معلومة

ما هو أفضل تصميم لتجارب التحقق من صحة الارتفاع والانتعاش والتخفيف الخطي في لوحة ELISA واحدة 96 بئر؟

ما هو أفضل تصميم لتجارب التحقق من صحة الارتفاع والانتعاش والتخفيف الخطي في لوحة ELISA واحدة 96 بئر؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد بحثت في الويب عن شرح مفصل لإجراء تجربة التحقق من الصحة هذه ، ولكن للأسف لم أجد تجربة مرضية. جئت عبر المصادر التالية:

  • نصيحة Thermo Scientific Tech رقم 58: IMAHO ، وصف مكتوب جيدًا ، ولكن لا تزال هناك بعض المشكلات

    الايجابيات

    • واضح في وصف المصطلحات والعمليات الحسابية المباشرة
    • تم تحديد استكشاف الأخطاء وإصلاحها من النتائج

    سلبيات

    • لم يتم تصميمه ليتم تنفيذه في لوحة ELISA واحدة بها 96 بئر
    • لم يذكر أي معايير مقبولة لكلا الاختبارين التحقق من الصحة
    • لم يذكرفارغ
  • Quansys Biosciences: تصميم عملي للتنفيذ

    الايجابيات

    • يمكن إجراء تجارب السنبلة والانتعاش والخطية للتخفيف في لوحة ELISA واحدة تحتوي على 96 بئرًا
    • مقدمة مبررة لـعينة داخلية، والتي يتم تخفيفها بنفس الكمية مثل العينة المسننة
    • إضافةفارغ
    • ذكر معايير القبول لكلا النوعين من التجارب

    سلبيات

    • لم يذكر استكشاف الأخطاء وإصلاحها
    • قليلا تصميم لوحة فوضوي
  • بروتوكول R & D spike and Recovery: موجز ولكنه مفيد

    الايجابيات

    • واضح في التصميم
    • ذكر المعايير المقبولة على الأقل لانتعاش السنبلة 80-120٪
    • ذكرفارغ
    • تلميح حول إمكانية استخدام عينة مخففة مرتبة حتى تعطي القراءة

    سلبيات

    • تم استخدام عينة واحدة للتقييم ولم يتم حساب المتوسط ​​على 3 عينات على الأقل
    • لا يوجد ذكر لأي معايير للتخفيف الخطي

قضايا / أسئلة
- س 1: كيف يمكننا دمج التجربتين في لوحة واحدة لتجنيب العينات والمواد؟
- س 2: هل يمكننا تخفيف العينة بمخفف الفحص بدلاً من مخفف العينة؟
- Q3: في حالة وجود مادة عينة منخفضة ، هل يمكننا تخطي العينة الأنيقة وإضافة 1: 2 واحدة مخففة بدلاً من ذلك لتجنيب المادة؟
- س 4: عند تحضير المسامير في Thermo Scientific tech # 58 ، لماذا تمت إضافة 10 ميكرولتر من محلول السنبلة إلى عينة 50 ميكرولتر؟ ما الذي يحكم هذه الإضافة ، هل هناك نسبة للالتزام هنا أم نسبة اعتباطية؟ هل يمكننا إضافة عينة 90 ميكرولتر و 10 ميكرولتر من محلول المخزون؟

من فضلك لا تتردد في التوسعمصادر، أوأسئلة، وبالطبعالإجاباتهي موضع ترحيب كبير لتحقيق الهدف التالي:

أفضل تصميم لاختباري التحقق من الصحة (على سبيل المثال ، السنبلة والاسترداد وخطي التخفيف) في لوحة ELISA واحدة مكونة من 96 بئرًا والتي ستستخدم الحد الأدنى من مادة العينة قدر الإمكان مع شرح الحسابات بناءً على المتوسطات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها بشكل واضح خطة

ملاحظة: لا تتمتع بسمعة طيبة لإضافة علامات مهمة لتحسين البحث ، على سبيل المثال:إليسا,تصديق


خلفية:

  • هناك الكثير من الوصفات لاستخراج البروتين من الأنسجة البشرية ، ولكن جميعها تتلخص في شيء واحد ؛ الحفاظ على بروتينات الأنسجة قدر الإمكان مع الحصول على عائد معقول للتطبيقات النهائية ، باستخدام عازلة الاستخراج ، والتقنيات الإضافية ، وإضافة مثبطات الأنزيم البروتيني
  • ELISA هو أحد تطبيقات المصب التي قد تكون مهتمًا بها ، ولكن سؤال واحد مهم؟ هل مصفوفة العينة التي حصلت عليها بالفعل صالحة لمقايسة ELISA؟ ضع في اعتبارك أن عينتك ليست مصلًا ، بل هي مزيج من الأنسجة ، ومانع استخلاص ، ومثبطات الأنزيم البروتيني ، وأشياء أخرى أيضًا
  • عادة ما يتم إجراء فحصين معروفين لمعالجة السؤال أعلاه. هذه هي ، spike-and-recovery (SAR) ، و Linearity-of-dilution (LOD) ، وهذان الاختباران خاصان بالتحليل الذي تريد قياسه في عيناتك ، على سبيل المثال ، السيتوكينات ، العوامل ، Igs ، إلخ ... ومخصصة أيضًا للأنسجة ومجموعة الفحص أيضًا
  • في كثير من الأحيان ، تكون مهتمًا بإجراء هذين الاختبارين بأقل قدر ممكن من الموارد ، أي وقت أقل ، ومواد أقل للمجموعة ، والأهم من ذلك ، مواد عينة أقل. قد يكون هذا صعبًا للغاية ويعتمد على العديد من المشكلات التي تقع خارج نطاق هذا المنشور لمناقشتها جميعًا
  • إذا كنت مهتمًا بإجراء هذين الاختبارين باستخدام لوحة ELISA واحدة فقط 96-بئر وفحص صلاحية مصفوفات العينة المختلفة ، أو المخزن المؤقت للعينة (المخزن المؤقت للتحلل أو يسمى أحيانًا المخزن المؤقت للاستخراج) لتحليل معين ، على سبيل المثال X ، فإن هذا المخطط أدناه مخصص أنت:

الملاحظات الفنية:

