحدد المنظمين الجدد من التضفير الذي سيتم دراسته بمزيد من الأساليب الآلية.


محتويات

لوحظ التضفير البديل لأول مرة في عام 1977. [9] [10] ينتج فيروس Adenovirus خمسة نسخ أولية في وقت مبكر من دورته المعدية ، قبل تكاثر الحمض النووي الفيروسي ، ونسخة إضافية لاحقًا ، بعد بدء تكرار الحمض النووي. يستمر إنتاج النصوص الأولية المبكرة بعد بدء تكرار الحمض النووي. النسخة الأولية الإضافية التي تم إنتاجها في وقت متأخر من الإصابة كبيرة وتأتي من 5/6 من جينوم الفيروس الغدي 32 كيلو بايت. هذا أكبر بكثير من أي من الفيروسات الغدية mRNAs الموجودة في الخلايا المصابة. وجد الباحثون أن نسخة الحمض النووي الريبي الأولية التي أنتجها الفيروس الغدي من النوع 2 في المرحلة المتأخرة كانت مقسمة بعدة طرق مختلفة ، مما أدى إلى ترميز mRNAs لبروتينات فيروسية مختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، احتوى النص الأساسي على مواقع متعددة من مادة البولي أدينيل ، مما يعطي 3 نهايات مختلفة لـ mRNAs التي تمت معالجتها. [11] [12] [13]

في عام 1981 ، تم تمييز أول مثال على التضفير البديل في نسخة من جين طبيعي داخلي. [11] تم العثور على الجين الذي يكوِّد هرمون الغدة الدرقية كالسيتونين بشكل بديل في خلايا الثدييات. النسخة الأولية من هذا الجين تحتوي على 6 إكسونات يحتوي الكالسيتونين مرنا على إكسونات 1-4 ، وينتهي بعد موقع متعدد الأدينيل في إكسون 4. يتم إنتاج مرنا آخر من هذا الرنا المرسال المسبق عن طريق تخطي إكسون 4 ، ويتضمن إكسونات 1–3 ، 5 و 6. يشفر البروتين المعروف باسم CGRP (الببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين). [14] [15] كما لوحظت أمثلة على التضفير البديل في النسخ الجينية للجلوبين المناعي في الثدييات في أوائل الثمانينيات. [11] [16]

منذ ذلك الحين ، وجد أن التضفير البديل موجود في كل مكان في حقيقيات النوى. [1] "صاحب الرقم القياسي" للربط البديل هو أ D. melanogaster الجين المسمى Dscam ، والذي يمكن أن يحتوي على 38،016 نوعًا من أنواع لصق. [17]

في عام 2021 ، تم اكتشاف أن جينوم الفيروس الغدي من النوع 2 ، الفيروس الغدي الذي تم تحديد التضفير البديل فيه لأول مرة ، كان قادرًا على إنتاج مجموعة متنوعة من الرنا المرسال أكبر بكثير مما كان يعتقد سابقًا. [18] باستخدام تقنية التسلسل من الجيل التالي ، كان الباحثون قادرين على تحديث نسخة النسخ 2 من الفيروس الغدي البشري ، وتقديم 904 مرنا فريد من نوعه ، ينتجه الفيروس من خلال نمط معقد من التضفير البديل.

يتم التعرف بشكل عام على خمسة أنماط أساسية من التضفير البديل. [1] [2] [3] [19]

  • تخطي إكسون أو كاسيت اكسون: في هذه الحالة ، قد يتم فصل exon من النص الأساسي أو الاحتفاظ به. هذا هو الوضع الأكثر شيوعًا في الثدييات قبل الرنا المرسال. [19]
  • exons حصري متبادل: يتم الاحتفاظ بواحد من اثنين من exons في mRNAs بعد التضفير ، ولكن ليس كلاهما.
  • موقع متبرع بديل: يتم استخدام وصلة لصق 5 'بديلة (موقع مانح) ، وتغيير حدود 3' من exon المنبع.
  • موقع متقبل بديل: يتم استخدام وصلة لصق بديلة 3 '(موقع متقبل) ، وتغيير حدود 5' من exon المصب.
  • احتباس Intron: قد يتم تقسيم التسلسل إلى intron أو الاحتفاظ به ببساطة. يختلف هذا عن تخطي exon لأن التسلسل المحتفظ به لا يحيط به الإنترونات. إذا كان intron المحتفظ به في منطقة الترميز ، يجب أن يقوم intron بتشفير الأحماض الأمينية في إطار مع exons المجاورة ، أو سيؤدي رمز الإيقاف أو التحول في إطار القراءة إلى عدم عمل البروتين. هذا هو الوضع الأكثر ندرة في الثدييات. [19]

