معلومة

البدائل الحديثة لبصمة الحمض النووي

البدائل الحديثة لبصمة الحمض النووي


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

نظرًا لأن بصمة الحمض النووي طريقة قديمة اعتقدت أنه قد تكون هناك بعض الطرق الأكثر حداثة وفعالية لتحديد تسلسل الحمض النووي ، هل تعرف أيًا منها؟


يعد DNAse-seq الخيار الأكثر وضوحًا. إنها تستخدم نفس فكرة البصمة DNAse ولكنها تقيس المخرجات باستخدام تسلسل عالي الإنتاجية ، بحيث يمكن إجراؤها على جينوم كامل في طلقة واحدة.


تسلسل الحمض النووي ، RFLP ، IHC ، فى الموقع التهجين ، النشاف الجنوبي.

أعتقد أن التقنية التي تبحث عنها (ما تتحدث عنه) هي اختبار التحول الكهربائي أو EMSA


بدائل للتطور الدارويني

بدائل للتطور الدارويني تم اقتراحه من قبل العلماء الباحثين في علم الأحياء لشرح علامات التطور والعلاقة بين مجموعات مختلفة من الكائنات الحية. لا تنكر البدائل المعنية أن التغييرات التطورية بمرور الوقت هي أصل تنوع الحياة ، ولا أن الكائنات الحية التي تعيش اليوم تشترك في سلف مشترك من الماضي البعيد (أو الأجداد ، في بعض المقترحات) ، بل تقترح آليات بديلة لـ التغيير التطوري بمرور الوقت ، معارضة الطفرات التي تصرفت عن طريق الانتقاء الطبيعي باعتبارها المحرك الأكثر أهمية للتغيير التطوري.

هذا يميزهم عن بعض الأنواع الأخرى من الحجج التي تنكر حدوث تطور واسع النطاق من أي نوع ، كما هو الحال في بعض أشكال الخلق ، التي لا تقترح آليات بديلة للتغيير التطوري ولكنها تنكر بدلاً من ذلك حدوث التغيير التطوري على الإطلاق. . لا تنكر جميع أشكال نظرية الخلق أن التغيير التطوري يحدث بشكل ملحوظ ، يؤكد مؤيدو التطور التوحدي ، مثل عالم الأحياء آسا جراي ، أن التغيير التطوري يحدث بالفعل وهو مسؤول عن تاريخ الحياة على الأرض ، بشرط أن تكون هذه العملية متأثرًا بإله أو آلهة بمعنى ما.

حيث تم قبول حقيقة التغيير التطوري ولكن تم رفض الآلية التي اقترحها تشارلز داروين ، الانتقاء الطبيعي ، تم تقديم تفسيرات للتطور مثل اللاماركية ، والكارثة ، والتكوين ، والحيوية ، والبنيوية والطفرة (تسمى الملوحة قبل عام 1900). دفعت عوامل مختلفة الناس لاقتراح آليات التطور غير الداروينية. الانتقاء الطبيعي ، بتركيزه على الموت والمنافسة ، لم يروق لبعض علماء الطبيعة لأنهم شعروا أنه غير أخلاقي ، ولم يترك مجالًا كبيرًا للغائية أو لمفهوم التقدم في تطور الحياة. أثار بعض الذين جاءوا لقبول التطور ، لكنهم كرهوا الانتقاء الطبيعي ، اعتراضات دينية. شعر آخرون أن التطور هو عملية تقدمية بطبيعتها أن الانتقاء الطبيعي وحده لم يكن كافياً لتفسيره. لا يزال البعض الآخر يشعر أن الطبيعة ، بما في ذلك تطور الحياة ، تتبع أنماطًا منظمة لا يستطيع الانتقاء الطبيعي تفسيرها.

بحلول بداية القرن العشرين ، كان التطور مقبولًا بشكل عام من قبل علماء الأحياء ، لكن الانتقاء الطبيعي كان في حالة خسوف. [2] تم اقتراح العديد من النظريات البديلة ، ولكن سارع علماء الأحياء إلى استبعاد نظريات مثل التكوُّن العضلي والحيوي واللاماركية التي لم تقدم أي آلية للتطور. اقترحت الطفرة آلية ، لكنها لم تكن مقبولة بشكل عام. ادعى التوليف الحديث لجيل لاحقًا أنه يكتسح جميع البدائل للتطور الدارويني ، على الرغم من أن بعضها قد تم إحياؤه كآليات جزيئية تم اكتشافها.


كائن حي جديد يمكنه مضاعفة وتيرة علم الأحياء

لإعادة مراجعة هذه المقالة ، قم بزيارة ملفي الشخصي ، ثم اعرض القصص المحفوظة.

لإعادة مراجعة هذه المقالة ، قم بزيارة ملفي الشخصي ، ثم اعرض القصص المحفوظة.

كان ثيودور إشريش يدرس براز الأطفال عندما توصل إلى الاكتشاف الذي من شأنه أن يحدد مسار علم الأحياء الحديث. في ألمانيا في ذلك الوقت ، كان الأطفال يموتون بسبب الإسهال. عندما أطل Escherich من خلال مجهره على البكتيريا المأخوذة من الأطفال ، رأى بكتيريا على شكل قضيب ستحمل اسمه: الإشريكية القولونية.

كان ذلك 1857. سريعًا إلى الأمام 150 عامًا و بكتريا قولونية هو العمود الفقري لعلم الأحياء الحديث. اكتشف علماء الأحياء المجهرية الأوائل ذلك بكتريا قولونية نمت جيدًا في المختبر ، في المرق أو في أطباق أجار مع الحد الأدنى من التغذية. وعندما جاءت ثورة علم الوراثة ، فك علماء الوراثة الجينوم الصغير - واحد على ألف من حجم الإنسان - وتوصلوا إلى كيفية التلاعب بالحمض النووي الخاص به. سلالات المختبر الشائعة رديئة جدًا بحيث لا تصيبك بالإسهال الآن. تستخدم الدراسات بكتريا قولونية، من فحص أساسيات الحمض النووي إلى السلالات الهندسية التي تصنع المضادات الحيوية ، تملأ الرفوف الموجودة على الرف.

لكن ورقة بحثية جديدة من مختبر جورج تشيرش ، رائد علم الوراثة بجامعة هارفارد ، تقدم بديلاً مثيرًا للاهتمام: البكتيريا الضمة الطبيعية ينمو بشكل أسرع من بكتريا قولونية. يمكن أن تقلل إلى نصف مقدار الوقت الذي يقضيه علماء الوراثة في التجارب الروتينية. النتيجة الأكثر إثارة للاهتمام ، كما يقول هنري لي ، باحث ما بعد الدكتوراه في مختبر تشيرش الذي يعمل معه V. natriegens، هذه الدراسة ترسم مسارًا لترويض الميكروبات ، ونقلها من البرية إلى المختبر في شهور بدلاً من عقود. ظهرت النسخة الأولية للورقة ، التي لم تتم مراجعتها من قبل الأقران ، في مستودع bioRxiv هذا الشهر.

V. natriegens يأتي من طين مستنقع الملح ، ويشتهر بأنه مزارع سريع. يتضاعف العدد كل 10 دقائق - مقارنة بـ 20 دقيقة لـ بكتريا قولونية في ظروف نمو مثالية. لكن V. natriegens يحتاج إلى فعل أكثر من النمو السريع ليكون مفيدًا ، وهذا هو المكان بكتريا قولونية لديه الميزة الحالية. يقول آدم أركين ، عالم الأحياء بجامعة كاليفورنيا ، بيركلي ، والذي لم يشارك في الدراسة.

على مدى السنوات الأربع الماضية ، كان لي يحاول اللحاق V. natriegens فوق. لقد نظف العجوز بكتريا قولونية الأدب لمعرفة كيف قام علماء الأحياء الدقيقة في وقت مبكر بتحويله إلى كائن مختبر مرن. يقول لي: "لقد كانت عملية ممتعة للغاية ، وممتعة حقًا". في البداية ، "لا تعرف كيف تصنع الرؤوس أو ذيول أي شيء."