  • في هذا المخطط ، يتم فحص الاسترداد في 3 أنواع من الحلول ؛فحص العازلة,عينة عازلةوعينات. هذه تختلف في تعقيدها. عادةً ما يتم تحسين المخزن المؤقت للمقايسة للكشف عن البروتين القياسي المزود مع المجموعة التجارية
  • فكرةسبايك والانتعاشهو أن تضيف كمية معينة من محلول المخزون القياسي إلى الآبار التي تحتوي على المحلول المراد اختباره (على سبيل المثال ، عينة المخزن المؤقت أو العينات) وقياسها ، لمعرفة ما إذا كان يمكنك استرداد هذا المبلغ مرة أخرى ، ومقدار ما يمكنك استرداده منه في ٪. إذا لم تتمكن ، لأي سبب من الأسباب ، من استرداد هذا المبلغ مقارنة بئر التحكم ، حيث تمت إضافة نفس الكمية إلى المخزن المؤقت للمقايسة ، فهذا يعني أن شيئًا ما في محلول الاختبار ليس في صالح الفحص. يسمى المبلغ المحدد الذي تضيفه في الآبارتصاعد، ويجب أن تكون بنفس المقدار في جميع الآبار المختبرة (حاول أن تكون متسقًا). تأكد من أن الكمية المضافة عند تخفيفها في البئر ، يجب قياس تركيزها النهائي بالمقايسة وتقع داخل المنحنى القياسي الخاص بك. على سبيل المثال ، إذا كان المنحنى القياسي الخاص بك يتراوح من 4 إلى 4500 بيكوغرام / مل ، وكان لكل بئر 100 ميكرولتر من العينة ، إذا كنت تريد الآن إضافة ارتفاع إلى تلك العينة جيدًا ، فيمكنك إضافة المبلغ الذي تريده والذي سيظل يمنحك في النهاية قراءة داخل المنحنى القياسي ، يمكنك اختيار إضافة 10 مايكرولتر من أعلى مخزون وهو 500 جالون / مل ، لذلك ينتهي بك الأمر هنا بـ 1/10 ، أي 50 جالون / مل ، وهو أمر جيد لأنه يقع داخل 4-500 جالون. / نطاق مل. بدلاً من ذلك ، يمكنك إضافة عينة 50 مايكرولتر + سبايك 50 ميكرولتر (500 جالون / مل) وستنتهي بتخفيف 1/2 (وهو نفسه في هذا المخطط) ، أي 250 جالون / مل ، وهو أمر جيد أيضًا. لذا فالأمر متروك لك ، مع الأخذ في الاعتبار أن التركيز النهائي يجب أن يكمن داخل منحنىك القياسي
  • بالنسبة إلىخطية التخفيف، من الواضح أنك بحاجة إلى محلول عالي التركيز يمكنك عمل تخفيف متسلسل من شقين (أو أيًا كان ما تريده) ويجب أن تظل قراءته داخل المنحنى القياسي. أفضل مرشح لهذا هو الآبار العالية الشائكة. الاللدسيخبرك عن تأثير التخفيفات المختلفة على دقة الفحص
  • لريال سعوديواللدستحصل في النهاية على متوسط ​​نسبة مئوية من 3 عينات على الأقل (سيتم تقديم مثال حسابي لاحقًا) ، أضفت عينة رابعة ، ولكن يمكن أن تكون هذه العينة الرابعة نوعًا مختلفًا ، على سبيل المثال عينات من زراعة الأنسجة ، لذا فالأمر متروك عليك أن تعيد تصميم هذا المخطط وأن تكون مبتكرًا
  • اختيار أفضل تخفيف ليس بالمهمة السهلة ، فهو لا يخلو من التنازلات في بعض الأحيان. على سبيل المثال ، إذا كان لديك مخزن مؤقت قاسي للعينة ، فقد لا تحصل على استرداد جيد عند تخفيف 1/2 ، 1/4 ، 1/8 منعينة عازلةفيفحص العازلة، في حين أن الاسترداد الجيد تقريبًا يتحقق عند 1/16 ، فإن عامل التخفيف هذا هو على الأرجح العامل الذي يجب أن تذهب إليه في الفحص. من ناحية أخرى ، قد لا يتم الكشف عن 1/16 بواسطة اختبار ELISA الخاص بك ، والذي يحد من حساسيته. هنا ،هيمكن للآبار أن تعطيك فكرة عما إذا كنت قد اكتشفت شيئًا ما في هذه العينات غير المحددة أم لا ، ولهذا السبب أوصيك بتضمين عينة واحدة على الأقل من القيمة المرتفعة المتوقعة للتحليل المعني (ليس من السهل أحيانًا التنبؤ) في هذا المخطط ، هنا هذه عينة 3. شيء آخر ، إذا حصلت على استرجاع جيد في 1/16 ، فلا تنتقل إلى 1/32 أو 1/64 ، لأنه من الواضح أنه باستخدام هذه التخفيفات الأعلى ، فإنك تقلل من فرصة اكتشاف التحليل لأنه يقتصر على حساسية الفحص الخاص بك
  • في معظم الحالات ، سترى أن عامل التخفيف من الانتعاش الجيدعينة عازلةفي العمودين 3 و 4 ، سيتطابق مععينات مسننةفي الأعمدة 5 و 7 و 9. سوف يمنحك ذلك تأكيدًا على أنك في الاتجاه الصحيح. إذا تم استخراج العينة 4 من قبل مختلفعينة عازلة، فمن الواضح أنه لا ينبغي توقع أن ينتهي الأمر بنفس عامل التخفيف (من فضلك ، كن أكثر منطقية!)

الملخص

CAMPATH-1H هو جسم مضاد أحادي النسيلة مؤنس ضد مستضد CD52 الذي يتم تطويره لعلاج ابيضاض الدم الليمفاوي المزمن (CLL) وأمراض المناعة الذاتية والوقاية من رفض الزرع. يعد قياس مستويات مصل الجسم المضاد أمرًا مهمًا لتحسين نظم الجرعات ولكنه صعب بسبب التركيز المنخفض مقارنة مع IgG البشري الطبيعي.

