معلومة

بدائل PCR

بدائل PCR


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل دورات من التسخين والتبريد لإفساد الخيوط ، مما يستدعي بوليميرات DNA خاصة قابلة للحرارة. في الخلية ، أثناء النسخ المتماثل ، يقوم Helicase بفك الحمض النووي دون الحاجة إلى الحرارة. هل يمكن استخدام Helicase بدلاً من التدوير الحراري لتحقيق الحمض النووي الفردي الذي تقطعت به السبل؟ هل سيؤدي ذلك إلى القضاء على الحاجة إلى التدوير الحراري ، ومن ثم البوليميرات الخاصة المقاومة للحرارة؟


تم تحريره بعد التوضيحات المعنية ،

لنبدأ بالوظائف الطبيعية لكلا الإنزيمين. Helicases يفترق خيوط الحمض النووي بينما البوليميراز تركيب خيوط الحمض النووي كما هو موضح في الشكل التالي. (مصدر الصورة: ويكيميديا ​​كومنز)

شاهد هذه الرسوم المتحركة ، وسوف تزيل شكوكك حول الوظيفة. ومع ذلك ، فإن بوليميراز RNA له كلا النشاطين.

في الخلايا ، يلزم عمل الهليكاز لفصل خيوط الحمض النووي. بعد ذلك يمكن أن يعمل البوليميراز فقط. أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يتم فصل الخيوط عن طريق زيادة درجة الحرارة. هذه العملية تسمى ذوبان الحمض النووي. درجة الحرارة هذه مرتفعة بشكل عام ، حيث تتراوح ما بين 90 درجة مئوية و 100 دولارًا أمريكيًا حسب التسلسل الخاص بك. عند درجة الحرارة هذه ، لن تعمل العديد من البروتينات ، وبالتالي فأنت بحاجة إلى بوليماراز قابل للحرارة. منذ حوالي 40 عامًا ، تم اكتشاف مثل هذا الإنزيم من الكائنات القاسية (Chien et al 1976). الآن هو متاح تجارياً كـ Taq polymerase. هذه الإنزيمات عبارة عن بروتينات مؤتلفة مع بعض الطفرات التي زادت أيضًا من إنتاجيتها واستقرارها (Villbrandt et al 1997).

نأتي الآن إلى سؤالك الرئيسي (الذي أعتقد أنني فهمته بشكل صحيح هذه المرة).

تم بالفعل اختبار المفهوم الذي تسأل عنه بنجاح في اكتشاف الحمض النووي الريبي. استخدم الباحثون "النسخ العكسي متساوي الحرارة التضخيم المعتمد على الهلياز"(Goldmeyer et al 2007). لم يستخدموا الهليكاز فقط ولكن أيضًا النسخ العكسي (لأنهم كانوا يكتشفون الحمض النووي الريبي). توضح الصورة التالية (المأخوذة من الورقة) الخطوات الرئيسية في هذه العملية. تشير الدوائر إلى بوليميريز الحمض النووي ، وتشير المربعات إلى عكس النسخ ، والمثلثات تشير إلى هيليكاز.

نقلا عن الورقة (النقاط هي لي) ،

تشير الأسهم إلى بادئات محددة ، والدوائر تشير إلى بوليميراز الحمض النووي ، والمربعات تشير إلى النسخ العكسي ، والمثلثات تشير إلى الهليكاز. يتم تصنيع أول حبلا (كدنا) لأول مرة عن طريق النسخ العكسي

  • (الخطوتين 1 و 2). ثم يتم فصل الهجينة RNA-DNA من النسخ العكسي بواسطة يوفرد هليكازات تولد قوالب RNA و DNA مفردة تقطعت بهم السبل
  • (الخطوتين 3 و 4). تدخل ssRNA الجولة التالية من تفاعل RT
  • (الخطوة 5-أ) توليد المزيد من حبلا الأولى (كدنا). تم تحويل ssDNA إلى DNA مزدوج الشريطة بواسطة بوليميراز DNA
  • (الخطوة 5-ب) وتضخيمها بشكل متزامن في تفاعل tHDA
  • (الخطوات من 6 إلى 9). تكرر هذه العملية نفسها لتحقيق تضخيم أسي لتسلسل هدف الحمض النووي الريبي.

تم تطوير تقنيات تضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة. لا تحتاج إلى دورة حرارية لتضخيم شظايا الحمض النووي بهذه الطريقة.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17720718


علم الأحياء الدقيقة: الثقافة مقابل الجزيئية

يلقي عالم الأحياء الدقيقة الدكتور مارك ويلكس نظرة على الموضوعات والرسائل الرئيسية التي انبثقت عن مؤتمر الجمعية البريطانية للتكنولوجيا الميكروبية هذا العام.

المؤتمر العلمي السنوي الثاني والثلاثون الأخير للجمعية البريطانية للتكنولوجيا الميكروبية كان بعنوان "موضوعات ساخنة في علم الأحياء الدقيقة". ركز على مجالات في علم الأحياء الدقيقة الطبية حيث كان التغيير سريعًا ومن المرجح أن يكون أكثر من ذلك في المستقبل القريب.

في علم الفيروسات السريري التشخيصي ، كان هناك انتقال بالجملة من الاستنبات إلى تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) ، ومؤخراً التسلسل. في المقابل ، ظل علم الجراثيم التشخيصي قائمًا إلى حد كبير على الثقافة. هناك العديد من الأسباب لهذا ، بما في ذلك التكلفة ، والمهارات اللازمة ، وحقيقة أن أساليب الثقافة ، مهما كانت القيود ، كافية بشكل عام.

كانت الآراء مستقطبة ، حيث رفض البعض الانخراط في الأساليب الجزيئية الجديدة ، بينما ينظر آخرون إلى أولئك الذين ما زالوا يستخدمون الثقافة ويصرون على أن تفاعل البوليميراز المتسلسل أصبح الآن قديمًا وأن تسلسل الجيل التالي (NGS) هو السبيل الوحيد للذهاب. اقترح البعض أن العقبة الوحيدة أمام التسلسل عالي الإنتاجية هي "المحافظة الفطرية للمهنة".

يوضح نطاق الموضوعات المختلفة التي تم تناولها في الاجتماع أنه لا يوجد ، في الواقع ، تعارض بين الطريقتين المختلفتين. يتم تحقيق مكاسب كبيرة باستخدام المناهج الجزيئية والثقافية للتعامل مع المواقف المختلفة ، وفي بعض الحالات ، يؤدي النهج المركب إلى تحقيق أفضل النتائج. دعونا نلقي نظرة على كيفية استخدام الأساليب في بعض المجالات سريعة التغير.

تحسين تشخيص الإنتان

قدم البروفيسور بول دارك ، من جامعة مانشستر وقائد الرعاية الحرجة بشبكة البحوث السريرية في المعهد الوطني لحقوق الإنسان ، العرض الأول عن "التحرك نحو تقديم الطب الدقيق في حالات تعفن الدم".

هنا لدينا موقف غير عادي حيث المعيار الذهبي - ثقافة الدم الإيجابية - ليس جيدًا في الواقع. ثقافات الدم سلبية حتى في تلك التي يشتبه بشدة في تعفن الدم لأسباب سريرية. ربما يكون السبب الأكثر أهمية لهذا هو العلاج المسبق بالمضادات الحيوية ، وليس عدم كفاية الثقافة نفسها. بالإضافة إلى كونها غير حساسة ، غالبًا ما تكون طرق الاستزراع بطيئة جدًا بحيث لا تكون مفيدة في حالات الإنتان الشديد.

من غير المحتمل أن يكون هناك أي تحسينات كبيرة في طرق الاستزراع ، فما هي البدائل الجزيئية؟ هناك جهود متزايدة لتطوير طرق جزيئية للكشف السريع عن الحمض النووي البكتيري والفطري مباشرة من الدم دون الحاجة إلى زراعة الدم. لا تتأثر هذه بالتجربة قبل العلاج بالمضادات الحيوية. تمت مراجعة العديد من الطرق التي تحمل علامة CE وأظهرت إمكانات كبيرة ، على الرغم من أن تكلفة كل اختبار كانت عالية.

تتمثل الطريقة الجزيئية التكميلية في النظر إلى المؤشرات الحيوية للمضيف ، مثل CRP و PCT ، التي يتم إطلاقها في الدورة الدموية استجابةً للمنبهات الحادة المؤيدة للالتهابات. ترتبط المنبهات البكتيرية بالاستجابات السريعة والعالية ، والأهم من ذلك أنها تسقط بسرعة مع العلاج الصحيح للعدوى البكتيرية. لذلك ، عند استخدامها بشكل كمي ، لديها القدرة على المساعدة في اتخاذ قرارات بدء المضادات الحيوية ووقفها. على الرغم من أنهم بالطبع لا يقدمون أي معلومات مباشرة حول مسببات الأمراض أو حساسية المضادات الحيوية.

من المحتمل أن مجموعة من الطرق الجزيئية لاكتشاف الحمض النووي والواصمات الحيوية للمضيف ستعطي أفضل النتائج وتؤدي إلى تقدم كبير في التشخيص الموثوق والسريع للإنتان.

مسببات الالتهاب الرئوي المكتسب من المجتمع (CAP)

أحد المجالات التي ظهر فيها تفوق الأساليب الجزيئية بوضوح هو تحديد المسببات المرضية للالتهاب الرئوي المكتسب من المجتمع. في عصر ما قبل المضادات الحيوية ، العقدية الرئوية يمكن عزل ما يصل إلى 95٪ من الحالات ، ولكن في معظم الحالات لا يتم عزل العامل الممرض الموثوق به. ليس من الواضح ما إذا كان هذا يمثل تغييرًا حقيقيًا في مسببات المرض ، أو استخدام المضادات الحيوية على نطاق واسع أو كليهما.

وصفت الدكتورة كيت تمبلتون ، عالمة استشارية إكلينيكية ، إدنبرة ، دراسة تاريخية حديثة أجروا فيها اختبارًا كميًا متعدد الممرضات لعينات من البلغم لدى البالغين الذين تم نقلهم إلى المستشفى باستخدام CAP. لقد جمعوا عينات من البلغم المخاطي القيح (96٪) وشفط القصبة الهوائية (4٪) من 323 بالغًا مصابين بالتهاب رئوي مؤكد إشعاعيًا تم إدخالهم إلى مستشفيين للرعاية الثالثة في المملكة المتحدة. لقد أجروا الثقافة الكمية وتعدد الإرسال في الوقت الفعلي لـ PCR لـ 26 من البكتيريا والفيروسات التنفسية. باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل ، حددوا عامل ممرض محتمل (بكتيري أو فيروسي) في 87٪ من المرضى ، مقارنة بـ 39٪ باستخدام المزرعة وحدها. كما هو متوقع ، اكتشف تفاعل البوليميراز المتسلسل البكتيريا بشكل متكرر أكثر من الزرع في المرضى الذين تلقوا المضادات الحيوية (77.6٪ مقابل 32.1٪).

بطبيعة الحال ، فإن عزل أحد العوامل الممرضة الموثوقة لا يثبت أنه مسؤول عن المرض في كل حالة ، خاصة وأن العديد من البكتيريا التي تم اكتشافها تنتقل في الجهاز التنفسي العلوي دون حدوث ضرر واضح في كثير من السكان. ومع ذلك ، فإن نتائج الدراسة مشجعة للغاية.

تحديد البكتيريا الفطرية

NGS للكشف عن المتفطرة السلية من عينات البلغم قد ثبت أنه من الممكن ، ومع ذلك ، في الوقت الحاضر الكشف عن المتفطرات يعتمد على الثقافة. وصف الدكتور بيتر جان سيسينز ، رئيس وحدة المضادات الحيوية والمقاومة في المركز المرجعي الوطني للبكتيريا المتفطرة والسل في بلجيكا ، استخدام MALDI-TOF للتعرف السريع على المتفطرات. في هذه الحالة ، تكون الجزيئات عبارة عن بروتينات وليست أحماض نووية ، كما في الأمثلة الأخرى الموصوفة.

لقد أحدث تحديد البكتيريا المستنبتة بواسطة MALDI-TOF ثورة في طريقة العمل في معظم المعامل في المملكة المتحدة وأوروبا. يمكن الآن التعرف على الغالبية العظمى من البكتيريا والخمائر في دقائق مع الحد الأدنى من التحضير. ومع ذلك ، فقد ثبت أن التعرف على البكتيريا الفطرية والفطريات الخيطية أكثر صعوبة. وصف الدكتور Ceyssens بعض الطرق البسيطة التي يتم فيها قتل الثقافات الإيجابية بالحرارة ، واستخراجها بالإيثانول ، وصوتها ثم تحميلها على MALDI-TOF بالطريقة المعتادة. وقد سمح ذلك بتحديد ما يقرب من 90٪ من الأنواع المختلفة من المتفطرات غير السل التي يتم مواجهتها في المختبرات السريرية في غضون دقائق ، وهي خطوة كبيرة إلى الأمام على التقنيات الحالية المعقدة والمكلفة وتستغرق عدة أيام. قد تكون هذه الطريقة الجزيئية الرخيصة والسريعة متفوقة على NGS في معظم الحالات.

المادة المظلمة الميكروبية

أوضح البروفيسور ويليام ويد ، من جامعة كوين ماري في لندن ، كيف يمكن استخدام الأساليب الجزيئية والثقافية جنبًا إلى جنب لزيادة معرفتنا بعلم الأحياء الدقيقة بشكل كبير في مجال ربما تكون فيه قيود الثقافة مقبولة للغاية. كان حديثه بعنوان "تربية غير المثقفين". اتضح أن هذا ليس إشارة إلى الجمهور ، ولكن إلى نهج مبتكر ومضني للغاية لزراعة بكتيريا جديدة من الفم.

عادة ما تكون بكتيريا الفم شديدة الحساسية وبطيئة النمو - وتتطلب وسائط معقدة وأوقات حضانة طويلة. العديد من اللاهوائيات صارمة تتطلب عناية إضافية في جمع العينات ونقلها واحتضانها.

من الصعب إجراء تحليل ثقافي شامل للعينات ، مما يعني أنه من الممكن فقط تحليل أعداد صغيرة من العينات وحوالي نصف البكتيريا الفموية المكتشفة بالطرق الجزيئية غير قابلة للزراعة.

تنتمي بعض هذه الشُعب الموجودة جيدًا ، مثل Bacteroidetes ، حيث يوجد العديد من الممثلين المثقفين ، مثل باكتيرويديز الهشة، والتي كانت معروفة منذ أكثر من قرن. يشكل البعض الآخر سلالات متفرعة عميقة مكتشفة حديثًا مع عدم وجود ممثلين قابلين للزراعة. يمكن أن تشمل أسباب عدم النجاح تحت أخذ العينات - لأن الثقافة تتطلب عمالة أكثر بكثير من الطرق الجزيئية - والاعتماد على البكتيريا الأخرى في المجتمع. قد يكون هذا بسبب متطلبات غذائية أو إشارات معينة ، والتي يصعب تكاثرها في المختبر أو قد تكون البكتيريا نفسها داخل الخلايا وطفيلية وبالتالي يصعب نموها في الثقافة النقية.

ركز حديثه على محاولاته لثقافة أعضاء اللجوء غير المثقفين التآزر. كانت الفرضية الأساسية هي أن بعض البكتيريا الفموية غير المزروعة تتطلب وجود بكتيريا أخرى ، لذلك قد يكون من الممكن زراعتها في البداية في مزرعة مختلطة في المختبر ، بهدف فطامها في النهاية عن اعتمادها على البكتيريا الأخرى وبالتالي الحصول على مزارع نقية.

زرعت العينة المأخوذة من الجيب اللثوي على أجار الدم وحضنت لا هوائي لمدة 10 أيام. تم بعد ذلك تصوير الألواح ، وطليها بالنسخة المتماثلة ومسحها على أغشية النايلون. تم تهجين الأغشية مع التآزر مسبار السماح بمنطقة التآزر يتم وضع المستعمرات بسرعة على اللوحة الأصلية. يمكن بعد ذلك زراعة هذه المستعمرات على أجار الدم مرة أخرى وبالتالي يتم إثراء الثقافة الأولية تدريجيًا التآزر. بعد ثمانية ممرات ، يتكون الخليط من أربع بكتيريا موصوفة جيدًا.

أظهرت الطرق الجزيئية أنه لم يكن هناك فقط الأنواع الأربعة من البكتيريا ، ولكن أيضًا التآزر النوع W0 90. بالمرور 12 ، كان هذا الكائن الحي قادرًا على النمو بشكل مستقل ، على الرغم من وجوده بجانب ثقافة Parvimonas micra. تم وصف الكائن الحي ، المسمى (البكتريا الحمضية) وتسلسل الجينوم بأكمله.

تذكر أن كل مقطع استغرق 10 أيام وأن هناك حاجة إلى 12 مقطعًا للحصول على العزلة في مزرعة نقية ، لذلك كانت هناك حاجة لما يقرب من ستة أشهر من العمل الشاق لاستعادة الكائن الحي في الثقافة النقية.

لا يمكن أن يتم ذلك إلا من خلال الجمع بين الأساليب الثقافية التقليدية والطرق الجزيئية ، وهو يظهر حقًا عبثية محاولة طرح الأساليب الثقافية والجزيئية على أنها معادية لبعضها البعض.