على سبيل المثال ، كان على "لي" أن يكتشف كيفية إدخال جينات أجنبية فيها V. natriegens، وهي عملية تافهة مع بكتريا قولونية. أولاً ، احتاج إلى صنع قطعة دائرية من الحمض النووي ، تسمى البلازميد ، يمكن أن تتسلل إليها V. natriegens الخلايا. وكان بحاجة إلى التفريق بينهما بسرعة بطريقة أو بأخرى V. natriegens المستعمرات التي تناولت البلازميد وتلك التي لا. مع بكتريا قولونية، يمكنك شراء تركيبات بلازميد جاهزة للتخزين تحول البكتيريا لونًا واحدًا عندما يكون التحول ناجحًا والآخر عندما لا يكون كذلك. كان على لي أن يبني البلازميد كله بنفسه.

في النهاية ، عمل على التحول ، جنبًا إلى جنب مع تقنيتين أخريين للمعالجة الجينية: مقاطعة الجينات الموجودة في V. natriegens وتعطيلها باستخدام Crispr. يقول أركين: "لقد أثبت أن لديه موطئ قدم في معظم الجينات ، مما يمنحنا جميعًا الإيمان بأنه سوف يعمل بشكل جيد".

يقول أركين إنه متشكك V. natriegens نفسها يمكن أن تحل محل بكتريا قولونية في المختبرات ، لكن الاهتمام باستخدام أدوات وراثية لجميع أنواع البكتيريا الغامضة سيستمر في النمو. بكتريا قولونية جيد جدًا في النمو في أجسام البشر. ولكن ماذا لو أراد علماء الأحياء الاصطناعية هندسة بكتيريا يمكنها عزل الكربون في المحيطات أو تلك التي تحافظ على صحة النباتات أثناء الجفاف؟ حسنًا ، إذن أنت تريد البكتيريا التي ، بعد ملايين السنين من التطور ، أصبحت بالفعل جيدة جدًا في العيش في المحيطات أو التربة الحية.

من يدري من أين ستأتي الميكروبات القادمة التي ستغير العالم. ولكن إذا كان لدى العلماء خارطة طريق للعمل بسرعة على علم الوراثة ، فلن يستغرق الأمر قرنًا لاستخدامها في المرة القادمة.


Tullius ، T. D. الدراسات الفيزيائية لمجمعات البروتين والحمض النووي عن طريق البصمة. Annu. القس بيوفيس. بيوفيز. تشيم. 18, 213–237 (1989).

Adilakshmi، T.، Lease، R.A & amp Woodson، S. A. الدقة الأحماض النووية. 34، e64 (2006).

Song ، L. & amp Crawford ، G.E DNase-seq: تقنية عالية الدقة لرسم خرائط لعناصر تنظيم الجينات النشطة عبر الجينوم من خلايا الثدييات. كولد سبرينج حرب. بروتوك. https://doi.org/10.1101/pdb.prot5384 (2010).

Koohy ، H. ، Down ، T. A. & amp Hubbard ، T. J. تظهر مجموعات بيانات إمكانية الوصول إلى الكروماتين تحيزًا بسبب خصوصية تسلسل إنزيم DNase I. بلوس واحد 8، e69853 (2013).

جاين ، إس. ، أمبير توليوس ، ت.د.بصمة مجمعات البروتين والحمض النووي باستخدام جذور الهيدروكسيل. نات. بروتوك. 3, 1092–1100 (2008).

Armeev، G.A، Gorkovets، T.K، Efimova، D.A، Shaitan، K.V & amp Shaytan، A. K. جامعة موسكو. بيول. علوم. ثور. 71, 29–33 (2016).

Balasubramanian ، B. ، Pogozelski ، W.K & amp Tullius ، T. D. خيط الحمض النووي الذي ينكسر بواسطة جذور الهيدروكسيل تحكمه المساحات السطحية المتاحة لذرات الهيدروجين في العمود الفقري للحمض النووي. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 95, 9738–9743 (1998).

شادل ، إس إي وآخرون. التحليل الكمي لبيانات الرحلان الكهربائي: منهجية جديدة لتركيب المنحنى وتطبيقها لتحديد ثابت ربط البروتين والحمض النووي. الدقة الأحماض النووية. 25, 850–860 (1997).

Das، R.، Laederach، A.، Pearlman، S.M، Herschlag، D. & amp Altman، R.B SAFA: برنامج تحليل البصمة شبه الآلي للتقدير الكمي عالي الإنتاجية لتجارب بصمة الحمض النووي. RNA 11, 344–354 (2005).

بيشوب ، إي بي وآخرون. خريطة لشكل الأخدود الطفيف والجهد الكهروستاتيكي من أنماط انشقاق جذور الهيدروكسيل في الحمض النووي. ACS كيم. بيول. 6, 1314–1320 (2011).

Shaytan ، A. K. وآخرون. تحدد البصمة الجذرية للهيدروكسيل جنبًا إلى جنب مع النمذجة الجزيئية السمات الفريدة لتشكل الحمض النووي وتحديد المواقع النووية. الدقة الأحماض النووية. 45, 9229–9243 (2017).

شياو ، هـ وآخرون. الأساس الجزيئي لارتباط CENP-C مع نوكليوسوم CENP-A في مراكز الخميرة. تطوير الجينات. 31, 1958–1972 (2017).

Schneider، C. A.، Rasband، W. S. & amp Eliceiri، K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. نات. أساليب 9, 671–675 (2012).

Mitternacht، S. FreeSASA: مكتبة C مفتوحة المصدر لحسابات مساحة السطح التي يمكن الوصول إليها بالمذيبات. F1000 5, 189 (2016).

Ingle، S.، Azad، R.N، Jain، S. S. & amp Tullius، T.D. الدقة الأحماض النووية. 42, 12758–12767 (2014).

Costa، ​​M. & amp Monachello، D. فحص الحمض النووي الريبي باستخدام بصمة جذور الهيدروكسيل. طرق مول. بيول. 1086, 119–142 (2014).

Hampel ، K.J & amp Burke ، J.M. أساليب 23, 233–239 (2001).

Nilsen ، T.W. رسم خرائط تفاعلات بروتين RNA باستخدام بصمة جذور الهيدروكسيل. كولد سبرينج حرب. بروتوك. 2014, 1333–1336 (2014).

دينغ ، إف ، لافندر ، سي إيه ، ويكس ، كي إم أند دوكوليان ، إن في صقل بنية الحمض النووي الريبي ثلاثي الأبعاد بواسطة فحص جذري الهيدروكسيل. نات. أساليب 9, 603–608 (2012).

هيكل Tian، S. & amp Das، R. RNA من خلال رسم خرائط كيميائية متعددة الأبعاد. س: القس بيوفيس. 49، e7 (2016).

Begusova، M.، Spotheim-Maurizot، M.، Sy، D.، Michalik، V. & amp Charlier، M. RADACK ، محاكاة عشوائية لهجوم جذري الهيدروكسيل على الحمض النووي. J. بيومول. هيكل. دين. 19, 141–158 (2001).

لينكرت ، إم وآخرون. البيانات الوصفية مهمة: الوصول إلى بيانات الصورة في العالم الحقيقي. J. خلية بيول. 189, 777–782 (2010).

Takamoto ، K. ، Chance ، M. R. & amp Brenowitz ، M. تحليل تركيب الذروة شبه الآلي أحادي النطاق لمخططات الأشعة الذاتي لبصمة الحمض النووي لجذور الهيدروكسيل من أجل التحليل الكمي للتحولات. الدقة الأحماض النووية. 32، E119 (2004).

Word، J.M، Lovell، S.C، Richardson، J.S & amp Richardson، D.C Asparagine and glutamine: استخدام ملامسات ذرة الهيدروجين في اختيار اتجاه سلسلة أميد الجانبية. جيه مول. بيول. 285, 1735–1747 (1999).

القضية ، د. أ. وآخرون. العنبر 2017 (جامعة كاليفورنيا ، سان فرانسيسكو ، سان فرانسيسكو ، كاليفورنيا ، 2017).

Lee، B. & amp Richards، F.M. تفسير هياكل البروتين: تقدير إمكانية الوصول الثابت. جيه مول. بيول. 55, 379–400 (1971).

Best ، R.B et al. تحسين مجال قوة البروتين CHARMM الشامل لجميع الذرات التي تستهدف تحسين أخذ العينات من العمود الفقري phi و psi و chi (1) و chi (2) زوايا ثنائية السطوح. J. كيم. نظرية الحساب. 8, 3257–3273 (2012).

هنتر ، جي دي ماتبلوتليب: بيئة رسومات ثنائية الأبعاد. حاسوب. علوم. م. 9, 90–95 (2007).