بعد النظر في الطرق المختلفة ، تم تطوير مقايسة مناسبة بناءً على التألق المناعي غير المباشر. تم تحضين عينات الاختبار بالخلايا المستهدفة (HUT-78 ، خط الخلايا التائية البشرية) وتم اكتشاف CAMPATH-1H عن طريق ربط مضاد Ig البشري المسمى الفلورسنت باستخدام مقياس التدفق الخلوي. تم إثبات متانة الاختبار في ظل مجموعة من الظروف التجريبية. بسبب التقارب المنخفض لـ CAMPATH-1H ، شوهدت إشارة ضعيفة فقط بتركيزات منخفضة. كان حد الكشف 0.15 ميكروغرام / مل وكان الحد الكمي 0.25 ميكروغرام / مل. بما أن عينات المصل تم تخفيفها على الأقل 1: 2 ، فإن أقل تركيز يمكن قياسه في مصل المريض كان 0.5 ميكروغرام / مل. كانت الدقة الكلية (معامل التباين) ± 13٪ والدقة الكلية (التحيز) كانت + 9٪. كانت هناك نسبة منخفضة من النتائج الإيجابية الكاذبة (& lt2٪) في مصل المريض العادي أو قبل العلاج. تم الحصول على الاسترداد الكمي من عينات المصل المزودة بـ CAMPATH-1H وتخزينها في ظل مجموعة متنوعة من الظروف ، بما في ذلك المعالجة عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وتجميدها وإذابتها حتى أربع مرات.

هذا الاختبار المصادق عليه مناسب لقياس مستويات CAMPATH-1H في التجارب السريرية ويمكن تطبيق نفس المبادئ على أي جسم مضاد أحادي النسيلة مرتبط بالخلايا.


مقدمة

حدث تفشي مرض فيروس كورونا الجديد 2019 (COVID-19) في أواخر عام 2019 ، وانتشر الآن في جميع أنحاء العالم مما أدى إلى وباء عالمي [1]. يعود سبب COVID-19 إلى فيروس كورونا الجديد المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة 2 (SARS-CoV-2) ، الذي أصاب أكثر من 164 مليون شخص وأسفر عن أكثر من 3.4 مليون حالة وفاة. لقد تجاوز معدل المراضة والوفيات المرتفعة لـ COVID-19 بكثير معدلات الإنفلونزا الموسمية والأمراض الأخرى [2،3،4]. في الوقت الحاضر ، لا يزال فيروس SARS-CoV-2 ينتشر عالميًا ، مما يتسبب في آثار طويلة المدى على صحة الإنسان والأنشطة العادية [5]. نظرًا لعدم توفر دواء أو علاج محدد لـ COVID-19 ، أصبح التشخيص الدقيق وسلسلة إجراءات الوقاية والسيطرة أكثر الوسائل فعالية لمنع انتشاره.

تتضمن مناهج التشخيص الحالية بشكل أساسي فئتين: اختبار الحمض النووي على أساس تقنية RT-PCR واختبار الأجسام المضادة على أساس كروماتوجرافيا المناعة [6،7،8،9،10،11]. يعتبر اختبار الحمض النووي الريبي لـ SARS-CoV-2 الرائد من قبل مراكز السيطرة على الأمراض (CDC) بمثابة "المعيار الذهبي" للتشخيص السريري. ومع ذلك ، فإن العيوب مثل ساعات العمل الطويلة ، والحاجة إلى الكواشف المتخصصة ، والمعدات ، والمشغلين المدربين تقيد تطبيقه على نطاق واسع [12 ، 13]. باستثناء RT-PCR ، طور الباحثون طريقتين متساويتين من أجل الاكتشاف السريع والحساس للحمض النووي الريبي الفيروسي ، بما في ذلك التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP) وتضخيم البوليميراز المعاد تركيبه (RPA) [14،15،16،17،18] . ومع ذلك ، أظهرت الدراسات السابقة أن المعدل الإيجابي لاختبار الحمض النووي الريبي الفيروسي هو فقط 30-60٪ ، مما يشير إلى ارتفاع معدل سلبية كاذبة للكشف عن الحمض النووي لـ COVID-19 [12 ، 19 ، 20 ، 21]. تتطلب العديد من القيود والقضايا مزيدًا من البحث مثل عينات الجهاز التنفسي المختلفة ، وجمع العينات غير المناسب ، ونقلها ، ومعالجتها [22 ، 23]. من ناحية أخرى ، قد يؤدي تدهور الحمض النووي الريبي المنقى ، أو وجود مثبطات RT-PCR ، أو الطفرات الجينية إلى نتائج سلبية خاطئة [22 ، 24 ، 25]. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام المقايسة المناعية أيضًا للكشف عن الأجسام المضادة التي يتم إنشاؤها بواسطة أجسامنا استجابةً لعدوى SARS-CoV-2 [12 ، 22 ، 26]. يعمل الكشف عن الأجسام المضادة IgM و IgG الخاصة بالميكروبات في الدورة الدموية كطريقة تقليدية لتحديد ما إذا كان الشخص مصابًا بالعدوى [27]. في COVID-19 ، يمكن أن تظهر الأجسام المضادة IgM و IgG في وقت واحد تقريبًا في المصل في غضون 2 إلى 3 أسابيع بعد ظهور المرض [9 ، 28 ، 29]. تم تطوير العديد من طرق الكشف للكشف عن IgG و IgM كتشخيص سريع لـ COVID-19 مثل ELISA والمقايسة المناعية بالتلألؤ المغناطيسي [30،31،32،33،34]. ليو وآخرون. استخدم مجموعتان من مجموعات ELISA استنادًا إلى بروتينات السارس- CoV-2 spike و nucleocapsid للكشف عن الأجسام المضادة IgM و IgG وتقييم جدواها التشخيصية [35]. Chen et al. أبلغ عن اختبار مناعي سريع وحساس للتدفق الجانبي يستخدم جزيئات نانوية من البوليسترين المخدر باللانثانيد للكشف عن مضاد SARV-CoV-2 IgG في مصل الدم البشري [36]. على الرغم من استخدام اختبار الأجسام المضادة أيضًا في التشخيص الإضافي لـ COVID-19 ، فقد تتفاعل بعض الاختبارات مع فيروسات كورونا الأخرى ، مثل تلك التي تسبب نزلات البرد [37]. لذلك ، هناك طلب كبير على تطوير تقنيات جديدة ذات دقة تشخيصية محسنة لـ COVID-19. تعد البروتينات السفلية (S) و nucleocapsid (N) الخاصة بـ SARS-CoV-2 من المؤشرات الحيوية الواعدة لمستضد لتشخيص COVID-19 في دم الإنسان لأنها تلعب دورًا رئيسيًا في التعرف على المستقبلات وتكاثر الفيروس والاستجابة المناعية [38 ، 39،40]. يعتقد العديد من الخبراء أن اكتشاف مستضدات البروتين الفيروسي يمكن أن يكون مفيدًا في تشخيص COVID-19 وفقًا لتجربة اكتشاف مستضد البروتين SARS-CoV [41،42،43]. على عكس التضخيم الأسي لاكتشاف الحمض النووي ، لا يمكن تضخيم البروتينات بشكل مباشر ، وبالتالي فإن اكتشاف كمية دقيقة من البروتينات يتطلب تقنيات كشف فائقة الحساسية [12].