بالإضافة إلى هذه الأنماط الأولية من التضفير البديل ، هناك آليتان رئيسيتان أخريان يمكن بواسطتهما إنشاء mRNAs مختلفة من نفس المروجين الجيني المتعدد ومواقع polyadenylation المتعددة. يوصف استخدام العديد من المروجين بشكل صحيح كآلية تنظيم نسخ بدلاً من الربط البديل عن طريق بدء النسخ في نقاط مختلفة ، ويمكن إنشاء نصوص ذات 5'-most exons مختلفة. في الطرف الآخر ، توفر عدة مواقع متعددة الأدينيل نقاط نهاية مختلفة 3 'للنسخة. تم العثور على كل من هاتين الآليتين في تركيبة مع التضفير البديل وتوفر تنوعًا إضافيًا في mRNAs المستمدة من الجين. [1] [3]

تصف هذه الأنماط آليات التضفير الأساسية ، ولكنها قد تكون غير كافية لوصف أحداث الربط المعقدة. على سبيل المثال ، يوضح الشكل الموجود على اليمين 3 أشكال من الجين هيالورونيداز 3 للفأر. تُظهر مقارنة البنية الخارجية الموضحة في السطر الأول (الأخضر) مع الموجود في السطر الثاني (الأصفر) احتباس intron ، بينما تُظهر المقارنة بين الشكل الثاني والثالث spliceform (الأصفر مقابل الأزرق) تخطي exon. تم مؤخرًا اقتراح نموذج تسمية لتعيين جميع أنماط الربط الممكنة بشكل فريد. [19]

تعديل آلية الربط العامة

عندما يتم نسخ pre-mRNA من الحمض النووي ، فإنه يتضمن عدة إنترونات وإكسونات. (في الديدان الخيطية ، المتوسط ​​هو 4-5 إكسونات وإنترونات في ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة يمكن أن يكون هناك أكثر من 100 introns و exons في نسخة واحدة من pre-mRNA.) يتم تحديد exons التي سيتم الاحتفاظ بها في mRNA أثناء عملية الربط. يتم تنظيم واختيار مواقع الوصلة عن طريق منشط الربط العابر وربط البروتينات المثبطة بالإضافة إلى العناصر المؤثرة ضمن ما قبل الرنا المرسال نفسه مثل معززات الربط الخارجي وكواتم التضفير الخارجي.

الإنترون النووي حقيقي النواة النموذجي له تسلسل إجماعي يحدد مناطق مهمة. كل intron لديه التسلسل GU في نهايته 5 '. بالقرب من نهاية 3 يوجد موقع فرع. يكون النوكليوتيد عند نقطة التفرع دائمًا A ويختلف الإجماع حول هذا التسلسل إلى حد ما. في البشر ، يكون تسلسل توافق موقع الفرع هو yUnAy. [20] يتبع موقع الفرع سلسلة من البيريميدين - السبيل البوليبيريميدين - ثم AG في النهاية 3. [3]

يتم إجراء عملية ربط الرنا المرسال بواسطة مركب RNA والبروتين المعروف باسم spliceosome ، والذي يحتوي على snRNPs المعين U1 و U2 و U4 و U5 و U6 (U3 لا يشارك في الربط mRNA). [21] يرتبط U1 بـ 5 'GU و U2 ، بمساعدة عوامل بروتين U2AF ، ويرتبط بنقطة التفرع A داخل موقع الفرع. يُعرف المجمع في هذه المرحلة باسم مجمع spliceosome A. عادة ما يكون تكوين المركب A هو الخطوة الأساسية في تحديد نهايات intron المراد تقسيمها ، وتحديد نهايات exon التي يجب الاحتفاظ بها. [3] (تسمية U مشتقة من محتواها العالي من اليوريدين).

الروابط المعقدة U4 و U5 و U6 و U6 تحل محل موضع U1. إجازة U1 و U4. ثم ينفذ المركب المتبقي تفاعلين استرة. في أول عملية استرة ، يتم قطع نهاية الإنترون 5 'من exon المنبع وربطها بموقع الفرع A بواسطة ارتباط 2' ، 5'-phosphodiester. في الاسترة الثانية ، يتم قطع نهاية الإنترون 3 من exon المصب ، ويتم ربط الإكسونات برابطة فوسفوديستر. ثم يتم تحرير intron في شكل الوهق ويتحلل. [1]

