معلومة

ما الفرق بين جزء الكروموسوم الحر والمصفوفة خارج الصبغيات؟

ما الفرق بين جزء الكروموسوم الحر والمصفوفة خارج الصبغيات؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

هذه إشارة إلى مراجعة تحليل الفسيفساء التي أجراها يوشيم وهيرمان على C.

بالنسبة للأول ، أشاروا إلى Herman 1984. بالنسبة للأخير ، أشاروا إلى Lackner et al 1994 و Miller et al 1996 ، لكن هذه دراسات تستخدم المصفوفات خارج الصبغيات ، وليس أوراقًا تحددها كتقنية في حد ذاتها.

لدي فضول لمعرفة ما هو التمييز - لدي انطباع بأن المصفوفات خارج الصبغيات نكون شظايا بها نسخ عديدة من الجين المعني + علامة.


سألت أستاذي ، ويبدو أن الإجابة هي الاختلافات في كل من الجيل والمنتج النهائي.

يتم إنشاء شظايا الكروموسوم الحر من خلال التشعيع / الأضرار الأخرى للخط الجرثومي في حيوان واحد. من خلال سلسلة من التقاطعات ، من الممكن إدخال شظايا فردية (تحتوي على تكرار للجين الذي يهمك ، بالإضافة إلى علامة) في خلفية متحولة. سيتم فقد الجزء خارج الصبغيات أثناء الانقسام الفتيلي في نقاط مختلفة من التطور ، وفي تحليل الفسيفساء ، يمكنك البحث عن فقد العلامة الخاصة بك (وبالتالي فقدان أليل النوع البري) ، ومعرفة ما إذا كان منتج yfg مطلوبًا في خلية معينة أنواع النمط الظاهري للنوع البري.

يتم إنشاء المصفوفات خارج الصبغيات عن طريق الاستنساخ ، وعادة ما يكون لديك العديد من النسخ من كل من الجين والعلامة. إنه نفس مبدأ شظايا الكروموسومات الحرة من حيث تحليل الفسيفساء ، ولكنه قوي جدًا ، حيث يمكنك بسهولة استنساخ الجينات الفردية (مقابل التشعيع والأمل في اكتشاف yfg على جزء) والعلامات (والآن يمكنك استخدام علامات غير داخلية مثل GFP).

على الرغم من أن إنشاء المصفوفات خارج الصبغيات أسهل نسبيًا ، إلا أن المشكلة تكمن في أنك تحصل في نهاية المطاف على العديد من نسخ الجين ، مما يؤدي إلى مستويات جرعات غير داخلية. حتى لو لم يتسبب ذلك في نمط ظاهري متحور مختلف تمامًا في الخلايا ، فمن الممكن أن ينفصل ما يكفي من هذه البروتينات عند الانقسام إلى الخلايا الوليدة ، بحيث أنه حتى إذا فقدت الجزء ، فلا يزال بإمكانك الاحتفاظ بمنتجك الجيني. في الخلايا الوليدة (إذا لم ينفصل البروتين الواسم أيضًا بهذه الطريقة ، فقد تستخلص استنتاجات خاطئة حول ضرورة وجود منتج yfg في تلك الخلايا المعينة).


تحديد أشكال تسلسل الكروموسوم التي تتوسط الاقتران الانتصافي والتشابك في C. ايليجانس

أنواع معينة انيقة تحتوي الكروموسومات على مناطق متخصصة تسمى مراكز الاقتران ، والتي تتوسط الاقتران المتماثل والتشابك أثناء الانقسام الاختزالي. ترتبط أربعة بروتينات ذات صلة ، ZIM-1 و 2 و 3 و HIM-8 ، بهذه المواقع وهي مطلوبة لوظائفها الأساسية. نوضح هنا أن عناصر التسلسل القصير المخصب في مناطق الكروموسوم المقابلة تقوم بتجنيد هذه البروتينات بشكل انتقائي في الجسم الحي. في المختبر يشير التحليل باستخدام SELEX إلى أن خصوصية الربط لكل بروتين تنشأ من مزيج من إصبعين من الزنك ومجال مجاور. إن إدخال مجموعة من أشكال التجنيد في كروموسوم يفتقر إلى مركز الاقتران الداخلي الخاص به كافٍ لاستعادة الاقتران المتماثل والتشابك وإعادة التركيب المتقاطع والفصل. تساعد هذه النتائج في إلقاء الضوء على كيفية توسط مواقع الكروموسومات في الجوانب الأساسية لديناميات الكروموسوم الانتصافي.


نتائج

تعمل بروتينات SDC كمركب في الجسم الحي للقمعلها -1 و X الكروموسومات

كيف يميز SDC-2 بين الأهداف المختلفة ويقمعها بدرجات مختلفة؟ للإجابة على هذا السؤال ، حددنا أولاً البروتينات التي تعمل مع SDC-2 في لها -1. sdc-2 كان معروفًا بتفاعله وراثيًا مع sdc-1 و sdc-3 لتنفيذ تحديد الجنس وتعويض الجرعة في XXالحيوانات (Villeneuve and Meyer 1990 Davis and Meyer 1997 Dawes et al. 1999) ، لكن الأدوار الجزيئية الدقيقة لـ SDC-1 و SDC-3 لم تكن مفهومة. نقدم هنا ثلاثة خطوط من الأدلة على أن بروتينات SDC الثلاثة تشكل معقدًا في الجسم الحي للقمع لها -1 وX الكروموسومات مباشرة.

أولاً ، يتم تنسيق كل من SDC-1 و SDC-2 و SDC-3 إلى X الكروموسومات و لها -1 المناطق التنظيمية في الجسم الحي. خنثى يحمل عدة نسخ ترادفية من لها -1 تم تلطيخ المناطق التنظيمية على المصفوفات خارج الصبغية الموسومة بـ GFP بأجسام مضادة SDC المنقية من التقارب (انظر المواد والطرق). تم تقييم توطين بروتين SDC في نوى الأمعاء البالغة ، والتي يسهل حجمها الكبير ومحتوى الحمض النووي متعدد الصيغ الصبغية الفحص. بروتين SDC-2 عالي الشحنة ، والذي يحمل شكل ملفوف ، مترجم إلى X الكروموسومات و لها -1 المصفوفات في خلايا الأمعاء البالغة (الشكل 1 أ) ، كما هو موضح سابقًا في الأجنة (Dawes et al. 1999) ، وبالتالي التحقق من صحة الفحص. بروتينات إصبع الزنك SDC-1 و SDC-3 (Nonet and Meyer 1991 Klein and Meyer 1993) تتحد مع SDC-2 في لها -1 و على X الكروموسومات (الشكل 1 أ ، ب) ، بما يتفق مع الدور المباشر لهذه البروتينات في لها -1القمع وتعويض الجرعة. في XX الحيوانات تحملsdc-3(Tra) ، توطين SDC-1 و SDC-2 و SDC-3 إلى لها -1 تم تقليله بشكل كبير ، ولكن الترجمة إلىX ظهر الكروموسوم غير متأثر (لم تظهر بيانات الشكل 1F) ، بما يتفق مع الطفرة التي تعيق تحديد الجنس ولكن ليس تعويض الجرعة (DeLong et al. 1993). sdc-3(ترا) تزيل القيودلها -1 النسخ ، مما تسبب في 100٪ من XX الحيوانات التي سيتم ذكراها بشدة عن طريق تعطيل فكرة ربط ATP مفترضة في SDC-3 (DeLong et al. 1993 Klein and Meyer 1993). لذلك ، يتم ترجمة SDC-1 و SDC-2 و SDC-3 بشكل مناسب لتحقيق قمع خاص بالجينات وعلى نطاق الكروموسوم.

ال X-آلات تعويض جرعات الكروموسوم يتم ترجمتها إلى لها -1 المناطق التنظيمية في الجسم الحي. صور متحد البؤر لنواة الأمعاء الفردية (أF) أو نواة جنينية (جي ، ح) من النوع البري أو متحولة [sdc-3(ترا) أو dpy-27] XX الحيوانات المحصنة بأجسام مضادة SDC أو DPY أو MIX ، كما هو موضح في كل لوحة. تحتوي النوى على صفائف DNA خارج الصبغية تحمل نسخًا متعددة من لها -1 المناطق التنظيمية (البلازميد pHD25 من الشكل 3 أ) ،لاك يكرر العامل (لاكو) ، وترميز الجينات المعدلة لبروتين اندماج LacI – GFP. ارتباط ضاغط LacI – GFP بـلاكو يسمح باكتشاف مجموعة بواسطة GFP تألق ذاتي. التلوين (أصفر) بين المصفوفات (الخضراء) والأجسام المضادة (الحمراء) في الصور المدمجة (حق لوحات) أظهرت ارتباط البروتين مع لها -1 التسلسلات التنظيمية. رؤوس الأسهم بمناسبةX الكروموسومات. بالتوافق مع sdc-3(ترا) مما تسبب في إلغاء قمع لها -1، يمنع بروتينات SDC و DPY من الارتباط بـ لها -1.

ثانيًا ، تتفاعل بروتينات SDC جسديًا لتشكيل معقد. قامت الأجسام المضادة لأي من بروتينات SDC بترسيب جميع بروتينات SDC الثلاثة من المستخلصات الجنينية من النوع البري (الشكل 2 ب). كانت تفاعلات الترسيب هذه محددة ، لأن أيا من مصل ما قبل المناعة قد عجل بأي من بروتينات SDC (الشكل 2 ب) ، ولم ترسب أي من الأجسام المضادة لـ SDC (البيانات غير معروضة) أو حددت (الشكل 2 أ) البروتينات المماثلة من مقتطفات من خاص به sdc طفرات فارغة.