سلاتر ، G.W. ، Desruisseaux ، C. & amp Hubert ، S. J. آليات فصل الحمض النووي أثناء الرحلان الكهربائي. في الرحلان الكهربائي للأحماض النووية: المجلد الأول: مقدمة في الرحلان الكهربائي للأحماض النووية (محرران. Keith، R.M & amp Jing، C.) 27-41 (Humana Press، Totowa، NJ، 2001).

Maxam، A. M. & amp Gilbert، W. طريقة جديدة لتسلسل الحمض النووي. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 74, 560–564 (1977).

Brahmasandra ، S. N. ، Burke ، D. T. ، Mastrangelo ، C.H & amp Burns ، M.A التنقل ، الانتشار والتشتت للحمض النووي أحادي الخيط في تسلسل المواد الهلامية. الكهربائي 22, 1046–1062 (2001).

Maramis، C.F & amp Delopoulos، A.N. المؤتمر المتوسطي الثاني عشر للهندسة الطبية والبيولوجية والحوسبة 2010: 27-30 مايو 2010 خالكيديكي ، اليونان (محرران. Panagiotis، D.B & amp Nicolas، P.) 671–674 (Springer، Berlin، 2010).

Greenbaum ، J. A. ، Pang ، B. & amp Tullius ، T. D. إنشاء خريطة هيكلية على نطاق الجينوم بدقة النوكليوتيدات المفردة. الدقة الجينوم. 17, 947–953 (2007).

بيرج ، جي إم الملحق: الأشكال السطحية لورنتزيان متأصلة في الكشف عن التصوير الشعاعي التلقائي. الدقة الأحماض النووية. 25, 850–860 (1997).

Spotheim-Maurizot، M. & amp Davidkova، M. الأضرار الإشعاعية التي تلحق بالحمض النووي الريبي في مجمعات بروتين الحمض النووي. موتات. الدقة. 711, 41–48 (2011).

موروزوف ، إيه في وآخرون. استخدام ميكانيكا الحمض النووي للتنبؤ بمواقع الجسيمات النووية وطاقات التكوين في المختبر. الدقة الأحماض النووية. 37, 4707–4722 (2009).

Cloutier ، T. E. & amp Widom ، J. مرونة التواء الحمض النووي وتشكيل مجمعات البروتين والحمض النووي الحلقية بشكل حاد. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 102, 3645–3650 (2005).

Sali، A. & amp Blundell، T.L. نمذجة البروتين المقارنة من خلال تلبية القيود المكانية. جيه مول. بيول. 234, 779–815 (1993).

Lu، X.J & amp Olson، W.K. 3DNA: نظام برمجيات متعدد الاستخدامات ومتكامل لتحليل وإعادة بناء وتصور هياكل الأحماض النووية ثلاثية الأبعاد. نات. بروتوك. 3, 1213–1227 (2008).

درايزن ، إي جيه وآخرون. HistoneDB 2.0: قاعدة بيانات هيستون مع المتغيرات - مورد متكامل لاستكشاف الهستونات ومتغيراتها. قاعدة البيانات 2016، baw014 (2016).

همفري ، دبليو ، دالك ، إيه آند شولتن ، كيه في إم دي: الديناميات الجزيئية المرئية. جيه مول. رسم بياني. 14, 33–38 (1996).

Lowary ، P. T. & amp Widom ، J. قواعد تسلسل الحمض النووي الجديدة لارتباط التقارب العالي مع هيستون octamer وتحديد المواقع النووية الموجهة بالتسلسل. جيه مول. بيول. 276, 19–42 (1998).

ريتشكوف ، ج.ن.وآخرون. الهياكل النووية المجمعة جزئيًا عند التفاصيل الذرية. بيوفيز. ج. 112, 460–472 (2017).

Eslami-Mossallam، B.، Schiessel، H. & amp van Noort، J. Nucleosome dynamics: التسلسل مهم. حال. علوم واجهة الغروانية. 232, 101–113 (2016).

Kappen، L. S. & amp Goldberg، I. H. تلف حمض ديوكسي ريبونوكلييك بواسطة كروموفور نيوكارزينوستاتين: فواصل حبلا ناتجة عن أكسدة انتقائية لـ C-5ʹ من deoxyribose. الكيمياء الحيوية 22, 4872–4878 (1983).


طرق الكشف عن تفاعلات البروتين والحمض النووي

يمكن استخدام طريقة الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) لمراقبة تنظيم النسخ من خلال تعديل هيستون (علم التخلق) أو تفاعلات ارتباط عامل النسخ والحمض النووي. تسمح طريقة اختبار ChIP بتحليل تفاعلات الحمض النووي والبروتين في الخلايا الحية عن طريق معالجة الخلايا بالفورمالديهايد أو الكواشف المتشابكة الأخرى من أجل تثبيت التفاعلات من أجل التنقية والكشف عن المصب. يتطلب إجراء فحوصات ChIP معرفة البروتين المستهدف وتسلسل الحمض النووي الذي سيتم تحليله ، حيث يجب على الباحثين توفير الجسم المضاد ضد البروتين محل الاهتمام وبادئات PCR لتسلسل الحمض النووي محل الاهتمام. يتم استخدام الجسم المضاد لترسيب مركب البروتين - DNA بشكل انتقائي من شظايا DNA الجينومية الأخرى ومجمعات البروتين - DNA. تسمح البادئات PCR بتضخيم محدد واكتشاف تسلسل الحمض النووي المستهدف. تسمح تقنية PCR الكمية (qPCR) بتحديد كمية تسلسل الحمض النووي المستهدف. يعتبر اختبار ChIP قابلاً للتنسيقات القائمة على الصفيف (ChIP-on-chip) أو التسلسل المباشر للحمض النووي الذي تم التقاطه بواسطة البروتين المناعي (ChIP-seq).

  • التقاط لقطة لبروتين معين - DNA
    التفاعلات كما تحدث في الخلايا الحية
  • الكمي عندما يقترن بتحليل qPCR
  • القدرة على تشكيل محفز للبروتينات المختلفة
  • يحتاج الباحث إلى مصدر أجسام مضادة من فئة ChIP
  • يتطلب تصميم بادئات محددة
  • يصعب تكييفها للفحص عالي الإنتاجية

دليل خطوة بخطوة لفحوصات الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) الناجحة

تتضمن هذه النظرة العامة المحدثة لإجراء ChIP تفاصيل إضافية حول اختيار الأجسام المضادة الأولية (على سبيل المثال ، الأجسام المضادة التي تم التحقق من صحتها بواسطة ChIP). تصف مذكرة التطبيق أيضًا وتقدم أمثلة على الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) كأسلوب لدراسة علم التخلق ، حيث تتيح للباحثين التقاط لقطة لتفاعلات معينة بين البروتين والحمض النووي.

يوفر كتيبنا الفني للتفاعل البروتيني المكون من 72 صفحة بروتوكولات ومعلومات تقنية ومعلومات عن المنتج للمساعدة في تحقيق أقصى قدر من النتائج لدراسات تفاعل البروتين. يوفر الكتيب معلومات أساسية وتلميحات مفيدة ونصائح حول استكشاف الأخطاء وإصلاحها لمقايسات الترسيب المناعي ومقايسات الترسيب المناعي المشترك ، والمقايسات المنسدلة ، والنشاف والتشابك في أقصى الغرب. يحتوي الكتيب أيضًا على قسم موسع حول طرق دراسة تفاعلات البروتين والحمض النووي ، بما في ذلك ChIP و EMSA و RNA EMSA. يعتبر الكتيب مصدرًا أساسيًا لأي مختبر يدرس تفاعلات البروتين.

تتضمن المحتويات: مقدمة في تفاعلات البروتين ، مقايسات الترسيب المناعي المشترك ، المقايسات المنسدلة ، النشاف الغربي الأقصى ، رسم خرائط تفاعل البروتين ، مقايسات مراسلة الخميرة ثنائية الهجين ، فحوصات تحول الحركة الكهربية [EMSA] ، فحوصات الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) ، البروتين - يقارن الحمض النووي ، وأكثر من ذلك.