تحرير العناصر التنظيمية والبروتينات

يتم تنظيم الربط عن طريق البروتينات العابرة المفعول (المثبطات والمنشطات) والمواقع التنظيمية المتوافقة مع رابطة الدول المستقلة (كاتمات الصوت والمعززات) على ما قبل الرنا المرسال. ومع ذلك ، كجزء من تعقيد التضفير البديل ، يُلاحظ أن تأثيرات عامل التضفير غالبًا ما تعتمد على الموضع. وهذا يعني أن عامل التضفير الذي يعمل كمنشط للتضفير عند ارتباطه بعنصر محسن intronic قد يكون بمثابة مثبط عندما يرتبط بعنصر الربط الخاص به في سياق exon ، والعكس صحيح. [22] وتلعب البنية الثانوية لنسخة ما قبل الرنا المرسال أيضًا دورًا في تنظيم التضفير ، مثل الجمع بين عناصر التضفير أو إخفاء تسلسل من شأنه أن يعمل كعنصر ربط لعامل التضفير. [23] [24] معًا ، تشكل هذه العناصر "رمز الربط" الذي يحكم كيفية حدوث التضفير في ظل ظروف خلوية مختلفة. [25] [26]

هناك نوعان رئيسيان من عناصر تسلسل الحمض النووي الريبي التي تعمل بنظام رابطة الدول المستقلة الموجودة في ما قبل الرنا المرسال ولديها بروتينات ربط الحمض النووي الريبي العابرة المفعول. الربط كاتمات الصوت هي المواقع التي ترتبط بها بروتينات مانع التضفير ، مما يقلل من احتمال استخدام موقع قريب كوصلة لصق. يمكن أن توجد هذه في intron نفسها (كاتمات صوت الربط intronic ، ISS) أو في exon المجاور (كاتمات صوت الربط exonic ، ESS). وهي تختلف في التسلسل ، وكذلك في أنواع البروتينات التي ترتبط بها. غالبية مثبطات التضفير هي بروتينات نووية نووية غير متجانسة (hnRNPs) مثل hnRNPA1 وبروتين ربط المسالك بوليبريميدين (PTB). [3] [25] الربط معززات هي المواقع التي ترتبط بها بروتينات منشط التضفير ، مما يزيد من احتمال استخدام موقع قريب كوصلة لصق. قد تحدث هذه أيضًا في intron (معززات الربط الداخلي ، ISE) أو exon (معززات الربط الخارجي ، ESE). معظم البروتينات المنشطة التي ترتبط بـ ISEs و ESEs هي أعضاء في عائلة بروتين SR. تحتوي هذه البروتينات على أشكال للتعرف على الحمض النووي الريبي ومجالات أرجينين وسيرين الغنية (RS). [3] [25]

بشكل عام ، تعمل محددات الربط بطريقة مترابطة تعتمد على السياق ، بحيث يتم تنظيم القواعد التي تحكم كيفية الربط من كود الربط. [26] قد يؤدي وجود عنصر تسلسل RNA معين يعمل بنظام cis إلى زيادة احتمالية تقطيع موقع قريب في بعض الحالات ، ولكنه يقلل الاحتمال في حالات أخرى ، اعتمادًا على السياق. يتضمن السياق الذي تعمل فيه العناصر التنظيمية سياقًا مؤثرًا في رابطة الدول المستقلة والذي تم إنشاؤه من خلال وجود ميزات تسلسل الحمض النووي الريبي الأخرى ، والسياق العابر الذي تم إنشاؤه بواسطة الظروف الخلوية. على سبيل المثال ، تؤثر بعض عناصر تسلسل الحمض النووي الريبي المؤثرة في رابطة الدول المستقلة على التضفير فقط في حالة وجود عناصر متعددة في نفس المنطقة من أجل إنشاء السياق. كمثال آخر ، يمكن أن يكون لعنصر cis تأثيرات معاكسة على التضفير ، اعتمادًا على البروتينات التي يتم التعبير عنها في الخلية (على سبيل المثال ، PTB العصبية مقابل غير العصبية).تم إثبات الأهمية التكيفية لكاتم الصوت والمعززات من خلال الدراسات التي تظهر أن هناك اختيارًا قويًا في الجينات البشرية ضد الطفرات التي تنتج كواتم صوت جديدة أو تعطل المعززات الموجودة. [27] [28]

مثيلة الحمض النووي والتضفير البديل في الحشرات الاجتماعية تحرير

أظهرت مثيلة CpG DNA دورًا في تنظيم التضفير البديل في الحشرات الاجتماعية. [29] [30] في نحل العسل (أبيس ميليفيرا) ، يبدو أن مثيلة CpG DNA تنظم تخطي exon بناءً على الدراسات الجينومية القليلة الأولى [31] [32] بعد توفر جينوم نحل العسل. [33] CpG DNA methylation منظم بديل للربط على نطاق أوسع ، لا يؤثر فقط على تخطي exon ، ولكن أيضًا على احتباس intron ، وأحداث الربط الأخرى. [34]