صفيف الجزيء المنفرد (Simoa) عبارة عن ELISA رقمي [44]. تم تطوير Simoa بواسطة مجموعة David Walt للكشف عن البروتينات ذات الحساسية التحليلية العالية للغاية ، والتي يمكن أن تكون أعلى 1000 مرة من تلك الموجودة في ELISAs التقليدية. في ELISA الرقمي ، يقتصر التألق الناتج عن تفاعل الركيزة الإنزيمية في ميكروويلات بحجم فيمتوليتر. نظرًا لأن كل ميكروويل يمكن أن يلائم حبة واحدة فقط ، يمكن الكشف عن وجود جزيء بروتين واحد من خلال قراءة التألق [45]. هنا ، في هذا العمل ، اقترحنا طريقة ELISA رقمية لاكتشاف البروتين S-RBD والبروتين N في وقت واحد وبشكل فائق الحساسية عبر Simoa وتقنية ترميز الخرزة المغناطيسية. يحدد هذا العمل أزواج الأجسام المضادة الأكثر موثوقية للكشف عن بروتينين من خلال عملية الاختيار ويقوم بتحسين كواشف Simoa لأعلى حساسية ونطاق ديناميكي باستخدام البروتينات المؤتلفة. علاوة على ذلك ، فإن الفحص المقترح له إمكانات عالية لتشخيص COVID-19 ويوفر فرصًا لمراقبة المرضى عن طريق اختبار بروتين S-RBD والبروتين N في الدم.


مقدمة

قد يكون لانخفاض وظائف الكلى مجموعة واسعة من الأسباب مثل العدوى ، والسموم ، والاضطرابات الوراثية ، واختلال التمثيل الغذائي مثل مرض السكري من النوع 2 أو أمراض المناعة الذاتية. هناك العديد من التغيرات المرضية الأساسية ، والتي قد تؤدي إلى إصابة الكلى الحادة (AKI) أو تعزز تطور مرض الكلى المزمن (CKD). يُعرَّف القصور الكلوي الحاد بأنه انخفاض مفاجئ في معدل الترشيح الكبيبي (GFR) والناتج الكلوي ، مما يؤدي إلى تراكم النفايات النيتروجينية [1] ، في حين يتميز مرض الكلى المزمن بالتشوهات الهيكلية أو الوظيفية للكلية مع ما يترتب على ذلك من آثار على الصحة بمرور الوقت فترة لا تقل عن ثلاثة أشهر [2]. بيلة الألبومين ، نيتروجين اليوريا في الدم (BUN) ومعدل الترشيح الكبيبي المقدر (eGFR) هي المؤشرات الحيوية المعتمدة من قبل المبادئ التوجيهية لتصنيف CKD وهي تنبئ بقوة بتطور مرض الكلى والمراضة في الإنسان ، ولكن أيضًا في القوارض. في الوقت الحالي ، يتم بذل جهد كبير لتحديد المؤشرات الحيوية الجديدة أو لوحات العلامات الحيوية للتشخيص والتشخيص لأمراض الكلى ، وكذلك من أجل فهم أعمق لأمراض الكلى ولتحديد الأهداف العلاجية المحتملة [3].

يمكن أن يكون الإندوستاتين أحد هذه العلامات الواعدة ، حيث اكتسب اهتمامًا متزايدًا على مدار السنوات الماضية. من الجدير بالذكر أن الإندوستاتين تم اكتشافه بالفعل عام 1997 بواسطة O’Reilly وزملائه وهو مثبط 20 كيلو دالتون لتكاثر الخلايا البطانية في المختبر ومثبط قوي لتكوين الأوعية الدموية ونمو الورم في الجسم الحي [4]. إنه جزء C- طرفي من النوع الثامن عشر من الكولاجين ويظهر بشكل رئيسي أثناء إعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية [5]. أظهرت الدراسات الحديثة أن التعبير المتغير [6-8] وزيادة تركيز الإندوستاتين المنتشر [9،10] مرتبطان بضعف وظائف الكلى. الأهم من ذلك ، يمكن استخدام الإندوستاتين أيضًا كعلامة تنبؤ لـ AKI في المرضى المصابين بأمراض خطيرة [11].

فاف- BCL2 الفئران المعدلة وراثيا (BCL2 tg) معرضة للإصابة بسرطان الغدد الليمفاوية الجريبي مع تقدم العمر وللتطور إلى أمراض الكلى ، مثل التهاب كبيبات الكلى من نوع المناعة الذاتية [12]. في السابق ، تم تحديد التآزر بين منتج الاندماج ETV6 / RUNX1 ، الناتج عن انتقال t (1221) في البشر ، والجزيء المضاد للاستماتة BCL2 باستخدام نموذج فأر جديد [13]. بعد التقاطع ETV6 / RUNX1 و BCL2 الفئران المفردة المعدلة وراثيًا ، كانت الحيوانات المحورة وراثيًا الناتجة (E / R tg BCL2 tg) تؤوي أعدادًا مرتفعة من الخلايا B وتتر الغلوبولين المناعي التلقائي عند مقارنتها بالفئران BCL2 tg. أدى ذلك إلى ترسب عميق للمجمعات المناعية في الكبيبات وتسريع تطور التهاب كبيبات الكلى المناعي [13].

من أجل تحديد الوظيفة البيولوجية للإندوستاتين في نماذج الفئران المختلفة أثناء التسبب في أمراض الكلى ، هناك حاجة إلى قياس تركيز الإندوستاتين في المصل والبلازما بشكل موثوق وقابل للتكاثر. نظرًا لعدم توفر أداة قياس كمية عالية الجودة ، تقدم هذه الدراسة التطوير والتحقق من صحة وتطبيق مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لقياس مستويات الإندوستاتين في القوارض ، والذي يتوفر أيضًا تجاريًا. يمكن إظهار الأهمية البيولوجية للإندوستاتين كمؤشر حيوي مبكر مع تحديد تركيز الإندوستاتين في BCL2 المعدلة وراثيا ETV6 / RUNX1BCL2 الفئران المعدلة وراثيا مزدوجة مع ضعف وظائف الكلى.