مارك ويلكس هو عالم سريري رائد في علم الأحياء الدقيقة في بارتس هيلث NHS Trust وعضو لجنة الجمعية البريطانية للتكنولوجيا الميكروبية.


خيارات الوصول

شراء مقال واحد

الوصول الفوري إلى المقال الكامل PDF.

سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

اشترك في المجلة

الوصول الفوري عبر الإنترنت إلى جميع الإصدارات اعتبارًا من عام 2019. سيتم تجديد الاشتراك تلقائيًا سنويًا.

سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.


الملخص

كائنات التقييم المشتبه في إصابتهم بالعدوىالمتصورة chez des enfants en Tanzania et au Kenya.

الميثودات Des gouttes de sang digital ont été Collectées 338 enfants avec une suspicion Clinique de malaria non Compliquée dans les Cliniques de Tanzania et du Kenya. La présence de parasites de المتصورة a été détectée par la microscopie، par des tests of التشخيص السريع (TDR) و moléculaires Quantitatives basées sur l'amplification des acides nucléiques (QT-NASBA) et par la PCR. Les résultats ont été Comparés et analysés pour leurs concordances.

Résultats Le degré de concordance obtenu était élevé، allant de 88،6٪ à 100٪ entre les TDR ou les tests moléculaires et la microscopie. Dans les المناطق الريفية في كينيا من حالات الإصابة بالملاريا ، معامل الارتباط allait de 0،94 لـ TDR à 0.76 pour la PCR. Dans les area urbaines de la Tanzania avec une incidence faible des cas، pour les TDR une valeur de ص = 1،0 a étérouvée mais cette valeur était de 0،25 pour la PCR et de 0،33 pour NASBA.

الاستنتاجات La malaria est surestimée lorsque le Diagnostic is uniquement basé sur les signes Clines. لا الملاريا هي مؤكدة لورسك للتشخيص هي فريدة من نوعها لعيادات حول العلامات. Dès lors، la definitely de labouratoire est essentielle. La microscopie is une méthode fiable dans les rifes où la malaria est fréquemment rencontrée mais les TDR sont une bonne avec l'avantage d’être simples and rapides. ليه لاختبارات moléculaires sont plus sensibles mais plus difficiles à implémenter dans les area plants. مناطق حدوث حالات الإصابة بالإضافة إلى الكائنات الحية ، واختبارات الموليكورات ديتكتنت ونومبر المعنوية بالإضافة إلى الإصابة بالعدوى في الدمالمتصورة que les TDR ou la microscopie. عرض الاختبارات على نطاق واسع صعبًا ، ووفرًا لنظام الاكتشاف البسيط والمتوسط ​​، والمُروجون للطلبات المستقبلية.


DPCR: مراجعة التكنولوجيا

تفاعل البلمرة المتسلسل الرقمي (dPCR) هو طريقة جديدة للتقدير الكمي المطلق للأحماض النووية المستهدفة. يعتمد التحديد الكمي بواسطة dPCR على حقيقة أن التوزيع العشوائي للجزيئات في العديد من الأقسام يتبع توزيع بواسون. يعمل كل قسم كمفاعل دقيق PCR فردي ويتم اكتشاف الأقسام التي تحتوي على تسلسل هدف مضخم بواسطة التألق. تكفي نسبة الأقسام الموجبة لـ PCR لتحديد تركيز التسلسل المستهدف دون الحاجة إلى المعايرة. مكّن التقدم في علم الموائع الدقيقة من الثورة الحالية في القياس الرقمي من خلال توفير طرق تقسيم فعالة. في هذه المراجعة ، قارنا المفاهيم الأساسية وراء القياس الكمي للأحماض النووية بواسطة dPCR والكمي في الوقت الحقيقي PCR (qPCR). نقوم بتفصيل الإحصائيات الأساسية لـ dPCR وشرح كيف تحدد مقاييس الدقة والأداء. نقوم بمراجعة تنسيقات PCR الرقمية المختلفة للموائع الدقيقة ، ونقدم مبادئها الفيزيائية الأساسية ، ونحلل التطور التكنولوجي لمنصات dPCR. نقدم استراتيجيات مضاعفة الإرسال الجديدة التي تم تمكينها بواسطة dPCR ونفحص كيف يمكن أن يكون التضخيم متساوي الحرارة بديلاً لـ PCR في المقايسات الرقمية. أخيرًا ، نحدد ما إذا كانت المزايا النظرية لـ dPCR على qPCR صحيحة من خلال الاطلاع على الدراسات التي تقارن بشكل مباشر المقايسات المنفذة بكلتا الطريقتين.

الكلمات الدالة: صفائف القياس الكمي المطلق لل microwells dPCR الرقمية PCR قطيرة جزيئات الموائع الدقيقة غرف الموائع الدقيقة تقنيات الموائع الدقيقة على الصمامات الرقيقة التي تقسم qPCR الكمي في الوقت الحقيقي PCR في الوقت الحقيقي PCR.

بيان تضارب المصالح

الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.

الأرقام

( أ ) مبادئ تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). كل دورة PCR ...

مقايسة qPCR في الوقت الحقيقي باستخدام…

مقايسة qPCR في الوقت الحقيقي باستخدام منحنى قياسي. ( أ ) منحنيات التضخيم لـ ...

مبادئ PCR الرقمية. ال…

مبادئ PCR الرقمية. العينة مقسمة إلى عدة أقسام مستقلة مثل ...

مقارنة بين التقنيات المعتمدة على تفاعل البوليميراز المتسلسل. في…

مقارنة بين التقنيات المعتمدة على تفاعل البوليميراز المتسلسل. في PCR التقليدي ، يتم تحليل منتجات التضخيم عند ...

دقة القياس الكمي لل dPCR. ال…

دقة القياس الكمي لل dPCR. دقة dPCR غير موحدة وتعتمد على ...

منصات التقسيم النشطة. ( أ…

منصات التقسيم النشطة. ( أ ) رسم تخطيطي لصمام الضغط في ...

منصات التقسيم السلبي. ( أ…

منصات التقسيم السلبي. ( أ ) Megapixel Digital PCR باستخدام مصفوفات مستحلب مستو ...

منصات ذاتية التعبئة والتقسيم. (...

منصات ذاتية التعبئة والتقسيم. ( أ ) هندسة لتكوين مصيدة متداخلة ...

المنصات القائمة على قطرات موائع جزيئية. ( أ…

المنصات القائمة على قطرات موائع جزيئية. ( أ ) رسم تخطيطي يوضح توليد القطرات باستخدام ...

فحوصات القطيرات المتعددة dPCR. dPCR ...

فحوصات القطيرات المتعددة dPCR. يمكن مضاعفة فحوصات dPCR عن طريق ترميز المستوى ...


تطوير معايير لتوفير المختبرات البيولوجية في سياقات منخفضة الموارد: إجراءات ورشة عمل (2019)

قدم تشارلز تشيو ، دكتوراه في الطب ، وهو عضو في لجنة تخطيط ورشة العمل ، عرضًا بعنوان "التشخيص الجزيئي في إعدادات الموارد المنخفضة. & rdquo وصف طرق الاختبار الميكروبيولوجية ldquoclassical & rdquo (أي غير الجزيئية) على النحو التالي:

  • حضاره
  • الأمصال
  • المجهر
  • التنميط البيوكيميائي
  • اختبار المستضد المباشر: المقايسات المناعية للتدفق الجانبي وامتصاص / التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI) لتحديد البكتيريا والفيروسات والفطريات

تشمل التشخيصات الجزيئية ، أو الكشف المستند إلى الحمض النووي الريبي & ldquo ، مجموعة متنوعة من التقنيات الجديدة وحتى التجريبية ، مثل:

  • التهجين (المجسات) ، على سبيل المثال ، متجمع بشكل منتظم متكرر متناوب قصير (CRISPR) - فحوصات قائمة على CAS
  • التنميط الجيني
  • التسلسل ، بما في ذلك التسلسل النانوي
  • تضخيم الإشارة
  • التضخيم المستهدف (تفاعل البلمرة المتسلسل [PCR]): مفرد ومضاعف

توفر اختبارات التشخيص الجزيئي بعض المزايا في الأماكن منخفضة الموارد. يتم تعطيل العوامل الممرضة للاختبار ، لذا فإن التعامل معها أكثر أمانًا من الطرق التي تتطلب استخدام الكائنات الحية المعدية ، مما يقلل من احتمالية التعرض المهني. أنها لا تعتمد على التضخيم القائم على الثقافة ، وهو أمر مهم لأن العديد من مسببات الأمراض

ليست مثقفة. نظرًا لأن مثل هذا الاختبار المستند إلى الجزيئات يتيح أداء التشخيص مع مسببات الأمراض غير المعدية المعطلة ، فإن الحاجة إلى احتواء BSL-3 أو -4 المكلف والمعقد يتم تجنبها للعمل التشخيصي على مسببات الأمراض شديدة الخطورة. توفر الطرق الجزيئية أيضًا وقت استجابة أسرع ولا تتطلب أحجام عينات كبيرة.

ومع ذلك ، تابع الدكتور تشيو ، الاختبار الجزيئي له أيضًا عيوب كبيرة. أولاً ، هذه الأساليب أغلى من التقنيات التقليدية. لاحظ أحد المشاركين ، على سبيل المثال ، أن تكلفة مجموعة PCR واحدة تساوي حوالي عام واحد وراتب rsquos لعامل المختبر في الأماكن منخفضة الموارد. ثانيًا ، يعتبر تقييم الأداء والتحقق من الصحة والموافقة التنظيمية على العديد من هذه الطرق أمرًا صعبًا ، خاصةً إذا تم تنفيذ العمل خارج بيئات المختبرات السريرية الخاضعة للسيطرة العالية ، والتي قد لا تكون متاحة في الأماكن منخفضة الموارد. استعرض الدكتور تشيو بعض المجالات التي تفتقر إلى معايير الاختبار الجزيئي ، خاصة بالنسبة للبيئات غير المنظمة بدرجة عالية: الضوابط الإيجابية والسلبية ، والمنصات ، والأداء التحليلي ، ومسببات الأمراض المستهدفة ، وقواعد البيانات المرجعية. بسبب هذا النقص في التوحيد القياسي ، فإن نفس الاختبار الذي يتم إجراؤه في معملين مختلفين قد يؤدي إلى نتائج مختلفة ، والاختبار التأكيدي بطيء ومكلف.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن الكيانات التي تصدق عادةً و / أو توافق على مثل هذه الاختبارات (على سبيل المثال ، إدارة الغذاء والدواء الأمريكية [FDA] والمعهد الوطني الأمريكي للمعايير والتكنولوجيا ومنظمة الصحة العالمية والعديد من المنظمات غير الحكومية) لديها لم تفعل ذلك بعد لمعظم التقنيات الجزيئية الجديدة. في الولايات المتحدة ، يوجه الإطار التنظيمي ، تعديلات تحسين المختبرات السريرية (CLIA) ، الاختبارات المعملية السريرية. يحدد الحد الأدنى من المعايير التي تعمل بموجبها جميع المختبرات السريرية. تم اعتماد مختبرات CLIA عن طريق التفتيش من قبل وكالة مثل الكلية الأمريكية لعلم الأمراض. يتطلب الامتثال لـ CLIA التحقق من الصحة وضمان الجودة لجميع الاختبارات المعملية المستخدمة في الرعاية السريرية ، بما في ذلك الاختبارات المطورة في المختبرات. & rdquo يقوم معهد المعايير السريرية والمخبرية (CLSI) أيضًا بإصدار & ldquoGuidelines و mdashCLSI طرق التشخيص الجزيئي للأمراض المعدية & rdquo (CLSI ، 2015). لكن الشهادة بموجب هذه الأطر ليست هي نفسها موافقة إدارة الغذاء والدواء. علاوة على ذلك ، قد لا تفي العديد من المختبرات في الأماكن منخفضة الموارد بمعايير CLIA أو المعايير التنظيمية المماثلة لاختبار الكفاءة ، ودمج الضوابط الموحدة ، وما إلى ذلك.

وأوضح الدكتور تشيو وجود مخاوف ما قبل التحليلية والتحليلية وما بعد التحليلية للتشخيص الجزيئي. تشمل الشواغل السابقة للتحليل الحاجة إلى طرق مناسبة لجمع العينات ، والتوقيت المناسب ، وظروف التخزين المناسبة لكل من الكائنات الحية ومكونات الفحص (على سبيل المثال ،

الحفاظ على سلسلة التبريد ، وهو أمر مهم بشكل خاص في الأماكن منخفضة الموارد ومع حمض الريبونوكلييك القابل للتغير [RNA]) ، والتحكم في التلوث. تركز الاهتمامات التحليلية على تقييم أداء الاختبار وحساسية mdash والنوعية والدقة والدقة والخطية وتأثير المصفوفة والتداخل وقابلية التكرار والقيود. تشمل مخاوف ما بعد التحليل الإبلاغ المناسب عن النتائج ، والنسخ / مل أو وحدة دولية / مل أو سجل وحدة دولية / مل ، والقيم التنبؤية الإيجابية والسلبية (PPV و NPV ، على التوالي) ، والقيمة التشخيصية والمنفعة السريرية.

بناءً على هذه الاعتبارات وغيرها ، قدم الدكتور تشيو قائمة بالأسئلة ذات الصلة التي يجب معالجتها في سياق الاختبار الجزيئي في الأماكن منخفضة الموارد:

  • من الذي سيدفع مقابل الاختبار ، ومن الذي تم تدريبه واعتماده لإجراء الاختبار؟
  • كم مرة سيتم إجراء الاختبار؟ ما هي أحجام المواد المطلوبة؟ هل الظروف الخاصة تبرر التكاليف؟
  • هل يمكن تحديد الكائنات الحية المهمة سريريًا وتحديد كميتها في عينات المرضى أو من الثقافة؟
  • إذا لم يكن الاستزراع ممكنًا ، يمكن تبرير الطرق الجزيئية. ولكن إذا كانت ستُستخدم للتشخيص أو المراقبة لتوجيه تدخلات الصحة العامة أو التشخيص لتوجيه العلاج للمرضى الفرديين ، فهل ستوفر المعلومات الدقيقة اللازمة؟
  • أين سيتم إجراء الاختبار وفي أي إعدادات؟ هل هذه الإعدادات مناسبة لتحقيق نتائج دقيقة؟

ثم وصف الدكتور تشيو بإيجاز كل فئة تقنية قام بإدراجها في بداية عرضه وعلق على حالات تطورها (انظر الإطار 4.1 في نهاية هذا الفصل).

وأوضح الدكتور تشيو أن طرق الكشف المباشر ، مثل التسلسل ، لا يمكن أن تحل محل الأمصال ، فرع الطب المخبري الذي يفحص مصل الدم للكشف عن الأجسام المضادة والمستضدات. 1 يرى أن الاختبار الجزيئي مكمل ، ولكن ليس بديلاً عن طرق الاختبار التقليدية. كما وصف مرحلة التطوير والاستخدام لكل من التقنيات الجزيئية:

  • PCR موجود ، لكنه لا يزال يمثل تحديًا بسبب نقص التوحيد القياسي.
  • لا يزال تسلسل الجيل التالي محدودًا. على الرغم من عدم اعتماد إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) بعد ، إلا أنه يتم استخدام بعض تسلسل الثقوب النانوية في هذا المجال.
  • تعد تقنية CRISPR-Cas واعدة للغاية ولكنها لا تزال في مرحلة البحث.
  • يعد MALDI عمومًا مكلفًا للغاية بالنسبة للأماكن منخفضة الموارد.
  • يتوفر Multiplex PCR ولكنه مكلف أيضًا.
  • من المرجح أن تتطور المقايسات المستندة إلى استجابة المضيف بسرعة في المستقبل.
  • يعتبر التسلسل الميتاجينومي واعدًا ولكنه أيضًا مكلف وغير متاح على نطاق واسع حتى الآن.

قدم الدكتور تشيو الرسائل الجاهزة التالية:

  1. من المحتمل أن تكون هناك حاجة إلى مجموعة من الطرق التقليدية (على سبيل المثال ، شرائط الفلورسنت المناعي ، PCR في الوقت الحقيقي) وأحدث الأساليب (على سبيل المثال ، تسلسل النانو ، فحوصات CRISPR-Cas ، PCR متعدد الإرسال) للمضي قدمًا.
  2. تفضل التكلفة والاعتبارات العملية الأخرى التشخيص الجزيئي الحقيقي لنقاط الرعاية (على سبيل المثال ، المقايسات المناعية للتدفق الجانبي ، CRISPR-Cas).
  3. سيكون من المهم تقرير ما إذا كان ينبغي التركيز على الاختبار التشخيصي أو المراقبة. من الذى (في مقام، في البلد ، دولي) ماذا تفعل؟ الأمراض المعدية المستجدة لا تحترم الحدود.
  4. كان للتسلسل أكبر تأثير في المراقبة الجينية ، ولكن ليس بعد في التشخيص الجزيئي.
  5. تظل MALDI ومنصات PCR متعددة الإرسال (على سبيل المثال ، BioFire و Luminex) وحتى أدوات PCR أحادية plex (على سبيل المثال ، Cepheid GeneXPert) باهظة الثمن لاستخدامها في التشخيص ، ولكنها قد تكون مقبولة للمراقبة المستهدفة ، مثل أثناء تفشي المرض.
  6. هناك حاجة ماسة إلى تشخيصات متعددة الإرسال رخيصة الثمن ومجهزة ميدانيًا ولكنها غير موجودة.
  7. من المحتمل ألا تحل طرق الكشف المباشر محل علم الأمصال (على سبيل المثال ، فحوصات التدفق الجانبي) في أي وقت قريب.
  8. ستتطلب البيانات المعقدة من التسلسل الجيني والطرق الأخرى موارد الحوسبة السحابية لنشر النتائج بسرعة ، وهو أمر بالغ الأهمية في سيناريوهات الصحة العامة.