أمثلة تحرير

تخطي إكسون: ذبابة الفاكهة dsx يحرر

قبل mRNAs من D. melanogaster الجين dsx تحتوي على 6 اكسونات. في الذكور ، يتم ربط exons 1،2،3،5 و 6 لتشكيل mRNA ، والذي يشفر البروتين التنظيمي النسخي المطلوب لتطور الذكور. في الإناث ، يتم ربط exons 1،2،3 و 4 ، وتسبب إشارة polyadenylation في exon 4 انقسام mRNA في تلك المرحلة. إن mRNA الناتج هو بروتين تنظيمي نسبي مطلوب لتنمية الإناث. [35]

هذا مثال على تخطي exon. يحتوي intron المنبع من exon 4 على مسار بولي بريميدين لا يتطابق مع تسلسل الإجماع جيدًا ، بحيث ترتبط بروتينات U2AF به بشكل سيئ دون مساعدة من منشطات الربط. لذلك لا يتم استخدام موقع متقبل لصق 3 'هذا في الذكور. ومع ذلك ، تنتج الإناث محول التضفير المنشط (ترا) (انظر أدناه). يتم إنتاج بروتين SR Tra2 في كلا الجنسين ويرتبط بـ ESE في exon 4 إذا كان Tra موجودًا ، فإنه يرتبط بـ Tra2 ، جنبًا إلى جنب مع بروتين SR آخر ، يشكل معقدًا يساعد بروتينات U2AF في الارتباط بجهاز البولي بريميدين الضعيف. يتم تجنيد U2 إلى نقطة التفرع المرتبطة ، وهذا يؤدي إلى إدراج exon 4 في mRNA. [35] [36]

مواقع القبول البديلة: ذبابة الفاكهة محول يحرر

ما قبل mRNAs من محول (ترا) الجين ذبابة الفاكهة سوداء البطن الخضوع لعملية الربط البديلة عبر وضع موقع القبول البديل. يقوم الجين Tra بتشفير البروتين الذي يتم التعبير عنه عند الإناث فقط. يحتوي النص الأساسي لهذا الجين على إنترون مع موقعين متقبلين محتملين. في الذكور ، يتم استخدام موقع متقبل المنبع. يؤدي هذا إلى تضمين إصدار أطول من exon 2 في النص المعالج ، بما في ذلك رمز الإيقاف المبكر. يقوم mRNA الناتج بتشفير منتج بروتين مبتور غير نشط. تنتج الإناث بروتين الجنس القاتل (Sxl) الرئيسي لتحديد الجنس. بروتين Sxl هو مثبط للربط يرتبط بمحطة الفضاء الدولية في الحمض النووي الريبي لنسخة Tra بالقرب من موقع متقبل المنبع ، مما يمنع بروتين U2AF من الارتباط بجهاز بولي بيريميدين. هذا يمنع استخدام هذا التقاطع ، مما يؤدي إلى تحويل ربط الجسيمات إلى موقع متقبل المصب. الربط عند هذه النقطة يتجاوز كود الإيقاف ، والذي يتم اقتطاعه كجزء من الإنترون. يشفر mRNA الناتج بروتين Tra النشط ، والذي يعد في حد ذاته منظمًا للربط البديل للجينات الأخرى المرتبطة بالجنس (انظر dsx فوق). [1]

تعريف إكسون: تحرير مستقبلات فاس

يتم إنتاج الأشكال الإسوية المتعددة لبروتين مستقبلات Fas عن طريق الربط البديل. يتم إنتاج اثنين من الأشكال الإسوية التي تحدث بشكل طبيعي في البشر بواسطة آلية تخطي exon. يشفر mRNA بما في ذلك exon 6 الشكل المرتبط بالغشاء لمستقبل Fas ، والذي يعزز موت الخلايا المبرمج ، أو موت الخلية المبرمج. يشير زيادة التعبير عن مستقبلات Fas في خلايا الجلد المعرضة بشكل مزمن للشمس ، وغياب التعبير في خلايا سرطان الجلد ، إلى أن هذه الآلية قد تكون مهمة في القضاء على الخلايا ما قبل السرطانية لدى البشر. [37] إذا تم تخطي exon 6 ، فإن mRNA الناتج يشفر بروتين Fas القابل للذوبان الذي لا يعزز موت الخلايا المبرمج. يعتمد تضمين أو تخطي exon على نوعين من البروتينات المضادة ، TIA-1 وبروتين ربط المسالك بولي بريميدين (PTB).