المواد والأساليب

المواد النباتية والكواشف والكيماويات

تم استخدام ما مجموعه 38 نمطًا وراثيًا من الفول السوداني (انظر الجدول التكميلي 1) أثناء تحسين بروتوكول ELISA وتوحيده. تم تخزين بذور هذه الأنماط الجينية بعد الحصاد عند 10 & # x000B0C وتم إخراجها فقط عند الحاجة للتجربة. تم شراء مكونات ELISA مثل معايير مسببات الحساسية للفول السوداني ، والأجسام المضادة أحادية النسيلة (الأجسام المضادة الأولية والثانوية biotinylated MAbs) ، وتقارن الإنزيمات من شركة INDOOR Biotechnologies Inc. (شارلوتسفيل ، فيرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) لتقدير خمسة من مسببات الحساسية المهمة للفول السوداني وهي Ara h 1 و Ara h 2 Ara h 3 و Ara h 6 و Ara h 8. وتشمل هذه الأجسام المضادة أحادية النسيلة 2C12 (استنساخ 2C12 A11 A3) والجسم المضاد الحيوي 2F7 (استنساخ 2F7 C12 D10) لـ Ara h 1 والجسم المضاد أحادي النسيلة 1E8 والجسم المضاد أحادي النسيلة 4G9 بالنسبة لـ Ara h 3 بينما الجسم المضاد أحادي النسيلة 3B8 (استنساخ 3B8 B5) والجسم المضاد الحيوي 3E12 (استنساخ 3E12 C4 B3) لـ Ara h 6. وبالمثل ، فإن الجسم المضاد أحادي النسيلة 1C4 (استنساخ 1C4 G4 C8) والأرنب متعدد النسيلة المضاد لـ Ara h 2 ( AH2) لجسم Ara h 2 المضاد للقبض 4G6 ومصل مضاد متعدد النسيلة تم تربيته في الأرنب لـ Ara h 8 تم شراؤه من شركة INDOOR Biotechnologies Inc. Conjugated Goat anti-Rabbit IgG من مختبرات Jacksons (Bar Harbour ، الولايات المتحدة الأمريكية رقم القط 111-036- 046). تم شراء ABTS & # x02122 (رقم Cat 11204521001) وجميع الكواشف والمواد الكيميائية الأخرى من شركة Sigma-Aldrich Co. (Oakville ، ON ، كندا).

معايير مسببات الحساسية وإعداد محلول الإنزيم

تم شراء معايير المواد المسببة للحساسية من شركة INDOOR Biotechnologies Inc. (شارلوتسفيل ، فيرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم عزل هذه المعايير من دقيق الفول السوداني المحمص قليلاً (صنف Runner) وتنقيتها بواسطة كروماتوجرافيا التقارب. تم توفير المعايير المنقاة في محلول الفوسفات ، وتم استلامها على الجليد وتخزينها في & # x0221220 & # x000B0C حتى استخدامها مرة أخرى. طبيعي منقي Ara h 1 (لوت 39285 Conc. 20000 نانوغرام / مل) ، Ara h 2 (لوت 39158 Conc. 2500 نانوغرام / مل) ، Ara h 3 (مجموعة 39051 Conc. 1،250 نانوغرام / مل) Ara h 6 (مجموعة 39198 Conc تم استخدام 1.000 نانوغرام / مل) و Ara h 8 (لوت 39033 Conc. 2500 نانوغرام / مل) كمعايير مسببة للحساسية لكل مقايسة. تراوح التركيز القياسي لكل مادة مسببة للحساسية من 2000-4 نانوغرام / مل لـ Ara h 1 ، 250 - 0.5 نانوغرام / مل لـ Ara h 2 ، 125 - 0.24 نانوغرام / مل لـ Ara h 3 ، 100 - 0.2 نانوغرام / مل لـ Ara h 6 و 250 - 0.49 نانوغرام / مل لـ Ara h 8. ركيزة ABTS عبارة عن ركيزة بيروكسيديز قابلة للذوبان في الماء تنتج منتجًا نهائيًا أخضر قابل للقياس للاستخدام في طرق ELISA. تم إذابة ABTS & # x02122 (Sigma Aldrich Cat No. 11204521001) في محلول ABTS 1 ملي مولار. يحتوي محلول ABTS على 0.1 مولار من حامض الستريك اللامائي و 0.2 مولار من فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة.202. تم إذابة 274 مجم ABTS & # x02122 في 500 مل من محلول ABTS وتخزينها في زجاجة بلون كهرماني عند 4 & # x000B0C حتى الاستخدام.

تطوير بروتوكول لتقدير مسببات الحساسية

ELISA هو شكل شطري له جسم مضاد مزدوج يعتمد على التفاعل المحدد بين المستضد والجسم المضاد. البروتينات المسببة للحساسية من الفول السوداني عبارة عن شطيرة بين اثنين من الأجسام المضادة مثل التقاط الجسم المضاد والجسم المضاد المترافق مع الستربتافيدين بيروكسيديز (الشكل 1). لتطوير الألوان تم استخدام ABTS & # x02122. تعتمد كثافة اللون على تركيز البروتين المسبب للحساسية الموجود في العينة المحددة ويتم قياسه باستخدام قارئ لوحة ميكروسكوبية iMark (Bio-Rad) عند 405 نانومتر. تم استخدام برنامج Microplate Manager (MPM) أثناء تحليل قيم الكثافة البصرية للمعايير والعينات. أظهر التمثيل المنهجي الخطوات الرئيسية التي ينطوي عليها تطوير بروتوكول ELISA ، لتقدير مسببات الحساسية من الفول السوداني من خلال بذور الفول السوداني (الشكل 1).

شكل 1. رسم تخطيطي يوضح بروتوكول تقدير مسببات الحساسية في بذور الفول السوداني من خلال ساندويتش ELISA.

