معلومة

كيفية تعقيم وسط النمو المحتوي على اليوريا بأمان؟

كيفية تعقيم وسط النمو المحتوي على اليوريا بأمان؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أنا أستخدم وسط نمو يحتوي على اليوريا لإجراء تجارب على البكتيريا (1-2 لتر / يوم). بعد التجربة ، يجب تعقيم وسط النمو والتخلص منه. لقد فعلت ذلك حتى الآن عن طريق التعقيم ، لكن فنينا اشتكى من رائحة الأمونيا التي تتطور (تتفكك اليوريا عند تسخينها ، وتطلق الأمونيا).

أنا متأكد من أن الكمية التي يتم إطلاقها في الهواء ليست خطيرة (لقد أفرغت الأوتوكلاف عدة مرات) ، خاصة إذا كنت لا تتنفس عن قصد في أول عاصفة من الهواء تخرج بعد الفتح ، لكنني أعتقد أنها مفيدة للنظر في البدائل. كما أنني لست متأكدًا مما إذا كان الأوتوكلاف قد يتضرر على المدى الطويل.

هل يملك احد خبرة في هذا؟ هل ترى طريقة لتعقيم كميات أكبر من وسط النمو بشكل موثوق بدون تسخين؟


التعقيم بالبخار هو أفضل وسيلة للتعقيم. إذا كان وسيط النمو لديك كبيرًا ، فما مقدار المطهر الكيميائي الذي تعتقد أنك ستحتاجه لرفع تركيزه في العمل؟

أضف بعض الأحماض إلى وسط النفايات الخاص بك (بحيث يكون حمضيًا ضعيفًا فقط) ، ليس كمطهر ، ولكن لقمع تكوين الأمونيا. ستظل اليوريا تتحلل أثناء الأوتوكلاف ، لكن أيون الأمونيوم (pKa ~ 9) سيبقى بشكل عام في المحلول.


يجب عليك مراجعة إرشادات المؤسسات الخاصة بك حيث أن المرافق المختلفة لها لوائح مختلفة ولكن بشكل عام من المقبول:

في غطاء دخان وفي حاوية جيدة التهوية (غير مختومة):

1.إضافة مادة التبييض السائلة إلى تركيز نهائي بنسبة 20٪ (أضف جزء من التبييض إلى 3 أجزاء من الثقافة)

2- دعنا نجلس بين عشية وضحاها

3 تخلص من الصرف بكميات وفيرة من الماء


أنواع الإعلام الثقافي

وسائط الاستزراع هي وسيلة خاصة تستخدم في المختبرات الميكروبيولوجية لتنمية أنواع مختلفة من الكائنات الحية الدقيقة. يتكون وسط النمو أو المستنبت من مغذيات مختلفة ضرورية لنمو الميكروبات.

نظرًا لوجود العديد من أنواع الكائنات الحية الدقيقة ، ولكل منها خصائص فريدة وتتطلب عناصر غذائية محددة للنمو ، فهناك العديد من الأنواع بناءً على العناصر الغذائية التي تحتويها والوظيفة التي تلعبها في نمو الكائنات الحية الدقيقة.

قد تكون الثقافة صلبة أو سائلة. تتكون وسائط الاستزراع الصلبة من مادة تشبه الهلام البني تعرف باسم أجار. تضاف إليها مواد مغذية وكيميائية مختلفة للسماح بنمو الكائنات الحية الدقيقة المختلفة.

فيما يلي بعض أنواع الثقافة أو وسائط النمو الهامة المستخدمة في المختبرات الميكروبيولوجية:

طبق أجار مع مستعمرات بكتيرية


إجراء الأوتوكلاف

ارتداء معدات الحماية الشخصية:

  • معطف المختبر
  • حماية العين
  • احذيه مقفله من ناحيه الاصابع
  • قفازات مقاومة للحرارة لإزالة العناصر ، خاصة الأواني الزجاجية الساخنة

التعبئة والتغليف والتحميل

  • يجب السماح للأفراد المعينين فقط بتعيين و / أو تغيير معلمات أجهزة التعقيم.
  • قبل استخدام الأوتوكلاف ، تحقق من الداخل بحثًا عن أي عناصر تركها المستخدم السابق والتي يمكن أن تشكل خطرًا.
  • نظف مصفاة الصرف قبل تحميل الأوتوكلاف.
  • ضع العناصر دائمًا في حاوية ثانوية.
  • لا تفرط في تحميل الأكياس أو تعبئتها بإحكام شديد. اترك مساحة كافية لتدوير البخار. إذا لزم الأمر ، ضع الحاوية على جانبها لزيادة تغلغل البخار وتجنب انحباس الهواء.
  • استخدم فقط الأكياس القابلة للتعقيم لتعبئة النفايات.
  • لا تسمح للأكياس بلمس الجدران الداخلية لجهاز الأوتوكلاف لتجنب ذوبان البلاستيك.
  • تأكد من تعبئة كمية كافية من السوائل مع محتويات أكياس الأوتوكلاف إذا كانت جافة.
  • ضع الأواني الزجاجية وأدوات المختبر المتسخة في حاويات ثانوية وأوتوكلاف لهم في دورة المواد الصلبة. لا تملأ أكثر من 2/3 الحاويات بالسوائل. قم بفك الأغطية أو استخدم سدادات ذات فتحات تهوية.
  • في حالة الأواني الزجاجية النظيفة والأدوات المغلفة ، ضعها في وعاء ثانوي قبل تعقيمها في دورة البضائع المغلفة.
  • للاحتواء الثانوي ، استخدم صواني الأوتوكلاف المصنوعة من مادة البولي بروبيلين أو البولي كربونات أو الفولاذ المقاوم للصدأ. يجب أن تحتوي الصواني على قاع وجوانب صلبة لاحتواء المحتويات ومنع الانسكابات.
  • اختر دورة مناسبة للمادة. قد يؤدي التحديد غير الصحيح للدورة إلى تلف الأوتوكلاف ، أو يتسبب في غليان السائل أو تكسر الزجاجات.
  • ابدأ دورتك واملأ سجل مستخدم الأوتوكلاف. تستغرق الدورة المكتملة عادةً ما بين 1 إلى 1.5 ساعة.
  • افحص مقياس ضغط الغرفة / الغلاف لضغط أدنى يبلغ 20 رطلاً لكل بوصة مربعة (psi).
  • أغلق وأغلق الباب.
  • تحقق من درجة حرارة 250 درجة فهرنهايت (121 درجة مئوية) لكل حمولة.
  • لا تحاول فتح الباب أثناء تشغيل الأوتوكلاف.