  • الموقع المانح 5 بوصات في intron downstream من exon 6 في pre-mRNA لديه اتفاق ضعيف مع تسلسل الإجماع ، ولا يرتبط عادةً بـ U1 snRNP. إذا لم يتم الربط مع U1 ، يتم تخطي exon (انظر "a" في الشكل المرافق).
  • يؤدي ارتباط بروتين TIA-1 إلى موقع محسن الربط الداخلي إلى استقرار ارتباط U1 snRNP. [3] مجمع الموقع المانح الناتج 5 'يساعد في ربط عامل التضفير U2AF بموقع لصق 3 في المنبع من exon ، من خلال آلية غير معروفة بعد (انظر ب). [38]
  • يحتوي Exon 6 على كاتم صوت الربط الخارجي الغني بالبيريميدين ، ure6، حيث يمكن ربط PTB. إذا ارتبط PTB ، فإنه يثبط تأثير مجمع المانحين 5 بوصات على ربط U2AF بالموقع المستقبِل ، مما يؤدي إلى تخطي exon (انظر ج).

هذه الآلية هي مثال على تعريف exon في الربط. يتجمع الجسيم اللزج على إنترون ، وتقوم الوحدات الفرعية snRNP بطي الحمض النووي الريبي بحيث يتم ربط طرفي الإنترون 5 'و 3'. ومع ذلك ، فإن الأمثلة التي تمت دراستها مؤخرًا مثل هذا المثال تظهر أن هناك أيضًا تفاعلات بين نهايات exon. في هذه الحالة بالذات ، تعد تفاعلات تعريف exon ضرورية للسماح بربط عوامل التضفير الأساسية قبل تجميع الجسيمات المتصاعدة على الإنترونات المرافقة. [38]

منافسة المنشط القامع: HIV-1 تات تحرير exon 2

ينتج فيروس نقص المناعة البشرية ، وهو الفيروس القهقري الذي يسبب الإيدز في البشر ، نسخة أولية من الحمض النووي الريبي ، والتي يتم تقطيعها بطرق متعددة لإنتاج أكثر من 40 مرنا مختلفًا. [39] التوازن بين النصوص المقسمة تفاضليًا يوفر mRNAs متعددة ترميز منتجات مختلفة مطلوبة للتكاثر الفيروسي. [40] أحد النصوص المقسمة تفاضليًا يحتوي على ملف تات الجين ، حيث يكون exon 2 عبارة عن exon كاسيت يمكن تخطيها أو تضمينها. يتم تنظيم إدراج tat exon 2 في RNA عن طريق المنافسة بين مثبط الربط hnRNP A1 وبروتين SR SC35. ضمن exon 2 ، يتداخل تسلسل كاتم صوت الربط الخارجي (ESS) وتسلسل مُحسِّن الربط الخارجي (ESE). إذا ارتبط بروتين A1 repressor بـ ESS ، فإنه يبدأ الارتباط التعاوني لجزيئات A1 ​​المتعددة ، ويمتد إلى موقع 5 'المانحين المنبع من exon 2 ويمنع ارتباط عامل الربط الأساسي U2AF35 بجهاز البولي بريميدين. إذا كان SC35 يرتبط بـ ESE ، فإنه يمنع الربط A1 ويحافظ على موقع 5 'المانحين في حالة يمكن الوصول إليها لتجميع spliceosome. تضمن المنافسة بين المنشط والمانع إنتاج كلا النوعين من الرنا المرسال (مع إكسون 2 وبدونه). [39]

التضفير البديل هو أحد الاستثناءات العديدة للفكرة الأصلية القائلة بأن تسلسل الحمض النووي يرمز إلى عديد ببتيد واحد (فرضية إنزيم الجين الأول). قد يكون من الأصح الآن أن نقول "جين واحد - العديد من عديد الببتيدات". [41] هناك حاجة إلى معلومات خارجية من أجل تحديد أي عديد ببتيد يتم إنتاجه ، بالنظر إلى تسلسل الحمض النووي وما قبل الرنا المرسال. نظرًا لأن طرق التنظيم موروثة ، فإن هذا يوفر طرقًا جديدة للطفرات للتأثير على التعبير الجيني. [7]

لقد تم اقتراح أن التضفير البديل بالنسبة لحقيقيات النوى كان خطوة مهمة للغاية نحو كفاءة أعلى ، لأنه يمكن تخزين المعلومات بشكل اقتصادي أكثر. يمكن تشفير العديد من البروتينات بواسطة جين واحد ، بدلاً من طلب جين منفصل لكل منها ، وبالتالي السماح ببروتينات أكثر تنوعًا من جينوم ذي حجم محدود. [1] كما أنه يوفر مرونة تطورية. قد تتسبب طفرة نقطة واحدة في استبعاد إكسون معين أو تضمينه في بعض الأحيان من نسخة أثناء التضفير ، مما يسمح بإنتاج بروتين إسوي جديد دون فقدان البروتين الأصلي. [1] حددت الدراسات المناطق المضطربة جوهريًا (انظر البروتينات غير المنظمة جوهريًا) على أنها غنية في exons غير التكوينية [42] مما يشير إلى أن الأشكال الإسوية البروتينية قد تعرض تنوعًا وظيفيًا بسبب تغير الوحدات الوظيفية داخل هذه المناطق. ينعكس هذا التنوع الوظيفي الذي تحققه الأشكال الإسوية في أنماط تعبيرها ويمكن التنبؤ به من خلال مناهج التعلم الآلي. [43] [44] تشير الدراسات المقارنة إلى أن التضفير البديل سبق تعدد الخلايا في التطور ، وتشير إلى أنه ربما تم اختيار هذه الآلية للمساعدة في تطوير الكائنات متعددة الخلايا. [45]