طحن البذور والتجانس والتنقية

تم تحضير مستخلصات العينة بطحن جرامين من بذور الفول السوداني في مسحوق ناعم ثم تذويبها في 40 مل من PBS-T (0.05٪ توين في محلول ملحي مخزون بالفوسفات ، ودرجة الحموضة 7.4) تحتوي على 1 مولار كلوريد الصوديوم في 50 مل من أنابيب الصقور (Sarstedt No: 55.476) . بعد ساعتين من التحريك اللطيف على منصة هزازة في درجة حرارة الغرفة ، تم جمع الطور المائي بالطرد المركزي عند 2500 دورة في الدقيقة عند 4 & # x000B0C لمدة 20 دقيقة. تم بعد ذلك الطرد المركزي في الطور المائي عند 3500 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة الغرفة لإزالة الآثار المتبقية والجسيمات غير القابلة للذوبان. تم تخزين مقتطفات البروتين في & # x0221220 & # x000B0C حتى الاستخدام.

عامل التخفيف لمختلف مسببات الحساسية من الفول السوداني

يعتبر تخفيف مستخلص العينة أمرًا بالغ الأهمية بالنسبة لـ ELISA والذي بدوره يحدد قيم نطاق الكشف للأجسام المضادة وتركيزات المستضد المستهدفة. بعد ذلك ، تم تقدير تركيز عينة المواد المسببة للحساسية المحددة بضرب التركيز الموجود في الرسم البياني بواسطة عامل التخفيف (36 ، 37). باستخدام تخفيفات مختلفة ، قمنا بتقدير نطاق الكشف عن تركيز المستضد والجسم المضاد المستهدف. قمنا بتوحيد عوامل التخفيف لاكتشاف كل بروتينات مسببة للحساسية موجودة في بذور الفول السوداني. تم تخفيف كل عينة بثلاث تخفيفات مختلفة للكشف عن بروتين الحساسية الموجود في البذور. البروتينات الرئيسية المسببة للحساسية مثل Ara h 1 (1/1000 ، 1/2000 ، 1/4000) ، Ara h 2 (1/5000 ، 1/10000 ، 1/20000) ، Ara h 3 (1/5000 ، تم تخفيف 1/10000 ، و 1/20000) ، و Ara h 6 (1/40.000 ، 1/80.000 ، و 1/160.000) على نطاق مرتفع مقارنةً ببروتين الحساسية الثانوية ، Ara h 8 ، والذي تم تخفيفه بدرجة منخفضة نطاق التخفيف (1/10 ، 1/20 ، و 1/40). تم تحديد التركيز الأمثل للستربتافيدين المترافق مع HRP بنفس الطريقة.

خطوات المشاركة في ELISA

طلاء الجسم المضاد والحجب

تم طلاء ألواح البوليسترين الدقيقة (NUNC Maxisorp ، روسكيلد ، الدنمارك) بـ 100 & # x003BCL mAb عند 10 & # x003BCL / 10 مل في محلول كربونات 50 ملي مولار (100 & # x003BCL / بئر). بعد فترة الحضانة طوال الليل عند 4 & # x000B0 درجة مئوية ، تم غسل الآبار المطلية ثلاث مرات بمخزن غسيل (محلول فوسفات يحتوي على 0.05 ٪ توين 20) وتركه للانسداد بنسبة 1 ٪ من مساحة سطح الجسم لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة متبوعًا بغسل ثلاث مرات باستخدام محلول الغسيل.

التقاط عينات مسببات الحساسية والمعيار

تم تخفيف المعيار والعينات في محلول غسيل يحتوي على 1٪ جزء ألبومين مصل بقري V (Sigma Aldrich Cat No. 10735086001). تم تخفيف معيار كل مسبب للحساسية لعمل 10 تخفيفات مضاعفة متسلسلة في المخزن المؤقت للتخفيف. بعد ذلك ، تمت إضافة عينات مسببات الحساسية (100 & # x003BCL / بئر) مع ثلاثة تخفيفات مختلفة في الآبار المعنية وحضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

إضافة الأجسام المضادة للكشف في اللوحة

بعد غسل لوحات الحضانة ثلاث مرات وتم تخفيف مضاد Ara h mAb المعين حيوياً إلى 1/1000 في محلول غسيل يحتوي على BSA (1 مجم / مل) تمت إضافته إلى الآبار (100 & # x003BCL / بئر) وحضنت لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة.

إنزيم الستربتافيدين المتقارن

بعد ثلاث عمليات غسل ، تمت إضافة Streptavidin المترافق مع HRP المخفف إلى 1/1000 في محلول غسيل يحتوي على BSA (1 مجم / مل) إلى الآبار وحضنت لمدة ساعة عند درجة حرارة الغرفة.

إضافة الركيزة

تمت إضافة الركيزة اللونية إلى الآبار والتي شكلت محلولًا ملونًا عند تحفيزها بواسطة الإنزيم. تم غسل الآبار ثلاث مرات وأضيف 100 & # x003BCL من 1 ملي مولار ABTS إلى كل بئر. بعد 5 دقائق ، لوحظ تطور اللون.

الكشف عن طريق قارئ ELISA

تم قياس الكثافة الضوئية (OD) عند 405 نانومتر باستخدام BioRad Microplate Reader وتمت معالجة البيانات باستخدام Microplate Manager V 6.1 (مختبرات Bio-Rad).

دراسات سبايك والتعافي

لاختبار دقة تقدير مسببات الحساسية للفول السوداني ، تم زيادة الكمية المعروفة لكل مادة مسببة للحساسية في مستخلصات الفول السوداني. كان التركيز القياسي السنبلة لكل مادة مسببة للحساسية يتراوح من 100 إلى 1600 نانوغرام / مل لـ Ara h 1 ، و 25 إلى 200 نانوغرام / مل لـ Ara h 2 ، و 6.25 إلى 100 نانوغرام / مل لـ Ara h 3 ، و 10 إلى 160 لـ Ara h 3 ، ومن 10 إلى 100 نانوغرام / مل لـ Ara h 8. زادت هذه الكميات المعروفة من المواد المسببة للحساسية الفردية (Ara h 1 و Ara 2 و Ara 3 Ara h 6 و Ara h 8) في مستخلص الفول السوداني وتم حسابها لاحقًا المحتوى النهائي في الاستخراج. تم حساب الاسترداد كـ (B & # x02013C) / (A & # x000D7 100) ، حيث A = الكمية المعروفة لمعيار الفول السوداني ، B = تركيز المعيار المسنن ، C = تركيز مستخلص الفول السوداني.