أنهى الدكتور تشيو عرضه بالقول إنه يجب إثبات فعالية ودقة العديد من التقنيات الجزيئية قبل أن تصبح قابلة للاستخدام على نطاق واسع في الأماكن منخفضة الموارد. على الرغم من إجراء بعض الاختبارات في الأماكن منخفضة الموارد ، لا يزال هناك الكثير من العمل الذي يتعين القيام به.

خلال المناقشة التي أعقبت ذلك ، قال أحد المشاركين إن مجموعته تعمل على تطوير تقنيات تفاعل البوليميراز المتسلسل بدون مسبار ، في محاولة لاستخدام المقايسات المناعية المتعددة في علم الأمصال ، وتوفير تسلسل سانجر باستخدام

التحليل عن بعد ، عند الحاجة ، كنسخة احتياطية لتطبيقات PCR الميدانية. وأشار إلى أن الأسئلة الحقيقية هي كيفية توصيل الأدوات الجديدة إلى الميدان وتدريب الأشخاص على كل هذه المهارات الجديدة ، وخاصة معالجة البيانات وتخزينها وأمانها. بعض الأدوات المتوفرة الآن لا تتطلب أي صيانة وتحتوي على خراطيش يمكن التخلص منها. تتمثل إحدى طرق البيانات في استخدام المعلوماتية الحيوية المستندة إلى مجموعة النظراء لتحليل البيانات وإرجاع النتائج بحيث لا تكون هناك حاجة إلى موهبة المعلوماتية الحيوية المحلية لهذا الغرض ، بشرط وجود اتصال بالإنترنت. ومع ذلك ، ذكر مشارك آخر أن الاتصالات مشكلة حقيقية في هذا المجال لأن عرض النطاق الترددي غير كاف. لذلك ، قد لا تعمل النهج السحابية في حالة تفشي المرض.

سأل أحد المشاركين عما إذا كان يمكن تقديم قضية تهدف إلى الاكتفاء الذاتي من الكاشف. أجاب الدكتور تشيو أن السبب في ذلك هو أن سوق الكاشف ليست تنافسية للغاية ومن المرجح أن تؤدي المنافسة إلى خفض التكاليف. قال نفس المشارك إن تحليل التكلفة والعائد ، وهو غير موجود ولكن هناك حاجة إليه ، يمكن أن يساعد المانحين في تحديد نوع الدعم الذي ينبغي عليهم تقديمه.

مع ملخص الدكتور Chiu & rsquos لأحدث ما توصل إليه الفن واستنتاجاته حول الاستعداد التكنولوجي ، كان المشاركون على استعداد لفحص الجوانب العملية للنشر والاستخدام الميداني. قدم جوناثان تاونر ، دكتوراه ، من المراكز الأمريكية لمكافحة الأمراض والوقاية منها (CDC) عرضًا تقديميًا عن تجاربه الميدانية خلال العديد من الفاشيات الفيروسية النزفية ، بما في ذلك تفشي فيروس إيبولا في غرب إفريقيا في 2014-2015. توضح تجارب Dr. Towner & rsquos تطبيق التقنيات المتاحة على الاستجابات الواقعية لتفشي الأمراض الرئيسية. كانت تجربته الميدانية الأولى في أوغندا في 2000-2001 ، حيث استخدم مركز السيطرة على الأمراض كلاً من اختبار ELISA القائم على PCR. تم إجراء العمل في معمل المستشفى ، وتمت معالجة أكثر من 1000 عينة على مدار 3 أشهر ، مع أكثر من 280 اختبارًا إيجابيًا للفيروس. في عام 2005 ، شارك في الاستجابة لتفشي فيروس ماربورغ في أنغولا. تم استخدام ELISA و PCR مرة أخرى ، وهذه المرة تم تنفيذ العمل في مختبر موجود تم إنشاؤه لتشخيص فيروس نقص المناعة البشرية. هذه المرة ، تم العثور على 180 عينة من أصل 505 عينة من الدم أو المصل أو حليب الثدي أو المسحات إيجابية للفيروس. من عام 2010 إلى عام 2016 ، شارك الدكتور تاونر في برنامج ترصد وتشخيص الحمى النزفية الفيروسية المعززة في أوغندا لتوفير التدريب للموظفين الطبيين المحليين وغيرهم من العاملين. وضع هذا البرنامج موظفي مراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها في البلد وساعد في تحقيق عدد أقل بكثير من حالات VHF اللاحقة بالإضافة إلى تقليل الوقت اللازم للتشخيص.

ثم في عام 2014 ، حدث تفشي فيروس إيبولا الضخم في غرب إفريقيا ، مما أثر بشكل خطير على غينيا وسيراليون وليبيريا. اجتذب هذا الحدث ، بكلمات د.

ترسل ألمانيا وفرنسا وإيطاليا وبلجيكا وهولندا وإنجلترا وكندا والولايات المتحدة ونيجيريا وجنوب إفريقيا والصين وروسيا أشخاصًا ومعدات ومساعدات أخرى في استجابة رائعة وجهود تعاونية. شملت الوكالات الأمريكية مراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها ، والمعاهد الوطنية للصحة ، ووزارة الدفاع. كان الهدف هو توفير التشخيص السريع في هذا المجال. إجمالاً ، تم إنشاء 27 مختبراً ميدانياً في جميع أنحاء غرب إفريقيا.

ولَّد حجم الاستجابة لتفشي فيروس إيبولا في غرب إفريقيا تحدياته الخاصة. على سبيل المثال ، تم استخدام العديد من فحوصات PCR المختلفة في الوقت الحقيقي في شبكة كبيرة من المختبرات ، مما أدى إلى الحاجة إلى لوحات عالية الجودة ومحاولات لتوحيد المقايسات. بالنسبة للألواح التي وزعتها مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها في سيراليون وغينيا ، كان 2 من 6 مختبرات تنتج نتائج غير صحيحة بمعدل 10 في المائة ، الأمر الذي تطلب تنفيذ التحسينات. ظهرت الحاجة إلى اختبار الإيبولا ثنائي الهدف ، بالإضافة إلى عناصر التحكم في الخلية RNA PCR ، لتقليل معدل الإيجابيات أو السلبيات الكاذبة عند استخدام هدف واحد فقط. كما أدى عدم وجود عنصر تحكم في الحمض النووي الريبي الخلوي إلى زيادة خطر حدوث نتائج سلبية كاذبة.

كانت هناك أيضًا تحديات في قواعد البيانات والتوثيق وإعداد التقارير. كان من الصعب إكمال نماذج استمارات التقديم ، لذلك كان لعدد كبير من العينات وثائق قليلة أو معدومة. كان هناك عدم وجود محددات فريدة للعينات والحالات وصعوبات في ربط البيانات المخبرية والسريرية والوبائية. غالبًا ما كانت المعلومات الخاصة بتاريخ البدء مفقودة ، وكذلك معرفة ما إذا كانت المسحات من الجثث (مناسبة) أو المرضى الأحياء (غير مناسبة). أخيرًا ، كانت هناك مشاكل في الوقت المستغرق للحصول على النتائج ، وعدم كفاية عدد أخصائيي الفصد المدربين ، ونقل العينات.

وخلص الدكتور تاونر إلى أنه تم تحقيق الكثير رغم هذه المشاكل. تم إجراء اختبار الذروة خلال الفترة من أكتوبر إلى ديسمبر 2014 ، حيث تم اختبار أكبر عدد من العينات عند 180 عينة يوميًا في يوليو 2015. في المتوسط ​​، تم اختبار 71 بالمائة من العينات في يوم وصولها إلى المختبر ، وتم اختبار 99.9 بالمائة أيضًا في اليوم نفسه أو في اليوم التالي. تم تلقي العينات لمدة 14 شهرًا تقريبًا من 12 من 14 مقاطعة وكانت بشكل أساسي عبارة عن دم كامل ومسحات فموية من جثث. بشكل عام ، تم اختبار أكثر من 27000 عينة. ظل مختبر Dr. Towner & rsquos قيد التشغيل لمدة 406 يومًا ، مع عدم وجود أيام عطلة أو اضطرابات في الاختبار. بدأت دراسة تجريبية لاختبار الثبات الفيروسي لدى الناجين الذكور في 23 مايو وأسفرت عن اختبار أكثر من 500 عينة من السائل المنوي. بدأت تجربة لقاح سيراليون ، أو STRIVE ، في 24 مايو ، وتم اختبار 51 عينة من 30 مشاركًا. تم تدريب ثمانية وعشرين فريقًا من الموظفين من 17 فرعًا مختلفًا في جميع أنحاء مركز السيطرة على الأمراض في أتلانتا على بروتوكولات وإجراءات مختبر بو ، ثم تم نشرهم للمساعدة في الحفاظ على عمل المختبر.

بعد انتهاء مرحلة أزمة الوباء ، تم اختيار الدكتورة آية ليبي من جامعة نجالا في سيراليون كمتلقي لاتفاقية تعاونية مع مراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها (CDC) لمدة 3 سنوات لإجراء مراقبة بيئية للموجات المترية (VHF) على المنطقة وخفافيش rsquos. خضعت مرافق مختبر University & rsquos إلى تجديدات كبيرة في المختبرات من مارس إلى أغسطس 2017. هناك الآن كهرباء مستقرة ويتم صيانتها بشكل صحيح ، ومجمدات ، ومعدات عمل أخرى. الشراء قيد التشغيل ، على الرغم من أن تسليم المواد سريعة التلف لا يزال يمثل مشكلة. سيوفر هذا الترتيب مع الجامعة مزايا تعليمية وكذلك فوائد صحية عامة للمنطقة ويمثل ما يمكن أن تحققه الشراكة. تم جمع ما يقرب من 5000 عينة من الخفافيش ، جميعها من مناطق الغابات. هناك محطتان ميدانيتان ، واحدة في جزيرة Tiwai في سيراليون ، والتي بدأت في التجديدات ، والأخرى في Gola Rainforest National Park في ليبيريا.

بعد العرض التقديمي الذي قدمه الدكتور تاونر ورسكووس ، أشار أحد المشاركين إلى أن التقنيات الجزيئية الجديدة تقلل من المخاطر ، لذلك هناك حاجة إلى الحد الأدنى من مستويات الاحتواء إذا كانت مسببات الأمراض مثل الإيبولا وماربورغ محلية في منطقة معينة. في مثل هذه الحالة ، ربما لا تكون هناك حاجة إلى مختبرات BSL-3 و -4 ، لكن بعض المستلمين يبحثون عن مرافق عالية الاحتواء من أجل المكانة وليس الاحتياجات الحقيقية. كرر مشارك آخر الحاجة إلى التمييز بين المختبرات التي تجري المراقبة وتلك التي تجري التشخيص ، وأشار إلى أن المعامل المرجعية ضرورية لتحديد السلالات وللبحث. ربما يكون الاحتواء المنخفض مناسبًا للحقل بينما يلزم الاحتواء العالي للمختبرات المرجعية.

على الرغم من أن الدكتور تشيو قال إن تكاليف التقنيات الجزيئية يجب تخفيضها قبل استخدامها في الأماكن منخفضة الموارد ، ذكر أحد المشاركين أن التكلفة المقبولة قد تعتمد على المرض وعدد المرضى المصابين وتكاليف الرعاية و العلاج وعوامل أخرى. وهذا يترجم إلى أمراض شائعة تحتاج إلى قدرات تحليلية أرخص. بعض التكنولوجيا تنتشر بالفعل. على سبيل المثال ، تم بالفعل نشر 165 آلة & ldquoGene Expert & rdquo في جميع أنحاء جمهورية الكونغو الديمقراطية ، على الرغم من أن إنتاجيتها منخفضة ، كما أشار أحد المشاركين. بالإضافة إلى ذلك ، لا تكتشف هذه الآلات سوى سلالة إيبولا زائير ، والتي ، إذا تحورت ، قد لا يتم اكتشافها مثل السلالات الأخرى. وأشار مشارك آخر إلى أن الممولين يجب أن يضعوا في الحسبان القدرات التي تم نشرها بالفعل عند اتخاذ قرارات الدعم.

سلط أحد المشاركين الضوء على الاحتياجات المختلفة لمواقف التشغيل العادية مقابل الاستجابات للأوبئة. تستخدم مؤسسته اختبار Luminex ، لكن ما هو مناسب يعتمد على ما إذا كان الباحث يبحث عن مُمْرِض واحد أو أكثر. ذكر مشارك آخر أن أي شيء جديد يتم بناؤه يجب أن يتم ربطه بالمرافق الموجودة

بالفعل جزء من شبكة بحيث يمكن مشاركة الكواشف والموارد الأخرى.

صرح الدكتور تشيو أن الكشف المباشر عن الكائن الحي محل الاهتمام هو المعيار & ldquogold. يعتبر الأطباء أكثر تحفظًا من الباحثين ، لذلك قد يستغرق الأمر من 5 إلى 10 سنوات قبل قبول أنواع الاختبارات الجديدة كأساس لعلاج المريض. نظرًا لحدوث حوادث سيئة مع اختبار الأدوية واللقاحات بالفعل في البلدان النامية ، فهناك حاجة خاصة إلى التحفظ مع التشخيص الجزيئي كأدوات جديدة لتوجيه العلاج الطبي على هذه الأسس أيضًا.

وأكد أحد المشاركين أن تكلفة الكواشف تمثل مشكلة ، لا سيما بسبب الميزانيات الصغيرة للبلدان منخفضة الموارد. وأشار مشارك آخر إلى أن التقنيات نفسها مكلفة للغاية وينبغي نصح الجهات المانحة بالاعتماد على التقنيات التي أثبتت جدواها كخط أساس. في ضوء عوامل التكلفة ، قال مشارك آخر إنه من المنطقي استخدام مجموعات موزعة من المعامل للاختبار الأساسي وللاحتفاظ بالإمكانيات الباهظة الثمن وعالية الإنتاجية للمواقع المركزية. وأشار مشارك آخر إلى أن حالات الطوارئ خاصة ، لكن الاستجابة للطوارئ ستتحسن إذا تم تجهيز المزيد من المختبرات للتعامل مع الأعمال العادية. إن وجود معمل للتشغيل العادي يحافظ أيضًا على تدريب الموظفين وسلاسل التوريد وممارستهم. يجب على المانحين أيضًا الاستفسار عن أنظمة إدارة الجودة. في البلدان النامية ، قد لا تتوفر المختبرات المرجعية والموارد الأخرى لتسهيل التوحيد القياسي والتحقق والخطوات الضرورية الأخرى.

قال أحد المشاركين إن & ldquoWild West & rdquo يمكن أن ينتج عن نقص في الإشراف التنظيمي و mdasheven في الولايات المتحدة ، ولكن بشكل أكبر في بعض البلدان النامية. وأشار مشارك آخر ، مع ذلك ، إلى أن فرنسا توفر الرقابة في البلدان الفرنكوفونية. ذكر مشارك آخر أن نقص الكواشف وصيانة المعدات وإصلاحها هو كابوس للمانحين و rsquos وأن هناك حاجة ماسة للتدريب على هذه الوظائف الأخيرة. ومع ذلك ، أشار مشارك آخر إلى أن مستويات التعليم في بعض المناطق منخفضة للغاية لدرجة أن مفهوم الصيانة غير موجود ، وبالتالي فإن توفير مثل هذا التدريب للموظفين المحليين أمر صعب للغاية. بالإضافة إلى ذلك ، يشكل النقل حاجزًا أمام بناء القدرات المرجعية. هناك حاجة إلى شراكات لتوفير الوقود والثلج الجاف والمواد المخبرية الأساسية الأخرى. قدمت الشركات متعددة الجنسيات ، مثل Coca Cola ، وشركات النفط ، على سبيل المثال ، بعض هذه الإمدادات. وقد طور الاتحاد الأفريقي والجماعة الاقتصادية لدول غرب أفريقيا والجماعة الإنمائية لجنوب أفريقيا طرقاً لمعالجة بعض هذه المشاكل ،

اقترح أحد المشاركين أن يتم وضع البنوك الحيوية في مواقع آمنة ، مثل القواعد العسكرية. وأشار مشارك آخر إلى أن البنوك الحيوية آمنة و

التعرف على قيمة العينات الحية ، ولكن قد لا يكون لديها خطط لما يجب فعله بها ، مما يثير تساؤلات حول ما إذا كان ينبغي أن يكون لديهم مجموعات دون أغراض محددة بوضوح.

دعا المشاركون إلى رؤية أوسع لضمان الاستعداد للفاشية التالية. كما طرحوا مسألة كيفية إثارة اهتمام المانحين بتعزيز ما هو موجود بالفعل بدلاً من بناء مرافق جديدة. أخيرًا ، تساءلوا كيف يمكن للمانحين المساعدة في & ldquoleave خلف & rdquo المرافق بعد تفشي المرض ، كما حدث في سيراليون بعد تفشي فيروس إيبولا عام 2014.