أظهرت الأبحاث التي تستند إلى مشروع الجينوم البشري وتسلسل الجينوم الآخر أن لدى البشر حوالي 30٪ فقط من الجينات أكثر من الدودة المستديرة. أنواع معينة انيقة، وحوالي ضعف عدد الذبابة ذبابة الفاكهة سوداء البطن. أدى هذا الاكتشاف إلى تكهنات بأن التعقيد الأكبر الملحوظ للبشر ، أو الفقاريات بشكل عام ، قد يكون بسبب معدلات أعلى من التضفير البديل في البشر مما هو موجود في اللافقاريات. [46] [47] ومع ذلك ، فإن دراسة على عينات من 100000 ESTs لكل من الإنسان ، والفأر ، والجرذان ، والبقر ، والذباب (D. melanogaster)، الفيروس المتنقل (C. ايليجانس) والنبات نبات الأرابيدوبسيس thaliana لم يتم العثور على اختلافات كبيرة في تواتر الجينات المضفرة بدلاً من ذلك بين البشر وأي من الحيوانات الأخرى التي تم اختبارها. [48] ​​ومع ذلك ، اقترحت دراسة أخرى أن هذه النتائج كانت نتيجة لأعداد مختلفة من ESTs المتاحة لمختلف الكائنات الحية. عندما قارنوا ترددات التضفير البديلة في مجموعات فرعية عشوائية من الجينات من كل كائن حي ، استنتج المؤلفون أن الفقاريات لديها معدلات تضفير بديلة أعلى من اللافقاريات. [49]

قد تؤدي التغييرات في آلية معالجة الحمض النووي الريبي (RNA) إلى التضفير الخاطئ للنصوص المتعددة ، في حين أن تعديلات النوكليوتيدات المفردة في مواقع لصق أو مواقع تنظيم التضفير المتفاعل cis قد تؤدي إلى اختلافات في التضفير لجين واحد ، وبالتالي في mRNA المنتج من a نسخ الجينات الطافرة. أشارت دراسة في عام 2005 تضمنت تحليلات احتمالية إلى أن أكثر من 60٪ من الطفرات المسببة للأمراض البشرية تؤثر على التضفير بدلاً من التأثير المباشر على متواليات التشفير. [50] تشير دراسة حديثة إلى أن ثلث الأمراض الوراثية يحتمل أن يكون لها مكون تضفير. [22] بغض النظر عن النسبة المئوية الدقيقة ، يوجد عدد من الأمراض المرتبطة بالتضفير. [51] كما هو موضح أدناه ، فإن السرطان هو أحد الأمثلة البارزة على الأمراض المرتبطة بالتضفير.

توجد أيضًا mRNAs المقسمة بشكل غير طبيعي في نسبة عالية من الخلايا السرطانية. [5] [6] [8] كشفت التحليلات المجمعة لـ RNA-Seq والبروتيوميات عن تعبير تفاضلي مذهل للأشكال الإسوية لصق البروتينات الرئيسية في مسارات السرطان المهمة. [52] ليس من الواضح دائمًا ما إذا كانت مثل هذه الأنماط الشاذة من التضفير تساهم في النمو السرطاني ، أم أنها مجرد نتيجة لتشوهات خلوية مرتبطة بالسرطان. بالنسبة لأنواع معينة من السرطان ، كما هو الحال في القولون والمستقيم والبروستاتا ، فقد تبين أن عدد أخطاء الربط لكل سرطان يختلف اختلافًا كبيرًا بين السرطانات الفردية ، وهي ظاهرة يشار إليها باسم عدم استقرار النسخ. [53] [54] كما تبين أن عدم استقرار النسخ يربط بين grealty وانخفاض مستوى التعبير لجينات عامل التضفير. طفرة DNMT3A وقد ثبت أنه يساهم في الأورام الدموية الخبيثة ، وذلك DNMT3Aتظهر خطوط الخلايا المطفرة عدم استقرار نسبي مقارنة بنظيراتها من النوع البري متساوي المنشأ. [55]