تشكل بروتينات SDC معقدًا في الجسم الحي. (أ) الكشف عن بروتينات SDC في المستخلصات الجنينية. بقع غربية من مقتطفات من النوع البري (N2) أو sdc (خالية) الأجنة الطافرة التي تحمل طفرة حذف أو هراء في sdc تم فحص الجين باستخدام الجسم المضاد لـ SDC المشار إليه على اليسار. تم اكتشاف بروتينات بوزن 250 كيلو دالتون و 240 كيلو دالتون (مزدوج) و 140 كيلو دالتون بواسطة الأجسام المضادة SDC-2 أو SDC-3 أو SDC-1 ، على التوالي ، في النوع البري ولكن ليس sdc مقتطفات (خالية) ، توضح خصوصية الجسم المضاد. (ب) يقوم الجسم المضاد لأي بروتين من نوع SDC بترسيب جميع بروتينات SDC الثلاثة. تم إجراء تسريب Coimmunoprecipitation مع كل جسم مضاد لـ SDC على مقتطفات جنينية من النوع البري. تم فصل المادة المترسبة المناعية بواسطة SDS-PAGE وتم ترقيعها بالجسم المضاد الموضح على اليسار. (PI) مصل ما قبل المناعة للجسم المضاد SDC-1 ، الترسيب المناعي (IP).

ثالثًا ، يقوم مجمع SDC بقمع نسخ ملفات لها -1، منذ إنتاج بروتينات SDC خارج الرحم في XO الحيوانات (عادة الذكور) التي تسبب النمو الجنسي خنثى. عادة ما يتم التعبير عن SDC-2 فقط في XX الحيوانات ، والتعبير خارج الرحم عن SDC-2 حول 36 ٪ من XO الحيوانات إلى خنثى (Dawes et al. 1999) ، وهو تحول جنسي يتطلب نوعًا بريًاsdc-3 نشاط. نظرًا للتأنيث غير المكتمل باستخدام SDC-2 وحده ، فقد قمنا في نفس الوقت بإفراط في التعبير عن SDC-2 باستخدام إما SDC-1 أو SDC-3 لتقييم مساهماتهم المشتركة تجاه تطوير الخنثى. الإفراط في التعبير عن SDC-1 فقط (البيانات غير معروضة) أو SDC-3 (Davis and Meyer 1997) فشل في تأنيث XO الحيوانات. ومع ذلك ، فإن الإفراط في التعبير عن كل من SDC-2 و SDC-1 عزز بشكل كبير من XOتأنيث يسبب ∼88٪ من هؤلاء XO الحيوانات المراد تحويلها جنسياً (الجدول 1). كانت جميعها تقريبًا خصبة ذاتيًا ، على عكس المتحولين XO الحيوانات التي عبرت فقط عن SDC-2. رفع مستوى SDC-3 بوصة XOالحيوانات ، كما تم التحقق من تلطيخ الأجسام المضادة ، لم تعزز التأنيث الناجم عن SDC-2 (31 ٪ تأنيث مع كلا البروتينين) ، مما يشير إلى أن SDC-3 لم يكن مقيدًا (الجدول 1). التآزر بين SDC-1 و SDC-2 في تأنيث XO توفر الحيوانات بطريقة تعتمد على SDC-3 دليلًا وظيفيًا على أن جميع بروتينات SDC الثلاثة تعمل معًا للقمع لها -1 مباشرة.

sdc-1 يعزز sdc-2 في تأنيثXO الحيوانات

تقوم بروتينات SDC بتجنيد X- مجمع تعويض جرعة الكروموسوم ل لها -1

لأن SDC-2 و SDC-3 يلعبان أدوارًا محورية في تجميع مجمع تعويض الجرعة على X الكروموسومات (Chuang et al. 1996 ، Davis and Meyer 1997 Dawes et al. 1999) ، سألنا ما إذا كانت بروتينات SDC تجند هذا المركب إلى لها -1. يشتمل مجمع تعويض الجرعة على البروتين الخاص بتعويض الجرعة DPY-27 والبروتينات ثنائية الوظيفة DPY-26 و MIX-1 ، والتي تعمل أيضًا في الانقسام الاختزالي والانقسام ، على التوالي (Chuang et al. 1996 Lieb et al.1996، 1998 ). تشبه بروتينات تعويض الجرعة مكونات مركب التكثيف المحفوظ على نطاق واسع ، والذي يدفع تكاثف الكروموسوم الانقسامي في المختبر ، مما يعني أن تنظيمX-تعبير الكروموسوم يتضمن تعديل بنية الكروماتين (Koshland and Strunnikov 1996 Hirano 2000). تتطلب جميع بروتينات تعويض الجرعة باستثناء SDC-2 SDC-3 لتوطينها في X الكروموسوم (Chuang et al. 1996 Davis and Meyer 1997) ، و SDC-3 ، بدوره ، يتطلب SDC-2 لتوطينه فيX كروموسوم (ديفيس وماير 1997). يمكن ترجمة SDC-2 إلى تنسيقX كروموسوم بدون بروتينات تعويض جرعات أخرى (Dawes et al. 1999) ، مما يشير إلى أنه يتعرف على X يمنح الكروموسوم خصوصية الكروموسوم لتعويض الجرعة. لا تبدو جميع مكونات تعويض الجرعة ضرورية لها -1القمع ، لأن ذلك نادر dpy-26 ، dpy-27، أوdpy-28 XX المسوخات التي تفلت من الفتك تتطور لتصبح خنثى (Plenefisch et al. 1989). لذلك ، تم اكتشاف آلية تعويض الجرعة الكاملة لها -1 سيُظهر أن SDC-2 يستهدف هذه الآلية بالكروماتين الذي تربطه.

DPY-26 و DPY-27 و MIX-1 كلها مرتبطة ببروتينات SDC على كليهمالها -1 المصفوفات و X الكروموسومات (الشكل 1C-E). علاوة على ذلك ، توطين البروتينات الثلاثة لتعويض الجرعةلها -1 كان يعتمد على بروتينات SDC لأنsdc-3(ترا) عطلت طفرة التوطين للها -1 ولكن ليس ل X كروموسوم (بيانات الشكل 1 و غير معروضة). لم يكن توطين SDC-2 و SDC-3 يعتمد على DPY-27 (الشكل 1G) ، لكن DPY-26 تطلب DPY-27 لتوطينهالها -1 (الشكل 1H) ، كما هو الحال بالنسبة لتعريبها إلىX كروموسوم. وبالتالي ، فإن تجميع مكونات تعويض الجرعة المعروفة على لها -1 يشبه تجميعها علىX كروموسوم. علاوة على ذلك ، يقوم SDC-2 بتجنيد آلية تعويض الجرعة لأهداف الكروماتين الخاصة بها ، على الرغم من أن بعض المكونات يمكن الاستغناء عنها للقمع.

يرتبط مجمع تعويض الجرعة / SDC بثلاثة أهداف مختلفة للكروماتين في الداخل لها -1

حددنا المواقع بالضبط داخل لها -1 التي توظف آلية تعويض الجرعات. استخدام مقايسة الصفيف خارج الصبغيات لفحص شظايا 1 كيلو بايت الفردية عبر لها -1، وجدنا أن SDC-1 و SDC-2 و SDC-3 و DPY-26 و DPY-27 و MIX-1 جميعها مرتبطة بثلاث مناطق مختلفة محددة بواسطة الأجزاء B و C و D (الشكل 3 أ ، ب) . تعطل توطين جميع البروتينات بواسطة a sdc-3(Tra) الطفرة (البيانات غير معروضة) ، مما يدل على أن الارتباط كان محددًا.

توطين SDC-2 إلى لها -1 يتم تحديده من خلال ثلاثة عناصر مميزة للتعرف على الحمض النووي التي تتعطل قدرتها على الارتباط بسبب طفرات معينة. (أ) تخطيطي للها -1 تم اختبار الجين وملخص المناطق الفرعية من أجل تحديد موقع SDC-2 بواسطة اختبار الصفيف. ينتج النسخ من مروج P1 وظيفيًا خاصًا بالذكور لها -1 نسخة ، بما في ذلك أربعة exons (أخضر). المروج (P2) يتواجد داخل intron الثاني من لها -1. يتم تنظيم P2 مع P1 ويقوم بعمل نسخة 0.8 كيلو بايت لوظيفة غير معروفة تتضمن آخر اثنين من exonsلها -1 (ترينت وآخرون ، 1991 بيري وآخرون ، 1993). درجة الترابط بين SDC-2 مع لها -1 يتم عرض المناطق حسب اللون ، مع وجود المفتاح على اليمين. تظهر أصغر ثلاث مناطق ذات تركيز قوي لـ SDC-2 (المنطقة 1 [B] ، والمنطقة 2 [C5] ، والمنطقة 3 [D6]) بواسطة تظليل رمادي غامق. تشترك C5 و D6 في عنصر متطابق 15-bp (خطوط عمودية صلبة) ومعرف تسلسل إجمالي بنسبة 50٪. لا يوجد تشابه واضح مع B مع C5 أو D5 ولكنه يحتوي على موقعلها -1(gf) (خط عمودي متقطع). تم تعطيل عملية تحديد المواقع المشتركة SDC-2 تمامًا بواسطة 15-mer عشوائيًا في C5 أو D5 وبواسطة الانتقال G → A لـ لها -1(gf) في B (النجوم الصفراء في B 'و C5 ′ و D5 ′). (ب) صور متحد البؤر لنواة أمعاء فردية من نوع بري XX مصفوفات خارج الصبغية تحمل علامات GFP (خضراء) مع إصدارات من النوع البري (B و C5 و D5) أو إصدارات متحولة (B 'و C5 و D5 ′) للمناطق 1-3. تم تحصين الحيوانات بأجسام مضادة لـ DPY-27 (أحمر) أو SDC-3 (أزرق). يظهر التنسيق بين المصفوفة والبروتين باللون الأصفر في الصورة المدمجة. تشير رؤوس الأسهم X الكروموسومات.

يتضمن الجزء B مروج P1 الذي ينتج 1.2 كيلو بايت وظيفيةلها -1 نسخة طبق الأصل (Trent et al. 1991 Perry et al. 1993). تم تورط هذه المنطقة التنظيمية لأول مرة في لها -1 قمع من خلال طفرة اكتساب الوظيفة ، لها -1(gf) ، التي تلغي الضغط جزئيًا لها -1 النسخ ، مما تسبب في ذكورة كبيرة ، ولكن غير مكتملة لـ XX المسوخ (ترينت وآخرون 1988). موقع لها -1(gf) 2 bp قبل أن يدفعنا موقع بدء النسخ إلى اختبار ما إذا كان لها -1(gf) يتداخل مع ارتباط مجمع القمع (بيري وآخرون 1994). في الواقع ، فشلت SDC-2 و SDC-3 و DPY-27 في الاقتران بجزء (B ') يؤوي انتقال A → T لـ لها -1(gf) ، مما يدل على أن إلغاء قمع لها -1 يحدث النسخ جزئيًا على الأقل عن طريق تعطيل ارتباط المثبط (الشكل 3 أ ، بيانات ب غير معروضة). اللها -1(gf) يبدو أن الطفرة تقضي على ربط SDC بدلاً من تقليله ، لأن الإفراط في التعبير عن SDC-2 فشل في قمعXX الذكورة التي تسببها لها -1(ز) (انظر المواد والطرق).