المربع 4.1 حالة تطور التشخيص الجزيئي: ملخص

وصف الدكتور تشارلز تشيو حالة تطور التشخيص الجزيئي. بدأ من خلال شرح أنه في & ldquoprobe التهجين و rdquo أو تحقيقات الحمض النووي غير المكبرة ، يتم فحص خيوط DNA أو RNA التي تقل عن 50 زوجًا أساسيًا من العينة لتسلسل الحمض النووي المحدد و ldquotargets & rdquo التي تشير إلى وجود كائنات مسببة للأمراض معينة. يتم تمييز خيوط الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي بالأنزيمات أو الركائز المستضدية أو الوحدات الفرعية الجزيئية المضيئة كيميائيًا أو النظائر المشعة. ترتبط هذه المجسات بخصوصية عالية للتسلسلات التكميلية إما من الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي ، والتي يشار إليها باسم & ldquohybridization. & rdquo ترتبط المجسات بسرعة ، في ظل ظروف صارمة ، ويمكنها حتى اكتشاف تغيير نوكليوتيد واحد في تسلسل الحمض النووي. يمكن استخدامها مباشرة على عينات المريض أو على عزلات المزرعة. ومع ذلك ، فهي أقل حساسية 100-10000 مرة من طرق التضخيم ، وقد لا يكون هذا المستوى من الحساسية كافياً للكشف عن الكائنات الحية ، مثل فيروس الإيبولا ، التي لديها عدد نسخ منخفض في عينات الأنسجة ، مثل الدم. يستخدم تهجين المسبار بشكل تقليدي عند وجود أعداد كبيرة من الكائنات الحية ، على الرغم من أن الطريقة ، كما لوحظ ، ليست حساسة للغاية. وقد وجد أنه مفيد بشكل خاص لتأكيد وجود أنواع البكتيريا الفطرية ، والفطريات الجهازية ، والعطيفة ، والمكورات المعوية ، والمستدمية النزلية ، والمكورات العقدية A و B ، والمكورات العقدية الرئوية ، والنيسرية البنية ، والمكورات العنقودية الذهبية ، والليستيريا.

فحوصات كريسبر-كاس (CRISPR تعني التكرارات المتقطعة القصيرة المنتظمة المتباعدة بشكل منتظم و Cas للنظام المرتبط بـ CRISPR) تلقت قدرًا هائلاً من الدعاية الحديثة كوسيلة لتحرير الجينوم. هذه الأنظمة ، المشتقة من آلية دفاع بكتيرية طبيعية ضد الفيروسات التي تصيبها ، جعلت تعديل الجينوم عن طريق إضافة أو استبدال أو إزالة أزواج قواعد الحمض النووي أكثر دقة وكفاءة ومرونة وأقل تكلفة مقارنة بالاستراتيجيات السابقة لتغيير الجينات تسلسل (الأكاديمية الوطنية للعلوم ، الأكاديمية الوطنية للطب ، 2017). يمكن تطبيقها على الكائنات الحية غير البشرية والبشر والكائنات الحية الدقيقة. حفزت هذه التطورات على زيادة الاهتمام من جميع أنحاء العالم بالطرق المحتملة التي يمكن من خلالها تحرير الجينوم تحسين صحة الإنسان. صرح الدكتور تشيو أن التشخيص الجزيئي القائم على CRISPR-Cas يمكن أن يكون بمثابة & ldquogame-changer & rdquo لتشخيص الأمراض المعدية ، ومراقبة مسببات الأمراض الناشئة ، والتنميط الجيني الفيروسي ، والكشف عن عوامل مقاومة المضادات الحيوية ، وفحص السرطان ، والتطبيقات الأخرى.

كريسبر-كاس والمقايسات ناقصة لها مزايا وعيوب وفقا للدكتور تشيو. من بين المزايا أن هذه الاختبارات حساسة للغاية ، ولها فترات زمنية أقل من ساعتين ، وتتمتع بمرونة كبيرة في التصميم ، وتتطلب أقل من أسبوع واحد من التصميم إلى التنفيذ. فهي محمولة بشكل كبير ، ولا تتطلب كهرباء أو أجهزة باهظة الثمن ، ويمكن أن توفر قراءات لونية يسهل تفسيرها نسبيًا. أثبتت جامعة كاليفورنيا في بيركلي مؤخرًا أنه يمكن اكتشاف فيروس الورم الحليمي البشري مباشرةً من الأنسجة التناسلية دون استخلاصه في غضون ساعة واحدة باستخدام تقنية كريسبر-كاس. كما يتم استخدامه حاليًا لتحديد فيروسات زيكا وحمى الضنك في العينات السريرية. ومع ذلك ، تشمل العيوب عدة عوامل تتعلق بحقيقة أن CRISPR-Cas لا يزال في المرحلة. لديها قدرة تعدد إرسال غير واضحة ، وتتطلب خطوة تضخيم مستهدفة ، والتي يمكن أن تؤدي إلى مشاكل التلوث ، ولم يتم إثبات أدائها في معظم الاستخدامات السريرية الفعلية حتى الآن. هناك أيضًا قضايا تنظيمية مهمة بالإضافة إلى مخاوف بشأن توفر الاختبار لأن العديد من الاستخدامات المقصودة قد تكون خاضعة لبراءات الاختراع.

وصف الدكتور تشيو تقنيات تضخيم الإشارة والهدف. تعد تقنية السلسلة المتفرعة أكثر طرق تضخيم الإشارة استخدامًا للتشخيص. لطالما استخدمت هذه التقنية لتحديد الأحمال الفيروسية لفيروس نقص المناعة البشرية والتهاب الكبد الوبائي (تسونغاليس ، 2006). يمكن استخدامه للكشف عن البروتينات والأحماض النووية ، كل من DNA و RNA. لا يتغير تركيز المجس أو الهدف ، لكن الحساسية تزداد مع زيادة تركيز الجزيئات الموصوفة المرتبطة بالحمض النووي المستهدف. ميزته على طرق التضخيم المستهدفة ، مثل PCR ، هي أن الاكتشاف & ldquosignal & rdquo يتناسب طرديًا مع كمية الهدف في العينة ، مما يتيح سهولة القياس الكمي. هناك أيضًا انخفاض في خطر التلوث ، والمثبطات ليست مشكلة.

تستخدم طرق التضخيم المستهدف ، مثل PCR والتضخيم بوساطة النسخ (TMA) ، عمليات بوساطة إنزيم لعمل نسخ من الحمض النووي المستهدف. والنتيجة هي أن المحلل يحصل على ملايين أو مليارات من الهدف ، مما قد يؤدي إلى مشاكل في التلوث ونتائج إيجابية خاطئة. أصدرت منظمة الصحة العالمية معايير PCR (منظمة الصحة العالمية ، 2016).

PCR هي تقنية بسيطة نسبيًا لتضخيم وكشف تسلسل الحمض النووي الريبي والحمض النووي الريبي ، مثل تلك المرتبطة بالمواد الوراثية لمسببات الأمراض. مقارنة بالطرق التقليدية لاستنساخ الحمض النووي وتضخيمه ، والتي قد تستغرق أيامًا حتى تكتمل ، فإن تفاعل البوليميراز المتسلسل يتطلب بضع ساعات فقط. يتم أولاً تغيير طبيعة الحمض النووي المزدوج الشريطة للحرارة لفصل الخيوط. ثم يتم محاذاة المواد الأولية مع خيوط الحمض النووي المنفصلة (التلدين) ، ثم يقوم بوليميراز الحمض النووي بتمديد البادئات. والنتيجة هي نسختان من خيط الحمض النووي الأصلي. تشكل عملية التمسخ والصلب والاستطالة دورة واحدة من التضخيم ، والتي تتكرر 20-40 مرة. يمكن بعد ذلك تحليل المنتج المضخم.

تُستخدم الطريقة على نطاق واسع لتضخيم الحمض النووي للاستخدام التجريبي والاختبار الجيني واكتشاف المواد المسببة للأمراض. تفاعل البوليميراز المتسلسل حساس للغاية ولا يتطلب سوى أحجام عينات صغيرة. سلط الدكتور تشيو الضوء على ورقة عام 2010 (Boehme et al. ، 2010) أظهرت أن التقنية القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل يمكن أن تكتشف بسرعة وجود السل ، بما في ذلك الأشكال المقاومة للمضادات الحيوية ، من عينات البلغم. وأشار بوهمه إلى أن المكافحة العالمية للسل تعوقها طرق التشخيص البطيئة وغير الحساسة ، لا سيما للكشف عن السل المقاوم للأدوية. يقلل الاكتشاف المبكر من معدل الوفيات ويقطع النقل ، لكن التعقيد واحتياجات البنية التحتية للطرق الحساسة يحد من إمكانية الوصول إليها وتأثيرها في الأماكن منخفضة الموارد. اختبار الكشف السريع الذي طوره Boehme et al. تم نشره بسرعة في إفريقيا وأماكن أخرى ، على الرغم من أنه مكلف.

كانت هناك أيضًا حالات عديدة من التناقضات بين المختبرات في نتائج PCR ، مما يشير إلى تباين في الأداء بين المختبرات ، على الرغم من التحقق من صحة فحوصات PCR واعتمادها واستخدامها بشكل روتيني في بعض المختبرات. بالإضافة إلى ذلك ، يؤثر الانجراف & ldquogenomic الانجراف على هذه الاختبارات ويتدهور أداء تفاعل البوليميراز المتسلسل بمرور الوقت مع تحور الفيروسات. Multiplex PCR ، وهو هدف مرغوب فيه ولكن لم يتحقق بالكامل بعد ، سيسمح بتحليل أهداف متعددة في نفس العينة. استشهد الدكتور تشيو بورقة كتبها ماهوني وآخرون. (2007) بشأن تطوير اختبار لوحة PCR متعدد الإرسال للكشف عن 20 فيروسات تنفسية بشرية.

الدكتور Chiu & rsquos مجال خبرة خاص هو تسلسل الحمض النووي. توجد حاليًا العديد من الأجهزة والأساليب لتسلسل الحمض النووي. على سبيل المثال ، بالنسبة للبكتيريا ، يشكل 16S RNA جزءًا من الريبوسوم البكتيري. تحتوي أجزاء الحمض النووي الريبي هذه على مناطق ذات تسلسل محفوظ بدرجة عالية و ldquohypervariable و rdquo يمكن اعتبارها بصمات جزيئية و ldquofinger و rdquo يمكن استخدامها لتحديد الأجناس والأنواع البكتيرية. يمكن استهداف هذه المناطق المحفوظة لتضخيم مجموعة واسعة من البكتيريا من العينات السريرية. ومع ذلك ، فإن التقنية ليست كمية بسبب اختلاف عدد النسخ. الميزة الرئيسية لهذا النهج هي أنه لا توجد حاجة للثقافة ، لذلك يمكن استخدامها على مجموعة واسعة جدًا من الكائنات الحية. في هذا النهج ، يتم استخراج الحمض النووي من عينة سريرية ، مثل الأنسجة أو سوائل الجسم. يتم تضخيم جينات 16S RNA وتسلسلها ومقارنتها بقاعدة بيانات مرجعية ، مثل GenBank ، للبحث عن تطابق. أصبح هذا النوع من الاختبارات متاحًا في البيئات السريرية. يتوفر أيضًا نهج مشابه باستخدام جينات 18S و 28S و ITS لمسببات الأمراض حقيقية النواة (الفطريات والطفيليات).

نهج آخر هو وقت التأين باستخدام المصفوفة بالليزر لقياس الطيف الكتلي للرحلة (MALDI-TOF MS). ظهرت هذه التقنية كأداة لتحديد وتشخيص الميكروبات غير المعروفة من الخلايا السليمة أو مستخلصات الخلايا باستخدام البروتينات المترجمة من الجينومات الميكروبية. إنه سريع وحساس واقتصادي. تم اعتماده من قبل علماء الأحياء المجهرية لتحديد الميكروبات وتصنيف الإجهاد ، والدراسات الوبائية ، والكشف عن عوامل الحرب البيولوجية ، ومسببات الأمراض التي تنقلها المياه والأغذية ،

عوامل مقاومة المضادات الحيوية ومسببات أمراض الدم والمسالك البولية (Singhal et al. ، 2015).

يتضمن مطياف الكتلة (MS) المركبات الكيميائية المؤينة إلى جزيئات مشحونة وقياس نسبة الكتلة إلى الشحن (m / z). تم استخدام MS منذ أوائل القرن العشرين في العلوم الكيميائية ، ولكن تطوير تأين رذاذ الإلكترون (ESI) و MALDI في الثمانينيات زاد من قابليته للتطبيق على الجزيئات البيولوجية الكبيرة ، مثل البروتينات.

يعتمد كل من ESI و MALDI على أساليب التأين ldquosoft & rdquo التي لا تؤدي إلى فقد كبير في سلامة العينة. في التأين عن طريق أي منهما ، يتم تحويل البروتينات إلى أيونات عن طريق إضافة أو فقدان واحد أو أكثر من البروتونات. يتمتع MALDI-TOF MS بمزايا معينة مقارنة بـ ESI-MS لأنه ينتج أيونات مشحونة منفردة ، مما يجعل تفسير البيانات أمرًا سهلاً. بالإضافة إلى ذلك ، يلزم الفصل المسبق عن طريق اللوني لـ ESI-MS ، ولكن ليس لـ MALDI-TOF MS ، وهو مؤتمت بالكامل. الإنتاجية العالية والسرعة المرتبطة بـ MALDI-TOF MS جعلته متفوقًا على عمل البروتينات على نطاق واسع.

يتم تحضير العينة للتحليل بواسطة MALDI-TOF MS عن طريق خلطها أو طلاءها بمحلول من مركب عضوي ماص للطاقة و ldquomatrix & rdquo. يتم تبلور كل من المصفوفة والعينة المحتجزة فيها عن طريق التجفيف ، وتتأين العينة في المصفوفة بشعاع ليزر. هذا يولد أيونات بروتونية من العينة ، والتي يتم تسريعها بعد ذلك بحيث تنفصل عن بعضها البعض على أساس نسبة الكتلة إلى الشحن (m / z). يتم قياس النسبة عن طريق تحديد الوقت اللازم لسفر الأيونات بطول أنبوب TOF (وبالتالي & ldquotime of flight & rdquo). بناءً على معلومات TOF ، يتم إنشاء طيف مميز يسمى بصمة كتلة الببتيد (PMF) للتحليل في العينة. يتم التعرف على الميكروبات من خلال مقارنة طيف MS لعزل ميكروبي غير معروف بأطياف العزلات المعروفة في قاعدة بيانات مرجعية. من الواضح أن الحد من هذه التقنية هو أن التحديد الدقيق للعزلات الجديدة ممكن فقط إذا كانت قاعدة البيانات المرجعية تحتوي على PMFs من سلالات النوع من أجناس وأنواع وأنواع فرعية معينة في العينة.

موضوع المجهول مهم جدا في الأمراض المعدية. وأشار الدكتور تشيو إلى أن من أهم ثلاثة أمراض شائعة وهي الالتهاب الرئوي ، والتهاب السحايا / التهاب الدماغ ، والحمى / الإنتان و [مدش] 15-62 في المائة ، 40-60 في المائة ، و 20 في المائة ، على التوالي ، سببها كائنات مجهولة ويتم تفويتها في مختبرات التشخيص بالمستشفى حتى في الدول المتقدمة. هذا يجعل فكرة القدرة على تسلسل كل شيء في عينات المرضى جذابة ، وهو ما يمكن القيام به الآن باستخدام تسلسل الجيل التالي من الميتاجينوم. تتغلب Metagenomics على المشاكل المزدوجة المتمثلة في عدم القدرة على استنبات معظم الكائنات الحية الدقيقة والتعامل مع التنوع الجيني الواسع للميكروبات. هذه هي أكبر العوائق أمام التقدم في علم الأحياء الدقيقة السريرية والبيئية (National Research Council ، 2007). تسعى Metagenomics إلى الفهم

علم الأحياء على المستوى الكلي ، وتجاوز الكائنات الحية الفردية والتركيز على الجينات في مجتمع ميكروبي بأكمله ، سواء كان ذلك من عينة من التربة أو من جسم الإنسان. كما يتطلب أيضًا تطوير أساليب حسابية متقدمة تزيد من فهم التركيب الجيني وأنشطة المجتمعات المعقدة للغاية بحيث يمكن أخذ عينات منها ، ولكن لا يتم وصفها تمامًا (National Research Council ، 2007).