التفريغ

  • تأكد من اكتمال الدورة وعودة درجة الحرارة والضغط إلى النطاق الآمن.
  • ارتدِ معدات الوقاية الشخصية الموصوفة أعلاه ، بالإضافة إلى مئزر وواقي للوجه في حالة إزالة السوائل. قف للخلف من الباب كإجراء احترازي وافتح الباب بحذر بما لا يزيد عن بوصة واحدة. سيطلق هذا البخار المتبقي ويسمح للضغط داخل السوائل والحاويات بالتطبيع.
  • السماح للحمل المعقم بالوقوف لمدة 10 دقائق في الغرفة. سيسمح ذلك للبخار بتنقية الهواء وحبسه للهروب من السوائل الساخنة ، مما يقلل المخاطر على المشغل.
  • لا تقم بتحريك حاويات السوائل شديدة الحرارة أو إزالة الأغطية قبل تفريغها.
  • ضع السوائل في منطقة تشير بوضوح إلى أن العناصر "ساخنة" حتى تبرد العناصر إلى درجة حرارة الغرفة.
  • اترك المواد التي يتم تعقيمها لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل نقلها. لا تقم أبدًا بنقل المواد شديدة الحرارة.
  • ضع كيس الخطر البيولوجي المبرد والمعقم في صندوق النفايات الطبية المنظم. يمكن التخلص من السوائل المعدية المعقم في المجاري الصحية.

هناك نوعان من معقمات الحرارة الجافة

ال نوع الهواء الساكن يشار إليه على أنه معقم من نوع الفرن حيث تتسبب ملفات التسخين الموجودة في الجزء السفلي من الوحدة في ارتفاع الهواء الساخن داخل الغرفة عبر الحمل الحراري بالجاذبية. هذا النوع من معقمات الحرارة الجافة أبطأ بكثير في التسخين ، ويتطلب وقتًا أطول للوصول إلى درجة حرارة التعقيم ، وهو أقل انتظامًا في التحكم في درجة الحرارة في جميع أنحاء الغرفة من نوع الهواء القسري.

ال الهواء القسري أو الحمل الحراري الميكانيكي جهاز التعقيم مزود بمنفاخ يعمل بمحرك يقوم بتدوير الهواء الساخن في جميع أنحاء الغرفة بسرعة عالية ، مما يسمح بنقل أسرع للطاقة من الهواء إلى الأجهزة.


كيف يغير الفطر السحري دماغك

المهلوسات ، مثل عيش الغراب السيلوسيبين (السحري) ، تغير من إدراكك ، ومزاجك ، وعدد كبير من العمليات العقلية الأخرى من خلال العمل بسحرها على قشرة دماغك. تنشط الأدوية مستقبلات محددة تسمى مستقبلات 5-HT2A (2ARs) التي يتم تشغيلها عادة بواسطة السيروتونين.

تساعدك سلسلة التغييرات العصبية الحيوية في دماغك على تجربة عجب متجدد في الأشياء اليومية. سيكون لديك وعي ذاتي أكبر. ستكون حواسك أكثر حدة بحيث تبدو الألوان أكثر حيوية وصوتًا وطعمًا ورائحة أكثر كثافة. وستظل مركزًا على الحاضر.

تستمر الآثار الإيجابية لفترة طويلة بعد مغادرة الأدوية للمبنى. أبلغ المشاركون عن انخفاض كبير في القلق والاكتئاب بعد استخدام واحد فقط.

كما ذكروا تجربة "اليقظة الروحية" التي كانت مسؤولة عن تحول دائم في وعيهم. بعد ذلك ، قال المشاركون إنه كان من الأسهل الاستمرار في التركيز على الحاضر ، وكان لديهم وعي أكبر بالترابط بين كل الأشياء.

لذلك ، إذا كنت تعاني من أي من الأمراض العقلية المذكورة أعلاه ، أو إذا كنت ترغب في تجربة التنوير الروحي وتهدئة الثرثرة المستمرة في ذهنك ، فقد يكون عيش الغراب سيلوسيبين مناسبًا لك. وقد تتساءل عن كيفية زراعتها.


كيفية تعقيم وسط النمو المحتوي على اليوريا بأمان؟ - مادة الاحياء

تعتبر التقنية المعقمة دائمًا أمرًا نسبيًا. تعتمد الاحتياطات المطلوبة على الوضع التجريبي ، بما في ذلك وسائط النمو المستخدمة ، والقدرات التنافسية للكائن التجريبي ، ومدة التجربة ، والاستخدام المقصود للثقافة. بالنسبة لهذه التجارب ، فإن أخطر مشكلة تلوث هي العفن. تنمو العديد من القوالب الشائعة جيدًا على وسائط الخميرة وتتنافس بشكل فعال ، مما يؤدي إلى زيادة نمو الصفائح وإخفاء تلك الخميرة التي تمكنت من النمو. تعتبر البكتيريا مشكلة أقل لأن معظمها لا ينمو جيدًا على هذه الوسائط ، وبقليل من الخبرة ، يمكن للمرء بسهولة تمييزها عن الخميرة. يمكن أن تكون سلالات الخميرة الأخرى ملوثات كارثية إذا لم يتم اكتشافها. على وجه الخصوص ، يمكن أن تكون الخميرة الحمراء التي تظهر أحيانًا مربكة حقًا ، ولكنها تتميز عن الخميرة الحمراء لأنها لا تتطلب الأدينين.