يتعلم أكثر

حدد المنتجات

يتم استخدام مقايسة تحول الحركة الكهربية للحمض النووي (EMSA) لدراسة البروتينات المرتبطة بتحقيقات أليغنوكليوتيد الحمض النووي المعروفة ويمكن استخدامها لتقييم درجة التقارب أو خصوصية التفاعل. تعتمد هذه التقنية على ملاحظة مفادها أن معقدات البروتين والحمض النووي تهاجر بشكل أبطأ من جزيئات الدنا الحرة عند تعريضها إلى بولي أكريلاميد غير مسبب للتحول أو الرحلان الكهربي لهلام الاغاروز. نظرًا لأن معدل هجرة الحمض النووي يتحول أو يتأخر عند ارتباط البروتين ، يُشار أيضًا إلى الفحص على أنه تحول هلام أو مقايسة تأخر الهلام. تؤدي إضافة جسم مضاد خاص بالبروتين إلى مكونات الارتباط إلى إنشاء معقد أكبر (جسم مضاد - بروتين - دنا) ، والذي ينتقل بشكل أبطأ أثناء الرحلان الكهربي. يُعرف هذا باسم "التحول الفائق" ، ويمكن استخدامه لتأكيد هويات البروتين. حتى ظهور EMSA ، تمت دراسة تفاعلات البروتين والحمض النووي بشكل أساسي عن طريق مقايسات ربط مرشح النيتروسليلوز باستخدام مجسات ذات علامات إشعاعية.

  • الكشف عن بروتينات ربط الحمض النووي منخفضة الوفرة من المحللات
  • اختبار طفرات موقع الربط باستخدام العديد من تكوينات المسبار مع نفس المحللة
  • اختبار تقارب ملزمة من خلال تحليل طفرات مسبار الحمض النووي
  • إمسا غير المشعة ممكن باستخدام تحقيقات الحمض النووي المسمى بيوتينيلات أو الفلورسنت
  • تحليل تفاعلات البروتين والحمض النووي في المختبر
  • يصعب قياسها
  • تحتاج إلى إجراء اختبار الانزياح الفائق مع الجسم المضاد للتأكد من هوية البروتين في المجمع

تقليديا ، تم تمييز مجسات الحمض النووي إشعاعيًا بـ ³²P من خلال دمج [γ-³²P] dNTP خلال تفاعل 3 'ملء باستخدام جزء Klenow أو بعلامة 5' باستخدام [γ-³²P] ATP و T4 polynucleotide kinase. بعد الرحلان الكهربائي ، يتعرض الجل لفيلم الأشعة السينية لتوثيق النتائج. مجموعة EMSA Thermo Scientific LightShift Chemiluminescent EMSA عبارة عن اختبار غير مشع يوفر أداءً قويًا وحساسًا. تشتمل المجموعة على كواشف لإعداد وتخصيص تفاعلات ربط الحمض النووي ، ومجموعة تحكم من الحمض النووي ومستخلص البروتين لاختبار نظام المجموعة ، واستقرار الستربتافيدين- HRP المتقارن للتحقق من هدف الحمض النووي المرتبط بالبيوتين ، ووحدة ركيزة مضيئة كيميائيًا بشكل استثنائي للكشف.

إنزيم EMSA الكيميائي الإشعاعي المكون من أربعة مجمعات مختلفة من الحمض النووي والبروتين. تراوحت أحجام الدوبلكس المستهدفة التي تحمل علامة البيوتين من 21 إلى 25 زوجًا قاعديًا. تم اشتقاق عوامل النسخ Oct-1 و AP1 و NF-B من مستخلص هيلا النووي. يتم توفير مستخلص EBNA-1 كعنصر تحكم في LightShift Chemiluminescent EMSA Kit. كانت سلاسل المنافسين المحددة غير المصنفة (عند استخدامها) موجودة عند زيادة 200 ضعف عن الهدف المحدد. تراوحت أوقات التعرض لأفلام الأشعة السينية لكل نظام من دقيقتين لـ EBNA و Oct-1 و AP1 و 5 دقائق لـ NF-B.


البشر القدامى ، الحيل الجديدة

عندما استعاد الباحثون الحمض النووي لأول مرة من عظام إنسان نياندرتال ، كانت التقنيات المتاحة لفهمه قوية ولكنها بسيطة نسبيًا. قارن العلماء التسلسلات القديمة والحديثة ، وحصروا المواقع المشتركة والطفرات ، وأجروا تحليلات إحصائية مجمعة. هذه هي الطريقة التي اكتشفوا بها في عام 2010 أن الحمض النووي لإنسان نياندرتال يشكل ما يقرب من 2٪ من جينوم الأشخاص اليوم من أصل غير أفريقي ، نتيجة التزاوج الذي حدث في جميع أنحاء أوراسيا منذ 50000-60.000 سنة مضت. وبهذه الطريقة أيضًا اكتشفوا أن الحمض النووي للدينيسوفان يشكل ما يقرب من 3٪ من جينوم الأشخاص في بابوا غينيا الجديدة وأستراليا.

قال جون هوكس ، عالم الأنثروبولوجيا بجامعة ويسكونسن ، ماديسون: "لكن هذا النوع من النهج البسيط جدًا ليس جيدًا جدًا في فرز التعقيد" لكيفية تفاعل هؤلاء السكان المفقودين. كما أنه لا يسمح للباحثين باختبار فرضيات محددة حول كيفية حدوث ذلك التهجين.

يمكن لعلماء الوراثة السكانية التراجع من خلال بيانات الحمض النووي لتحديد أسلاف مشتركين منذ مئات الآلاف من السنين ، ويمكنهم اكتشاف الحوادث الأخيرة لتدفق الجينات من عشرات الآلاف من السنين الماضية. قال هوكس إن التمييز بين التهجين الذي حدث بين تلك الفترات ، من الأحداث "القديمة بما يكفي حتى لا تكون حديثة ولكن صغيرة بما يكفي حتى لا تكون قديمة" ، "هذا في الواقع يتطلب خدعة إضافية." ذلك لأن الأحداث الأخيرة تلطخ آثار أقدامها على الأحداث الأقدم ، فإن تسلسلات الحمض النووي التي خلفتها تلك الأحداث القديمة مجزأة للغاية ومتحورة بحيث يصعب التعرف عليها ، بل ويصعب تمييزها بالتاريخ والموقع.

قرر آدم سيبل ، عالم الأحياء الكمية في مختبر كولد سبرينغ هاربور في نيويورك ، وزملاؤه التركيز على مثل هذه الفجوات في السرد. كانوا مهتمين بشكل خاص بالبحث عن علامات تدفق الجينات من الإنسان الحديث إلى إنسان نياندرتال. من الصعب دراسة هذا التدفق للمعلومات الجينية مقارنة بالعكس ، ليس فقط بسبب المدة التي حدثت فيها ، ولكن أيضًا بسبب وجود عدد أقل من الجينومات التي يمكن الرجوع إليها: فكر في جميع الجينومات الموجودة حاليًا تحت تصرف الباحثين ، مقابل حفنة من جينومات الإنسان البدائي تركت سليمة ، أو الجينوم الوحيد الذي تم استرداده من بقايا دينيسوفان. دفع التحدي مرة أخرى إلى الحاجة إلى أساليب جديدة.

باستخدام إحدى هذه التقنيات الجديدة ، أولاً في عام 2016 ثم مرة أخرى في نسخة أولية نُشرت في وقت سابق من هذا الصيف ، وجد سيبل وفريقه أن حوالي 3٪ من الحمض النووي لإنسان نياندرتال - وربما ما يصل إلى 6٪ - جاء من البشر المعاصرين الذين تزاوجوا مع إنسان نياندرتال. منذ أكثر من 200000 سنة. نفس المجموعة التي أدت إلى ظهور الإنسان الحديث في جميع أنحاء العالم قد زودت إنسان نياندرتال (على الأقل قليلاً) بالحمض النووي أكثر مما أعطاهم إنسان نياندرتال لاحقًا. قال سيبل: "تعتقد أنك تنظر فقط إلى إنسان نياندرتال ، لكنك في الواقع تنظر إلى مزيج من الإنسان البدائي والإنسان الحديث."

قال هوكس "هذا رائع". وأضاف أن هذا المستوى العالي من الاختلاط الجيني يشبه القول إن 6٪ من السيارات على الطريق التي تراها حمراء ، لكنك بطريقة ما لم تلاحظ أبدًا أي سيارات حمراء. يجب أن تلاحظ ذلك ". ومع ذلك ، فإن الأساليب في الاستخدام العام لم تفعل ذلك. بالنسبة إلى هوكس ، يشير هذا الإغفال إلى أنه قد يكون هناك الكثير من المواد الجينية المشتركة التي لا يزال يتعين العثور عليها حتى لو لم يكن من الممكن قياسها بدقة. قد تغير التقنيات الأكثر تقدمًا ذلك.