تقع الأجزاء C و D داخل intron الثاني الكبير من لها -1. على عكس P1 ، لم تكن هذه المنطقة المحددة متورطة فيلها -1 القمع عن طريق طفرات اكتساب الوظيفة. ومع ذلك ، فإن الذكورة الجزئية XX الحيوانات لها -1(gf) مقارنة مع الذكورة شبه الكاملة بواسطةsdc-3(ترا) اقترح أن SDC بوساطة لها -1يتطلب القمع تسلسلات خارج غف منطقة. علاوة على ذلك ، اقترحت التجارب غير المباشرة إمكانية تورط intron الثاني في لها -1 القمع (لي وآخرون 1999).

اكتشفنا ما إذا كانت تفاعلات البروتين والحمض النووي التي لوحظت مع الشظايا C و D على المصفوفات خارج الصبغيات قد حدثت أيضًا في الخلايا الداخلية. لها -1 الجين عن طريق أداء الكروماتين المناعي (ChIP) من lysates من أجنة من النوع البري المعالج بالفورمالديهايد. تم استخدام الأجسام المضادة SDC-2 للترسيب المناعي لمركب SDC مع الحمض النووي المرتبط به ، وتم تحليل الحمض النووي لإثراء لها -1 شظايا باستخدام مواد أولية للمناطق من A إلى F في تفاعلات PCR منفصلة. التمهيدي المرافقة له -1، وهو جين موجود على كروموسوم مختلف ، وتم استخدام شظايا جينومية في الجزء العلوي من المنطقة A كعناصر تحكم. تم إثراء الحمض النووي من المناطق C و D فقط على وجه التحديد بثلاثة أضعاف إلى أربعة أضعاف مقارنةً بالتحكم السلبي (الشكل 4 أ). بالتوازي مع الرقائق التي يتم إجراؤها باستخدام الأجسام المضادة SDC-2 أو SDC-3 ، فقط الحمض النووي من النوع البري ، ولكن ليسsdc-3تم إثراء (Tra) lysates للجزء C (الشكل 4B). أكدت هذه النتيجة على خصوصية ChIP من خلال إظهار أنها تعكس بشكل صحيح تعطيل ارتباط SDC بـ لها -1حدث بسبب sdc-3(ترا). في الضوابط ، تم الكشف عن مستويات مكافئة من DNA المنطقة C في تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الحمض النووي المستخرج من النوع البري والمتحولات (الشكل 4 ب). وبالمثل ، تم الكشف عن مستويات مماثلة من بروتينات SDC في كلا المحللين مع البقع الغربية (الشكل 4 ج) وتجارب IP (الشكل 4 د). تظهر هذه التجارب معًا أن مجمع SDC يرتبط بالمنطقة C و D في الداخللها -1 الجين. يشير عدم القدرة على اكتشاف المنطقة B من خلال هذا الاختبار إلى أن المنطقة B لديها قدرة أقل على ربط SDC من المنطقتين C و D ، كما هو موضح أدناه وافترض سابقًا (Li et al. 1999).

تُظهر تجارب الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) تفاعل بروتينات SDC مع البروتينات الداخلية. لها -1الجين. (أ) تحليل PCR للحمض النووي من رقاقة يتم إجراؤها باستخدام الأجسام المضادة SDC-2 ومحللات الفورمالديهايد المتشابكة XXالأجنة. مجموعات التمهيدي الخاصة بـ لها -1 مناطق أو جين تحكم (له -1) من أجل PCRs مع الحمض النووي المترسب (M) والتخفيفات التسلسلية المزدوجة من SDC-2-DNA المترسب (SDC-2) أو إدخال DNA (المدخلات). تم تطبيع شدة نطاق PCR الذي ينتجه كل زوج تمهيدي من DNA المخصب بـ IP إلى نطاق PCR المقابل الناتج من أعلى تركيز لدخل الحمض النووي. المناطق D و C من لها -1 تم إثرائها على وجه التحديد أعلاه له -1السيطرة على الحمض النووي بثلاثة أو أربعة أضعاف ، على التوالي. (البرايمر المرافقةله -1 أنتجت منتج PCR من الحمض النووي المخصب بـ IP بكثافة طبيعية بنسبة 22 ٪ ، بينما أنتجت البادئات المحيطة بالمناطق D و C نطاقات بنسبة 67 ٪ و 86 ٪ على التوالي ، كثافة طبيعية.) (بتم إجراء تحليل PCR باستخدام بادئات المنطقة C على تخفيفات تسلسلية مزدوجة للحمض النووي من شريحة باستخدام الأجسام المضادة SDC-2 أو SDC-3 ومحللات من النوع البري المعالج بالفورمالديهايد أوsdc-3(ترا) XX الأجنة. تم تطبيع شدة كل نطاق PCR لشدة نطاق PCR المصنوع من أعلى تركيز للحمض النووي المخصب IP من النوع البري. تم حساب متوسط ​​الشدة والانحرافات المعيارية من أربع مجموعات من تحليلات PCR على مادة من تجربتي ChIP مستقلتين. تم إظهار خصوصية بروتوكول ChIP من خلال هطول الحمض النووي للمنطقة C من النوع البري ولكن ليس المتحولة. تم الكشف عن مستويات مماثلة من الحمض النووي للمنطقة C بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام التخفيفات التسلسلية ذات شقين من النوع البري و sdc-3(Tra) مدخلات المحللة. (ج ، د) تم الكشف عن مستويات مماثلة من SDC-2 و SDC-3 من خلال تحليل لطخة غربية لأي من (ج) ليسيتس كامل أو (د) مادة SDC-2 IP من محلولات من النوع البري المعالج بالفورمالديهايد sdc-3(ترا) الأجنة.

تكمن عناصر التعرف على الحمض النووي المتنوعة داخل العناصر الثلاثة المتميزةلها -1 أهداف الكروماتين

بعد أن أظهرنا أن الأجزاء B و C و D هي أهداف SDC حقيقية ، فقد حددنا متطلبات تسلسل الحمض النووي لربط SDC بشكل أكثر دقة. من بين أربعة أجزاء فرعية من المنطقة B ، دعم B2 فقط تحديد موقع مركزي كبير لـ SDC-2 (الشكل 3 أ). ومع ذلك ، كان التوطين إلى B2 أقل اتساقًا من الترجمة إلى B ، مما يشير إلى أن الربط القوي لـ SDC-2 يتطلب أكثر من عنصر منفصل واحد داخل المنطقة B. في المقابل ، تم تضييق الترجمة القوية للمنطقتين C و D إلى جزء 303 نقطة أساس ( C5) من C وإلى جزء 192 نقطة أساس (D6) من D (الشكل 3 أ ، ب). كل من SDC-1 و SDC-3 و DPY-26 و DPY-27 و MIX-1 كلها مرتبطة بـ SDC-2 على هذه الأجزاء ، مما يدل على أن جميع المعلومات المطلوبة لبروتينات SDC للتفاعل مع الكروماتين وتوظيف مجمع تعويض الجرعة يمكن يتم تحديدها بـ 192 نقطة أساس من الحمض النووي (الشكل 3 أ ، بيانات ب غير معروضة) التي تمت إزالتها من سياقها الكروموسومي الأصلي.

تم العثور على تشابه محدود للغاية في تسلسل الحمض النووي بين B (المنطقة 1) وإما C5 (المنطقة 2) أو D6 (المنطقة 3). في المقابل ، تشترك C5 و D5 (جزء من 287 نقطة أساس تتضمن D6) في الهوية الإجمالية بنسبة 50٪ وامتداد 15 نقطة أساس (CAAAAACTGAGCCTG) للهوية الكاملة على الخيط المضاد للمعنى لـ C5 وشريط الإحساس D5. لم يتم العثور على نسخة دقيقة من هذا العنصر في X أو في أي مكان آخر في الجينوم. عشوائي عنصر 15-bp إلى ACAGACTGCAGATAC (لـ C5 ′ و D5 ′) أو GA CAGACGTCAATAC (لـ D5) منع بروتينات SDC-2 و SDC-3 و DPY-27 من الترجمة إلى صفائف بها شظايا متحولة (الشكل 3A) ، بيانات B غير معروضة). لذا فإن التسلسل المتكرر 15 نقطة أساس ضروري لاستهداف بروتينات SDC و DPY إلى المنطقتين 2 و 3. ومع ذلك ، فإن 15-Mer ليست كافية ، لأن SDC-2 فشل في الارتباط بمصفوفات تحمل نسخًا متعددة من الحمض النووي العشوائي وإما الـ 15 -mer أو عنصر 28-bp يتضمن التسلسلات المشتركة 15-mer والمتجاورة (البيانات غير معروضة). آخر رابطة الدول المستقلة- تسلسل التمثيل يجب أن يكون أساسياً. وهكذا ، تستخدم عناصر الحمض النووي الثلاثة لاستهداف آلية تعويض الجرعات لها -1 متنوعة. تتمتع بروتينات SDC نفسها بالمرونة في التعرف على التسلسل أو تساعد المكونات الخلوية الأخرى في منح خصوصية التسلسل والربط.

التوظيف التفاضلي من SDC-2 إلى لها -1 بواسطة عناصر التعرف الفردي

تحديد الطفرات التي قضت على ارتباط SDC بالمواقع الفردية في لها -1 سمح لنا بتقييم وربط المساهمة الوظيفية لكل موقع في الجسم الحي تجاه الربط الشامل للـ SDC وقمعه لها -1. قدمنا ​​ملفلها -1(gf) طفرة في المنطقة 1 والعشوائية 15 مترًا للمناطق 2 و 3 معًا أو بشكل منفصل في الطول الكامللها -1- الإنقاذ بنيات لاختبار دور كل موقع.XX تم فحص الحيوانات التي تعبر عن بنية واحدة من مجموعة خارج الصبغية الموسومة بـ GFP لتكرار توطين SDC-2 إلى المصفوفات وللتحول الجنسي إلى مصير الذكور ، وهو مؤشر على إلغاء النسخ (انظر المواد والطرق). يمكن بعد ذلك الاستدلال على الأهمية الوظيفية للموقع من خلال مقارنة التغيير في توطين SDC بدرجة التحول الجنسي الناجم عن تعطيل هذا الموقع (الشكل 5 أ).