على عكس التجارب قصيرة المدى ، يجب أن تكون وسائط التعقيم صارمة للغاية لأن التخزين يتيح وقتًا كافيًا حتى تتطور الملوثات بطيئة النمو. لقد استنتجنا من التجربة أن تخزين الوسائط في البرد يؤدي في الواقع إلى نتائج عكسية. لا يمنع التلوث ولكنه يبطئ نموه. وبالتالي قد لا يتم اكتشاف التلوث حتى يتم تحضين الثقافات. من الأفضل تخزين الوسائط في درجة حرارة الغرفة واكتشاف التلوث قبل استخدام الوسيط.

(1) التعقيم بالحرارة الرطبة

تُعد الحرارة الرطبة التي يوفرها الأوتوكلاف أو قدر الضغط طريقة فعالة لتعقيم معظم المواد. عند ضغط 15 رطل / بوصة مربعة فوق الضغط الجوي ، تصل درجة حرارة الماء إلى حوالي 121 درجة مئوية قبل أن يغلي. يتم تعقيم معظم المواد بشكل فعال لمدة 15 دقيقة من التعرض لدرجة الحرارة هذه. في حالة عدم توفر الأوتوكلاف ، فإن قدر الضغط المنزلي العادي سيعقم بشكل فعال إمدادات الوسائط على دفعات صغيرة.

(2) التعقيم بالحرارة الجافة

يمكن تعقيم المواد الجافة مثل الزجاج والمعدن في الفرن ، لكن هذا يتطلب درجة حرارة أعلى (160 درجة مئوية) ووقتًا أطول (ساعتان على الأقل) من الأوتوكلاف. هذا هو الأكثر عملية للأواني الزجاجية عندما يتوفر فرن يتم التحكم فيه بواسطة مؤقت تلقائي بحيث يمكن أن يحدث التعقيم والتبريد بين عشية وضحاها. استخدام الأدوات البلاستيكية التي تستخدم لمرة واحدة والمعقمة مسبقًا تجعل الفرن أقل أهمية.

يعمل اللهب المنبعث من موقد الغاز على تعقيم الزجاج الصغير أو الأجسام المعدنية بشكل فعال ، مثل حلقات التلقيح ، ولكن يجب تجنب "قلي" الخميرة عن طريق ملامسة الأشياء المسخنة في اللهب. اغمس موزعات الزجاج في الكحول ثم استخدم اللهب لإشعال الكحول. ضع الأدوات المعدنية مثل الحلقات في اللهب حتى تصبح حمراء ساخنة. قم بتبريد الأدوات الساخنة عن طريق ملامستها للأجار أو داخل أنبوب زجاجي معقم. ومع ذلك ، نظرًا لأن اللهب خطير ، يمكن ويجب تجنب هذه الطريقة كلما أمكن ذلك. لقد وجدنا أن اللهب ضروري حقًا فقط لتعقيم حلقات التلقيح والأدوات الصغيرة. لم نتمكن من إثبات أي قيمة في إشعال فتحات الأنابيب أو الزجاجات أو القوارير في هذه التجارب.

(4) التعقيم بالكحول

في العديد من الإجراءات التجريبية ، تكون الطريقة الأكثر فعالية لتعقيم الأشياء هي استخدام الإيثانول. إما 95٪ أو 70٪ سيعملون. هذا الأخير هو في الواقع أكثر فعالية ، ولكن الأول هو الأكثر ملاءمة في كثير من الأحيان. بالطبع يجب السماح للكحول بالتبخر أو الاحتراق قبل استخدام الشيء الملامس للخميرة. استخدم لهبًا لإشعال الكحول ، فالشمعة عمومًا أقل تكلفة وأكثر أمانًا من موقد الغاز. الكحول ، أكثر من الحرارة ، يقوم بالتعقيم ، لذا فقط "أشعل" الكحول لتقليل التسخين وتسريع العملية. أيضًا ، امسح المقعد بالكحول قبل البدء في تجربة لإزالة الغبار المليء بالعفن ، وهو المصدر الأكثر شيوعًا للتلوث. إذا لم تكن بشرتك حساسة بشكل خاص ، امسح يديك بكمية صغيرة من الكحول أيضًا.

(5) الحفاظ على الأشياء المعقمة معقمة

أكثر مصادر التلوث شيوعًا أثناء التجربة هي الغبار ، من سطح المنضدة ، ومن الهواء ومن الأشخاص. هذا يفرض عدة مبادئ واضحة:
1) حافظ على الأشياء مغطاة قدر الإمكان.
2) لا تلمس أي شيء يلامس المزرعة وإذا لمسته ، فقم بتعقيمه مرة أخرى قبل استخدامه.
3) امسح السطح المحيط بالتجربة بالكحول وقلل من اضطراب الهواء.
4) تجنب الكلام أو الغناء أو الصفير أو السعال أو العطس في اتجاه الأشياء التي يجب أن تكون عقيمة. قد يكون الشعر الطويل ، إذا لم يتم ربطه من الخلف ، مصدرًا للتلوث.
5) الحفاظ على مساحة مناسبة للتحضير والتخزين واستخدام الوسائط المعقمة. لسوء الحظ ، فإن نباتات المنزل والحيوانات والمواد الأخرى مثل وسط ذبابة الفاكهة ، التي توجد بشكل شائع في فصول علم الأحياء ، هي مصادر وفيرة للعفن ويجب أن تبقى بعيدًا عن المنطقة المستخدمة في الإجراءات المعقمة.