البدائل الحديثة لبصمة الحمض النووي - علم الأحياء

مقايسة البصمة DNase I هو في المختبر طريقة لتحديد الموقع المحدد لبروتينات ربط الحمض النووي. فهو لا يعثر فقط على البروتين المستهدف الذي يرتبط بحمض نووي معين ، بل يحدد أيضًا التسلسل المرتبط بالبروتين المستهدف. يمكن استخدام هذه التقنية لدراسة التفاعلات بين البروتينات والحمض النووي خارج الخلايا وداخلها.

يرتبط البروتين بجزء الحمض النووي ، مما يحمي موقع الارتباط من الانقسام بواسطة DNase I. تُترك أجزاء من جزيء الحمض النووي بعد الانقسام (المعروف أيضًا باسم & quotfootprinting & quot ، وبالتالي يمكن تحديد تسلسله. هلام الرحلان الكهربائي ، لا يوجد شريط لاصق إشعاعي يتوافق مع موقع ارتباط البروتين.فحوصات البصمة محددة ودقيقة وتستخدم على نطاق واسع

تمت دراسة تنظيم النسخ على نطاق واسع ، ولكن لا يزال هناك الكثير مما هو غير معروف. تعتبر عوامل النسخ والبروتينات ذات الصلة التي تدفع أو تمنع النسخ بالاقتران مع المحفزات أو المعززات أو كاتمات الصوت ضرورية لفهم التنظيم الفريد للجينات الفردية داخل الجينوم. تساعد تقنيات مثل بصمة DNase I في توضيح البروتينات التي ترتبط بهذه المناطق ذات الصلة من الحمض النووي وتكشف عن تعقيدات التحكم في النسخ.

تطبيقات متقدمة

في الجسم الحي يمكن استخدام البصمة جنبًا إلى جنب مع الترسيب المناعي لتقييم خصوصية البروتين في العديد من المواضع في جميع أنحاء الجينوم. يمكن أن يكون ارتباط الحمض النووي بالبروتين محل الاهتمام مناعيًا باستخدام جسم مضاد للبروتين ، ومن ثم يمكن تقييم ارتباط منطقة معينة باستخدام تقنية بصمة الحمض النووي.

2. البصمة الكمية

يمكن تعديل تقنية البصمة DNA لتقييم قوة ارتباط البروتين بمنطقة الحمض النووي. باستخدام تركيزات مختلفة من البروتين لتجربة البصمة ، يمكن ملاحظة ظهور البصمة مع زيادة التركيزات ويمكن بعد ذلك تقدير تقارب ارتباط البروتينات.

3. الكشف عن طريق الرحلان الكهربائي الشعري

لتكييف تقنية البصمة مع طرق الكشف الأحدث ، يتم الكشف عن شظايا الحمض النووي المسمى بواسطة جهاز الرحلان الكهربائي الشعري بدلاً من تشغيلها على هلام بولي أكريلاميد. إذا تم إنشاء جزء الحمض النووي المراد تحليله عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) ، فإن جزيء الفلورسنت مثل carboxyfluorescein (FAM) يقترن مباشرة بالبادئات. بهذه الطريقة ، ستحتوي الأجزاء التي ينتجها DNase I الهضم على FAM ، ويمكن اكتشافها بواسطة آلة التفريد الكهربي.

المواد والكواشف التالية ، بالإضافة إلى الإجراءات المتاحة لبصمة DNase I المكتشفة بواسطة الرحلان الكهربي للهلام البولي أكريلاميد (PAGE).


الأسئلة المقدمة وإجاباتنا

1. بالنظر إلى ملياري دولار أمريكي (المبلغ التقديري لتكلفة برنامج شامل للتشفير الشريطي للحمض النووي [ويتفيلد ، 2003]) ، كيف ستنفق هذه الأموال للاستفادة من أبحاث التصنيف والتنوع البيولوجي ، وما هو إرث هذه البيانات؟

سنستخدمها في التعليم وبناء القدرات ، مع رؤية حقيقية للمستقبل! بكل بساطة ، ينطبق التشبيه البالي للصبي والسمكة هنا - أعط الصبي سمكة ، فهو يأكل ليوم واحد. علم الصبي الصيد ويأكل مدى الحياة. من الواضح أن لدينا القدرة على تحقيق مكاسب ضخمة إذا أردنا الاستثمار في خيار القيمة الخاص بالتصنيف وتطوير فهم معقد للعالم الطبيعي. يعد الفهم الأساسي للأنواع والأصناف الأعلى أمرًا أساسيًا في علم الأحياء ولا يزال مثيرًا للجدل لدرجة أنه سيكون من الغطرسة والحماقة عدم الاستثمار في الموارد البشرية اللازمة لاكتشاف التنوع البيولوجي وتعداده وفهمه ، وهو الأهم.

نظرًا للتاريخ الطويل للتصنيف في العديد من بلدان هولاركتيك ، فإن المجهود الكبير والعمل التصنيفي الأكثر ثراءً ، إلى جانب مجموعة واسعة من بيانات تاريخ الحياة ، قام به خبراء التصنيف الذين يعيشون داخل هذه البلدان وعلى حيواناتهم. تقع أهم مناطق التنوع البيولوجي وأسوأ جهل لنا بهذا التنوع في أجزاء أخرى من العالم. قد يأتي التأثير الأكبر على المدى الطويل لهذه الأموال المتخيلة من إنشاء فرص التدريب والمناصب للباحثين والطلاب في أجزاء من العالم ذات أكبر تنوع بيولوجي يمكن اكتشافه. يعرف كل واحد منا مرشدين أنتجوا كادرًا من الطلاب الذين كان لهم تأثيرًا هائلاً على التصنيف والنظاميات وعلم الأحياء. إنشاء برامج على أساس نماذج مثل PEET (www.nhm.ku.edu/peet/) ، LINNE (Page et al. ، 2005) (www.flmnh.ufl.edu/linne/default.htm) ، و ATOL (www .nsf.gov) في جميع أنحاء العالم ، ودعم وظائف البحث التصنيفي في الجامعات والمتاحف سيكون له تأثير منتشر في مستقبل البحث البيولوجي.

تقدم ورش العمل الجارية التي ترعاها NSF لـ LINNE (شبكة البنية التحتية القديمة للبيئات الطبيعية) بنية تحتية إلكترونية ذات رؤية للتصنيف "الوصفي" القائم على المجموعات والذي من شأنه أن يقلل أو يزيل العديد من العقبات التي تعترض النمو السريع للمعرفة التصنيفية. هذا النهج مدفوع بالتصنيف كعلم وسيولد بسرعة نوع المعرفة السليمة اللازمة لفهم تنوع الحياة على مستوى الأنواع وفوقه. يضع هذا البحث الأساس العلمي المناسب الذي يجب أن تُبنى عليه أدوات تحديد الحمض النووي. 2 مليار دولار من شأنه أن يمول بسهولة LINNE وجيشًا حقيقيًا من علماء التصنيف الذين يمكنهم اكتشاف الأنواع ووصفها ، وتوسيع متاحف التاريخ الطبيعي والمعشبات لتعكس العالم الحي ، وتوضيح الأنماط الرائعة للبيولوجيا التي تستحق دراستنا المستقبلية التفصيلية. لا تتحقق أي من هذه الفوائد من تمرين كبير على التشفير الشريطي. إن الاستفادة من التقدم النظري في علم اللاهوت النظامي إلى جانب البنية التحتية الإلكترونية هو نهج متفوق للغاية ويمهد الطريق لعلامات الحمض النووي والمورفولوجية المفيدة حقًا لتحديد الأنواع.

مع وجود ملياري دولار ، لن يؤدي استخدام تشفير الحمض النووي الشريطي أو الجهود الممولة بقوة لمعالجة التنوع البيولوجي باستخدام نهج تكاملي إلى تحقيق نجاح بنسبة 100٪ بأي مقياس معقول. والسؤال إذن ما هو المكتسب للاستثمار. مما لا شك فيه أن المزيد من "العناصر" ، بالمعنى النمطي ، يمكن تعدادها من خلال التركيز على قطعة صغيرة من الحمض النووي ، ولكن هذا سيترك بالضرورة تفاصيل ما هو ذي معنى جانبًا. ومع ذلك ، حتى إذا تم تعداد عدد أقل من العناصر مقابل كل دولار من خلال نهج تكاملي ، فستكون هذه وحدات مهمة تطوريًا ، ويكون المنتج النهائي علميًا له تأثيرات بعيدة المدى.