التحليل الإحصائي وتصميم تحليل العينة

أجريت جميع التجارب بثلاث مكررات على أساس معامل التخفيف (DF). تم استخدام قيم قراءة لوحة ELISA المتوسطة (الكثافة البصرية OD) لكل معيار وعينة لرسم منحنى قياسي عن طريق وضع قيم تركيز قياسية لكل مسببات الحساسية على المحور Y وقيم OD ذات الصلة على المحور X على جدول بيانات Excel على الكمبيوتر. باستخدام قيم معادلة الانحدار ، قمنا بتقدير تركيز معين لمسببات الحساسية في كل عينة. يتم التعبير عن البيانات كوسائل & # x000B1 الانحراف المعياري (SD). تم وضع معايير وعينات مسببات الحساسية في لوحة تنسيق 96 بئر كما هو موضح في الشكل 2. تم إجراء التحليل الإحصائي للبيانات باستخدام SigmaPlot 11.0.

الشكل 2. رسم تخطيطي يوضح تصميم اللوحة المكونة من 96 بئر والتخفيف التسلسلي لمعيار مسببات الحساسية وعينات الفول السوداني في ثلاث مكررات وثلاث تخفيفات. الآبار A1 إلى A10 و B1 إلى B10 تحتوي على تخفيف متسلسل لمعايير مسببات الحساسية المحددة A11 إلى A12 و B11 إلى B12 فارغة بينما الآبار C و D و E و F و G و H تحتوي على عينات غير معروفة من الفول السوداني في ثلاثة تخفيفات مختلفة لـ مسببات الحساسية المحددة.


تتكون مخازن الحظر من تركيبات من البروتينات مصممة لمنع الارتباط غير المحدد باللوحة. يزيد المخزن المؤقت الأمثل للحظر من نسبة الإشارة إلى الضوضاء ولا يتفاعل مع الأجسام المضادة أو البروتين المستهدف. إذا لوحظ التفاعل التبادلي ، فيجب اختبار عامل منع مختلف. إذا لوحظ تفاعل متقاطع متكرر ، فقد يكون من المستحسن التحول إلى عامل مانع للبروتين غير الثدييات مثل مصل السلمون أو محلول مانع خالي من البروتين.

قد تستفيد بعض الأنظمة من إضافة خافض للتوتر السطحي مثل Tween 20 (منظف لطيف غير أيوني) إلى محلول الحجب. يمكن أن تساعد المواد الخافضة للتوتر السطحي في تقليل التفاعلات الكارهة للماء بين البروتين المعطل والمستضد أو الأجسام المضادة. عادةً ما يتم استخدام تركيز نهائي قدره 0.05٪ (حجم / حجم) توين 20. بالإضافة إلى ذلك ، يجب استخدام المخازن المؤقتة السدودة بكميات كافية لتغطية الآبار بالكامل. على سبيل المثال ، يتم استخدام 400 ميكرولتر بشكل عام لكل بئر من لوحة 96 بئر.

يتعلم أكثر

حدد المنتجات


4 DIM LIGHT MELATONIN ONSET

أظهر ليوي وساك 37 أن وقت ظهور الميلاتونين في البلازما كان علامة ممتازة على إيقاع الساعة البيولوجية لدى البشر. علاوة على ذلك ، كان من الواضح أن التعرض للضوء الساطع في وقت متأخر من المساء لم يقم فقط بقمع بداية إنتاج الميلاتونين الصنوبرية ، بل أدى أيضًا إلى تأخير ظهور الميلاتونين في الليلة التالية. في تلك الدراسات المبكرة ، تم قياس الميلاتونين باستخدام مقايسة مطيافية الكتلة الحساسة التي أبلغت عن مستويات النهار في نطاق 1 بيكوغرام / مل ، باستخدام 1 مل من العينة. استخدموا نهج العتبة لتعريف DLMO كوقت من اليوم يتجاوز فيه التركيز 10 بيكوغرام / مل. منذ ذلك الحين ، تم اقتراح العديد من الطرق المختلفة لتحديد المرحلة اليومية بناءً على إيقاع الميلاتونين (الشكل 2) ، وقد تضمنت طريقة عصا الهوكي ، 38 الوقت الذي يمر فيه المستوى بانحرافين معياريين من المستوى الأساسي 39 والوقت الذي يمر فيه الميلاتونين توقف التوليف (SynOff). 40 لكل من هذه الأساليب وغيرها نقاط قوتها وضعفها كما ناقشها كليرمان وآخرون. 41 تتطلب بعض الطرق مثل SynOff و 25٪ من أساليب المستوى الأقصى جمع عينات متعددة خلال الليل وهي غير عملية تمامًا لمعظم الأغراض السريرية أو التجريبية.

الميزة الواضحة لجمع اللعاب على عكس الدم هي أن الأول غير جراحي ويمكن تحقيقه في البيئات غير السريرية. وقد أدى ذلك إلى الاستخدام الواسع النطاق لقياسات الميلاتونين في اللعاب لتحديد DLMO. عند القيام بذلك ، كانت هناك حاجة لتغيير تعريف DLMO لميلاتونين اللعاب لمطابقة تلك التي تم الحصول عليها من البلازما بسبب المستويات المنخفضة بنسبة 30٪ -40٪ التي تم قياسها على هذا النحو ، بدلاً من عتبة البلازما DLMO الأصلية البالغة 10 بيكوغرام / مل ، عتبة اللعاب من & lt4 جزء من الغرام / مل مناسبة. 42 في الواقع ، في دراسة مكثفة لـ 1848 مجموعة DLMO اللعابية (5 عينات) ، تم استخدام عتبة DLMO البالغة 4 بيكوغرام / مل بنجاح لـ 1408 موضوعًا (76 ٪) ، في حين أن 213 شخصًا (11.5 ٪) لديهم قيم لم تتجاوز 4 بيكوغرام. / مل و 136 (7.3٪) فقط لديهم مستويات ميلاتونين لعابية كانت أعلى باستمرار من 4 بيكوغرام / مل أثناء نافذة التجميع. 43


خلفية

الأوكسيتوسين (OT) و Vasopressin (AVP) هي الببتيدات العصبية المحفوظة نسبيًا مع تأثيرات على السلوك الاجتماعي والإدراك واستجابات الإجهاد. على الرغم من أنه يتم قياس OT و AVP بشكل أكثر شيوعًا في الدم والبول والسائل الدماغي النخاعي (CSF) ، فإن هذه الأساليب تمثل مجموعة من التحديات بما في ذلك المخاوف المتعلقة بغزو جمع العينات ، وإمكانية تداخل المصفوفة في المقايسات المناعية ، وما إذا كان يمكن جمع العينات في نقاط زمنية محددة لتقييم استجابات الغدد الصماء المرتبطة بالحدث.