في الواقع ، هناك بالفعل انخفاض في التضفير البديل في الخلايا السرطانية مقارنة بالخلايا الطبيعية ، وتختلف أنواع التضفير على سبيل المثال ، تظهر الخلايا السرطانية مستويات أعلى من احتباس الإنترون من الخلايا الطبيعية ، ولكن مستويات أقل من تخطي exon. [56] قد ترجع بعض الاختلافات في التضفير في الخلايا السرطانية إلى التكرار المرتفع للطفرات الجسدية في جينات عامل التضفير ، [8] وقد ينتج بعضها عن التغيرات في فسفرة عوامل التضفير العابرة للمفعول. [7] قد ينتج البعض الآخر عن طريق التغيرات في الكميات النسبية لعوامل الربط الناتجة على سبيل المثال ، فقد ثبت أن خلايا سرطان الثدي لديها مستويات متزايدة من عامل التضفير SF2 / ASF. [57] وجدت إحدى الدراسات أن نسبة صغيرة نسبيًا (383 من أكثر من 26000) من متغيرات التضفير البديلة كانت أعلى بشكل ملحوظ في التردد في الخلايا السرطانية من الخلايا الطبيعية ، مما يشير إلى أن هناك مجموعة محدودة من الجينات التي ، عند التضفير الخاطئ ، المساهمة في تطور الورم. [58] ومع ذلك ، يُعتقد أن الآثار الضارة للنصوص التي تمت تقطيعها بشكل خاطئ يتم حمايتها وإزالتها بواسطة آلية مراقبة جودة ما بعد النسخ الخلوي تسمى تحلل الرنا المرسال غير المعقول [NMD]. [59]

أحد الأمثلة على متغير التضفير المحدد المرتبط بالسرطان موجود في أحد جينات DNMT البشرية. تقوم ثلاثة جينات DNMT بتشفير الإنزيمات التي تضيف مجموعات الميثيل إلى الحمض النووي ، وهو تعديل غالبًا ما يكون له تأثيرات تنظيمية. تم العثور على العديد من DNMT3B mRNAs بشكل غير طبيعي في الأورام وخطوط الخلايا السرطانية. في دراستين منفصلتين ، تسبب التعبير عن اثنين من هذه mRNAs بشكل غير طبيعي في خلايا الثدييات في تغييرات في أنماط مثيلة الحمض النووي في تلك الخلايا. كما نمت الخلايا التي تحتوي على أحد الرنا المرسال غير الطبيعي أسرع مرتين من خلايا التحكم ، مما يشير إلى مساهمة مباشرة في تطور الورم بواسطة هذا المنتج. [7]

مثال آخر هو رون (MST1R) بروتو أونكوجين. من الخصائص المهمة للخلايا السرطانية قدرتها على تحريك الأنسجة الطبيعية وغزوها. إنتاج نسخة مقسمة بشكل غير طبيعي من رون وجد أنه يترافق مع زيادة مستويات SF2 / ASF في خلايا سرطان الثدي. يؤدي الشكل الإسوي غير الطبيعي لبروتين رون المشفر بواسطة هذا الرنا المرسال إلى حركية الخلية. [57]

تم تحديد التعبير المفرط لمتغير لصق مقطوع لجين FOSB - ΔFosB - في مجموعة معينة من الخلايا العصبية في النواة المتكئة على أنها الآلية السببية المشاركة في تحريض وصيانة إدمان المخدرات والمكافآت الطبيعية. [60] [61] [62] [63]

تشير الدراسات الاستفزازية الحديثة إلى وظيفة أساسية لهيكل الكروماتين وتعديلات الهيستون في تنظيم الربط البديل. تشير هذه الرؤى إلى أن التنظيم اللاجيني لا يحدد فقط أجزاء الجينوم التي يتم التعبير عنها ولكن أيضًا كيفية تقطيعها. [64]

يعد التحليل على مستوى الجينوم للربط البديل مهمة صعبة. عادةً ، تم العثور على نصوص مقسمة بدلاً من ذلك من خلال مقارنة متواليات EST ، ولكن هذا يتطلب تسلسل أعداد كبيرة جدًا من EST. تأتي معظم مكتبات EST من عدد محدود جدًا من الأنسجة ، لذلك من المحتمل أن يتم تفويت متغيرات لصق الأنسجة الخاصة على أي حال. ومع ذلك ، فقد تم تطوير مناهج عالية الإنتاجية للتحقيق في التضفير ، مثل: التحليلات القائمة على المصفوفة الدقيقة للحمض النووي ، ومقايسات ربط الحمض النووي الريبي ، والتسلسل العميق. يمكن استخدام هذه الطرق للكشف عن تعدد الأشكال أو الطفرات في أو حول عناصر التضفير التي تؤثر على ارتباط البروتين. عندما يقترن مع فحوصات الربط ، بما في ذلك في الجسم الحي فحوصات الجينات المراسل ، يمكن بعد ذلك تحليل التأثيرات الوظيفية لتعدد الأشكال أو الطفرات على التضفير لنصوص ما قبل الرنا المرسال. [22] [25] [65]