(6) ادرس التلوث الخاص بك لتجنب ذلك في المرة القادمة

إذا تلوثت بعض لوحات أجار الخاصة بك ، يمكنك في كثير من الأحيان معرفة كيفية حدوث التلوث من خلال فحص اللوحة. إذا كانت الملوثات مغروسة في الأجار ، فمن المحتمل أن الملوث قد تم سكبه بالوسيط. إذا كان التلوث أسفل الأجار ، فمن الممكن أن يكون في الطبق قبل سكبه أو إدخاله عندما كان الغطاء مفتوحًا للصب. إذا كان التلوث في الأعلى ، فمن الممكن أن يكون قد حدث قبل إغلاق الغطاء بعد الصب ، أثناء فتح الغطاء لمسح التكثيف أو أثناء تلقيح اللوحة.

(7) صمم تقنياتك وفقًا لاحتياجاتك

تعد تقنية التعقيم المناسبة ضرورية لنجاح التجارب الميكروبيولوجية ، ولكن الاحتياطات المفرطة يمكن أن تكون عوامل إلهاء خطيرة. تتطلب الخميرة والبكتيريا طرقًا مختلفة عن زراعة الأنسجة. تنمو الخميرة بقوة ، وتتفوق على معظم الأشياء ، باستثناء عدد قليل من الفطريات الخيطية (الغامضة) وبعض البكتيريا. يمكن أن تصبح التجارب ملوثة ولا تضيع عندما يستخدم الطلاب الخميرة لأن الخميرة ستنمو جيدًا بما يكفي ، على الرغم من التلوث ، بحيث يمكن قراءة نتائج التجربة من خلال النمو المخالف. لذلك ، توخى أقصى درجات الحذر أثناء عمل الوسائط وصبها.

تستخدم معظم التجارب في هذا الكتيب نوعًا أو نوعين من أنواع الوسائط التالية:
1) وسط غذائي كامل يحتوي على كمية دون المستوى الأمثل من الأدينين (YED) ،
2) وسط غذائي كامل يحتوي على فائض من الأدينين (YEAD) ،
3) وسط محدد كيميائيًا يفتقر إلى الأدينين (MV) ،
4) وسيط محدد كيميائيا مع الأدينين (MV + Ade) ،
5) وسيط التبخر (YEKAC) ،
6) وسيط يستخدم لتحديد المسوخ الصغير (PETITE) و
7) وسيط غني يستخدم لتخزين سلالات الخميرة (YEPAD).

نحن نستخدم الوسائط المعدة من المكونات المتاحة تجاريًا. يتم تعويض النفقات الإضافية الصغيرة لهذه المكونات من خلال توحيدها وموثوقيتها. المدخرات التي يمكن تحقيقها باستخدام مكونات "محلية الصنع" أقل مما كان متوقعًا لأننا لم نعثر بعد على بديل لأغلى مكون ، أجار. على الرغم من أن المصادر الشائعة ، مثل أنواع مختلفة من عصائر الخضروات ، يمكن أن توفر معظم المكونات الأخرى ، فقد وجدنا أن التضحية بإمكانية التكاثر غير مبررة.

سيكون متوسط ​​YED (مستخلص الخميرة + سكر العنب) هو وسيلة النمو القياسية لدينا. يطلق عليه وسط "معقد" لأنه مصنوع من مكونات طبيعية (خميرة) وتركيبه الكيميائي الدقيق غير معروف. يحتوي على كل ما هو موجود في الخميرة - بما في ذلك الأدينين بالطبع - لذلك فهو أيضًا وسيط "كامل". تنمو المسوخات التي تتطلب الأدينين الأحمر جيدًا على هذا الوسط وتطور الصبغة الحمراء المميزة.

يحتوي وسط YEAD (مستخلص الخميرة + Adenine + Dextrose) على نفس مكونات YED ولكن يحتوي على كمية زائدة من الأدينين. تنمو المسوخات التي تتطلب الأدينين الأحمر جيدًا على هذه الوسيلة ولن تطور الصبغة الحمراء المميزة.

يحتوي وسط YEPAD (مستخلص الخميرة + البيبتون + الأدينين + الدكستروز) على نفس مكونات YEAD ولكنه يحتوي على الببتون المضاف. هذا وسيط غني جدًا يستخدم لتخزين سلالات الخميرة.

وسط MV (الحد الأدنى بالإضافة إلى الفيتامينات) هو وسيط محدد كيميائيًا ، مما يعني أنه يتكون من الحد الأدنى من المكونات الكيميائية النقية اللازمة لدعم نمو الخميرة من النوع البري. سنستخدم MV عندما نحتاج إلى وسيط لا يحتوي على الأدينين.

يحتوي وسط MV + Ade (الحد الأدنى بالإضافة إلى الفيتامينات + الأدينين) على نفس المكونات مثل MV ولكن يحتوي على كمية زائدة من الأدينين.

يحفز YEKAC (مستخلص الخميرة بالإضافة إلى أسيتات البوتاسيوم) الخميرة ثنائية الصبغيات على التبويض والخضوع للانقسام الاختزالي. إنه غير متوازن من الناحية التغذوية ، لذا سيحدث نمو ضئيل للغاية.

يحتوي وسط PETITE على الجلسرين كمصدر للكربون ويستخدم لتحديد طفرات المستعمرات الصغيرة. لن تنمو الخلايا الصغيرة على هذا الوسط.

وصفات لوسائل نمو أجار

إذا كنت تستخدم مزيجًا مُعبأ مسبقًا ، فاتبع التعليمات الموجودة على العبوة. إذا كنت تقوم بوزن المكونات الجافة ، فاستخدم الوصفات التالية. يتم إعطاء الوصفات لتحضير 100 مل. إذا كنت ترغب في تحقيق المزيد ، فما عليك سوى مضاعفة المبالغ للحصول على الحجم الذي تريده. مثال: لتحضير 500 مليلتر ، اضرب كل مكون في 5. لا تضع أكثر من 600 مليلتر في دورق سعة 1000 مليلتر. إذا ملأت الحاويات ممتلئة جدًا فقد تغلي أثناء عملية التعقيم. يستغرق ما يقرب من 25 مليلترًا من المتوسط ​​لصب لوح قياسي واحد بحجم 100 × 15 مم. (يمكن صنع الوسائط السائلة من هذه الوصفات عن طريق حذف الأجار.)