المساهمات النسبية للثلاثة لها -1تختلف عناصر التعرف لربط SDC و لها -1قمع. (أ) تحور تسلسلات DNA محددة داخل الطول الكامل لها -1 الجينات المحورة تعطل توطين SDC-2 إلىلها -1 وقمع لها -1. لها -1تُصوَّر التركيبات المتضمنة في المصفوفات المعدلة وراثيًا بواسطة المخططات الموجودة على اليسار ، مع وجود طفرات تشير إليها النجوم البيضاء. يمثل توطين النسبة المئوية SDC-2 للصفائف المعدلة وراثيًا بواسطة أشرطة رمادية. يتم تمثيل الانحراف المعياري بين السطور المقايسة بخط منقط. (ن) إجمالي عدد النوى المسجلة في جميع السطور. بسبب الذكورة كاملة الطول لها -1 تم تحديد كمية الجينات المحورة (انظر المواد والطرق) ثم تم تصنيفها على أنها (-) لا شيء ، (+) ضعيفة ، (++) معتدلة ، (+++) قوية ، أو (++++) شديدة. (بجي) أمثلة على الذكورة الناتجة عن إزالة الكبت لها -1. DIC photomicrographs من ذيول من (ب) نوع بري XX خنثى ، (جF) XX الحيوانات الذكورة بالطول الكامل لها -1 الجينات المحورة و (جي) نوع بريXO الذكر. وجهات النظر الجانبية (بد) والمناظر البطنية (هجي). (السهم الأبيض) مروحة ذكر (السهم الأسود) أشعة الذكور الحسية (رأس السهم الأسود) شويكات الذكور.

يحتوي الإقليمان 2 و 3 على نشاط ربط SDC-2 مكافئ تقريبًا في سياق الطول الكامل لها -1 الجين ، وهذه المناطق دعمت ارتباطًا أقوى من المنطقة 1 (الشكل 5 أ). تم ترجمة SDC-2 إلى 90٪ من المصفوفات التي تحمل نوعًا بريًا لها -1 الجين. تم تقليل التوطين بشكل طفيف فقط ، إلى 85 ٪ ، بواسطةلها -1(gf) الآفة في المنطقة 1 ، على الرغم من أن هذه الآفة ألغت توطين SDC-2 إلى جزء يحتوي على منطقة فقط 1. يجب أن يكون ارتباط SDC المتبقي قد حدث من خلال المنطقتين 2 و 3. في الواقع ، في الجينات المحورة بمنطقة من النوع البري 1 ، أدى التوزيع العشوائي لكل من 15 مير إلى تقليل توطين SDC-2 إلى 20٪ -40٪ ، كما أدى التوزيع العشوائي لكل من 15-مير إلى تقليل توطين SDC-2 إلى 10٪. لم يتم تقليل توطين SDC بشكل كبير عن طريق تعطيل المنطقة 1 على الجينات المحورة بالفعل متحولة لأي من المنطقة 2 أو المنطقة 3 ، ولكن تم تقليلها بشكل معتدل عن طريق تعطيل المنطقة 1 على متحولة الجينات لكل من المنطقتين 2 و 3. تقارب ربط SDC الضعيف نسبيًا للمنطقة 1 في سياق الطول الكامل لها -1 يتوافق الجين المحول مع صعوبة اكتشاف المنطقة 1 عن طريق تحليل ChIP على الجين الداخلي.

القمع الكامل لـ لها -1 يتطلب مشاركة جميع المناطق الثلاث الملزمة لـ SDC

هي قوة ارتباط SDC بمنطقة مرتبطة بالفعالية في القمع لها -1؟ تحليل النمط الظاهري الجنسي في XX الحيوانات ذات النوع البري أو الطول الكامل المعدللها -1 كشفت الجينات المحورة أن القمع الكامل لـلها -1 تطلب مشاركة جميع المناطق الثلاثة الملزمة لـ SDC. ومع ذلك ، فإن المنطقة 1 ، الأضعف في نشاط ربط SDC ، قدمت أكبر مساهمة فردية للقمع (الشكل 5A-G). ساهمت المناطق 2 و 3 في نشاط القمع في غياب المنطقة 1 ، لكن القمع كان أقل فعالية من المنطقة 1 (الشكل 5A-G). درجة ال لها -1 قد يكون القمع من المناطق 2 و 3 أكثر قابلية للمقارنة بقمع X- الجينات المرتبطة التي تحدث أثناء تعويض الجرعة.

تم استخلاص هذه الاستنتاجات من الملاحظات التالية (الشكل 5A-G): XX الحيوانات التي تحمل النوع البري لها -1أظهرت الجينات المحورة مستويات منخفضة جدًا (-) من الذكورة ، مما يشير إلى قمع قوي. تسبب تحور أي من المنطقة 2 أو 3 في ضعف الذكورة (+) الذي ارتبط باضطراب متوسط ​​في توطين SDC-2. تسبب تحور المنطقتين 2 و 3 في حدوث ذكورة معتدلة (++) ، على الرغم من التسبب في تعطيل قوي لتوطين SDC-2. أخيرًا ، تسببت طفرة المنطقة 1 في ذكورة قوية (+++) ، على الرغم من التسبب في انخفاض طفيف فقط في توطين SDC. لم يتم تعزيز هذا الذكورة عن طريق تعطيل المنطقة 2 أو 3 فقط ولكن تم تعزيزه عن طريق تعطيل كلتا المنطقتين 2 و 3 ، مما تسبب في الذكورة الشديدة (++++).

الارتباط الضعيف لبروتينات SDC بالمنطقة 1 بطول كامللها -1 أثار التحوير الجيني القلق من أن بروتينات SDC قد لا تتوسط في القمع من المنطقة 1. لذلك ، قمنا بتقييم تأثير تعطيل ارتباط SDC على وجه التحديد بالمنطقة 1 من خلال تقديمsdc-3(ترا) إلى النمط الجيني لها -1(-) حيوانات تحمل كامل الطول لها -1(+) الجينات المحورة مع الطفرات في المنطقتين 2 و 3. تم العثور على زيادة مضاعفة إلى ثلاثة أضعاف في عدد الحيوانات الذكورية ، مما يدل على أن بروتينات SDC تساهم في قمع المنطقة 1 في الجسم الحي.

مشاركة المنطقتين 2 و 3 في SDC بوساطة لها -1يتم تعزيز القمع في الجسم الحي من خلال تفسير البيانات الوراثية السابقة في سياق بيانات ربط SDC. تظهر نتائجنا أن لها -1(gf) الطفرة تقضي على ارتباط SDC بالمنطقة 1 ولكن ليس بالمنطقتين 2 و 3 ، في حين أن sdc-3تقلل طفرة (Tra) بشدة ارتباط SDC بالمناطق الثلاث. وبالتالي ، فإن زيادة درجة الذكورة في XX الحيوانات التي تسببهاsdc-3(Tra) طفرة (100 ٪ من المسوخ) مقارنة معلها -1(gf) الطفرة (30٪ من الطفرات) يجب أن تنتج عن تقليل ارتباط SDC بالمنطقتين 2 و 3. لذلك ، تساهم المنطقتان 2 و 3 بشكل كبير في القمع بوساطة SDC للنمو الداخلي.لها -1 الجين ، جنبًا إلى جنب مع المنطقة 1.


تصنيف وأصل eccDNAs

يتكون جينوم حقيقيات النوى من الحمض النووي الصبغي وعناصر الحمض النووي خارج الصبغيات والتي يتم استئصالها جسديًا من الكروموسومات 3. يُستخدم المصطلح & # x0201ceccDNA & # x0201d الآن لوصف الطيف الكامل للحمض النووي الدائرية في حقيقيات النوى. تنتشر eccDNAs على نطاق واسع عبر مختلف حقيقيات النوى من الخميرة إلى الإنسان 12-14. يمكن تقسيم eccDNAs إلى eccDNAs عضية مثل الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNAs) ، و eccDNAs غير عضوي أكثر مرونة مثل الدقائق المزدوجة (DMs) ، الحلقات ، الحمض النووي الدائرية الصغيرة (spcDNAs) و microDNAs (الجدول & # x200B (الجدول 1) 1 ) 15 . وتتراوح أحجامها من مئات الأزواج الأساسية (bp) إلى العديد من القواعد الضخمة (Mb). بسبب الوجود العالمي والاشتقاق غير المتجانس ، تعتبر eccDNAs لتعكس اللدونة الجينومية وعدم الاستقرار.

الجدول 1

تصنيف eccDNAs في حقيقيات النوى

اسم eccDNAنطاق الحجمالوظيفة البيولوجيةمراجع
الحمض النووي للميتوكوندريا16 كيلو بايتالحفاظ على وظيفة الميتوكوندريا134
دقيقة مزدوجة100 كيلو بايت -3 ميجا بايتالعمل كوسيلة لتضخيم الجينات خارج الصبغيات6, 56
DNA دائري صغير متعدد التشتت100 برميل - 10 كيلو بايتتعزيز عدم الاستقرار الجينومي34
ميكرو دنا100-400 نقطة أساسإنتاج miRNAs75
دائرة التيلوميرمضاعفات تكاملية 738 زوج قاعدياستعادة طول التيلومير135

تشير الدلائل المتزايدة إلى أن eccDNAs في الخلايا حقيقية النواة عادة ما تحمل تسلسلات متكررة متقطعة أو تسلسلات جينومية متكررة بشكل مترادف 16-18. يمكن الاستنتاج أن الحمض النووي المتكرر بالترادف معرض بشكل خاص لتكوين eccDNA 17. من ناحية أخرى ، فإن eccDNAs مشتق أيضًا من DNA غير التكراري. لون وآخرون. وجد 19 أن eccDNAs من خلايا HeLa S3 تتكون من تسلسلات DNA غير متكررة أو منخفضة النسخ. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن بعض spcDNAs غير التكرارية التي تم تحديدها على كلا الجانبين من خلال التكرارات المباشرة لمتوسط ​​طول 9-11 نقطة أساس 20 ، 21. يمكن أن تنشأ eccDNAs من كل من المناطق المشفرة وغير المشفرة. على سبيل المثال ، تم تحديد الجينات المسرطنة والجينات المقاومة للأدوية على أنها مكونات سائدة في DMs 22. بالإضافة إلى ذلك ، تنبثق microDNAs بشكل تفضيلي من exons و 5 'مناطق غير متعدية (5' UTR) وجزر CpG 23.