أسلوب جديد

لقد تحققنا من صحة فحوصات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISAs) لقياس اللعاب OT و AVP في الكلاب الأليفة.

نتائج

كان كل من OT و AVP موجودين في لعاب الكلاب ويمكن اكتشافهما بواسطة ELISA والكروماتوجرافيا السائلة عالية الأداء - قياس الطيف الكتلي (HPLC-MS). OT concentrations in dog saliva were much higher than those typically detected in humans. OT concentrations in the same samples analyzed with and without sample extraction were highly correlated, but this was not true for AVP. ELISA validation studies revealed good accuracy and parallelism, both with and without solid phase extraction. Collection of salivary samples with different synthetic swabs, or following salivary stimulation or the consumption of food led to variance in results. However, samples collected from the same dogs using different techniques tended to be positively correlated. We detected concurrent elevations in salivary and plasma OT during nursing.

Comparison with existing methods

There are currently no other validated methods for measuring OT/AVP in dog saliva.

الاستنتاجات

OT and AVP are present in dog saliva, and ELISAs for their detection are methodologically valid.


خلفية

Colorectal cancer (CRC) is a broadly occurring and lethal cancer, with approximately 1.4 million new cases and 700,000 deaths yearly [1]. CRC outcome dramatically improves with early detection followed by curative resection [2,3,4] thus CRC screening is recommended for all U.S. patients over 50 years of age [5, 6]. The gold standard screening test is colonoscopy, with some stool-based tests also having good performance [7, 8]. However, compliance with CRC screening recommendations is low by some measures only 40% of the population for which screening is recommended will undergo testing [9].

A low-burden CRC screening test, such as a blood-based test, has been widely sought. However, it has proven difficult to find blood-based CRC signal with performance matching that of colonoscopy or of stool-based tests across average risk patients. Blood-based CRC signal may be stronger in patients with more advanced disease, such as those with symptoms of colorectal neoplasia. If so, the appearance of symptoms would offer an opportunity to provide low-burden CRC testing with higher performance. Interest in a low-burden CRC test for symptomatic patients has also come from the clinical community. By itself, the increased CRC prevalence in the symptomatic population (10.9% in a Danish symptomatic cohort [10], as compared to 0.5–0.7% in the average risk population [7, 9]) would seem sufficient incentive for patients to follow clinicians’ recommendations to have colonoscopies. However, the compliance rate in the symptomatic population is estimated to be only 63.6% (unpublished observations). A low-burden CRC test for this population would highlight patient risk stratification, resulting in increased personalized incentive and increased colonoscopy compliance [11, 12].

Given the attractiveness of a low-burden CRC test for symptomatic patients, several groups have focused efforts here [10, 11, 13, 14]. The highest performing test, and the only validated test to date, was a blood-based test developed earlier in our laboratory [10, 14] using a sample set mirroring the composition of the intent-to-test (ITT) symptomatic population [14]. The specific symptoms present in this population (abnormal bowel habits, abdominal pain, rectal bleeding, unexplained weight loss, meteorism, anemia, and/or palpable mass) indicated a likelihood of increased CRC risk, which was borne out by the study colonoscopy results hence we term these patients “high risk.” The positive predictive value (PPV) of this test was 31%, meaning that 31% of the patients with positive test results had CRC uncovered during colonoscopies. This was a dramatic improvement over the positive CRC rate from asymptomatic screening colonoscopy alone (0.5–0.7%, [7, 9]) and over the positive CRC rate within the symptomatic population without additional stratification (10.9%, [10]). The strong performance of this earlier test demonstrated that a low-burden test for symptomatic patients provides information that may dramatically improve colonoscopy compliance among these high risk patients—a positive result would indicate much more certainty about the usefulness of further testing.

In the present paper, we report the development of a new blood-based CRC test. The new test is directed to the ITT population of symptomatic patients, and was developed using a much larger sample set (4435 vs 922 patient samples) and employing an assay format with more robust analytic performance: electrochemiluminescence antibody-based assays. These assays offer greater dynamic ranges and higher sensitivities when compared to the ELISA format used in the earlier test [15]. The new test’s validated classifier algorithm, developed using feature selection and machine learning applied to concentration measures of 27 proteins in the 4435 patient sample set, has significantly better specificity, resulting in a higher PPV. The new test offers a low-burden, high quality, and high performance CRC risk assessment to clinicians serving patients presenting with CRC symptoms. Results can be used to manage these patients’ choices about further CRC testing.


CSF BACE activity assay

In order to determine the best assay format for assaying BACE enzymatic activity in biological extracts or fluids such as CSF, we initially tested a solution-based assay and compared it with either a BACE capture assay format or a substrate capture assay format (see Supplemental Information) to determine the signal and background properties of these different assays. In the solution-based BACE enzymatic assay, which was superior to the capture-based assay formats (Fig. 1), a biotin labeled 15


شاهد الفيديو: محاضرة توضيح وكيفية مراجعة مادة تصميم وتحليل التجارب (قد 2022).


تعليقات:

  1. Ilhuitl

    أنا أفهم ذلك جيدًا. أنا يمكن أن تساعد مع قرار السؤال. معا يمكننا أن نجد القرار.

  2. Carlaisa

    أعتذر ، لكن هل يمكنك تقديم المزيد من المعلومات.

  3. Tomeo

    أعتقد أنك مخطئ. أنا متأكد. دعونا نناقش هذا. أرسل لي بريدًا إلكترونيًا على PM.

  4. Maubar

    لقد تغيرت السعادة بالنسبة لي!

  5. Haris

    وأنا أتفق مع كل ما سبق. يمكننا التحدث عن هذا الموضوع. هنا ، أو في فترة ما بعد الظهر.

  6. Slayton

    آسف ، لقد حذفت هذا الفكر :)



اكتب رسالة