خميرة مستخلص سكر العنب (YED):

1 جرام مستخلص الخميرة
2 غرام دكستروز لا مائي (جلوكوز)
2 جرام أجار (صمغ أجار أجار)
100 مل ماء

مستخلص الخميرة Adenine Dextrose Medium (YEAD):

1 جرام مستخلص الخميرة
2 غرام دكستروز لا مائي (جلوكوز)
2 جرام أجار (صمغ أجار أجار)
8 مل من محلول الأدينين
92 مل ماء

مستخلص الخميرة الببتون الأدينين سكر العنب المتوسط ​​(YEPAD):

1 جرام مستخلص الخميرة
2 جرام ببتون
2 غرام دكستروز لا مائي (جلوكوز)
2 جرام أجار (صمغ أجار أجار)
8 مل من محلول الأدينين
92 مل ماء

1 جرام مستخلص الخميرة
0.025 غرام دكستروز لا مائي (جلوكوز)
2.4 مل جلسرين
2 جرام أجار (صمغ أجار أجار)
98 مل ماء

0.15 جرام قاعدة نيتروجين الخميرة بدون أحماض أمينية وكبريتات الأمونيوم
0.52 جرام كبريتات الأمونيوم
2 غرام دكستروز لا مائي (جلوكوز)
2 جرام أجار (صمغ أجار أجار)
100 مل ماء

Minimal Media plus Adenine (MV + ade):

0.15 جرام قاعدة نيتروجين الخميرة بدون أحماض أمينية وكبريتات الأمونيوم
0.52 جرام من كبريتات الأمونيوم
2.0 غرام دكستروز لا مائي (جلوكوز)
2.0 غرام أجار (أجار صمغ أجار)
8.0 مل من محلول الأدينين
92 مل ماء

1 جرام خلات البوتاسيوم
0.25 جرام مستخلص الخميرة
2 جرام أجار (صمغ أجار أجار)
100 مل ماء

400 مجم أدينين في 400 مل من الماء (1 مجم / مل)
احفظه في درجة حرارة الغرفة.
استخدم 2 مل من محلول المخزون مقابل 100 مل من الوسط قلل الماء المضاف إلى الوسط بمقدار 2 مل.

أقراص Adenine Blotter الورقية

1.25 جرام من الأدينين
150 مل ماء مقطر
أقراص ورق نشاف فنية
أضف الأدينين إلى الماء المقطر في دورق كبير بما يكفي حتى لا يغلي المحلول. يغلي لمدة خمس دقائق. أضف الأقراص الورقية النشافة واتركها تغلي لمدة خمس دقائق أخرى. قم بإزالة الأقراص بالملقط المعقم إلى حاوية معقمة مغطاة مثل طبق بتري. ضعيها في طبقة واحدة واتركيها تجف لعدة أيام.

بالنسبة للعديد من التجارب قصيرة المدى ، من الممكن "تعقيم" الماء بالغليان.
1) ضع الماء في وعاء مغطى بشكل فضفاض ،
2) ضع الحاوية في قدر من الماء المغلي لمدة 15 دقيقة ،
3) بعد أن يبرد شد الغطاء على وعاء الماء.

ربما تكون الطريقة الأفضل لتحضير الماء المعقم هي وضع حاويات الماء المغطاة بشكل غير محكم في الأوتوكلاف أو قدر الضغط ثم تعقيم الماء في نفس الظروف المستخدمة في وسائط النمو.

ج. درجة حرارة الحضانة ومعدلات النمو

تبلغ درجة حرارة النمو المثلى لهذه السلالات حوالي 30 درجة مئوية ، لكنها ستنمو بشكل مرضٍ تمامًا على نطاق أوسع بكثير. يمكن إجراء كل هذه التجارب في درجة حرارة الغرفة المريحة ، لكن الخميرة تتحمل تقريبًا أي درجة حرارة يستطيع الناس تحملها. ومع ذلك ، ستؤثر درجة الحرارة على معدل النمو. في درجات الحرارة المنخفضة ، تنمو الخلايا بشكل أبطأ ، ويجب تحديد المعدل بالتجربة. تعتمد أوقات الحضانة المقدرة في هذه التجارب على الحضانة عند درجات حرارة في حدود درجة أو درجتين من 30 درجة مئوية.

يمكن للمرء ، في الواقع ، إبطاء الخميرة عن طريق تبريدها لجعل التجارب تتناسب مع جداول الفصل. ببساطة قم بتبريد الأطباق أو قم بتبريدها في مراحل مختلفة لإبطاء النمو. ومع ذلك ، ضع في اعتبارك أنه بعد أن يتم تبريد الثقافة ، قد تكون هناك فترة تأخير تصل إلى عدة ساعات قبل أن تبدأ في النمو مرة أخرى. بالطبع ، إذا وصلت إلى المرحلة الثابتة ، فلن تنمو أكثر في أي درجة حرارة.

يمكن تخزين سلالات الخميرة لفترات طويلة في الثلاجة عند درجات حرارة أعلى بقليل من درجة التجمد. ستستمر بعض السلالات في النمو ، على الرغم من أنها بطيئة جدًا ، في درجات الحرارة هذه ، لكن معظمها يظل قابلاً للحياة لأسابيع أو شهور ، والبعض الآخر لسنوات.