أنواع تقنية NIPT

الأنظمة الأساسية التقنية المستخدمة بشكل شائع لـ NIPT هي تسلسل الجينوم الكامل باستخدام تسلسل الجيل التالي (NGS) أو طرق مختلفة مستهدفة. عند النظر إلى أفضل تقنية NIPT مناسبة لمختبرك ، ستحتاج إلى التفكير في إنشاء البيانات وتحليلها ، وسير العمل في المختبر ، والآثار السريرية الناتجة.

NIPT وتسلسل الجينوم الكامل

يوفر NIPT باستخدام تقنية تسلسل الجينوم الكامل نتائج NIPT الأكثر إفادة من 1 إلى 7 مع عرض شامل عبر الجينوم بأكمله. يتميز NIPT بتسلسل الجينوم الكامل باستمرار بمعدلات فشل أقل مقارنة بالتسلسل المستهدف أو الأنظمة الأساسية القائمة على المصفوفة 8.

يحسن تحضير العينة الخالي من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المستخدم مع NIPT القائم على تسلسل الجينوم الكامل سير العمل في المختبر ، ويقلل بشكل كبير من تعقيد الفحص ويحسن بشكل كبير وقت الدوران (TAT). يمكن أيضًا توسيع هذا النوع من تقنية NIPT NGS بسهولة لتلبية احتياجات المختبر المتنامي.

NIPT وتسلسل الجينوم الكامل

المناهج المستهدفة لـ NIPT

تشتمل التقنيات المستهدفة لـ NIPT على تحليل تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNP) ، وتحليل المصفوفات الدقيقة ، وتضخيم الدائرة المتدحرجة. باستخدام الأساليب المستهدفة ، يتم تحليل مناطق محدودة فقط من الكروموسومات المختارة.

تحتوي هذه الأساليب المستهدفة على خطوات إضافية وتستخدم جولات تضخيم أكثر من طرق تسلسل الجينوم الكامل ، مما يوفر سير عمل أكثر تعقيدًا.

تحليل SNP

SNPs هي اختلافات جينية بين الأفراد. تحدد هذه التقنية الفرق بين الحمض النووي للوالدين والطفل ، والجرعة النسبية للتنوع الجيني لاستنتاج رقم النسخ. يتم تضخيم cfDNA بواسطة PCR باستخدام أهداف SNP محددة. يتم تسلسل هذه الأهداف ، ويتم تحديد توزيع الأليل لكل من الأم والطفل. تحدد الخوارزمية الشذوذ في ترددات الأليل المتوقعة.

تحليل SNP

تحليل ميكروأري

في هذا النوع من NIPT ، يتم استخدام مصفوفة ميكروأري ، وهي عبارة عن مجموعة من مناطق الحمض النووي المجهرية متصلة بسطح صلب. يتم تضخيم شظايا cfDNA بواسطة PCR ، ويتم تمييزها بمسبار الفلورسنت ، وربطها بالتسلسلات التكميلية على مصفوفة NIPT الدقيقة. Both the light intensity and binding position indicate the relative amount of DNA and presence or absence of the target, respectively. Deviations in expected fluorescent counts indicate aneuploidy.

تحليل ميكروأري

Rolling Circle Amplification

Rolling circle amplification targets specific cfDNA fragments which bind to a circular template and replicate by a rolling mechanism. The rolling circle replication products are fluorescently labeled and counted. Deviations in expected fluorescent counts indicate aneuploidy.

Rolling Circle Amplification

A Guide to NIPT Technology Options

Learn more about evaluating NIPT options and key considerations when selecting a technology for your lab.

A Guide to NIPT Technology Options

Comparison of NIPT Technology Types

How is NIPT Data Generated?

Purified cfDNA fragments are labelled with universal sequencing adapters to create a library. The library is amplified through bridge amplification (PCR-free) or PCR.

The sample libraries are sequenced using single or paired-end sequencing.

SNPs on chromosomes of interest are amplified by PCR and sequenced from cfDNA isolated from the plasma of pregnant women.

Probes designed to match specific sequences of the genome are synthesized onto specific areas on the microarray.

Targeted cfDNA fragments are amplified by PCR, tagged with a fluorescent probe, and bind to complimentary sequences on the microarray.

Target cfDNA fragments hybridize to probes designed to form circular complexes.

The DNA circles are copied thousands of times to generate rolling circle products.

How is NIPT Data Analyzed?

An over or under representation of sequenced reads based on expected distribution indicates aneuploidy.

An altered ratio of target alleles compared with expected ratios indicates aneuploidy.

An over or under representation of fluorescent counts compared with a reference genome indicates aneuploidy.

An over or under representation of fluorescent counts compared with a reference genome indicates aneuploidy.

What are the Clinical Considerations of NIPT?

All chromosomes are evaluated.

Only select chromosomes are evaluated.

Only select chromosomes are evaluated.

Only select chromosomes are evaluated.

What are the NIPT Lab Workflow Implications?

A PCR-free workflow eliminates the need for pre- and post-PCR lab space, allowing steps to be performed in a single area.

This workflow requires less hands-on time, faster TAT, and is less prone to contamination since PCR amplification is not employed.

PCR involves a more complicated workflow, significantly longer TAT, and necessitates pre- and post-PCR workspace considerations.

PCR involves a more complicated workflow, significantly longer TAT, and necessitates pre- and post-PCR workspace considerations.

There is reduced risk for contamination since PCR is not employed however, this method results in a long TAT.

مصادر إضافية

The Science Behind NIPT

See how this NIPT workflow detects aneuploidy in three simple steps.

Noninvasive Prenatal Testing and NIPT

Dr. Wapner, Vice Chair of Research in Obstetrics and Gynecology for Columbia University, shares his perspective on prenatal screening and NIPT.

NIPT Delivers Relief to Expectant Mother

Whole-genome sequencing provides results when another test was inconclusive.

NIPT: Effective Screening for the General Pregnancy Population

Glenn Palomaki, PhD, discusses the clinical validity and utility of offering NIPT as a primary screen in the general pregnancy population.

References
  1. Illumina Inc. VeriSeq™ NIPT Solution v2 Package Insert. 2020
  2. Palomaki GE, Kloza EM, Lambert-Messerlian GM, et al. DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: an international clinical validation study. Genet Med. 201113(11):913-920
  3. Ryan A, Hunkapiller N, Banjevic M, et al.Validation of an Enhanced Version of a Single-Nucleotide Polymorphism-Based Noninvasive Prenatal Test for Detection of Fetal Aneuploidies. Fetal Diagn Ther. 201640(3):219-223.
  4. Stokowski R, Wang E, White K, et al. Clinical performance of non-invasive prenatal testing (NIPT) using targeted cell-free DNA analysis in maternal plasma with microarrays or next generation sequencing (NGS) is consistent across multiple controlled clinical studies. Prenat Diagn. 2015doi: 10.1002/pd.4686.
  5. Jones KJ, Wang E, Bogard P, et al. Targeted cell-free DNA analysis with microarray quantitation for assessment of fetal sex and sex chromosome aneuploidy risk. Ultrasound Obstet Gynecol. 201851(2):275-276.
  6. Taneja PA, Snyder HL, de Feo E, et al. Noninvasive prenatal testing in the general obstetric population: clinical performance and counseling considerations in over 85,000 cases. Prenat Diagn. 2016 doi:10.1002/pd.4766.
  7. McCullough RM, Almasri EA, Guan X, et al. Non-invasive prenatal chromosomal aneuploidy testing--clinical experience: 100,000 clinical samples.
  8. Data on file. Illumina, Inc. November 2018.
للاستخدام البحثي فقط

ليس للاستخدام في إجراءات التشخيص باستثناء ما هو مذكور على وجه التحديد.

تقنيات مبتكرة

في Illumina ، هدفنا هو تطبيق تقنيات مبتكرة لتحليل التباين الجيني والوظيفة ، مما يجعل الدراسات ممكنة التي لم يكن من الممكن تخيلها حتى قبل بضع سنوات فقط. من المهم بالنسبة لنا تقديم حلول مبتكرة ومرنة وقابلة للتطوير لتلبية احتياجات عملائنا. بصفتنا شركة عالمية تضع قيمة عالية للتفاعلات التعاونية ، والتسليم السريع للحلول ، وتوفير أعلى مستوى من الجودة ، فإننا نسعى جاهدين لمواجهة هذا التحدي. تعمل تقنيات التسلسل والصفيف المبتكرة من Illumina على تعزيز التقدم الرائد في أبحاث علوم الحياة ، والجينوميات الانتقالية والمستهلكين ، والتشخيص الجزيئي.


Extrachromosomal DNA

Although most DNA is contained within a cell’s chromosomes, many cells have additional molecules of DNA outside the chromosomes, called extrachromosomal DNA, that are also part of its genome. The genomes of eukaryotic cells would also include the chromosomes from any organelles such as mitochondria and/or chloroplasts that these cells maintain (Figure 3). The maintenance of circular chromosomes in these organelles is a vestige of their prokaryotic origins and supports the نظرية التعايش الداخلي (see Foundations of Modern Cell Theory). In some cases, genomes of certain DNA viruses can also be maintained independently in host cells during latent viral infection. In these cases, these viruses are another form of extrachromosomal DNA. For example, the human papillomavirus (HPV) may be maintained in infected cells in this way.

Figure 3. The genome of a eukaryotic cell consists of the chromosome housed in the nucleus, and extrachromosomal DNA found in the mitochondria (all cells) and chloroplasts (plants and algae).