2. على الصعيد العالمي ، يمر بحث تصنيف ألفا (اكتشاف أنواع جديدة ووصفها) في أزمة. هل يعد تشفير الحمض النووي الشريطي حلاً مناسبًا لهذه المشكلة أم أنه سيعجل من تدهورها؟

لا يعد ترميز الحمض النووي الشريطي حلاً أو فجوة أو استبدالًا أو بديلًا للقيام بعلم منهجي. بغض النظر عن نظام الأحرف ، لا ينبغي ممارسة تصنيف ألفا في فراغ فكري. سيكون وصف التصنيف المستند إلى أي نظام أحادي الحرف ، سواء كان مورفولوجيًا فقط أو جينًا واحدًا ، ناقصًا بدون سياق مناسب. ومع ذلك ، على عكس الترميز الشريطي للحمض النووي ، والذي يعد انعكاسًا للظواهر والتصنيفات ، حتى الوصف الصرفي المتواضع يوفر على الفور روابط محتملة لتاريخ الحياة والسلوك والحالة التصنيفية. في أحسن الأحوال ، يوفر الترميز الشريطي للحمض النووي ، بدون التصنيف التكاملي الأساسي ، مستوى معينًا فقط من الاختلاف الظاهري لقطعة صغيرة من الحمض النووي التي قد تتوافق مع الأصناف المسماة عند قطع تعسفي (من المحتمل أن يكون ذلك مع معدل خطأ مرتفع بشكل غير مقبول).

إن بدء جهود ترميز الحمض النووي الشريطي على نطاق عالمي من شأنه أن يخلق طلبًا مبكرًا ضروريًا لعمل تصنيف ألفا كخدمة لصناعة الترميز الشريطي. سيكون هناك أيضًا طلب أولي من خبراء التصنيف الحقيقيين الذين يطلبون خدمات الترميز الشريطي للمجموعات المنقحة التي يرغبون في اختبارها أو تطوير أدوات تحديد الهوية. في نهاية المطاف ، سيتم الانتهاء من المجموعات والمجموعات السهلة ذات الاهتمامات الحالية (الاقتصادية أو العلمية) ومع ذلك ستبقى ملايين العينات للعناصر المجهولة وغير الموصوفة التي قد تكون أو لا تكون أصنافًا صالحة.

على عكس مشروع الجينوم البشري (www.genome.gov) ، مع وجود مجموعة جاهزة من المستخدمين والتمويل في انتظار العمل على المنتج الفوري ، يفتقر الترميز الشريطي للحمض النووي إلى موجة فعلية أو محتملة من خبراء التصنيف وأي رؤية للتمويل الكافي لمطابقة حجم تلك البيانات. However, there are many biologists outside of systematics that feel their studies are stymied without taxonomic revisions. These ecologists, behaviorists, conservation biologists, etc., will, without a doubt, move ahead with items identified by DNA barcoding. They will accept the level of noncorrespondence of these units to taxa and instead of taxa will use so-called “gene-species” or “molecular operational taxonomic units” (MOTUs) ( Blaxer, 2004), generating a false sense of security that nature has been successfully described. This will be similar to the confusion generated when “morphospecies” have been used as surrogates in ecological and biodiversity studies. However, because of an unjustified and poorly articulated trust in DNA characters over other character systems, and the apparent ease of barcoding methods, gene-species have the potential to be much more pervasive and damaging to integrative taxonomy, including the alpha level step.

3. Overlapping character variation between and within species is well documented for many character systems. Why is this any more or less of a problem for DNA barcoding?

This isn't a particular problem for DNA barcoding it is truly a problem for all character systems. The difference is that integrative taxonomy is able to overcome overlapping character variation in a particular character system by bringing to bear evidence from many other character systems. DNA barcoding is stuck with its single, simple character set. DNA barcoding has no way to overcome this common phenomenon—unless of course it brings in other genes and morphological characters and becomes integrative taxonomy! This change indeed has been suggested by recent, moderate supporters of barcoding (e.g., Schander and Willassen, 2005 D. Schindel, Consortium for the Barcode of Life [CBOL], personal communication), but then the question becomes: why continue to promote a universal barcode and “DNA profiles” ( Hebert et al., 2003a) for species if in fact the intent is to refer to a multicharacter integrative approach? Despite some lip-service to moderation, the most obvious promotion is still the one-gene approach to identification. For example: “The method that will enable this advance is ‘DNA barcoding,’ an approach that employs a small fragment of DNA, a portion of a single gene, to provide a unique identifier—a ‘DNA barcode’—for each living species on Earth.” and “This website describes work related to the creation of a DNA-based identification system for animals-at-large based on the analysis of a single mitochondrial gene—cytochrome oxidase subunit I (cox1 = COI)” (www.barcodinglife.org).

Even a single morphological character in most cases is likely a summary of many genes and thousands of base pairs, filtered by eons of natural selection and canalized by the hierarchy that results from a history of common ancestry. Such a rich, highly predictive, broadly explanatory understanding of species, as given by evolutionary history, offer an imminently more interesting and powerful approach to taxonomy than the comparatively easy but relatively uninformative and phenetic barcoding alternative.

Only through the ignorance of arrogance could one fail to learn the lessons of several centuries of comparative morphology. Single-character systems rarely work for even one truly diverse clade and never work for all clades. It is this remarkable diversification of life that makes taxonomy, natural history, and phylogenetics subjects of enduring interest. There is no need for a thinking community to expend great sums of money to reinvent this wheel: different, multiple genes will be needed to have reliable identifications of different clades and these should be developed logically in the context of a credible existing taxonomy.

4. Many taxonomists already practice DNA barcoding informally when delimiting and discovering species. Is this wrong, and what data is sufficient to demonstrate that a series of specimens represents a new species with traditional or barcoding methods?

In many cases the term DNA barcoding is being applied as a neologism captured but not coined by marketing-savvy biologists for well-established methods of investigating species-level boundaries ( Hebert et al., 2004). The means used by modern taxonomists to delimit and discover species and the tools provided for identification does include the use of DNA data. However, this is best done in the right order and measure. The idea that has been promoted that DNA barcoding should be the first and principal step in delimiting and discovering biologically important units in nature is fraught with problems. Chief among these is the mistaken idea that differences in a single-character system will identify species across all or nearly all life. Such a notion is a throw back to ancient typological thinking that over the last few hundred years has been shown repeatedly to be faulty. This, coupled with the phenetic view of currently implemented DNA barcoding methods, makes using DNA barcoding as a primary step is a costly attempt to preserve the worst aspects of traditional taxonomy! Integrative taxonomy, however, can and does use DNA data, and all types of data, to delimit, discover and identify meaningful, natural species and taxa at all levels. Thus the debate over barcoding is ليس DNA versus morphology, but rather single-character system, e.g., single gene, systematics versus integrative, multiple-character systematics.

All methods of species “discovery” depend heavily on the underlying species concept of the investigator and the data available to him or her. Even among the three of us there is little consensus as to the best species concept, or even the importance of species as a taxonomic rank, a situation that mirrors the broader biological community ( Wheeler and Meier 2000 Wilson 1999). What we are unified on is that DNA barcoding methods, as presently devised as a first or only step, are very likely to fail to recover phylogenetically and biologically meaningful units and will mask error by presenting an artificially simple view of the world, dressed in ostensibly innovative technology. Its deficiencies are apparent to anyone practicing integrative taxonomy.

5. The proposed barcoding genes can fail to recover accurate species trees. Does this matter for DNA barcoding?

Despite obvious failure in the early works on DNA barcoding, the “correct” identification of a specimen to its higher-level taxon was proposed as one of the major selling points ( Hebert et al., 2003a:318, 2003b:S98). However, Hebert in this debate now tells us that DNA barcoding is only intended to address the leaves of the tree. This moving target approach is not surprising and perhaps even commendable if it in fact represents a response to criticism and obvious methodological failings.

However, this still presumes that the higher-level taxonomy is done, or no name will be available for a sequence semaphorant. It also presumes that species are not themselves a phylogenetic hypothesis, a highly debatable position at best.