على الرغم من أن علم الجينوميات لا يزال علمًا جديدًا نسبيًا ، فقد أنتج الكثير من المعرفة الجديدة حول عالم الميكروبات غير القابل للثقافة باستخدام طرق جديدة جذريًا لممارسة علم الأحياء الدقيقة. تبدأ جميع أعمال الميتاجينوميات بنفس الخطوة الأولى: يتم استخراج الحمض النووي مباشرة من جميع الميكروبات الموجودة في عينة معينة. يمكن بعد ذلك تحليل عينة الحمض النووي المختلطة هذه مباشرة أو استنساخها في شكل يمكن صيانته في بكتيريا المختبر القابلة للزراعة. يتيح ذلك للباحثين إنشاء مكتبة للجينومات لجميع الميكروبات الموجودة في تلك العينة. يمكن دراسة هذه المكتبة ، بدورها ، إما عن طريق تحليل تسلسل النيوكليوتيدات للحمض النووي المستنسخ أو عن طريق تحديد البروتينات التي تصنعها الجينات المستنسخة عند التعبير عنها. هذه التقنية تفسح المجال لفرز حالات المرض المعقدة التي يمكن أن يكون لها العديد من الأسباب المختلفة. على سبيل المثال ، يمكن أن تحدث أمراض الحمى الاستوائية بسبب أنواع عديدة من البكتيريا أو الفيروسات أو الطفيليات أثناء ظهور أعراض مماثلة ، ويمكن أن يساعد استخدام الميتاجينوميات في تحديد الكائنات الحية المحددة التي تسبب الحمى لدى المرضى المصابين.

تشبه مكتبة metagenomic آلاف الألغاز المقطوعة في مربع واحد ، ويعد تجميع الألغاز معًا مرة أخرى أحد أكبر التحديات التي تواجهها metagenomics. أصبح هذا النهج ممكنًا الآن بسبب توفر تسلسل الحمض النووي عالي الإنتاجية وغير المكلف وقدرات الحوسبة المتقدمة اللازمة لفهم ملايين التسلسلات العشوائية الموجودة في مكتبات الجينوم. يتطلب هذا الأخير خط أنابيب قوي للمعلومات الحيوية ، مثل خط أنابيب التعرف على مسببات الأمراض فائقة السرعة (SURPI) المستند إلى التسلسل المشار إليه من قبل الدكتور تشيو.

كمثال لتقنية الميتاجينوميات التي قد تكون مناسبة للاستخدام في الأماكن منخفضة الموارد ، ناقش الدكتور تشيو تسلسل الثقوب النانوية ، والذي يسمح باكتشاف مسببات الأمراض الميتاجينومية في الوقت الحقيقي في المرضى الذين يعانون من الحمى / الإنتان. تشمل مزايا التسلسل النانوي قدرته على إجراء تحليل تسلسل في الوقت الفعلي ، وقراءات طويلة ، وتسلسل مباشر للحمض النووي ، والحمض النووي الريبي ، والبروتين من العينات. إنه محمول باستخدام جهاز بحجم الجيب ، ولا يتطلب اتصالاً بالإنترنت ، ويوفر أوقاتًا سريعة محتملة ، والتي تعد أساسية لتسلسل الأمراض المعدية. تتمثل عيوبه في أن استخدامه مكلف (500 دولار لكل خلية تدفق) ، ولا يزال لديه معدلات خطأ تتراوح من 8 إلى 12 بالمائة ، ويمكن أن تكون جودة خلايا التدفق متغيرة. ومع ذلك ، فقد تم استخدام تسلسل الثقوب النانوية بنجاح لمراقبة الإيبولا في الوقت الحقيقي في غرب إفريقيا (كويك وآخرون ، 2016). سريع وآخرون. أظهروا أنهم حققوا نتائج في أقل من 24 ساعة بعد تلقيهم للإيبولا إيجابية

العينة ، حيث تستغرق عملية التسلسل أقل من 15-60 دقيقة. يوضح هذا أن المراقبة الجينية في الوقت الحقيقي ممكنة في الأماكن منخفضة الموارد ويمكن إنشاؤها بسرعة لرصد تفشي المرض. نشرت مجموعة Dr. Chiu & rsquos في جامعة كاليفورنيا ، سان فرانسيسكو أيضًا ورقة بحثية حديثة (Th & eacutez & eacute et al. ، 2018) تصف استخدام metagenomics لإعادة بناء مقدمة وانتشار فيروس زيكا في المكسيك وأمريكا الوسطى.

في ورقة أخرى استشهد بها الدكتور تشيو وجاردي ولومان (2017) تنص على ما يلي:

& ldquo تظهر وباء إيبولا وزيكا الأخيران الحاجة إلى المراقبة المستمرة والتشخيص السريع والتتبع في الوقت الحقيقي للأمراض المعدية الناشئة. تسلسل سريع وميسور التكلفة لجينومات العوامل الممرضة و mdashnow هو عنصر أساسي في مختبر الأحياء الدقيقة للصحة العامة في ظروف جيدة الموارد و [مدشنا] يؤثر على كل من هذه المجالات. إن اقتران التشخيص الجينومي وعلم الأوبئة بمنصات رقمية مبتكرة للكشف عن الأمراض يزيد من إمكانية وجود نظام رقمي مفتوح وعالمي لمراقبة مسببات الأمراض. عندما يتم إخطاره من خلال نهج One Health ، والذي يتم فيه النظر في صحة الإنسان والحيوان والبيئة معًا ، فإن مثل هذا النظام القائم على الجينوم لديه إمكانات عميقة لتحسين الصحة العامة في الأماكن التي تفتقر إلى قدرة مختبرية قوية.

ومع ذلك ، هناك تحديات لتحقيق هذه الإمكانات. يصف جاردي ولومان بعض هذه التحديات التي يواجهها فيروس زيكا ، الذي يُظهر انخفاض التتر الفيروسي ، وجينوم صغير (& lt11 كيلو قاعدة) ، وفيروس عابر. مجتمعة ، هذه العوامل تعقد الكشف عن الحمض النووي الفيروسي من خلال نهج ميتاجينوم. أفاد جاردي ولومان أيضًا أن الحصول على كمية كافية من الحمض النووي الفيروسي لتسلسل الجينوم بما يتجاوز التشخيص البسيط قد يتطلب أيضًا PCR ونهج تسلسل amplicon. قد تشمل التحديات الأخرى الوصول إلى اتصالات إنترنت موثوقة ، والقدرة على جمع عينات البيانات الوصفية ، وترجمة النتائج الجينية إلى توصيات قابلة للتنفيذ في الوقت الفعلي. & rdquo


المختبرات والمحاكاة الافتراضية في علم الأحياء

فيما يلي المعامل والمحاكاة الافتراضية المفضلة لدي لتعلم واستكشاف علم الأحياء عندما تكون الخيارات العملية متاحة & # 8217t.

برامج العقل القابلة للتوسيع

لقد وجدت جوهرة أحد المواقع لأول مرة عندما كنت أبحث عن بدائل لتشريح الحيوانات العام الماضي. على الرغم من أن هذا أحد الموارد غير المجانية ، إلا أنه يستحق سعرًا معقولاً للغاية.

مختبر التشريح الافتراضي eFrog

ستجد في هذا الموقع تشريح حيوانات افتراضي من الدرجة الأولى. تتوفر العديد من التشريح: الأسماك (لامبري ، القرش ، وسمك الفرخ) ، القط ، خنزير الجنين ، دودة الأرض ، الضفدع ، واللافقاريات (الحبار ، نجم البحر ، وجراد البحر).

لكل تشريح ، يمكن للطلاب فحص كل من التشريح الخارجي والداخلي. نظرًا لاستخدامهم الملاقط الافتراضية لإزالة الأعضاء ، يتم تقديم شرح لكل عضو. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للطلاب اختيار مشاهدة مقطع فيديو يتعلق بهذا العضو المحدد. على سبيل المثال ، عند إجراء تشريح الضفدع الافتراضي ، يكون الطالب قادرًا على مشاهدة مقاطع فيديو حول التمعج المعوي ، وضخ القلب ، وتضخم الرئتين.

بالإضافة إلى التشريح الافتراضي ، يحتوي هذا الموقع على مختبرات افتراضية أخرى.

في مختبر Animacules ، يمكن للطلاب عرض مجموعة متنوعة من الخلايا من خلال مجهر افتراضي.

أنا مجنونة بمختبر eFly. يستكشف الطلاب التهجينات الجينية لأنها تولد فعليًا ذباب الفاكهة. أثناء تحليل ذبابة الفاكهة من تهجينهم ، أصبحوا على دراية بـ Punnett Squares ، الأليلات الجينية السائدة والمتنحية ، والسمات المرتبطة بالجنس.

هذا إلى حد بعيد أحد مواردي المفضلة للمختبرات الافتراضية! لديهم خيار لتجربة المعامل في الوضع التجريبي قبل الشراء.

تفاعل حيوي

بالإضافة إلى بعض مقاطع الفيديو الرائعة وخطط الدروس والأنشطة الأخرى ، يحتوي Biointeractive على بعض المعامل الافتراضية الرائعة لعلم الأحياء.

أثناء الانتهاء من مختبر تحديد البكتيريا ، يتم إرشاد الطالب خلال عملية استخدام PCR للتعرف على البكتيريا غير المعروفة المعزولة من طبق بتري.

في معمل تحديد البكتيريا ، يتم إرشاد الطالب خلال عملية استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل للتعرف على البكتيريا غير المعروفة المعزولة من طبق بتري.

في المختبر الافتراضي لأمراض القلب ، يفحص الطالب 3 مرضى ويستخدم النتائج لتحديد التشخيص. هذه محاكاة رائعة للمراهقين الذين يفكرون في مهنة الطب وهي واحدة أخطط لاستخدامها هذا العام مع طلاب علم التشريح وعلم وظائف الأعضاء.

تعلم علم الوراثة

معمل PCR الظاهري من Learn Genetics

لسنوات ، كان موقع Learn Genetics أحد المواقع المفضلة لدي للحصول على أفكار لتدريس الحمض النووي وعلم الوراثة. لديهم بعض المعامل الافتراضية والمحاكاة أيضًا. تساعد عمليات المحاكاة التفاعلية الخاصة بهم الطلاب على فهم الإجراءات التي يستخدمها العلماء لدراسة الخلايا والحمض النووي ، بما في ذلك تفاعل البوليميراز المتسلسل ، والرحلان الكهربي للهلام ، وقياس التدفق الخلوي ، واستخراج الحمض النووي ، والمصفوفات الدقيقة للحمض النووي.

بيومان بيولوجيا

تقدم Bioman Biology ألعابًا ومحاكاة افتراضية على موقع الويب الخاص بهم. تشبه هذه الألعاب إلى حد ما أكثر من كونها مختبرات افتراضية ، ولكنها تتم بطرق تساعد الطلاب على فهم المواد.

في محاكاة الرحلة التنفسية ، يسافر الطلاب عبر جميع أجزاء الجهاز التنفسي: أولاً كجزيء من الأكسجين ، ثم كجزيء من ثاني أكسيد الكربون.

تسمى المحاكاة التي أخطط لاستخدامها في صفي علم التشريح وعلم وظائف الأعضاء رحلة الجهاز التنفسي.

في ذلك ، يمكنك التحكم في مسار جزيء الأكسجين وهو يشق طريقه عبر الجهاز التنفسي: من خلال القصبة الهوائية إلى الرئتين ، عبر جدران الحويصلات الهوائية وإلى مجرى الدم ، عبر القلب وإلى خلايا الجسم. يقوم الطلاب بعد ذلك بسحب جزيء الأكسجين إلى الميتوكوندريا بالخلية ومشاهدته أثناء استخدامه لإنتاج ATP. ثم يأخذون جزيء ثاني أكسيد الكربون (نفايات من التنفس الخلوي) ويوجهون رحلته عبر الأوردة إلى القلب ، والعودة إلى الرئتين ، والعودة إلى القصبة الهوائية.

إنها تجربة تفاعلية رائعة حقًا وأتوقع أنها ستساعد الطلاب على إجراء اتصالات متعددة بين التشريح الإجمالي والعمليات الخلوية.


مقترح تمهيدي بديل لتعدد إرسال تفاعل البوليميراز المتسلسل التابع لشبكة ARTIC لتحسين تغطية تسلسل جينوم SARS-CoV-2

اقترحت مجموعة من علماء الأحياء ، ARTIC Network ، مجموعة تمهيدي PCR متعدد الإرسال لتحليل الجينوم الكامل لفيروس كورونا الجديد ، SARS-CoV-2 ، بعد وقت قصير من الكشف عن أوبئة هذا العامل الممرض. يبدو أن مجموعة التمهيدي قد تم تكييفها بالفعل من قبل العديد من الباحثين في جميع أنحاء العالم وساهمت في علم أوبئة الجينوم عالي الجودة والفوري لهذا الفيروس الجائح المحتمل. لقد رأينا أيضًا الأداء الرائع لمجموعة التمهيدي والبروتوكول ، حيث تمكنت مجموعة التمهيدي من تضخيم جميع منتجات PCR المرغوبة بتحيز تضخيم صغير خرافي من العينات السريرية ذات الحمل الفيروسي المرتفع نسبيًا. ومع ذلك ، لاحظنا انخفاضًا حادًا في القراءات المشتقة من منتجي PCR محددين ، 18 و 76 ، من أصل 98 منتجًا معينًا مع انخفاض الحمل الفيروسي للعينة. لقد اشتبهنا في أن سبب هذه المشكلة ذات التغطية المنخفضة يرجع إلى تكوين خافت بين البادئات المستخدمة لتضخيم هذين المنتجين PCR. هنا ، نقترح استبدال واحد فقط من تلك البادئات ، nCoV-2019_76_RIGHT (-) ، إلى برايمر مصمم حديثًا. أظهرت نتيجة استبدال البرايمر تحسنًا في التغطية في كلتا المنطقتين المستهدفتين بواسطة المنتجات ، 18 و 76. نتوقع أن يؤدي هذا التعديل البسيط إلى توسيع الحد الأقصى لتحليل جينوم SARS-CoV-2 بالكامل ليشمل عينات ذات حمل فيروسي أقل ويعزز الجينوم. علم الأوبئة لهذا العامل الممرض.


طرق التحديد والطباعة لدراسة العدوى البكتيرية: مراجعة موجزة و Mycobacterial كحالة دراسة

Graciela Castro-Escarpulli 1، Nayelli Maribel Alonso- Aguilar 1، Gildardo Rivera S & aacutenchez 3، Virgilio Bocanegra-Garcia 4، Xianwu Guo 5، Sara R Ju & aacuterez-Enr & iacutequez 6، Juleraa Luna-Cristu غوادالوبي 1 *

1 Laboratorio de Bacteriolog & iacutea M & eacutedica، Departamento de Microbiolog & iacutea، Mexico

2 Laboratorio de Inmunoqu & iacutemica II، Departamento de Inmunolog & iacutea، Escuela Nacional de Ciencias Biol & oacutegicas del Instituto Polit & eacutecnico Nacional، Mexico DF، 11340، Mexico

3 Laboratorio de Biotecnology & iacutea Ambiental ، المكسيك

4 Laboratorio de Medicina de Conservaci & oacuten، Mexico

5 معمل. Biotecnolog & iacutea Gen & oacutemica Centro de Biotecnolog & iacutea Gen & oacutemica del Instituto Polit & eacutecnico Nacional ، رينوسا ، 88710 ، المكسيك

6 Laboratorio de pruebas especiales، Centro M & eacutedico Nacional 20 de Noviembre del Instituto de Seguridad y Servicios Sociales de los Trabajadores del Estado، Mexico DF، 03229، Mexico

* المؤلف المراسل: د. غوادالوبي أغيليرا أريولا
Laboratorio de Bacteriolog & iacutea M & eacutedica
Departamento de Microbiolog & iacutea
Escuela Nacional de Ciencias Biol & oacutegicas
IPN ، Esq. Prolongaci & oacuten de Carpio y Plan de Ayala s / n
العقيد كاسكو دي سانتو توم وأكوتيس ، ديل ميغيل هيدالغو
CP. 11340. إم آند إيكوتيكسيكو سيتي ، دي إف ، المكسيك
الهاتف: (+ 52-55) 57296300 ، داخلي 62374
الفاكس: (+52-55) 57296207
بريد الالكتروني: [البريد الإلكتروني & # 160 محمي]

تاريخ الحصول عليه: 25 أكتوبر 2015 التاريخ المقبول: 05 ديسمبر 2015 تاريخ النشر: 15 ديسمبر 2015

الاقتباس: Aguilera-Arreola MG. طرق التحديد والطباعة لدراسة العدوى البكتيرية: مراجعة موجزة و Mycobacterial كحالة دراسة. قوس كلين ميكروبيول. 2015 ، 7: 1.

الملخص

عدة تقنيات تعتمد على البيولوجيا الجزيئية والكيمياء التحليلية تم تطويرها لتقليل بعض قيود التوصيف البكتيري. تمثل الطرق الجزيئية أفضل بديل للتعرف عليه سلالات بكتيرية معزولة عن أصول متنوعة ولتحسين البحث في سياق الجزيئية علم الأوبئة. ومع ذلك ، فإن هذه المنهجيات شاقة ومكلفة مقارنة بالتقنيات المظهرية أو الكلاسيكية ، ولا توجد مختبرات روتينية موثوقة. يجب أن توفر هذه المراجعة العناصر الأساسية لفهم هذه المنهجيات وتزيد من الاهتمام باستخدامها التعاوني بين المختبرات التحليلية حيث يكون تحديد البكتيريا وطبعها من الأولويات ، لأن الطرق الجزيئية لا يتم تنفيذها عالميًا ولكنها متوفرة في المختبرات البحثية والمرجعية.