في تحليل المصفوفة الدقيقة ، تمثل صفيفات شظايا الحمض النووي exons الفردية (على سبيل المثال Affymetrix exon microarray) أو حدود exon / exon (على سبيل المثال المصفوفات من ExonHit أو Jivan). ثم يتم فحص المصفوفة باستخدام (كدنا) المسمى من الأنسجة ذات الأهمية. يرتبط المسبار (cDNAs) بالحمض النووي من الإكسونات المتضمنة في الرنا المرسال في أنسجتها الأصلية ، أو بالحمض النووي من الحدود حيث تم ربط اثنين من الإكسونات. يمكن أن يكشف هذا عن وجود جزيئات mRNAs موصولة بدلاً من ذلك. [66]

يستخدم CLIP (الربط المتبادل والترسيب المناعي) الأشعة فوق البنفسجية لربط البروتينات بجزيئات الحمض النووي الريبي في الأنسجة أثناء التضفير. ثم يتم ترسيب بروتين منظم التضفير العابر المفعول باستخدام أجسام مضادة محددة. عندما يتم عزل واستنساخ الحمض النووي الريبي المرتبط بهذا البروتين ، فإنه يكشف عن التسلسلات المستهدفة لهذا البروتين. [4] هناك طريقة أخرى لتحديد البروتينات المرتبطة بـ RNA ورسم خرائط ارتباطها بنصوص ما قبل mRNA وهي "تقييم ميكروأري للأبتاميرات الجينومية بالتحول (MEGAshift)". net [67] تتضمن هذه الطريقة تكييف "التطور المنهجي للروابط" بواسطة طريقة Exponential Enrichment (SELEX) "[68] مع قراءات تعتمد على ميكروأري. قدم استخدام طريقة MEGAshift نظرة ثاقبة لتنظيم التضفير البديل من خلال السماح بتحديد التسلسلات في نصوص ما قبل mRNA التي تحيط بـ exons المقسمة بدلاً من ذلك والتي تتوسط الارتباط بعوامل الربط المختلفة ، مثل ASF / SF2 و PTB. [69] تم استخدام هذا النهج أيضًا للمساعدة في تحديد العلاقة بين البنية الثانوية للحمض النووي الريبي وربط عوامل التضفير. [24]

تم استخدام تقنيات التسلسل العميق لإجراء تحليلات على مستوى الجينوم لـ mRNAs - غير المعالجة والمعالجة - وبالتالي توفير نظرة ثاقبة في التضفير البديل. على سبيل المثال ، تشير النتائج من استخدام التسلسل العميق إلى أنه في البشر ، يخضع ما يقدر بنحو 95٪ من النصوص من جينات multexon لعملية الربط البديلة ، مع عدد من نسخ ما قبل mRNA مقسمة بطريقة خاصة بالأنسجة. [2] كما تم تطوير الجينوميات الوظيفية والنهج الحسابية القائمة على التعلم متعدد الأمثلة لدمج بيانات RNA-seq للتنبؤ بوظائف الأشكال الإسوية المقسمة بدلاً من ذلك. [44] كما ساعد التسلسل العميق في في الجسم الحي الكشف عن الوهب العابر التي يتم إطلاقها أثناء الربط ، وتحديد تسلسل موقع الفرع ، ورسم الخرائط على نطاق واسع لنقاط الفروع في نصوص ما قبل الرنا المرسال البشري. [70]

يتيح استخدام مقايسات المراسل العثور على بروتينات التضفير المتضمنة في حدث تضفير بديل محدد عن طريق بناء جينات مراسلة تعبر عن واحد من اثنين من بروتينات الفلورسنت المختلفة اعتمادًا على تفاعل التضفير الذي يحدث. تم استخدام هذه الطريقة لعزل المسوخات التي تؤثر على التضفير وبالتالي لتحديد البروتينات التنظيمية الجديدة للربط المعطل في تلك المسوخات. [4]

هناك مجموعة من قواعد بيانات الربط البديلة. [71] [72] [73] قواعد البيانات هذه مفيدة في العثور على الجينات التي تحتوي على ما قبل الرنا المرسال التي تمر بأحداث التضفير البديلة والربط البديل أو لدراسة التأثير الوظيفي للتضفير البديل.


شاهد الفيديو: حكم تجارة العملات forex. عبدالله رشدي - abdullah rushdy (قد 2022).