Attempts to avoid the problems of higher taxa also ignore the fact that mtDNA characters are hierarchically arranged when using neighbor-joining or other tree-building methods. There is no reason to assume that we can identify what a species-level group of individuals versus a separate genus is with DNA barcoding without a preexisting taxonomy and systematic revision. An arbitrary percent-difference cutoff could be applied, but this not justifiable given our understanding of evolution. Shifting away from applying barcodes to higher taxa does not save this program. Methodologically, barcoding results in a hierarchy down to the individual sequence semaphorant level and therefore does not allow for a nonarbitrary, uniform means of taxon recognition without an existing taxonomy and a broad sampling of haplotypes.

6. Some species are not mitochondrially monophyletic, sharing polymorphisms with unrelated taxa. How will this affect identifications using a barcoding approach?

The problem lies with species concepts and methods of species recognition. If your species concept is primarily reliant on interbreeding and production of viable offspring and such data are available (i.e., the biological species concept Mayr, 2000), paraphyly of one-character system is meaningless. If you maintain one of the many other species concepts (e.g., various forms of the “phylogenetic” or “evolutionary” species concepts ( Wheeler and Meier, 2000 Wilson, 1999), the current DNA barcoding approach does not give you the information you need to decide whether a cluster, grade, or leaf is a species or not.

Many possible complications may arise given various haplotypes and shared ancestral polymorphisms in mtDNA. Even simple paraphyletic gene-trees are problematic ( Funk and Omland, 2003). Given a described sister pair of species each known to be composed of interbreeding individuals and samples of individuals from Species 1 = A, B, C Species 2 = D, E, F and an unidentified fragment that has been sequenced = X, one possible resulting NJ gene-tree is (D(E(F(X(A(B, C)))))) ( Fig. 1). In such a case the new sequence cannot provide an unambiguous identification. In this case X may be a member of Species 1, as it is sister to (A(B, C)) but could also be identified as Species 2 as it lies within the convex group ( Estabrook, 1986) D, E, F ( Fig. 1). DNA barcoding alone is helpless to resolve this.

Diagram showing potential problem of determining a species identification using the barcode protocol. The unknown sequence semaphorant is X, sequence semaphorants sampled from an interbreeding population considered to be Species 1 are D, E, and F, and similarly A, B, and C are from Species 2. The individual represented by X could be placed in Species 2 or with Species 1.

Diagram showing potential problem of determining a species identification using the barcode protocol. The unknown sequence semaphorant is X, sequence semaphorants sampled from an interbreeding population considered to be Species 1 are D, E, and F, and similarly A, B, and C are from Species 2. The individual represented by X could be placed in Species 2 or with Species 1.

If sampling is restricted to few individuals and species are likely to have a relatively ancient split from a common ancestor, and/or are the result of allopatric speciation, then one may expect constant and relatively large differences between species-level taxa. Published barcode studies have used these types of samples (e.g., Hebert et al., 2004 Hogg and Hebert, 2004). Very recent, close sister taxa and highly variable populations are yet to be sampled. Current sparse and selective samples probably indicate that the purported accuracy of the method is about as good as it will get. Denser samples can only increase the likelihood of failure as the amount of variation can only increase.

7. Should the completion of a DNA barcoding program ever occur, would this mark the beginning or end of taxonomic and biodiversity research, and what will be the role of systematists in a world where most identifications are done by “barcode”?

If a DNA barcoding system was “completed,” in any sense of the word, then this would have to be something very different than what is currently envisioned. It would require sets of different, suitable genes selected for different groups of plants, animals, and bacteria. If this is what people are aiming to do, then this is integrative taxonomy and the proposed economy of DNA barcoding is marginalized. As such, this would certainly be useful for identification purposes, especially in difficult cases where key morphological characters are missing. However, as we point out above (Question 3), there does not seem to be an ostensible consensus in the barcoding community to pursue integrative taxonomy.

Regardless, the role of systematists would continue to be what it is now, to discover and characterize taxa using all available data. Identification is one thing, a service that systematics supplies to its users, but discovery and delimiting taxa are very different. They are the core of the science of systematics, and barcoding cannot replace that.

There exists an underlying confusion between identification and classification. Although taxonomy is not experimental, it is unequivocally scientific. As such, taxonomy is never finished. Hypotheses about species and monophyly must be retested with discoveries of new characters, populations, or species. Barcodes for species hypotheses would have to be tested too and in some cases recalibrated to remain an accurate reflection of the best species hypotheses. That the DNA barcoding library could be completed as currently conceived reveals its stark contrast as a nonscience to the science of taxonomy.

8. Would the inevitable expansion of sequencing efforts that would come with a program of DNA barcoding be concomitant with a decline in the quality of taxonomic research?

There is confusion of DNA barcoding with molecular systematics in general. The use of DNA in systematics is an established tool. Expansion of sequencing efforts can only increase the quality of integrative taxonomic research. All current graduate student projects in systematics we know of, and we expect the large majority worldwide, are based on a rich mix of sequencing of a number of unlinked genes, along with morphological, ecological, and biogeographic studies, that rigorously test phylogenetic hypotheses of relationships. To return to an Aristotelian single-character approach is misguided in the extreme—it flies in the face of all the progress made during the development of phylogenetic systematics. DNA barcoding as a first and primary step, is against what we teach as good science in such quality programs as PEET.

9. Assuming the technical problems of DNA barcoding can be overcome, is it now, or will it ever be, cost-effective relative to traditional methods to use DNA barcodes for bioinventory purposes?

If the technical and methodological problems of DNA barcoding were overcome, then it would cease to be DNA barcoding as it is presently proposed. The only certain way to overcome the inherent problems is to do integrative taxonomy first. Once a solid taxonomy is established the most useful character data, be that cox1, other sequences, or morphology, can provide a means for identification.

If the intention is to use mtDNA alone to generate bioinventory data, then these data will be deficient and suffer from the numerous shortcomings that we have outlined above. We would be astonished if any credible scientists would accept the diversity of cox1 haplotypes sampled from an area as a valid or meaningful measure of biodiversity. Certainly agencies receiving reports from the biological community on which they will base conservation and land use decisions should demand more rigorous and established methods before making such important choices. However, it is possible that ignorance of the method and momentum of the hype could result in rash and irreversible mistakes that will impact significant elements of biodiversity.

10. Hypothesis-driven research is the foundation upon which most research agencies assign funding priorities, yet taxonomy is discovery driven. How would your approach to taxonomy convince these agencies of the merits of taxonomic studies?

Taxonomy need be no more discovery driven than chemistry or physics. Hypotheses are generated in all these fields by discovering interesting patterns in nature they are then tested using appropriate rules of inference. It is true that taxonomy was once largely discovery driven, though good taxonomy has always been and remains based on hypotheses. Historically some taxa lacked sufficient scientific rigor that, and a general misunderstanding of the scientific nature of taxonomy, nearly killed the field. But modern systematics is as meticulous and hypothesis-based as any science. In modern phylogenetic systematics, hypotheses of relationships are tested by adding new character systems one after another, using rigorous rules of inference. Oddly enough, rather than leading us forward in modern integrative taxonomy, the proponents of DNA-barcoding seem to be leading the field back to a “descriptive” age of systematics. In a more integrative approach a species level hypothesis is presented in the form of a well-written description, but even bad species descriptions are testable. In fact these can be rather quickly rejected and synonymized. Good ones hold up very well to hundreds of critical tests. A monograph or revision once or twice per century, however, does not provide the frequency of hypothesis testing necessary to keep those hypotheses relevant in light of all known species, populations, and characters. In the age of cyber-infrastructure, digital tools, and IT, most of the weights that have held taxonomy back are gone. Now that we have the tools to vastly accelerate good taxonomy, it is in danger of being tossed out like rubbish for the latest parlor trick.

One reason taxonomists are not more broadly funded to simply or primarily describe taxa is in part because we now recognize that doing “traditional taxonomy,” in the inaccurate caricatured sense in which it is so often portrayed, provides a deficient product. Our expectation is that taxonomy will provide not just the most expedient product, but a high-quality product. Our view is not that we are preserving traditional taxonomy, rather we envision the future of taxonomy as descriptive and hypothesis based. DNA barcoding as a first and primary step preserves only the worst aspects of “traditional taxonomy” in being both typological and phenetic. Governmental funding agencies will and have recognized its defective nature and we are certain that any proposal that has a disproportional and/or ill conceived use of “barcoding” will correctly fail to receive funding.