الكلمات الدالة

التعرف على التهابات البكتيريا

مقدمة

تتمثل إحدى المهام الأساسية لمختبر علم الأحياء الدقيقة في التعرف الكامل على الكائنات الحية الدقيقة المشاركة في العمليات المرتبطة بالعدوى أو المتعلقة بالإنسان. هذا يسمح بمعرفة آثارها المسببة للأمراض ، وتطورها السريري ، بالإضافة إلى تطبيق علاج فعال مضاد للميكروبات [1].

استند تحديد وتوصيف البكتيريا في الماضي على طرق نمطية وراثية متنوعة (الجدول 1) ومع ذلك ، فقد لوحظ في العقود الماضية أن طرق التنميط الجيني يمكن أن تمثل بديلاً أفضل لتحديد هوية البكتيريا وإثراء البحث الوبائي للأمراض المعدية [2].

طرق النمط الظاهري طرق النمط الجيني
التفاعلات البيوكيميائية تهجين
التفاعلات المصلية الملف الشخصي البلازميدات
التعرض للعوامل المضادة للميكروبات تحليل تعدد الأشكال البلازميدات
القابلية للإصابة بالعاقمات إنزيمات تقييد الهضم
القابلية للبكتريوسينات التفاعل والفصل بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام النبضي (PFGE)
لمحة عن بروتينات الخلية النمذجة
تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) ومتغيراته
تفاعل Ligase المتسلسل (LCR)
نظام التضخيم المعتمد على النسخ (TAS)
كتابة تسلسل متعدد البؤرة (MLST)
التنميط و MIRUS-VNTR

الجدول 1: الطرق المستخدمة في المختبرات السريرية لتحديد البكتيريا أو طباعتها.

تسبب العدوى البكتيرية المراضة والوفيات ، وهي مسؤولة عن زيادة التكاليف وأوقات الاستشفاء للمرضى. يعتبر الوقت اللازم لتحديد العامل الممرض بناءً على خصائصه المظهرية هو التحدي الأول ، حيث يجب بذر العينة واحتضانها لمدة 24 ساعة على الأقل ، وبعد ذلك ، يجب إجراء الاختبارات الكيميائية الحيوية التقليدية في فترة 24 ساعة أخرى على الأقل ، الظروف التي تؤخر النتائج وتضر بصحة المريض و rsquos.

حاليًا ، في العديد من مختبرات علم الأحياء الدقيقة ، يعد استخدام الأنظمة التجارية الآلية أو شبه الآلية لتحديد البكتيريا ممارسة شائعة ، على سبيل المثال: API ENTEROTUBE و VITEK و PHOENIX و MALDI-TOF MS ونظام GENOTYPE MYCOBACTERIUM CM للبكتيريا الفطرية. بعض الخصائص التي تؤخذ في الاعتبار عند اختيار نظام تحديد الهوية هي: سهولة تلقيح العينات ، تحديد الخصائص ، المعالجة المطلوبة لمعالجة العينة بعد الحضانة ، وتوافر قواعد البيانات ومداها [3].

لا تستطيع طرق النمط الظاهري دائمًا تحديد الكائن الدقيق على مستوى الأنواع ، وأقل بكثير على مستوى السلالة. لذلك ، إذا تم تحديد الاختراق ، الذي يكون فيه استنساخ واحد فقط ، فسيكون هناك حاجة إلى مزيد من الوقت واستخدام تقنيات وراثية (جزيئية) أو تقنيات مناعية أكثر تحديدًا. على الرغم من محدودية تقنيات النمط الظاهري ، فإنها توفر تحديدًا أوليًا يسمح باتخاذ القرارات وهي متوفرة بشكل أكبر في المعامل السريرية أو المستشفيات نظرًا لتكاليفها المنخفضة والتدريب الواسع للعاملين في هذا المجال الصحي [4].

تتضمن طرق عزل وتحديد الكائنات الحية من العينات البشرية أو المنتجات البيولوجية أو من أي أصل آخر العزلة في ثقافة نقية للكائن الحي محل الاهتمام ، تليها الاختبارات اللازمة لتمييز الأيض الميكروبي و / أو عن طريق تقنيات مناعية متنوعة من شأنها تسهيل تحديد الهوية. في العديد من الجوانب ، تكون طرق الاستزراع والتقنيات الأخرى المستخدمة لتحديد الهوية محدودة من حيث الحساسية أو الخصوصية أو كليهما. تستند التحسينات في الحساسية والنوعية والوقت المطلوب إلى التقدم في البيولوجيا الجزيئية التي تم دمجها في الاستراتيجيات التجارية للتشخيص السريع. يعتمد استخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية لتحديد ومتابعة مسببات الأمراض على خصائص جينوم الكائن الحي المعين المراد اكتشافه أو توصيفه. ومع ذلك ، لا تزال هناك عدة جوانب تعقيد تطبيقها في مختبر علم الأحياء الدقيقة: صعوبة العزل ، وبطء النمو ، وتكاليف الاختبارات ، وحساسية الكشف الضعيفة لتحديد بعض الأنواع البكتيرية القادمة من عينات معقدة ، من بين أمور أخرى.

تغطي هذه المراجعة الأنماط الظاهرية المختلفة ، والتي تسمى أيضًا المنهجيات الكلاسيكية ، بالإضافة إلى طرق البيولوجيا الجزيئية المختلفة التي يتم تطبيقها على التوصيف البكتيري. وبالمثل ، فإنه يهدف إلى زيادة الاهتمام بالاستخدام التعاوني لهذه المنهجيات بين المختبرات حيث يكون تحديد البكتيريا وتحديد تصنيفها من الأولويات ، نظرًا لأنه على الرغم من أن الأساليب الجزيئية لم يتم تنفيذها عالميًا بعد ، إلا أنها متاحة في مختبرات البحث والمرجعية التي يمكن أن توفر الخبرة لحل المشاكل الصحية لبلد ما بمنهجيات المستوى الأول.

تحديد النمط الظاهري

لتحديد العامل المسبب للعدوى ، يجب مراعاة ما يلي: 1) جمع العينات ، 2) تحديد الأشكال المجهرية والمستعمرة ، و 3) التحديد على أساس التمثيل الغذائي البكتيري من خلال الاختبارات التقليدية أو الآلية [2]. تمثل دراسة النمط الظاهري وجهة النظر الكلاسيكية لتحديد الهوية ، وتعتمد عليها معظم استراتيجيات التحديد [5].

في معظم الحالات ، لا يعتمد تحديد النمط الظاهري على طريقة واحدة فحسب ، بل على مزيج من أكثر من طريقة. يجب أن تأتي العينة من الموقع الذي تسبب فيه الكائنات الحية الدقيقة في الضرر أو يجب أن تكون ممثلة للموقع أو المنتج الذي تتكاثر فيه. بعض العينات المستخدمة في علم الأحياء الدقيقة السريرية هي: البراز ، البول ، إفرازات البلعوم ، السائل النخاعي ، الدموع ، السائل المنوي ، السائل المهبلي ، الأنسجة و / أو الخزعات. تتطلب بعض الطرق عزلًا خالصًا للكائنات الحية الدقيقة من العينة ، بينما لا يحتاجها البعض الآخر. يعتمد التعرف على النمط الظاهري للبكتيريا بشكل أساسي على مقارنة الخصائص المظهرية للبكتيريا غير المعروفة بتلك الخاصة بزراعة النوع. تتناسب موثوقية التعريف بشكل مباشر مع عدد الخصائص المتشابهة. في علم الجراثيم الطبي ، تعد الخبرة السابقة للمحلل والارتباط بين الكائنات الحية الدقيقة والموقع ونوع العدوى مفيدة في التحديد الأولي. ومن ثم ، في عملية تحديد البكتيريا التقليدية أو الكلاسيكية ، تم إنشاء ثلاثة مستويات من المعالجة [1].

أ) تعتبر الاختبارات الأولية في المستوى الأول. هذه اختبارات سريعة وسهلة التنفيذ ، مثل امتصاص الأصباغ والبقع مثل غرام أو زيل-نيلسن ، التحديد المجهري للنمط المورفولوجي البكتيري الذي كشفته البقع ، وخصائص النمو في أجواء الحضانة المختلفة ، ودرجات الحرارة المختلفة ، وفي وسائط الاستزراع المتنوعة ، إنتاج إنزيمات أوكسيديز وكاتلاز ، تخمير الأكسدة ، تخمير الجلوكوز ، إنتاج الأبواغ ، والتنقل. من خلال هذه الاختبارات ، من الممكن بشكل عام وضع العامل الممرض ، مؤقتًا ، في بعض المجموعات الرئيسية ذات الصلة السريرية. بعد ذلك ، يمكن استخدام طرق أخرى ذات قوة تمييزية أكبر ، لتكون قادرة على التمييز بين الكائنات الحية الدقيقة التي تقدم جانبًا مشابهًا جدًا في التحليلات الكلية والميكروسكوبية [6].

ب) يجب أن يحدد المستوى الثاني من التعريف جنس الكائن الدقيق. في كلٍّ من هذا والمستوى السابق ، تستند الفرضية حول الهوية المحتملة للكائنات الدقيقة على خصائص الثقافة وعلى الاختبارات الأولية ، والتي ستسمح بتحديد الجنس أو مجموعة الأجناس أو ، في بعض الحالات ، عائلة الكائنات الحية الدقيقة. العزلة. يجب أيضًا مراعاة البيانات السريرية. هذا سوف يعتمد إلى حد كبير على نمط ثابت من السمات المظهرية وعلى خبرة عالم الأحياء الدقيقة [7].

ج) أخيرًا ، يكون مستوى التعريف الثالث على مستوى الأنواع. تسمح بعض الاختبارات البيوكيميائية بالتعرف بدقة على معظم البكتيريا المهمة سريريًا. إذا لم يكن ذلك ممكنًا ، فيمكن استخدام مجموعة اختبارات أكثر اتساعًا ، مثل تلك الموجودة في أنظمة تجارية مختلفة.

تتوفر العديد من الأنظمة أو المعدات متعددة الاختبارات في السوق لجعل التعرف على البكتيريا سريعًا وموثوقًا به. تتطلب هذه التقنيات تحكمًا دقيقًا في اللقاح ونقاوته وطريقة التلقيح والحضانة وقراءة الاختبارات ، لأن عدم اتباع هذه المعايير قد يؤدي إلى حدوث أخطاء. يمكن أن تكون هذه الأنظمة يدوية أو شبه آلية أو آلية. تتم مقارنة النتيجة بالاختبارات المعيارية أو بقاعدة بيانات الملامح العددية التي طورتها الطرق التجارية لهذا الغرض. القيد هو ظهور سلالات متحولة واكتساب البلازميدات التي يمكن أن تعطي منشأ لسلالات ذات خصائص مختلفة [5،8].

على عكس مختبرات الكيمياء الحيوية السريرية أو أمراض الدم التي استفادت من التكنولوجيا لتبسيط معالجة العينات وبالتالي الحصول على النتائج في وقت قصير ، فإن أتمتة مختبر علم الأحياء الدقيقة أكثر تعقيدًا نظرًا للتنوع الكبير في العينات السريرية المراد تحليلها والمتأصلة خصائص الكائنات الحية الدقيقة المختلفة. في الآونة الأخيرة ، أصبح قياس الطيف الكتلي (MS) جزءًا من مختبر علم الأحياء الدقيقة الذي يقدم بديلاً سريعًا وموثوقًا به لتحديد الكائنات الحية الدقيقة ، بما في ذلك واحدة من أصعب المجموعات البكتيرية التي يمكن تحديدها ، وهي البكتيريا الفطرية [9،10].

MS هي تقنية تحليلية تسمح بتحليل تركيبة العناصر الكيميائية المختلفة بدقة كبيرة من خلال السماح بقياس الأيونات المشتقة من الجزيئات وفصلها وفقًا لنسبة الكتلة / الحمل (m / z) [11]. يُطلق على الطيف الكتلي لكل مركب اسم & ldquochemical trace & rdquo وهو تمثيل رسومي للأجزاء التي تم الحصول عليها بترتيب متزايد للكتلة من حيث وفرتها النسبية. تم اقتراح تحديد البكتيريا بناءً على ملف تعريف البروتينات الذي تم الحصول عليه بواسطة مطياف الكتلة MALDI-TOF منذ عدة عقود. ومع ذلك ، فقد تم استخدامه مؤخرًا فقط كطريقة سريعة وموثوقة لتحديد البكتيريا [9]. تستخدم المنصات التجارية حاليًا مرض التصلب العصبي المتعدد لتحديد الكائنات الحية الدقيقة من خلال مناهج مختلفة: التحديد بناءً على ملف البروتين المحدد لكل كائن حي دقيق (نهج بروتيني) أو على تحليل أحماضه النووية (النهج الجيني). بعض الأنظمة التجارية التي تستخدم MS هي: MALDI-TOF لتحديد الميكروبات MicrobeLynx من شركة Waters Corporation و MALDI BiotyperTM من Bruker Daltonics و MS-ID لـ BioM & eacuterieux [12]. يسمح الأخير بالتعرف على البكتيريا الفطرية [13].

تحديد النمط الجيني (الجزيئي)

في السنوات الأخيرة ومع ظهور منهجيات جديدة تعتمد على الأساليب الجزيئية ، تم إحراز تقدم كبير في تشخيص البكتيريا ذات الصلة سريريًا. من بينها ، تبرز اكتشاف الحمض النووي الريبي الريبوزومي من خلال التهجين بمسبار الحمض النووي وتضخيم الأحماض النووية من العينات السريرية. تعمل هذه التقنيات على تحسين الحساسية وخصوصية التشخيص فيما يتعلق بتقنيات الكشف الأخرى ، بما في ذلك الثقافة ، وفي بعض الحالات ، سمحت بالكشف المتزامن للعديد من العوامل الميكروبية من نفس العينة [14].

تم دعم الخطوة الأولى في تطوير المنهجيات القائمة على تقنيات البيولوجيا الجزيئية من خلال الكشف عن الأحماض النووية للكائنات الدقيقة عن طريق مسبار من خلال التهجين. المسبار الجيني عبارة عن جزيء حمض نووي ، في حالة أحادية الشكل ومميز ، يمكن استخدامه للكشف عن تسلسل الحمض النووي التكميلي. يتم الحصول على مجسات قليل النوكليوتيد من الحمض النووي الطبيعي عن طريق استنساخ جزء الحمض النووي إلى نواقل البلازميد المناسبة ثم عزل الحمض النووي المستنسخ أو من خلال التوليف المباشر عن طريق الكيمياء التوليفية. يمكن تمييز المجسات بالمواد التي تنتج تفاعلات ملونة في ظل ظروف مناسبة [15].

تقنيات تهجين الحمض النووي سهلة التنفيذ والتفسير نسبيًا. تقنيات التضخيم المعتمدة على اكتشاف الحمض النووي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتفاعل Ligase المتسلسل (LCR) أو تضخيم الرنا الريباسي النوعي بوساطة النسخ متاح بالفعل على حد سواء ليتم إجراؤه في المنزل أو يتم الحصول عليه تجاريًا. توفر هذه التقنيات نتائج أسرع مع حساسية وخصوصية أفضل من التقنيات التقليدية.اعتمادًا على نوع العينة ، تكتشف هذه التقنيات من 15 إلى 20٪ عوامل معدية أكثر من تلك التقليدية و 25 إلى 70٪ أكثر من خلال التألق المناعي أو التحليل المناعي الإنزيمي (EIA) [14،16].

يسمح بناء مجسات للكشف عن علامات الفوعة ، مثل تلك الموجهة للجينات التي تشفر السموم ، بتحديد تلك الكائنات الحية التي تحمل هذه الجينات في العينات السريرية ، دون الحاجة إلى زراعة العينات. من الأمثلة اللاحقة تحقيقات الإشريكية القولونية السموم المعوية ذيفان ضمة الكوليرا، أو لسموم المطثية العسيرة، والتي يمكن تطبيقها مباشرة على عينات البراز [17].

تُستخدم جينات مستهدفة مختلفة للكشف عن الكائنات الحية الدقيقة ، على سبيل المثال تلك التي تسبب عدوى الانتقال الجنسي (STI) ، والتي تم استخدامها في فحوصات تفاعل البوليميراز المتسلسل من بينها الجينات omp1 و omp2 من البروتينات الغشائية الرئيسية (MOMP) لدراسة العوامل المسببة الرئيسية للبلازميد المشفر pCT والجينات 16S rRNA و 23S rRNA ، لإجراء فحوصات موجهة لتحديد المتدثرة الحثرية [14 ، 18 ، 19]. التركيز على الجينات 16S الرنا الريباسي و 23 S. الرنا الريباسي يزيد من حساسية المقايسة ، حيث توجد عادة نسخ متعددة في الكائنات الحية الدقيقة. ومع ذلك ، يقترح بعض المؤلفين أن التفاعلات المتصالبة مع بكتيريا أخرى يمكن أن تشكل مشكلة بينما أظهر آخرون أن استخدام المناطق المحفوظة من الجين 16S الرنا الريباسي في تفاعلات التضخيم يسمح بالتمايز بين الأنواع [19 ، 20]. يعد استخدام الجينات والمناطق المستهدفة للكشف عن البكتيريا المتفطرة منطقة مدروسة جيدًا ، خاصة بسبب الصعوبة المطروحة لعزل هذه الكائنات الدقيقة من العينات البيولوجية علاوة على الصعوبات الحالية في التعامل مع هذه الكائنات الحية الدقيقة شديدة الضراوة. تم استخدام العديد من المتواليات والجينات والمناطق بين الجينات لتحديد هذا الجنس البكتيري ، من بينها منطقة الرنا الريباسي 16-23S والجينات 16S الرنا الريباسي, جيرب و rpoB، عنصر الإدراج IS6110 ، ومناطق التمايز المستبعد RD1 و RD4 [21]. ستسمح دراسة هذه الجينات أو التسلسلات الجينية عن طريق PCR في النهاية بتحليل تسلسل مقارن للمنتج الذي تم الحصول عليه مع تسلسل العزلات المرجعية. تم تصميم العديد من التحقيقات التجارية لتشخيص الأمراض المعدية ، لكن القدرة على اكتشاف عدد صغير من الكائنات الحية أو نسخ قليلة من الجين في العينة السريرية لا تزال عاملاً مقيدًا لهذه التقنية. ومع ذلك ، يمكن أن يصبح الجمع بين تفاعل البوليميراز المتسلسل مع تهجين المجسات هو الأسلوب المفضل ، خاصة بالنسبة للكائنات الحية الدقيقة التي تكون ثقافتها في المختبر بطيئة وصعبة [15].