Besides chromosomes, some prokaryotes also have smaller loops of DNA called البلازميدات that may contain one or a few genes not essential for normal growth (see Figure 1 in Unique Characteristics of Prokaryotic Cells). Bacteria can exchange these plasmids with other bacteria in a process known as نقل الجينات الأفقي (HGT). The exchange of genetic material on plasmids sometimes provides microbes with new genes beneficial for growth and survival under special conditions. In some cases, genes obtained from plasmids may have clinical implications, encoding virulence factors that give a microbe the ability to cause disease or make a microbe resistant to certain antibiotics. Plasmids are also used heavily in genetic engineering and biotechnology as a way to move genes from one cell to another. The role of plasmids in horizontal gene transfer and biotechnology will be discussed further in Mechanisms of Microbial Genetics and Modern Applications of Microbial Genetics.

فكر في الأمر

Lethal Plasmids

Maria, a 20-year-old anthropology student from Texas, recently became ill in the African nation of Botswana, where she was conducting research as part of a study-abroad program. Maria’s research was focused on traditional African methods of tanning hides for the production of leather. Over a period of three weeks, she visited a tannery daily for several hours to observe and participate in the tanning process. One day, after returning from the tannery, Maria developed a fever, chills, and a headache, along with chest pain, muscle aches, nausea, and other flu-like symptoms. Initially, she was not concerned, but when her fever spiked and she began to cough up blood, her African host family became alarmed and rushed her to the hospital, where her condition continued to worsen.

After learning about her recent work at the tannery, the physician suspected that Maria had been exposed to الجمرة الخبيثة. He ordered a chest X-ray, a blood sample, and a spinal tap, and immediately started her on a course of intravenous penicillin. Unfortunately, lab tests confirmed the physician’s presumptive diagnosis. Maria’s chest X-ray exhibited pleural effusion, the accumulation of fluid in the space between the pleural membranes, and a Gram stain of her blood revealed the presence of gram-positive, rod-shaped bacteria in short chains, consistent with عصيات الجمرة الخبيثة. Blood and bacteria were also shown to be present in her cerebrospinal fluid, indicating that the infection had progressed to meningitis. Despite supportive treatment and aggressive antibiotic therapy, Maria slipped into an unresponsive state and died three days later.

Anthrax is a disease caused by the introduction of endospores from the gram-positive bacterium الجمرة الخبيثة into the body. Once infected, patients typically develop meningitis, often with fatal results. In Maria’s case, she inhaled the endospores while handling the hides of animals that had been infected.

جينوم الجمرة الخبيثة illustrates how small structural differences can lead to major differences in virulence. In 2003, the genomes of الجمرة الخبيثة and بكتيريا سيريوس العصويه, a similar but less pathogenic bacterium of the same genus, were sequenced and compared. [4] Researchers discovered that the 16S rRNA gene sequences of these bacteria are more than 99% identical, meaning that they are actually members of the same species despite their traditional classification as separate species. Although their chromosomal sequences also revealed a great deal of similarity, several virulence factors of الجمرة الخبيثة were found to be encoded on two large plasmids not found in B. cereus. The plasmid pX01 encodes a three-part toxin that suppresses the host immune system, whereas the plasmid pX02 encodes a capsular polysaccharide that further protects the bacterium from the host immune system (Figure 4). حيث B. cereus lacks these plasmids, it does not produce these virulence factors, and although it is still pathogenic, it is typically associated with mild cases of diarrhea from which the body can quickly recover. Unfortunately for Maria, the presence of these toxin-encoding plasmids in الجمرة الخبيثة gives it its lethal virulence.

Figure 4. Genome sequencing of عصيات الجمرة الخبيثة and its close relative B. cereus reveals that the pathogenicity of الجمرة الخبيثة is due to the maintenance of two plasmids, pX01 and pX02, which encode virulence factors.

  • What do you think would happen to the pathogenicity of الجمرة الخبيثة if it lost one or both of its plasmids?

Clinical Focus: Aamir, Resolution

Within 24 hours, the results of the diagnostic test analysis of Aamir’s stool sample revealed that it was positive for heat-labile enterotoxin (LT), heat-stabile enterotoxin (ST)، و colonization factor (CF), confirming the hospital physician’s suspicion of ETEC. During a follow-up with Aamir’s family physician, this physician noted that Aamir’s symptoms were not resolving quickly and he was experiencing discomfort that was preventing him from returning to classes. The family physician prescribed Aamir a course of ciprofloxacin to resolve his symptoms. Fortunately, the ciprofloxacin resolved Aamir’s symptoms within a few days.

Aamir likely got his infection from ingesting contaminated food or water. Emerging industrialized countries like Mexico are still developing sanitation practices that prevent the contamination of water with fecal material. Travelers in such countries should avoid the ingestion of undercooked foods, especially meats, seafood, vegetables, and unpasteurized dairy products. They should also avoid use of water that has not been treated this includes drinking water, ice cubes, and even water used for brushing teeth. Using bottled water for these purposes is a good alternative. Good hygiene (handwashing) can also aid the prevention of an ETEC infection. Aamir had not been careful about his food or water consumption, which led to his illness.

Aamir’s symptoms were very similar to those of كوليرا, caused by the gram-negative bacterium ضمة الكوليرا, which also produces a toxin similar to ST and LT. At some point in the evolutionary history of ETEC, a nonpathogenic strain of بكتريا قولونية similar to those typically found in the gut may have acquired the genes encoding the ST and LT toxins from ضمة الكوليرا. The fact that the genes encoding those toxins are encoded on extrachromosomal plasmids in ETEC supports the idea that these genes were acquired by بكتريا قولونية and are likely maintained in bacterial populations through horizontal gene transfer.


المقدمة

معا ذبابة الفاكهة and C. ايليجانس, global silencing mechanisms appear to play a crucial role in the specification and maintenance of germ line tissue (Wylie, 1999). في C. ايليجانس, these silencing mechanisms can be studied using transgene arrays containing a GFP reporter gene under the control of a promoter normally expressed in all cells (Kelly et al., 1997). The transgene arrays are strongly silenced in germ cells but are reactivated in the soma of each generation. Silencing in the germline can be partially prevented by increasing the ‘complexity’ of the transgene arrays formed in vivo through the co-injection of excess amounts of random, linear genomic fragments (Kelly et al., 1997).

Germline silencing of transgene arrays requires the action of the MES proteins (maternal effect sterility), MES-2, -3, -4, and -6 (Kelly and Fire, 1998). Two of the mes genes, mes-2 and mes-6, encode worm homologs of the ذبابة الفاكهة Polycomb Group proteins, Enhancer of Zeste and Extra Sex Combs, respectively (Holdeman et al., 1998 Korf et al., 1998). The Polycomb Group proteins maintain transcriptional repression of developmentally regulated genes through their ability to modulate chromatin conformation (Kennison, 1995). In addition, MES-2 and MES-4 each contain a SET domain, a conserved feature of many chromatin-interacting proteins. Defects in the mes factors cause sterility, owing to germ cell degeneration, and alleviate silencing of transgene arrays in the germline. Similar phenotypes can also result from depletion of a histone H1 isoform, H1.1 (Jedrusik and Schulze, 2001). Gene silencing through the regulation of chromatin conformation is therefore likely to be an essential component of germline maintenance, but the endogenous targets of this regulation are poorly understood. Severity of the germ cell degeneration in mes mutant animals increases with X-chromosome dose (Garvin et al., 1998), suggesting that some of the gene targets of MES-induced silencing reside on the X chromosome.

Global gene expression analysis has also suggested that the X chromosome is a possible target of silencing in the C. ايليجانس germline. Microarray analyses have identified 1416 germline-enriched genes in C. ايليجانس, which were classified into three distinct groups: sperm-enriched, oocyte-enriched and germline-intrinsic genes (defined as genes expressed similarly in the germline regardless of the gamete being made) (Reinke et al., 2000). Strikingly, sperm-enriched and germline-intrinsic genes are almost completely absent from the X chromosome. By contrast, oocyte-enriched genes are present on the X chromosome at a similar frequency to those found on autosomes. C. ايليجانس XO males make only sperm and thus would not require expression of oocyte-enriched genes, whereas XX hermaphrodites first produce sperm as L4 larvae and then become strictly oogenic as adults (Schedl, 1997 Hubbard and Greenstein, 2000). The X chromosome in male germlines may therefore be regulated differently from autosomes in a manner that prohibits the presence of the sperm-enriched and germline-intrinsic genes. Another possibility is that these classes of genes are absent from the X chromosome for some unknown reason, but that the X chromosome is otherwise competent for gene expression.

In support of the first possibility, the distinction of the male X chromosome from the autosomes in the germline of C. ايليجانس is reminiscent of sex chromatin formation in other species that bear non-equivalent sex chromosomes (heterogametic: XO or XY). During the pachytene stage of C. ايليجانس meiosis in males, the single (and thus unpaired) X chromosome adopts a highly compact morphology analogous to that seen in mammalian spermatocytes (Goldstein, 1982). In the heterogametic sex of diverse species, the male X chromosome in the pachytene stage of meiotic prophase is found in a visually distinct structure called the XY- or sex-body that is transcriptionally inactive (Handel and Hunt, 1992). McKee and Handel (McKee and Handel, 1993) proposed that the condensation of sex chromatin in XY and XO male germlines, and by consequence the transcriptional inactivation of these chromosomes, prevents harmful recombination events between non-equivalent X and Y chromosomes, and prevents loss of a single chromosome lacking a pairing partner in XO animals. في C. ايليجانس, both the exclusion of sperm-enriched and germline-intrinsic genes from the X chromosome, and the condensed structure of the X chromosome in the XO male germline suggest that the X chromosome in the male germ line may be targeted for silencing.

If the male X chromosome is silenced in the germline, then one expectation is that it should have a chromatin conformation consistent with decreased transcriptional activity. Chromatin structure can be regulated via differential modification of nucleosomal histone N termini ‘tails’, which includes acetylation, methylation, phosphorylation and ubiquitination (Strahl and Allis, 2000 Turner, 2000). Combinations of these modifications are proposed to comprise a ‘histone code’ that determines regional structural properties of chromatin (Strahl and Allis, 2000). The acetylation of lysine residues in the N termini of histones H3 and H4, as well as methylation of lysine 4 in histone H3, generally correlate with a transcriptionally active state. By contrast, methylation of lysine 9 in histone H3 correlates with transcriptional silencing and constitutive heterochromatin formation, and is required for binding of the heterochromatin protein HP1 (Strahl and Allis, 2000 Jenuwein, 2001). Some proteins containing a SET domain are histone methyltransferases that can methylate lysine 9 in histone H3 (Jenuwein, 2001 Jenuwein and Allis, 2001). The general scheme of a ‘histone code’ has probably undergone specific adaptations in different organisms, but overall remains strongly conserved.