يجب تجنب درجات الحرارة التي تزيد عن 30 درجة مئوية. على الرغم من أن الخلايا ستنمو في درجات حرارة أعلى ، فإنها تتراكم طفرات صغيرة غير مرغوب فيها ويتم تثبيط الأبواغ بشدة. يتم أيضًا تثبيط الصباغ الأحمر في طفرات الأدينين في درجات الحرارة المرتفعة. من الأسلم احتضان الثقافات التي يتم استنشاقها في درجة حرارة الغرفة المريحة.

احتضان الثقافات في الظلام أو الضوء المخفف بقدر ما هو مناسب. على الرغم من أنه ليس حرجًا ، فإن التعرض المطول لضوء الغرفة العادي أو الضوء الأكثر إشراقًا سيقلل من صلاحية الخلايا التي تحتوي على الصبغة الحمراء. يجب ألا تتعرض السلالة الحساسة للأشعة فوق البنفسجية G948-1C / U لمصادر الضوء لفترة طويلة.

لتحقيق النمو الأمثل ، ولكي تتطور الصبغة الحمراء ، يجب أن تكون الألواح هوائية. نقوم باحتضان الأطباق في أكياس تخزين الطعام البلاستيكية المفتوحة. يتوفر ما يكفي من الأكسجين مع الأكياس المفتوحة لدعم التنفس الهوائي. تمنع الأكياس البلاستيكية الألواح من الجفاف بسرعة كبيرة ، وتحميها من التلوث وتجعل حملها أسهل دون انسكاب.

د. استخدام المسواك وحلقات التلقيح

بالنسبة لمعظم الأغراض ، أسهل طريقة لنقل الخميرة من مكان إلى آخر على وسط أجار هي باستخدام مسواك معقم. المسواك ذو النمط المسطح أسهل في الاستخدام من النمط الدائري. تعتبر النهاية المدببة مفيدة في انتقاء العينات من المستعمرات الفردية أو لعمل بقع أو خطوط صغيرة. تعتبر النهاية المسطحة جيدة لنشر الخميرة ولتشذيبها لعزل مستعمرات مفردة وللخلط. المسواك معقمة من الصندوق مباشرة طالما أن الصندوق غير ملوث. ما عليك سوى قطع زاوية واحدة لعمل ثقب صغير (حوالي 1/4 إلى 1/2 بوصة عرضًا) وسيكون الصندوق بمثابة موزع. تشير أعواد الأسنان الموجودة في صندوق إلى كلا الاتجاهين ، ولكن يمكنك بسهولة تحديد النهاية التي تفضلها لأي مهمة. بالطبع ، يجب على المرء أن يحرص على التعامل مع كل عود أسنان فقط بحلول النهاية التي لن تمس الخميرة أو الوسط.

عود الأسنان هو بديل لحلقة التلقيح التقليدية والمتوفرة تجارياً حتى في البلاتين. نصنع حلقات التلقيح الخاصة بنا من قطعة 6 إلى 8 بوصات من قضيب نحاسي (كما هو مستخدم في اللحام بالنحاس) وسلك نيتشروم. قم بحفر ثقب صغير بالقرب من نهاية القضيب لتثبيت السلك ، وأدخل نهاية السلك في الفتحة ، ولف عدة لفات حول القضيب واترك بوصة أو اثنتين من السلك مستقيمًا. في نهاية الجزء المستقيم شكل حلقة مع زوج من كماشة الأنف الإبرة. اشعل السلك في موقد خبز حتى يتوهج باللون الأحمر لتعقيمه قبل كل استخدام ، وبالطبع اتركه ليبرد قبل أن يلمس (أو يقلى) الخميرة. لمسه للأجار يبرده على الفور.

هناك عدة طرق لنشر الخلايا. يستخدمون أنواعًا مختلفة من معدات الماصات وطرقًا مختلفة لتحريك الخلايا على سطح أجار.
طريقة صب الطلاء الكمي
تتطلب هذه الطريقة إعداد أنبوب تخفيف نهائي منفصل لكل لوحة ثم يتم سكب محتويات الأنبوب بالكامل على سطح أجار. تتميز هذه الطريقة بأنها لا تتطلب استخدام اللهب. من عيوبه عدم إمكانية استنساخه.

1. قم بعمل سلسلة من 1 إلى 10 تخفيف من معلقات خلية الخميرة.
2. الماصة 0.1 مل من المعلق المناسب في أنبوب معقم يحتوي على 0.9 مل من الماء المعقم. قم بتدوير الأنبوب لتعليق الخلايا ثم صب محتويات الأنبوب بالكامل على سطح وسط أجار. قم بإمالة اللوحة وتدويرها لتوزيع التعليق بالتساوي على سطح الأجار.
3. إذا كانت هناك بقع غير مغطاة ، استخدم عود أسنان معقم لفرد التعليق على المناطق المكشوفة.

يجب السماح للمعلق بالنقع في الأجار قبل تعريض الألواح للمعالجة التجريبية. لتسريع العملية ، اصنع أطباق الأجار عدة أيام مقدمًا واتركها تجف قليلاً قبل صب الخميرة المعلقة.

يوضح قسم الفيديو التخفيف التسلسلي وعدد الخلايا القابلة للحياة طريقة الطلاء بالصب.

طريقة الانتشار الكمي
عندما تريد بيانات دقيقة ، فمن الأفضل استخدام طريقة طلاء بديلة. يتم وضع تعليق الخلية بدقة على سطح الأجار ثم يتم نشره باستخدام مفرشة معقمة. هناك نوعان من الموزعات:

لا يوجد موزع لهب مشبك ورق
يمكنك بسهولة صنع مفرشة غير مكلفة قابلة لإعادة الاستخدام عن طريق استقامة ثنيتين في مشبك ورق كبير ، تاركًا طرفًا على شكل دبوس شعر للانتشار ومقبض مستقيم بزاوية قائمة عليه. يمكنك تعقيم عدة موزعات معًا في أكواب مغطاة أو ملفوفة بورق أو ورق.
الموزعة الزجاج الملتهب
إذا كانت لديك المعدات والمهارات اللازمة للعمل مع قضيب زجاجي ، فيمكنك صنع مفرشة زجاجية بسيطة عن طريق تسخين وثني قسم بوصة واحدة في نهاية قطعة قصيرة من قضيب الزجاج. يمكن أيضًا شراء هذه الموزعات.