PCR هو ملف في المختبر طريقة تخليق الحمض النووي التي يتم من خلالها تضخيم جزء معين من الحمض النووي عن طريق تحديده بزوج من البادئات المرافقة. يتم النسخ بشكل أسي من خلال الدورات المتكررة لفترات حضانة ودرجات حرارة مختلفة في وجود إنزيم بوليميريز DNA القابل للحرارة. بهذه الطريقة ، يمكن الحصول على ملايين النسخ من تسلسل الحمض النووي المطلوب في غضون ساعتين. هذه تقنية بيولوجيا جزيئية محددة للغاية وسريعة وحساسة ومتعددة الاستخدامات لاكتشاف أصغر كميات من حمض نووي معين ، وتعزيز التعرف عليها بسهولة وتجنب استخدام النظائر المشعة [22]. على الرغم من الفوائد التي تقدمها تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل مقارنةً بالثقافة للكشف عن بعض الكائنات الحية الدقيقة ، فإن التقنيات المتاحة تجارياً نادرة وتقتصر على المعامل البحثية أو المختبرات المرجعية المتخصصة في التشخيص الجزيئي ، من بين أسباب أخرى ، بسبب ارتفاع تكلفتها. يمكن أن يكون أحد البدائل لجعل استخدام التشخيصات الجزيئية ممكنًا حيث أن التقنيات الروتينية هي الحصول على الكواشف بطريقة منفصلة وتوحيد بروتوكولات استخراج الأحماض النووية والتضخيم المصممة في كل مختبر تشخيصي ، مما يؤدي إلى انخفاض كبير في الاعتماد التكنولوجي وإلى زيادة حساسية وخصوصية تقنيات التشخيص المستخدمة [23].

يعزز التضخيم المتعدد للاكتشافات المصاحبة لبعض الكائنات الحية الدقيقة ، في بعض الحالات ، حساسية وخصوصية تلك التي يتم تناولها في كائن حي دقيق واحد. يُطلق على متغير PCR هذا عدة PCR (mPCR) ، حيث يمكن تضخيم أكثر من تسلسل مستهدف واحد في وقت واحد عن طريق تضمين أكثر من زوج من البادئات في التفاعل [24]. تم تطبيق هذه التقنية بنجاح في العديد من مجالات التشخيص ، مثل دراسة الأمراض المعدية ، والتنميط الجيني للأنواع ، وتشخيص الأمراض الوراثية ، وتحديد الطفرات ، وعلم الأحافير ، والأنثروبولوجيا ، وعلوم الطب الشرعي ، من بين أمور أخرى هنا ، وقد أظهرت هذه التقنية إمكانية التوفير. وقت طويل ، دون المساومة على فائدة وكفاءة الاختبار [24]. من ناحية أخرى ، أصبحت أشكال الصفائح لتحديد العوامل الممرضة متاحة مثل التحلل الحراري والتحليل الطيفي [25].

في منصات التضخيم والتسلسل الحراري ، يتم تحديد الهوية البكتيرية بواسطة PCR لثلاث مناطق متغيرة من 16S rRNA (V1-V3 أو V1 و V2 و V6). يتم الحصول على أمبليكونات سفلية تبلغ 500 نقطة أساس ، ويمكن تحديد تركيبها من النيوكليوتيدات عن طريق انبعاث الضوء عن طريق إطلاق البيروفوسفات (تمديد المنتجات الثانوية عن طريق بلمرة سلسلة الحمض النووي). تم ابتكار هذه المنصة بشكل متزايد بناءً على نوع العينة السريرية وتحديد الأجزاء الجينية المختلفة المقابلة لعوامل الضراوة المختلفة ومقاومة مضادات الميكروبات ، مما أدى إلى تحسين تنوع هذه المنصة [2،25]

منصة ابتكارية أخرى لتحديد البكتيريا هي اقتران التضخيم (بواسطة PCR) والقياس الطيفي الكتلي (PCR / ESI-TOF). يسمح هذا الأخير بالكشف الشامل عن واحد أو أكثر من مسببات الأمراض التي تمت مواجهتها في مجموعة متنوعة من العينات (بيئية ، إكلينيكية ، منقولة بالغذاء ، في الثقافات). وهو يتألف من استخراج الأحماض النووية وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل بأزواج أولية من مجموعة واسعة يتم الحصول على منتج واحد أو عدة منتجات PCR التي تتوافق مع مناطق تحديد الجينوم للمجالات الميكروبية المختلفة فيما يتعلق بتعقيد عينة المشكلة. يتم تحلية المنتجات ثم تأينها ورذاذها باتجاه مقياس الطيف الكتلي ، مما يؤدي إلى توليد إشارات تتم معالجتها لتحديد كتلتها وتكوينها. يتم تفسير النتائج باستخدام استراتيجية TIGER (تحديد التثليث للتقييم الجيني للمخاطر) ، والوصول إلى المعلومات في قاعدة بيانات الجينوم التي تحدد الأنواع. تتمثل مزايا هذه المنصة في أنها لا تتطلب استزراعًا ، وهي فعالة في العينات متعددة الميكروبات ، وفي حالة مسببات الأمراض الجديدة غير المميزة ، فإنها تسمح بتخصيصها للأجناس أو العائلات البكتيرية. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يسمح أيضًا باكتشاف بعض جينات الضراوة والمقاومة ، وتحديد نوع الكائن الدقيق المحدد [2،12].

كتابة الكائنات الدقيقة

بعد تحديد البكتيريا ، يجب تصنيف الكائنات الحية الدقيقة للدراسات الوبائية ، وبالتالي ، تشكل أنظمة التصنيف الجزيئي إحدى التقنيات الجزيئية التي تساهم في علم الأحياء الدقيقة المستخدمة على نطاق واسع في السنوات الأخيرة. تتضمن هذه الأنظمة مجموعة كبيرة ومتنوعة من التقنيات التي تهدف إلى مقارنة بنية الجينوم للكائنات شديدة الارتباط.

تسمح طرق الكتابة (المظهرية والجينية) بالتفريق بين سلالة بكتيرية وأخرى. قبل استخدام تقنية الطباعة ، من المهم التأكد من أن الطريقة يمكن أن تميز بين العزلات غير المرتبطة ، وأنها قادرة على اكتشاف نفس السلالة في عينات مختلفة ، وأنها تعكس العلاقات الجينية بين العزلات ذات العلاقة الوبائية [26].

من الناحية العملية ، يجب أن يكون نظام الطباعة قابلاً للتكرار ، وله قدرة تمييز عالية ، وسهل الاستخدام وتفسير النتائج [26]. على الرغم من ذلك ، يعتمد اختيار الطريقة الجزيئية أيضًا على عوامل أخرى ، مثل الكائن الدقيق المراد دراسته ، والعينة السريرية ، والهدف المراد دراسته (جين واحد أو الجينوم بأكمله) ، ومجال التطبيق ، والبنية التحتية المتاحة في المختبر السريري ، والسرعة اللازمة للوصول إلى نتيجة. بمجرد تحديد الكائن الدقيق ، من المهم معرفة ما إذا كان مسؤولاً عن الاختراق ، لذلك يجب إجراء البحوث الوبائية المقابلة. لإنجاز هذه العملية ، تم استخدام تقنيات جزيئية متنوعة تهدف هذه الأدوات إلى تحديد العلاقة النسيليّة الموجودة بين عدة عزلات من نوع معين. هذه المعلومات مفيدة في حالات العدوى المتفرقة وحتى أثناء انتشار المرض والأوبئة لأنها تسمح بتحديد عدد الحيوانات المستنسخة المنتشرة ، واكتشاف مسببات الأمراض ومسار انتقال العدوى ، وتحديد مصدر العدوى ، والتعرف بشكل خاص على السلالات الخبيثة ، وبالتالي ، مما يؤدي إلى العلاج الأنسب [27،28].

تسفر تقنيات الطباعة التي تعتمد على الجينوم الكامل للكائن الدقيق عن نتائج أفضل في إنشاء العلاقة النسيليّة. ومع ذلك ، من أجل هذا التحليل ، هناك حاجة إلى هضم الجينوم باستخدام إنزيمات التقييد للحصول على أجزاء من الحمض النووي بأحجام مختلفة توفر أنماطًا أو ملامح ، بمجرد فصلها عن طريق الرحلان الكهربي. على الجانب الآخر ، هناك إزعاج يتمثل في أن الأجزاء المتنوعة التي تم الحصول عليها من إجراء التقييد عبارة عن شظايا كبيرة الحجم يجب تحليلها بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام النبضي (PFGE) [26]. PFGE هي تقنية تستخدم على نطاق واسع لكتابة البكتيريا ذات الصلة سريريًا. تعتمد أهميتها على أن هذا النوع من الرحلان الكهربائي قادر على فصل الأجزاء التي يزيد طولها عن 50 كيلو بايت حتى 10 ميجا بايت ، وهو أمر غير ممكن مع الرحلان الكهربائي التقليدي ، والذي يمكنه فقط فصل أجزاء من 100 نقطة أساس إلى 50 كيلو بايت. ترجع قدرة PFGE إلى ميزتها متعددة الاتجاهات ، وتغيير اتجاه المجال الكهربائي باستمرار ، وبالتالي ، السماح بإعادة توجيه اتجاه جزيئات الحمض النووي ، بحيث يمكن لهذه الجزيئات الانتقال من خلال هلام الاغاروز ، بالإضافة إلى هذا الحدث ، النبضات الكهربائية المطبقة لها فترات مختلفة ، مما يعزز إعادة توجيه الجزيئات وفصل الأجزاء ذات الأحجام المختلفة [29]. مع مرور الوقت ، تم تطوير أنواع مختلفة من معدات PFGE (الجدول 2) ، بشكل أساسي لتحسين دقة المواد الهلامية وتقليل تكاليف الكواشف والكهرباء. الجهاز الأكثر استخدامًا هو المجالات الكهربائية المتجانسة المشبكية (CHEF ، BioRad) ، لأنه يمكن أن يفصل الجزيئات التي يبلغ وزنها 7000 كيلو بايت ، ويتم توفير هذه الخاصية من خلال 24 قطبًا كهربائيًا موزعة سداسيًا وتولد مجالات كهربائية متجانسة تسمح بتشغيل العينات بشكل موحد [29،30]. بعض مزايا PFGE هي: أنها تمتلك قوة تمييز عالية ، وإمكانية استنساخ ممتازة ، وسهولة في قياس الجينوم وتسمح بالعمل مع عدد كبير من العينات. تشمل العيوب أن معظم البروتوكولات تتطلب أكثر من 4 أيام للحصول على أنواع النبض وتحليلها ، مقارنة بالطرق الأخرى التي يمكن أن تكون أقل تكلفة ، ولكنها غير مناسبة لدراسة السلالات المرتبطة بالاستنساخ (الجداول 2 و 3) [27،29]. تم تقييد تطبيق PFGE في دراسة عدوى المتفطرات بسبب الحاجة إلى الاعتماد على تركيزات عالية من الحمض النووي المتفطرات التي يصعب الحصول عليها ، حيث إن التكسير الفعال لجدار الخلية وتفكيك الدهون التي تغطي المتفطرات هي إجراءات معقدة بالإضافة إلى نمو المتفطرات يميل إلى التجميع في مجموعات ، مما يعيق أيضًا الفحص [31].

طريقة سهولة التقنية تفسير النتائج مدة الاختبار (أيام) التكاثر بين المختبرات استنساخ داخل المقايسة التكلفة لكل اختبار
PFGE معتدل سهل 3 حسن حسن معتدل
PCR-RFLP سهل سهل 1 حسن حسن قليل
مندوب- PCR سهل سهل 1 حسن معتدل قليل
AP-PCR سهل سهل 1 معتدل قليل قليل
AFLP معتدل معتدل 2 حسن حسن معتدل
MLST صعب معتدل 2 حسن حسن عالي

الجدول 2: معظم الميزات ذات الصلة ببعض طرق الكتابة على أساس تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل للأحماض النووية بالمقارنة مع الرحلان الكهربائي للهلام النبضي (PFGE).

طريقة الكتابة وصف عدد العلامات مقياس الوقت مصدر الاختلاف قوة التمييز قابلية اعادة الأنتاج تطبيق قاعدة البيانات
MLST تضخيم PCR لـ التدبير المنزلي الجينات لإنشاء ملامح أليل 7 GE تسلسل الحمض النووي متوسط ​​إلى مرتفع عالي راكدة بومانية pubmlst.org
جنيه المطثية العسيرة www.mlst.net
المكورات العنقودية السلبية المخثرة
المكورات المعوية
الزائفة الزنجارية
المكورات العنقودية الذهبية
مندوب- PCR تضخيم PCR للتسلسلات المتكررة في الجينوم غير متوفر جنيه أنماط التطويق متوسط ​​إلى مرتفع واسطة المكورات العنقودية الذهبية غير متوفر
السل الفطري
راكدة بومانية
PFGE مقارنة أجزاء تقييد الماكرو غير متوفر جنيه أنماط التطويق متوسط ​​إلى مرتفع عالي راكدة بومانية غير متوفر
المكورات العنقودية الذهبية
المكورات العنقودية السلبية المخثرة
AFLP هضم تقييد الإنزيم للحمض النووي الجيني ، وربط شظايا التقييد والتضخيم الانتقائي غير متوفر جنيه أنماط التطويق متوسط ​​إلى مرتفع قليل راكدة بومانية غير متوفر
الكلبسيلة الرئوية
المكورات العنقودية الذهبية
السل الفطري
MLVA تضخيم PCR للموقع VTR ، تصور تعدد الأشكال لإنشاء ملف تعريف أليل أكتوبر - 80 GE تسلسل الحمض النووي متوسط ​​إلى مرتفع عالي المطثية العسيرة minisatellites.upsud.fr
المكورات المعوية www.mlva.net
السل الفطري www.pasteur.fr/mlst
المكورات العنقودية الذهبية
RFLP هضم الحمض النووي الجيني أو أمبليكون مع إنزيمات مقيدة تنتج شظايا تقييدية قصيرة غير متوفر جنيه نمط النطاقات قليل عالي المكورات العنقودية الذهبية https: //app.chuv .ch / prasite / index.htm
الزائفة الزنجارية
السل الفطري

الجدول 3: تحليل مقارن لبعض تقنيات البيولوجيا الجزيئية والبكتيريا ذات الصلة بالمستشفى حيث يتم تطبيقها.

تفاعل البلمرة المتسلسل- RFLP

يتكون من PCR لتضخيم الجين أو أجزاء منه ، جنبًا إلى جنب مع الهضم اللاحق لمنتجات PCR باستخدام واحد أو أكثر من إنزيمات التقييد. يكشف التحليل الكهربي للمنتجات المقيدة عن تعدد أشكال الجين أو شظايا الجين (RFLP) ويثبت التغيرات الجينية بين العزلات. هذه التكنولوجيا قادرة على الكشف عن تعدد الأشكال المتسلسلة بسرعة فهي بسيطة من الناحية التكنولوجية وقابلة للتكرار بشكل كبير. إلى جانب ذلك ، فإنه يقارن جيدًا مع التقنيات الأخرى مثل: تغيير طبيعة الرحلان الكهربائي للهلام المتدرج (DGGE) ، أو الرحلان الكهربي الهلامي المتدرج بدرجة الحرارة (TGGE) ، أو تعدد الأشكال للتشكيل الفردي للخيط (SSCP) ، وتعدد الأشكال المقطوعة (CFLP) ، والذي يكشف أيضًا عن تعدد الأشكال المتسلسل بين سلالات دون الحاجة إلى تحديد التسلسل الكامل [32]. بالنسبة للمتفطرات ، تم استخدام PCR-RLFP على نطاق واسع ، خاصة لدراسة عنصر الإدراج IS6110 ، حيث يتم استخدام إنزيم Pvull لتوليد شظايا تقييد من الحمض النووي الجيني [33]. المتواليات أو الجينات الأخرى المستخدمة لتحديد التركيب الجيني السل الفطري، فضلا عن غيرها من المتفطرات غير السلية هي 16S rDNA ، والجينات rpoB, recA، و hsp65، والتي أسفرت عن نتائج متغيرة [34]. من بين هذه المتواليات ، كان الجين الأكثر اتساقًا هو الجين الذي يشفر بروتين الصدمة الحرارية 65 كيلو دالتون (hsp65) ، والذي تم تحليله من خلال اختبار قائم على PCR وتقييده الخلفي باستخدام الإنزيمات BstEII و HaeIII ، وهو اختبار يعرف باسم PRA (تفاعل البوليميراز المتسلسل). تحليل إنزيم التقييد و [مدش] PRA) [35]. من بين الطرق الجزيئية غير التجارية ، تعد طريقة PRA واحدة من أكثر الطرق استخدامًا لتحديد البكتيريا الفطرية غير السلية ذات النمو السريع ، نظرًا لسرعتها وتكلفتها المنخفضة ، وقبل كل شيء ، لأن قاعدة البيانات: https: // app. chuv. ch / prasite / index.htm ، وهو متاح ويحتوي على ملفات تعريف التقييد لما لا يقل عن 113 نوعًا [36].