We have used probes specific for histone modifications to study the chromatin organization of the X chromosome in germ cells of C. ايليجانس males and hermaphrodites. Both germline-silenced and germline-expressing transgene arrays were used to monitor how the histone modification patterns on these large, extrachromosomal arrays correlate with expression competence. The spectrum of histone modifications on transgene arrays illustrate a consistent correlation with the expression competence of the array in early meiotic germ cells. Moreover, we present evidence that, relative to autosomes, the histones on the X chromosome in male germ cells show a marked reduction in modifications that correlate with transcriptional activation and are enriched in a modification that is associated with heterochromatin.

Strikingly, the X chromosomes in oogenic hermaphrodite germ cells also appear silenced in early meiotic prophase as assessed by their histone modification pattern. Oocyte-enriched genes on the X chromosomes are, on average, expressed at levels significantly lower than oocyte-enriched genes on autosomes. Transcription of several X-linked oocyte genes was only detected in very late meiotic prophase I in the female germline of hermaphrodites.

We also demonstrate that three types of unpaired autosomal sequences are competent to express genes and display activating chromatin modifications: extrachromosomal transgene arrays containing interspersed genomic DNA, unpaired autosomal duplications and the autosomal portions of X:autosome translocations. Each has histone modification patterns more similar to autosomes than to the X chromosome throughout meiosis. These results show that pairing is probably not required for gene expression during meiosis, and suggest that chromatin on autosomes may be refractory to germline silencing. We also show that silencing of the X chromosome is a conserved feature in nematode species with divergent modes of reproduction, and thus does not appear to be a consequence of hermaphroditism.


What's the difference between a free chromosome fragment and an extrachromosomal array? - مادة الاحياء

بنهاية هذا القسم ، ستكون قادرًا على القيام بما يلي:

  • List the different steps in prokaryotic transcription
  • Discuss the role of promoters in prokaryotic transcription
  • Describe how and when transcription is terminated

The prokaryotes, which include Bacteria and Archaea, are mostly single-celled organisms that, by definition, lack membrane-bound nuclei and other organelles. A bacterial chromosome is a closed circle that, unlike eukaryotic chromosomes, is not organized around histone proteins. The central region of the cell in which prokaryotic DNA resides is called the nucleoid region. In addition, prokaryotes often have abundant plasmids, which are shorter, circular DNA molecules that may only contain one or a few genes. Plasmids can be transferred independently of the bacterial chromosome during cell division and often carry traits such as those involved with antibiotic resistance.

يتطلب النسخ في بدائيات النوى (وفي حقيقيات النوى) أن يزيل الحلزون المزدوج للحمض النووي جزئيًا في منطقة تخليق الرنا المرسال. تسمى منطقة الفك فقاعة النسخ. Transcription always proceeds from the same DNA strand for each gene, which is called the template strand. The mRNA product is complementary to the template strand and is almost identical to the other DNA strand, called the nontemplate strand, or the coding strand. The only nucleotide difference is that in mRNA, all of the T nucleotides are replaced with U nucleotides ((Figure)). في الحلزون المزدوج للحمض النووي الريبي ، يمكن لـ A ربط U عبر رابطتين هيدروجينيتين ، تمامًا كما هو الحال في الاقتران A-T في الحلزون المزدوج للحمض النووي.

Figure 1. Messenger RNA is a copy of protein-coding information in the coding strand of DNA, with the substitution of U in the RNA for T in the coding sequence. However, new RNA nucleotides base pair with the nucleotides of the template strand. RNA is synthesized in its 5′-3′ direction, using the enzyme RNA polymerase. As the template is read, the DNA unwinds ahead of the polymerase and then rewinds behind it.

يُطلق على زوج النيوكليوتيدات في الحلزون المزدوج للحمض النووي الذي يتوافق مع الموقع الذي نُسخ منه أول 5 & # 8242 mRNA نوكليوتيد موقع +1 ، أو موقع البدء. Nucleotides preceding the initiation site are denoted with a “-” and are designated upstream nucleotides. Conversely, nucleotides following the initiation site are denoted with “+” numbering and are called downstream nucleotides.

بدء النسخ في بدائيات النوى

لا تحتوي بدائيات النوى على نوى محاطة بالغشاء. لذلك ، يمكن أن تحدث عمليات النسخ والترجمة وتدهور الرنا المرسال في وقت واحد. The intracellular level of a bacterial protein can quickly be amplified by multiple transcription and translation events that occur concurrently on the same DNA template. Prokaryotic genomes are very compact, and prokaryotic transcripts often cover more than one gene or cistron (a coding sequence for a single protein). Polycistronic mRNAs are then translated to produce more than one kind of protein.

مناقشتنا هنا ستجسد النسخ من خلال وصف هذه العملية في الإشريكية القولونية, a well-studied eubacterial species. على الرغم من وجود بعض الاختلافات بين النسخ في بكتريا قولونية والنسخ في العتائق ، فهم بكتريا قولونية يمكن تطبيق النسخ على جميع الأنواع البكتيرية تقريبًا.

بدائية النواة بوليميريز الحمض النووي الريبي

تستخدم بدائيات النوى نفس بوليميريز الحمض النووي الريبي لنسخ جميع جيناتها. في بكتريا قولونية، يتكون البوليميراز من خمس وحدات فرعية متعددة الببتيد ، اثنتان منها متطابقتان. يتم الإشارة إلى أربعة من هذه الوحدات الفرعية α, α, β، و β‘, comprise the polymerase core enzyme. تتجمع هذه الوحدات الفرعية في كل مرة يتم فيها نسخ الجين ، وتتفكك بمجرد اكتمال النسخ. كل وحدة فرعية لها دور فريد من نوعه α- الوحدات الفرعية ضرورية لتجميع البوليميراز على الحمض النووي β-subunit binds to the ribonucleoside triphosphate that will become part of the nascent mRNA molecule and the β‘ subunit binds the DNA template strand. الوحدة الفرعية الخامسة ، σ، يشارك فقط في بدء النسخ. إنه يمنح خصوصية نسخية مثل أن يبدأ البوليميراز في تصنيع الرنا المرسال من موقع بدء مناسب. بدون σ، فإن الإنزيم الأساسي سينسخ من مواقع عشوائية وينتج جزيئات الرنا المرسال التي تحدد بروتين gibberish. يُطلق على البوليميراز المكون من جميع الوحدات الفرعية الخمس اسم holoenzyme.

محفزات بدائية النواة

A promoter is a DNA sequence onto which the transcription machinery, including RNA polymerase, binds and initiates transcription. في معظم الحالات ، توجد المحفزات في بداية الجينات التي تنظمها. يعد التسلسل المحدد للمحفز مهمًا جدًا لأنه يحدد ما إذا كان الجين المقابل يتم نسخه طوال الوقت ، أو في بعض الأوقات ، أو بشكل غير متكرر. Although promoters vary among prokaryotic genomes, a few elements are evolutionarily conserved in many species. At the -10 and -35 regions upstream of the initiation site, there are two promoter consensus sequences, or regions that are similar across all promoters and across various bacterial species ((Figure)). The -10 sequence, called the -10 region, has the consensus sequence TATAAT. The -35 sequence has the consensus sequence TTGACA. These consensus sequences are recognized and bound by σ. بمجرد إجراء هذا التفاعل ، ترتبط الوحدات الفرعية للإنزيم الأساسي بالموقع. تسهل منطقة A-T-rich -10 فك قالب الحمض النووي ، ويتم تصنيع العديد من روابط الفوسفوديستر. تنتهي مرحلة بدء النسخ بإنتاج نسخ فاشلة ، وهي عبارة عن بوليمرات من حوالي 10 نيوكليوتيدات يتم تصنيعها وإطلاقها.

Figure 2. The σ subunit of prokaryotic RNA polymerase recognizes consensus sequences found in the promoter region upstream of the transcription start site. تنفصل الوحدة الفرعية عن البوليميراز بعد بدء النسخ.

ارتباط بالتعلم

View this MolecularMovies animation to see the first part of transcription and the base sequence repetition of the TATA box.

Elongation and Termination in Prokaryotes

The transcription elongation phase begins with the release of the σ الوحدة الفرعية من البوليميراز. تفكك σ allows the core enzyme to proceed along the DNA template, synthesizing mRNA in the 5′ to 3′ direction at a rate of approximately 40 nucleotides per second. مع استمرار الاستطالة ، يتم فك الحمض النووي باستمرار قبل الإنزيم الأساسي ويعود خلفه. الاقتران الأساسي بين DNA و RNA ليس مستقرًا بدرجة كافية للحفاظ على استقرار مكونات تخليق mRNA. بدلاً من ذلك ، يعمل بوليميراز الحمض النووي الريبي كحلقة وصل مستقرة بين قالب الحمض النووي وخيوط الحمض النووي الريبي الوليدة لضمان عدم انقطاع الاستطالة قبل الأوان.

Prokaryotic Termination Signals

Once a gene is transcribed, the prokaryotic polymerase needs to be instructed to dissociate from the DNA template and liberate the newly made mRNA. اعتمادًا على الجين الذي يتم نسخه ، هناك نوعان من إشارات الإنهاء. أحدهما يعتمد على البروتين والآخر يعتمد على الحمض النووي الريبي. Rho-dependent termination is controlled by the rho protein, which tracks along behind the polymerase on the growing mRNA chain. بالقرب من نهاية الجين ، يصادف البوليميراز سلسلة من النيوكليوتيدات G على قالب الحمض النووي ويتوقف. نتيجة لذلك ، يصطدم بروتين rho بالبوليميراز. يؤدي التفاعل مع rho إلى إطلاق mRNA من فقاعة النسخ.

Rho-independent termination is controlled by specific sequences in the DNA template strand. عندما يقترب البوليميراز من نهاية الجين الذي يتم نسخه ، فإنه يصادف منطقة غنية بالنيوكليوتيدات C-G. ينثني mRNA مرة أخرى على نفسه ، وترتبط نيوكليوتيدات C-G التكميلية معًا. The result is a stable hairpin that causes the polymerase to stall as soon as it begins to transcribe a region rich in A–T nucleotides. تشكل منطقة U – A التكميلية لنسخة mRNA تفاعلًا ضعيفًا فقط مع قالب DNA. هذا ، إلى جانب البوليميراز المتوقف ، يؤدي إلى عدم استقرار كافٍ للإنزيم الأساسي للانفصال وتحرير نسخة الرنا المرسال الجديدة.