1. قم بعمل سلسلة من 1 إلى 10 تخفيف من معلقات خلية الخميرة.
2. استخدم طرف ماصه جديده لماصه 0.1 مل من التعليق المناسب علي سطح الاجار. قم بضرب الأنبوب قبل أخذ العينة. إذا كنت تقوم بعمل لوحات متعددة ، فيمكنك ماصة الخلايا في كل لوحة باستخدام نفس طرف الماصة ثم نشرها دون حرق الموزعة بين كل لوحة.
3. قم بتعقيم الموزعة في 95٪ من الإيثانول ثم قم بتمرير الموزعة عبر اللهب لإشعال الكحول. امسك الموزعة بعناية حتى يحترق كل الكحول الموجود على الموزعة تمامًا. يعد استخدام لهب الكحول خطوة خطيرة وتتطلب عناية وإشرافًا دقيقًا من قبل المعلم.
4. تبريد الموزعة عن طريق لمسها في أجار. استخدم الجانب المسطح لنشر التعليق على السطح ثم استخدم الجزء المنحني من الموزعة لعمل حدود متداخلة. اقلب اللوحة 90 درجة وكرر عملية عمل ضربات متداخلة. يمكن وضع الغطاء فوق اللوحة لتقليل التلوث. تجنب نشر التعليق إلى الحافة حيث يمكن أن ينساب بين الأجار وجانب طبق بتري.

مقطع الفيديو باستخدام الخميرة لقياس الأشعة فوق البنفسجية الشمسية ، يوضح طريقة طلاء الزجاج المشتعلة.

طريقة صب الطلاء النوعية لإنتاج مروج الخلايا
تنتج هذه الطريقة نموًا سميكًا ومتساويًا للخلايا (العشب) فوق سطح صفيحة الآجار. هذه طريقة سريعة ومفيدة لمجموعة متنوعة من التجارب النوعية.

1. عمل معلق عكر لخلايا الخميرة.
2. الماصة 1.0 مل من المعلق على سطح وسط أجار. قم بإمالة اللوحة وتدويرها لتوزيع التعليق بالتساوي على سطح الأجار.
3. إذا كانت هناك بقع غير مغطاة ، استخدم عود أسنان معقم لفرد التعليق على المناطق المكشوفة.

كما هو الحال في طريقة الطلاء الكمي ، يجب السماح للتعليق بالنقع في الأجار قبل تعريض الألواح للمعالجة التجريبية. إذا قمت بإعداد أطباق الأجار قبل عدة أيام وتركتها تجف قليلاً قبل صبها على تعليق الخميرة ، فسوف تسرع العملية.

قسم الفيديو تأثير الأشعة فوق البنفسجية الشمسية على الخلايا يوضح طريقة صب الطلاء للعشب.

F. الماصات الدقيقة الأوتوماتيكية ، والأنابيب المصلية ، والماصات التي تستخدم لمرة واحدة

الماصات الآلية هي حصيلة عمل البيولوجيا الجزيئية وعلم الأحياء الدقيقة الحديث. فهي سريعة ودقيقة ، وتوفر قدرًا كبيرًا من الوقت والإحباط. غالبًا ما تتطلب التجارب في هذا الدليل استخدام ماصة 0.1 مل. على الرغم من أنها باهظة الثمن نسبيًا ، إلا أنها تجعل المهمة سريعة جدًا بحيث يمكن بسهولة مشاركة المرء من قبل العديد من الطلاب أو مجموعات المختبرات. سوف تستخدمه لعمل التخفيفات التسلسلية ولطلاء الخلايا على أجار. يتم تغليف الأطراف المعقمة في عبوات بلاستيكية قابلة لإعادة الاستخدام. تدرب على استخدام المصاصة بالماء حتى تشعر بالراحة معها. (في حالة عدم توفر المراميات الدقيقة الأوتوماتيكية ، فمن الممكن استبدال الماصات ذات اللمبة التي تستخدم لمرة واحدة أو الأنابيب المصلية أو الأنابيب الشعرية المتدرجة)

1. اضغط على الطرف الصغير من المصاصة بقوة في الطرف المفتوح للطرف بينما لا يزال الطرف في الموزع.
2. لملئه ، اضغط على المكبس ببطء حتى تشعر بمقاومة ، ولكن ليس بقدر الإمكان. اغمر الطرف في المحلول ثم حرر المكبس ببطء. إذا التصقت أي قطرات بالطرف ، امسحها على حافة الوعاء.
3. ضع الطرف في السائل في الأنبوب الذي تستخدمه بالمص ثم اضغط على المكبس ببطء. هذه المرة اضغط عليها بقدر الإمكان لطرد كل العينة. قم بإزالة طرف المصاصة من المحلول ، ثم حرر المكبس ، وتخلص من الطرف.

يمكن استخدام الأنابيب المصلية ومضخات الماصات بدلاً من الماصات الآلية. ستعطي هذه الماصات قياسات دقيقة جدًا للحجم. من الممكن شراء أنابيب مصلية معقمة بعدة أحجام. يجب أن يكون لديك مجموعة من مضخات الماصات المتاحة للطلاب لاستخدامها مع هذه الماصات. تذكر أنه ليس من الممارسات الجيدة أبدًا استخدام فمك لسحب السائل إلى الماصة. ولا حتى الماء المعقم!