There has been a slow but growing realization in funding agencies that a strong integrative taxonomic base, with broad and deep phylogenetic studies and the coupling of intellectual merit and broader impacts to taxonomic studies, benefits all of biology. As the biological community realizes that taxonomy is providing a useful and high-quality product that is a mix of discovery and hypothesis driven research, funding will continue to grow. If there is an illusion that the job has been completed because everything has been “barcoded” or when users of taxonomic products find taxonomists are no longer conducting science, funding opportunities will be lost.


DNA Just One of More Than 1 Million Possible 'Genetic Molecules,' Scientists Find

Scientists used a computer program to uncover more than 1 million molecules that could potentially store genetic information, just like DNA.

الحمض النووي and its cousin RNA store genetic information and enable life as we know it — but what if millions of lesser-known chemicals could do the exact same thing?

A new study suggests that more than 1 million chemical look-alikes could encode biological information in the same way that DNA does. The new study, published Sept. 9 in the مجلة المعلومات الكيميائية والنمذجة, might point the way to new targets for pharmaceutical drugs, explain how life first evolved on Earth and even help us search for life-forms beyond our planet, the authors wrote.

"It is truly exciting to consider the potential for alternate وراثي systems . that these might possibly have emerged and evolved in different environments, perhaps even on other planets or moons within our solar system," co-author Jay Goodwin, a chemist at Emory University, said in a statement.

Both DNA and RNA, the two known types of nucleic acids, contain chemical bits called nucleotides, which link up in a particular order and relay different data, depending on their sequence, similar to individual letters within a written sentence. Some natural and man-made molecules mimic the basic structure of DNA, but before now, no one had attempted to count up how many of these look-alikes might exist, the authors wrote.

"There are two kinds of nucleic acids in biology," co-author Jim Cleaves, a chemist at the Tokyo Institute of Technology, said in the statement. "We wanted to know if there is one more to be found or even a million more."

"The answer is, there seem to be many, many more than was expected," Cleaves said.

The authors designed a computer program to generate chemical formulas for nucleic acid-like molecules. In DNA, nucleotides couple up in distinct pairings and assemble in a line, so the scientists made sure that their generated molecules could form in the same way. In the end, their program put together more than 1,160,000 different molecules that met these basic criteria.

"We were surprised by the outcome of this computation," co-author Markus Meringer, a chemist at the German Aerospace Center in Cologne, said in the statement. "It would be very difficult to estimate a priori that there are more than a million nucleic-acid like scaffolds. Now we know, and we can start looking into testing some of these in the lab."

The multitude of look-alikes may clarify the story of how life on Earth came to be, before DNA and RNA dominated the world of biology. Theoretically, تطور may have performed "test runs" with some of these other molecules before settling on nucleic acids as the best conveyors of genetic data, the authors suggested.

The look-alikes may also fuel future medical advances, they added. Drugs that resemble nucleotides are already used to undermine dangerous viruses and malignant cancer cells in the human body, according to the statement. With a library of structurally similar molecules on hand, drug developers could potentially adopt DNA look-alikes as a major weapon in the fight against disease.

"It is absolutely fascinating to think that by using modern computational techniques we might stumble upon new drugs when searching for alternative molecules to DNA and RNA that can store hereditary information," said co-author Pieter Burger, a biochemist at Emory University.


The technological evolution of forensic DNA profiling

In the classical DNA fingerprinting method radio-labeled DNA probes containing minisatellite [9] or oligonucleotide sequences [10] are hybridized to DNA that has been digested with a restriction enzyme, separated by agarose electrophoresis and immobilized on a membrane by Southern blotting or - in the case of the oligonucleotide probes - immobilized directly in the dried gel. The radio-labeled probe hybridizes to a set of minisatellites or oligonucleotide stretches in genomic DNA contained in restriction fragments whose size differ because of variation in the numbers of repeat units. After washing away excess probe the exposure to X-ray film (autoradiography) allows these variable fragments to be visualized, and their profiles compared between individuals. Minisatellite probes, called 33.6 and 33.15, were most widely used in the UK, most parts of Europe and the USA, whereas pentameric (CAC)/(GTG)5 probes were predominantly applied in Germany. These so-called multilocus probes (MLP) detect sets of 15 to 20 variable fragments per individual ranging from 3.5 to 20 kb in size (Figure 2). But the multi-locus profiling method had several limitations despite its successful application to crime and kinship cases until the middle of the 1990s. Running conditions or DNA quality issues render the exact matching between bands often difficult. To overcome this, forensic laboratories adhered to binning approaches [11], where fixed or floating bins were defined relative to the observed DNA fragment size, and adjusted to the resolving power of the detection system. Second, fragment association within one DNA fingerprint profile is not known, leading to statistical errors due to possible linkage between loci. Third, for obtaining optimal profiles the method required substantial amounts of high molecular weight DNA [12] and thus excludes the majority of crime-scene samples from the analysis. To overcome some of these limitations, single-locus profiling was developed [13]. Here a single hypervariable locus is detected by a specific single-locus probe (SLP) using high stringency hybridization. Typically, four SLPs were used in a reprobing approach, yielding eight alleles of four independent loci per individual. This method requires only 10 ng of genomic DNA [14] and has been validated through extensive experiments and forensic casework, and for many years provided a robust and valuable system for individual identification. Nevertheless, all these different restriction fragment length polymorphism (RFLP)-based methods were still limited by the available quality and quantity of the DNA and also hampered by difficulties to reliably compare genetic profiles from different sources, labs, and techniques. What was needed was a DNA code, which could ideally be generated even from a single nucleated cell and from highly degraded DNA, a code, which could be rapidly generated, numerically encrypted, automatically compared, and easily supported in court. Indeed, starting in the early 1990s DNA fingerprinting methods based on RFLP analysis were gradually supplanted by methods based on PCR because of the improved sensitivity, speed, and genotyping precision [15]. Microsatellites, in the forensic community usually referred to short tandem repeats (STRs), were found to be ideally suited for forensic applications. STR typing is more sensitive than single-locus RFLP methods, less prone to allelic dropout than VNTR (variable number of tandem repeat) systems [16], and more discriminating than other PCR-based typing methods, such as HLA-DQA1 [17]. More than 2,000 publications now detail the technology, hundreds of different population groups have been studied, new technologies as, for example, the miniSTRs [18] have been developed and standard protocols have been validated in laboratories worldwide (for an overview see [19]). Forensic DNA profiling is currently performed using a panel of multi-allelic STR markers which are structurally analogous to the original minisatellites but with much shorter repeat tracts and thus easier to amplify and multiplex with PCR. Up to 30 STRs can be detected in a single capillary electrophoresis injection generating for each individual a unique genetic code. Basically there are two sets of STR markers complying with the standards requested by criminal databases around the world: the European standard set of 12 STR markers [20] and the US CODIS standard of 13 markers [21]. Due to partial overlap, they form together a standard of 18 STR markers in total. The incorporation of these STR markers into commercial kits has improved the application of these markers for all kinds of DNA evidence with reproducible results from as less than three nucleated cells [22] and extracted even from severely compromised material. The probability that two individuals will have identical markers at each of 13 different STR loci within their DNA exceeds one out of a billion. If a DNA match occurs between an accused individual and a crime scene stain, the correct courtroom expression would be that the probability of a match if the crime-scene sample came from someone other than the suspect (considering the random, not closely-related man) is at most one in a billion [14]. The uniqueness of each person’s DNA (with the exception of monozygotic twins) and its simple numerical codification led to the establishment of government-controlled criminal investigation DNA databases in the developed nations around the world, the first in 1995 in the UK [23]. When a match is made from such a DNA database to link a crime scene sample to an offender who has provided a DNA sample to a database that link is often referred to as a cold hit. A cold hit is of value as an investigative lead for the police agency to a specific suspect. China (approximately 16 million profiles, the United States (approximately 10 million profiles), and the UK (approximately 6 million profiles) maintain the largest DNA database in the world. The percentage of databased persons is on the increase in all countries with a national DNA database, but the proportions are not the same by the far: whereas in the UK about 10% of the population is in the national DNA database, the percentage in Germany and the Netherlands is only about 0.9% and 0.8%, respectively [24].

Multilocus DNA Fingerprint from a large family probed with the oligonucleotide (GTG) 5 ( Courtesy of Peter Nürnberg, Cologne Center for Genomics, Germany ).


شاهد الفيديو: لقاحات كورونا. اهم الاسئلة ودواعى الاطمئنان. د كريم على المختصر المفيد (قد 2022).