Upon termination, the process of transcription is complete. By the time termination occurs, the prokaryotic transcript would already have been used to begin synthesis of numerous copies of the encoded protein because these processes can occur concurrently. The unification of transcription, translation, and even mRNA degradation is possible because all of these processes occur in the same 5′ to 3′ direction, and because there is no membranous compartmentalization in the prokaryotic cell ((Figure)). In contrast, the presence of a nucleus in eukaryotic cells precludes simultaneous transcription and translation.

Figure 3. يمكن للبوليميرات المتعددة نسخ جين بكتيري واحد بينما تقوم العديد من الريبوسومات بترجمة نصوص الرنا المرسال في نفس الوقت إلى عديد الببتيدات. بهذه الطريقة ، يمكن أن يصل بروتين معين بسرعة إلى تركيز عالٍ في الخلية البكتيرية.

ارتباط بالتعلم

Visit this BioStudio animation to see the process of prokaryotic transcription.

Section Summary

In prokaryotes, mRNA synthesis is initiated at a promoter sequence on the DNA template comprising two consensus sequences that recruit RNA polymerase. The prokaryotic polymerase consists of a core enzyme of four protein subunits and a σ protein that assists only with initiation. Elongation synthesizes mRNA in the 5′ to 3′ direction at a rate of 40 nucleotides per second. Termination liberates the mRNA and occurs either by rho protein interaction or by the formation of an mRNA hairpin.

راجع الأسئلة

Which subunit of the بكتريا قولونية polymerase confers specificity to transcription?


Repression of HR

Recently, it has become clear that telomeres also need to be protected from inappropriate homologous recombination. There are three types of HR that have detrimental outcomes at chromosome ends. The first is homologous recombination between sister telomeres, referred to as Telomere Sister Chromatid Exchange (T-SCE). T-SCEs could be detrimental to cells if the exchanged sequences are not equal in length. One sister telomere could become lengthened at the expense of the other. The exchange between sister telomeres can be detected by chromosome-orientation fluorescent in situ hybridization (CO-FISH) (for review, see Bailey et al. 2004). In the CO-FISH method, newly synthesized DNA is degraded and the remaining parental strands are detected with single-stranded probes. At telomeres, one parental strand is composed of 5′-TTAGGG-3′ repeats and the other has only 5′-CCCTAA-3′ sequences, allowing the two strands to be distinguished in metaphase chromosomes. After semiconservative replication, each chromatid in a metaphase chromosome will have a G-strand signal at one end and a C-strand signal at the other. A chromatid end displaying both C-strand and G-strand signals indicates that a T-SCE event has occurred at this end. In normal mouse and human cells, T-SCE is not frequent, but ALT cells, which maintain their telomeres by a recombination pathway, have very frequent T-SCE (Bailey et al. 2004 Bechter et al. 2004 Londono-Vallejo et al. 2004). The difference may be that T-SCEs are normally repressed and that ALT cells have loosened their control of HR at telomeres, allowing them to maintain their telomeres and therefore to survive (for review, see Neumann and Reddel 2002).

A second HR reaction that threatens telomeres is referred to as t-loop HR (Wang et al. 2004) (Fig. 5). T-loops are at risk for resolution by Holliday junction (HJ) resolvases because an HJ could be formed if the 5′ end of the telomere base pairs with the displacement loop (D loop). Branch migration in the direction of the centromere could generate a double HJ and resolution of this structure with crossover would delete the whole loop segment, leaving a drastically shortened telomere at the chromosome end. T-loop HR was discovered through a separation of function mutant of TRF2, TRF2 ΔB , which protects telomeres from NHEJ but induces sudden telomere truncations. These deletions are dependent on two proteins implicated in HR, the Mre11 recombination repair complex and XRCC3, a Rad51 paralog associated with HJ resolution activity. Cells expressing TRF2 ΔB also contain extrachromosomal telomeric DNA that is circular. On two-dimensional gels, these circles show a broad size distribution consistent with their representing the loop part of the t-loops. How the N terminus of TRF2 represses t-loop HR has not been established. As unperturbed cells contain small amounts of circular telomeric DNA, suppression of the t-loop HR reaction at telomeres may be incomplete. The control of t-loop HR appears to be further relaxed in ALT cells, which contain abundant telomeric circles (Cesare and Griffith 2004 Wang et al. 2004). As T-SCE and t-loop HR are similar reactions (one taking place in رابطة الدول المستقلة, the other in عبر), their prevalence in ALT cells may be due to loss of a repressor that controls both.

There may be a third type of HR with detrimental outcomes—the recombination between a telomere and interstitial telomeric DNA. Chromosome internal telomeric DNA is not frequent in human cells, but in many other vertebrates, such sequences are abundant throughout the chromosomes. Recombination between telomeres and these elements could generate terminal deletions, extrachromosomal fragments, inversions, and translocations. This type of recombination appears to take place in mouse cells lacking ERCC1, which generate large extrachromosomal elements that contain a single stretch of telomeric DNA, presumably at a chromosome internal site (Zhu et al. 2003). These elements, referred to as Telomeric DNA-containing Double Minute chromosomes (TDMs) could be formed by recombination between a telomere and interstitial telomeric DNA on the same chromosome. Perhaps shelterin carries ERCC1/XPF is on its “tool-belt” to prevent inappropriate recombination events.


معلومات الكاتب

Present address: The Institute for Genomic Research, 9712 Medical Center Drive, Rockville, Maryland, 20850, USA

L. Eichinger, J. A. Pachebat, G. Glöckner, M.-A. Rajandream and R. Sucgang: *These authors contributed equally to this work

الانتماءات

Center for Biochemistry and Center for Molecular Medicine Cologne, University of Cologne, Joseph-Stelzmann-Str. 52, 50931, Cologne, Germany

L. Eichinger, J. A. Pachebat, B. Tunggal, F. Rivero, P. Farbrother & A. A. Noegel

Laboratory of Molecular Biology, MRC Centre, CB2 2QH, Cambridge, UK

J. A. Pachebat, S. Kummerfeld, M. Madera, B. A. Konfortov, A. T. Bankier, M. Madan Babu, A. Wardroper, R. R. Kay & P. H. Dear

Genome Analysis, Institute for Molecular Biotechnology, Beutenbergstr. 11, D-07745, Jena, Germany

G. Glöckner, K. Szafranski, R. Lehmann, M. Felder, A. Rosenthal & M. Platzer

The Wellcome Trust Sanger Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridgeshire, CB10 1SA, UK

M.-A. Rajandream, M. Berriman, N. Hamlin, R. Davies, D. Saunders, P. Davis, A. Kerhornou, N. Hall, N. Bason, C. Churcher, J. Cooper, A. Cronin, I. Goodhead, T. Mourier, A. Pain, D. Harper, H. Hauser, K. James, D. Johnson, A. Knights, K. Mungall, K. Oliver, C. Price, M. A. Quail, E. Rabbinowitsch, M. Sanders, S. Sharp, M. Simmonds, S. Spiegler, A. Tivey, B. White, D. Walker, J. Woodward & B. Barrell

Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, 77030, USA

R. Sucgang, J. Song, G. Chen, X. Nie, L. Hemphill, B. Desany, M. Lu, R. Lindsay, J. Ma & A. Kuspa

Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, 77030, USA

Q. Xu, E. Sodergren, N. van Driessche, G. Shaulsky, G. Weinstock, R. Gibbs & A. Kuspa

Graduate Program in Structural and Computational Biology and Molecular Biophysics, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, 77030, USA

Human Genome Sequencing Center, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, 77030, USA

E. Sodergren, D. Muzny, M. Quiles, H. Loulseged, J. Hernandez, D. Steffen, G. Weinstock & R. Gibbs

Section of Cell and Developmental Biology, Division of Biology, University of California, La Jolla, California, 92093, San Diego, USA

R. Olsen, C. Anjard & W. F. Loomis

dictyBase, Center for Genetic Medicine, Northwestern University, 303 E Chicago Ave, Chicago, Illinois, 60611, USA

P. Gaudet, P. Fey, K. Pilcher, E. Just & R. L. Chisholm

Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, Tsukuba, Ibaraki, 305-8572, Japan

T. Morio, H. Urushihara & Y. Tanaka

Adolf-Butenandt-Institute/Cell Biology, Ludwig-Maximilians-University, 80336, Munich, Germany

Biochemistry Department, University of Cambridge, Cambridge, CB2 1QW, UK

Division of Biological Sciences, Graduate School of Science, Hokkaido University, 060-0810, Sapporo, Japan

Unité de Genomique des Microorganismes Pathogenes, Institut Pasteur, 28 rue du Dr Roux, 75724, Cedex 15, Paris, France

Department of Biology, University of York, York, YO10 5YW, UK

MRC Cancer Cell Unit, Hutchison/MRC Research Centre, Hills Road, CB2 2XZ, Cambridge, UK

Centre for Genetic Resource Information, National Institute of Genetics, Mishima, Shizuoka, 411-8540, Japan

Department of Medical Genome Sciences, Graduate School of Frontier Sciences, The University of Tokyo, Minato, Tokyo, 108-8639, Japan

Institut für Pharmazeutische Biologie, Universität Frankfurt (Biozentrum), 60439, Frankfurt am Main, Germany

Department of Molecular Biology, Princeton University, Princeton, New Jersey, 08544-1003, USA

School of Life Sciences, University of Dundee, Dow Street, Dundee, DD1 5EH, UK


شاهد الفيديو: الفرق بين الجين والأليل والسائد والمتنحي (قد 2022).


تعليقات:

  1. Phorcys

    أنا أعتبر، أنك لست على حق. اكتب لي في رئيس الوزراء ، سوف نتحدث.

  2. Mircea

    كل شيء عن واحد ولذا فهو لانهائي

  3. Kirkley

    بالطبع أنت على حق. هناك شيء حول ذلك ، وهذه فكرة رائعة. أنا أدعمك.

  4. Stanhope

    الغريب مثل هذا

  5. Raoul

    نعم حقا.انا اربط كلامي بالكل.



اكتب رسالة