رد فعل البوليميراز المتسلسل

فيرسالوفيتش وآخرون. [37] وصف طريقة لدراسة الجينوم البكتيري عن طريق فحص الأنماط المحددة لسلالة معينة تم الحصول عليها من خلال تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لعناصر الحمض النووي المتكررة الموجودة في الجينوم البكتيري. استخدموا مجموعتين رئيسيتين من العناصر المتكررة لأغراض الكتابة ، REP مع متواليات 38-bp تتكون من ستة مواضع متدهورة وحلقة متغيرة من 5 نقاط أساس بين كل جانب من جوانب جزء متناوب محفوظ. تم وصف متواليات REP لكل من البكتيريا المعوية وموجبة الجرام [28،38] ومؤخرًا ، للبكتيريا المتفطرة غير السلية ، في الأخير بنتائج جيدة [39]. تسلسلات إيريك هي مجموعة ثانية من تسلسلات الحمض النووي التي تم استخدامها بنجاح لكتابة السلالات ، فهي عبارة عن عناصر تزن 126 رطلًا تحتوي على تكرار مركزي مقلوب محفوظ للغاية وتقع في مناطق خارج الجينوم البكتيري. تم استخدام تحليل إيريك أيضًا في التنميط الجيني للبكتيريا المتفطرة [40]. يمكن إجراء تضخيم REP أو ERIC باستخدام جهاز تمهيدي واحد فقط أو بمجموعة واحدة أو مجموعات متعددة من البادئات. تكون أنماط إيريك عمومًا أقل تعقيدًا من أنماط REP ، لكن كلاهما يوفر تمييزًا جيدًا على مستوى السلالات. يزيد الاستخدام المشترك للطريقتين (REP-PCR و ERIC-PCR) في السلالات المراد كتابتها ، من قوة التمييز بينهما [28]. على الرغم من أن متواليات REP و ERIC هي الأهداف الأكثر استخدامًا لكتابة الحمض النووي ، إلا أن متواليات BOX تستخدم أيضًا ، وقد تم استخدام الأخير لتمييز سلالات من العقدية الرئوية. توجد عناصر BOX في مناطق جينية ويمكنها أيضًا تكوين هياكل حلقة جذعية بسبب تناسقها المتساوي. إنها فسيفساء من العناصر المتكررة تتكون من عدة مجموعات من ثلاثة متواليات تعرف باسم boxA و boxB و boxC. التسلسلات المكونة من ثلاث وحدات فرعية لها أطوال جزيئية 59 و 45 و 50 نيوكليوتيدات على التوالي. لا تحتوي عناصر BOX على علاقة تسلسل مع تسلسل REP و ERIC [28].

تضخم طول الجزء تعدد الأشكال

تعدد الأشكال لطول الجزء المضخم (AFLP) هو تقنية بصمة جينومية تعتمد على التضخيم الانتقائي لمجموعة فرعية من أجزاء الحمض النووي المتولدة من خلال هضم إنزيمات التقييد. في الأصل ، تم تطبيق AFPL على توصيف الجينوم النباتي ، وقد تم استخدامه حاليًا في الكتابة البكتيرية. تم وصف نوعين مختلفين من AFLP: الأول ، مع اثنين من الإنزيمات التقييدية المختلفة واثنين من البادئات للتضخيم ، والثاني ، مع أساس واحد فقط وإنزيم تقييد واحد. يتم استخراج الحمض النووي البكتيري وتنقيته ثم تعريضه للهضم بإنزيمين مختلفين ، مثل EcoRI و MseI. بعد ذلك ، ترتبط شظايا التقييد بالمحولات التي تحتوي على كل موقع تقييد وتسلسل متماثل مع موقع ربط لبادئ PCR. تحتوي بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل المستخدمة في التضخيم على تسلسلات الحمض النووي المتجانسة مع المحول وتحتوي على قاعدة أو قاعدتين انتقائيتين في نهاياتها 3 & [30،41]. تم تكييف طريقة AFLP لدراسة مرض السل ، ومع ذلك ، نادرًا ما يتم استخدامه بسبب ضعف قدرة تحليل التنميط الجيني في المتفطرة السلية [42].

كتابة تسلسل متعدد التركيز

تعد الطباعة المتسلسلة متعددة البؤرة (MLST) طريقة وراثية ذات قوة عالية الدقة تعتمد على تسلسل أجزاء من 7 جينات من 450 إلى 500 نقطة أساس (مع درجة عالية من التباين). يكتشف التحليل الاختلافات في المواقع المختلفة ويسمح بتحديد الكائنات الدقيقة المتطابقة (الحيوانات المستنسخة) أو الكائنات الحية الدقيقة شديدة الارتباط (السلالات النسيلية أو الأنماط الجينية). لذلك ، فهي علامات ظلت مستقرة طوال التطور وتستخدم لمقارنة السلالات في نطاقات زمنية كبيرة أو من مناطق جغرافية مختلفة [43]. يسمح التسلسل باكتشاف المتغيرات لتغيير واحد فقط في قاعدة بيانات الجين الذي تم تحليله. ومن ثم ، فقد تم حساب أنه إذا تم العثور على 30 أليلات مختلفة لكل موضع ، ودُرست سبعة جينات ، فيمكن تمييز ما يصل إلى 307 نمطًا وراثيًا مختلفًا [44]. يتم ترقيم كل أليل مع الأخذ في الاعتبار عرضه السابق في قاعدة البيانات ويتم تحديد كل نوع من أنواع التسلسل (ST) بواسطة رمز شريطي مكون من سبعة أرقام والتي تنفرد بها المواقع السبعة [45].

التنميط التنميط و MIRU-VNTR

هناك ثلاث طرق هي الأكثر استخدامًا للتنميط الجيني الفطري: التنميط الجيني ، وتحليل MIRU-VNTR ، وتحليل أجزاء التقييد التي تم الحصول عليها باستخدام إنزيم Pvull للكشف عن عنصر الإدراج IS6110 عن طريق التهجين. كانت الطريقة الثانية المستخدمة على نطاق واسع للتنميط الجيني السريع للبكتيريا الفطرية ، والتي تم وصفها في الأصل لكتابة م. بوفيس يعزل [46]. تجمع هذه التقنية بين تضخيم PCR لمنطقة التكرار المباشر (DR) لكل عزلة وتهجين مناطق المباعد ، وهذه الأخيرة عبارة عن تسلسلات فريدة تفصل بين DRs ، وهناك 47 DRs لـ مرض السل و 41 DRs لـ M. bovis تصور هذه الفواصل تعددًا كبيرًا للأشكال ، مما يتيح استخدامها كمؤشرات للتغير. تم تسمية هذه الطريقة بـ & ldquospoligotyping & rdquo مشتقة من & ldquospacer oligotyping & rdquo [47]. يتم تفسير نمط التهجين الذي تظهره كل عزلة على مصفوفة يمكن استخدامها مع النظام الثنائي أو عن طريق الرمز & ldquooctal & rdquo لتسهيل التعامل مع الأنماط [48]. تحليل المواقع الجينومية مرض السل التي تحتوي على متواليات التكرار الترادفي المتغير (VNTR) هي طريقة تنميط جيني سريعة ، تشبه التنميط الخفي ، وتستند إلى تحليل التسلسلات المتكررة الموجودة في جينوم الفطريات (وحدات التكرار المتناثرة MIRUMycobacterial) التي تختلف في مناطق DR. الحد الأدنى لمجموعة MIRUS-VNTR لتحقيق التمايز هو 12 موقعًا ، مما ينتج عنه رمز يحدد الصلة بالأنماط الجينية المختلفة من خلال تحليل المعلوماتية [49]. تمت زيادة عدد مواقع MIRUS إلى 24 ، مما يمنح دقة أعلى لهذا البروتوكول ووسع تطبيقه على دراسات من النوع التطوري [50].

الاستنتاجات

يعد عزل وتحديد وتحليل عزلات عينة واحدة من الوظائف والأهداف الرئيسية لمختبر الأحياء الدقيقة. ومع ذلك ، فمن الأساسي أن نتذكر أنه يتم الحصول على أفضل نتيجة جرثومية عندما يتم الحصول على العينة التي يتلقاها المختبر في ظل أفضل الظروف. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المهمة الرئيسية للمختبر هي التفريق بين الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض في حد ذاتها أو الإمراضية المحتملة للاستعمار والملوثات ، ووصف ، إذا أمكن ، آليات المقاومة الممكنة لتكون قادرة على اقتراح العلاج الأكثر فعالية.

يعتمد المختبر الطبي لتشخيص علم الجراثيم حاليًا على منهجيات متنوعة تشكل حجر الزاوية الأساسي في عملية تشخيص العدوى البكتيرية. في إطار روتينه اليومي ، يطبق المختبر السريري تقنيات النمط الظاهري للوصول إلى أهدافه. ومع ذلك ، فإن هذه التقنيات تقدم بعض القيود من حيث الحساسية والنوعية والوقت. تكون هذه القيود أكثر وضوحًا بالنسبة لبعض أنواع البكتيريا ذات النمو الصعب أو البطيء ، أو ما يسمى بالبكتيريا غير القابلة للزراعة ، أو لمعالجة العينات من المرضى الذين خضعوا للعلاج المتعدد. في العقد الماضي ، تم تطوير تقنيات متنوعة في مجال البيولوجيا الجزيئية والكيمياء التحليلية مع إمكانية كبيرة لتقليل بعض هذه القيود ، والتي سمحت بالبحث وتحديد العامل المسبب ، وكذلك تقييم استنساخ ، للبحث والأهداف الوبائية. نظرًا لأن هذه التقنيات لا تزال شاقة وبتكلفة أعلى من بعض الأساليب المظهرية ، فهي عادةً غير متوفرة في مختبرات المستشفيات العامة. على الرغم من أن تنفيذها ليس عالميًا ، إلا أنها متوفرة في المعامل البحثية والمرجعية.

لكي تكون مفيدة سريريًا ، يجب أن يكون التعرف على الكائنات الحية الدقيقة في أسرع وقت ممكن. تقترح الجوانب الاقتصادية والتطبيق العملي استخدام عدد أدنى من الاختبارات التشخيصية. بحكم الضرورة ، فإن التحديد في المختبر السريري سيمثل دائمًا حل وسط للدقة والدقة ، من جانب ، والسرعة والاقتصاد من ناحية أخرى ، وبالتالي فإن الجهود التعاونية بين المختبرات السريرية العامة ومختبرات البحث والمرجعية هي بلا شك المسار الصحيح من العمل من أجل تشخيص أفضل.

شكر وتقدير

كان هذا العمل جزءًا من المشاريع البحثية & quot تحديد العوامل المسببة للعدوى داخل المستشفى لـ Centro M & eacutedico Nacional (CMN) 20 de Noviembre & quot الممولة من قبل أمانة العلوم والتكنولوجيا والابتكار سابقًا ICYT-DF بموجب اتفاقية ICyTDF / 325/2011 و & quotBasic والبحث التطبيقي في علم الجراثيم & quot SIP 20150966 من المعهد الوطني للفنون التطبيقية. تتلقى MGAA و JLH و GCE و VB و GR و XG زمالات SNI و EDI و COFAA. كانت NMAA زمالة BEIFI.


بدائل PCR - علم الأحياء

لقد طلبت ترجمة آلية لمحتوى محدد من قواعد بياناتنا. يتم توفير هذه الوظيفة لراحتك فقط ولا يُقصد بها بأي حال من الأحوال أن تحل محل الترجمة البشرية. لا تقدم BioOne ولا مالكو وناشر المحتوى ، وهم يتنصلون صراحةً من مسؤوليتهم ، أي تعهدات أو ضمانات صريحة أو ضمنية من أي نوع ، بما في ذلك ، على سبيل المثال لا الحصر ، الإقرارات والضمانات فيما يتعلق بوظيفة ميزة الترجمة أو دقة أو اكتمال الترجمات.

لا يتم الاحتفاظ بالترجمات في نظامنا. يخضع استخدامك لهذه الميزة والترجمات لجميع قيود الاستخدام الواردة في شروط وأحكام استخدام موقع BioOne.

طريقة بديلة لملف الأنزيم المتماثل لتحديد خط الخلية والتلوث المتقاطع بين الأنواع: السيتوكروم ب تحليل PCR-RLFP

كلاريتا جي.لوسي ، 1 ستيفانيا فيراري ، 1 إنريكو سوسي ، 1 ريكاردو فيلا ، 1 مورا فيراري 1

1 Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell & # 39Emilia Romagna، Brescia، Italy البريد الإلكتروني: [email protected]

يتضمن PDF و HTML ، عند توفره

هذه المقالة متاحة فقط لـ مشتركين.
انها ليست متاحة للبيع الفردي.

أحد المخاطر الرئيسية في مختبرات زراعة الخلايا هو التحديد الخاطئ والتلوث المتبادل لخطوط الخلايا. تم استخدام عدة طرق لمصادقة خطوط الخلايا ، بما في ذلك التنميط الإنزيمي ، وهو الاختبار الذي اقترحه فريق Farmacopeia الأوروبي ، والذي يتم إجراؤه في مركز زراعة الأنسجة في بريشيا. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة تعرض العديد من العيوب ، مثل التباين العالي وقابلية التكاثر المنخفضة ، وهي تستغرق وقتًا طويلاً وتتطلب تركيزات عالية من الخلايا ليتم تنفيذها. لذلك ، تم تطوير طريقة بديلة لتأكيد نوع منشأ 27 مزرعة مختلفة من الخلايا الحيوانية. تم تحسين اختبار تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) - مقايسة تعدد الأشكال لطول جزء التضييق (RFLP) ، بناءً على استخدام زوج من البادئات التي تصلب إلى جزء من السيتوكروم ب الجين في جميع الأنواع. تم هضم منتج التضخيم بلوحة من ستة إنزيمات مقيدة ، وتم حل النمط المشتق على هلام agarose عالي الدقة بنسبة 3 ٪. بالنسبة لـ 23 نوعًا ، أنتج هذا البروتوكول نمط تقييد فريدًا ، وأسفر هذا التحليل عن تأكيد أصل هذه الخلايا الحيوانية. علاوة على ذلك ، تشير النتائج إلى أن السيتوكروم ب كان PCR-RFLP قادرًا على تضخيم التسلسلات المستهدفة باستخدام كميات منخفضة جدًا من الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA). كانت حساسيته في الكشف عن الأنواع بين الأنواع ، والتلوث المتبادل مماثلة لتلك الخاصة بتحليل الإنزيم المتماثل (يجب أن يمثل تلوث الحمض النووي 10 ٪ على الأقل من إجمالي الحمض النووي). بالنسبة إلى 4 أنواع من أصل 27 نوعًا (الأغنام ، والكلب ، وخنزير غينيا ، وقرد الريسوس) ، أظهر النمط المرصود ، حتى لو كان قابلاً للتكاثر بشكل كبير ، نطاقات إضافية لهذه الأنواع ، كما تم إجراء PCR محدد.

كلاريتا جي.لوسي ، وستيفانيا فيراري ، وإنريكو سوسي ، وريكاردو فيلا ، وماورا فيراري "طريقة بديلة لملف الأنزيم المتماثل لتحديد خط الخلية والتلوث المتصالب بين الأنواع: السيتوكروم ب تحليل PCR-RLFP ، "الأحياء الخلوية والنمائية في المختبر - الحيوان 44 (8) ، 321-329 ، (2 يوليو 2008). https://doi.org/10.1007/s11626-008-9125-x

تم الاستلام: 10 آذار (مارس) 2008 تاريخ القبول: 16 أيار (مايو) 2008 تاريخ النشر: 2 تموز (يوليو) 2008

هذه المقالة متاحة فقط لـ مشتركين.
انها ليست متاحة للبيع الفردي.


شاهد الفيديو: ПЦР в реальном времени real-time PCR от Coyote. Мобильная лаборатория полного цикла (قد 2022).


تعليقات:

  1. Randon

    منذ البداية ، كان من الواضح كيف سينتهي

  2. Nien

    سؤال مسلية جدا

  3. Rocke

    من فضلك اعد النظر

  4. Shiye

    هذه الفكرة العظيمة محفورة للتو

  5. Tecage

    برافو ، هذه الفكرة الجيدة جدًا ستكون مفيدة.

  6. Gaukroger

    أهنئ هذه الفكرة الرائعة فقط



اكتب رسالة