تعتبر الماصات التي تستخدم لمرة واحدة مقبولة أيضًا في معظم التجارب في هذا الكتيب. ثلاث قطرات من ماصة واحدة مليمتر واحد تساوي تقريبًا 0.1 مل. قياسات الحجم ليست دقيقة ولكن هذه الأنابيب رخيصة ولا تتطلب استخدام مضخات الماصة. يمكن أيضًا شراء هذه الماصات معقمة ومغلفة بشكل فردي. توفر أغلفة الماصات المعقم مسبقًا حاملًا معقمًا مناسبًا للماصة أثناء الإجراء التجريبي.

ج. صنع ثقافة فرعية من الخميرة

يمكن توفير مغذيات الخميرة بواسطة وسط صلب أو سائل. عندما تأتي سلالات الخميرة من أحد الموردين ، فإنها عادة ما تنمو على نباتات أجار. إذا حافظت على هذه الفتحات مغلقة بإحكام وتبريدها ، يمكنك تخزينها لمدة تصل إلى عام واحد. تسمح لك الفتحات الأصغر باستخدام المسواك لتحريك الخميرة. من الأفضل أن يكون لديك ثقافات جديدة لتجاربك. لذلك في اليوم السابق الذي تنوي فيه استخدام الخميرة ، انقل عددًا صغيرًا من الخلايا من مزرعة المخزون إلى وسط طازج (عادةً YED). يمكنك استخدام حلقة ملتهبة لنقل الخلايا ولكن المسواك المعقمة أسهل في العادة. قم بلمس الخلايا الموجودة في المنحدر الذي لا تحتاج إليه لنقل العديد من الخلايا. اصنع خطًا من الخلايا على سطح الأجار ، حاول ألا تخدع سطح الأجار. يسمى هذا الإجراء الخاص بزراعة الخميرة الطازجة بالثقافة الفرعية. يجب أن تقوم بإجراء زراعة فرعية قبل 12 ساعة على الأقل من نية استخدام الخميرة.

في بعض الأحيان يتم إرسال الثقافات من مراكز مخزون الخميرة على أوراق الحليب. لعمل ثقافة فرعية جديدة: افتح الرقاقة بشكل معقم وباستخدام ملقط معقم ضع المربع الصغير من ورق الحليب على طبق أجار YED معقم. إذا قمت بمسح الورقة عبر الأجار عدة مرات ، يجب أن تحصل على مستعمرات مفردة لاستخدامها وستنمو بقعة كبيرة من الخلايا في مكان وضع الورق. سوف يستغرق الأمر من 3 إلى 5 أيام للعديد من السلالات المستزرعة بهذه الطريقة لتنمو إلى حجم مناسب. الثقافات المرسلة بهذه الطريقة أقل عرضة للظروف الجوية القاسية وأوقات السفر الطويلة.

ح. عزل المستعمرات المفردة

تتطلب العديد من التجارب نمو مستعمرات من خلايا مفردة معزولة. يمكن تحقيق ذلك بسهولة عن طريق تسليط ثقافات على صفيحة أجار بنهاية مسطحة لعود أسنان. الغرض من هذه التقنية هو تخفيف الخلايا الموجودة على سطح الأجار في خطوط متتالية ومتداخلة ، حتى يتم فصل الخلايا الفردية أو توزيعها لتشكيل مستعمرات مفردة معزولة. يوضح الشكل أدناه الأسلوب الذي يجب أن تمارسه حتى تصبح بارعًا.

تتمثل الخطوة الأولى في عمل خط واحد قصير من الخلايا (يبلغ طوله حوالي 2 سم) بالقرب من حافة الأجار في طبق بتري. باستخدام عود أسنان جديد ، اصنع خطًا متداخلاً ثانيًا بزاوية 15 درجة تقريبًا للخط الأول ، واسحب الخلايا من الخط الأول إلى أجار جديد. اصنع عدة خطوط متوازية أخرى بنفس عود الأسنان. ثم خذ عود أسنان جديد وكرر العملية بدءًا من نهاية آخر خط. كرر هذا التسلسل حتى تتم تغطية اللوحة بالكامل. نظرًا لأن عدد الخلايا التي يتم إنتاجها من خلية أصل واحدة هو استنساخ ، فهذه عملية لاستنساخ الخميرة. إذا لم تكن الثقافة نقية ، لأي سبب كان ، فإن هذا يوفر طريقة لعزل الحيوانات المستنسخة النقية. يمكن تحقيق نفس النتيجة باستخدام حلقة ملتهبة ومبردة في كل خطوة حيث يتم استخدام عود أسنان جديد. هذا النهج أبطأ ، ويخاطر بقلي الخلايا.

في بعض التجارب ، نقوم بنقل العديد من الثقافات من نوع واحد من الوسط إلى نوع واحد أو عدة أنواع أخرى ، لتحديد متطلبات نمو الثقافات. يمكن القيام بذلك باستخدام المسواك أو الحلقات ، ولكن إذا كان هناك الكثير من السلالات المراد نقلها ، فإنه يصبح شاقًا. لعبت طريقة بسيطة وسريعة - الطلاء المتماثل - دورًا رئيسيًا في تطوير علم الوراثة الميكروبية وهي واحدة من أكبر مدخرات العمالة على الإطلاق. يمكن إجراء التجارب الموضحة أدناه بدون هذه التقنية ، ولكن القيام بها أمر رائع ويستحق عناء إعدادها. حتى مع التجارب المتواضعة ، يعد الجهد استثمارًا جيدًا على المدى الطويل.

مبدأ الطلاء المتماثلة هو مبدأ ختم مطاطي.

يتم استخدام ختم قطني قطني لختم نسخة طبق الأصل من نمط الخلايا التي تنمو على لوحة واحدة إلى لوحة واحدة أو عدة لوحات أخرى. يتكون الجهاز من حامل أسطواني للقطيفة بحجم مناسب تمامًا ليناسب الجزء السفلي من لوحة بتري ، وحلقة من نوع ما لتثبيت القطيفة في مكانها. بالنسبة للألواح البلاستيكية القياسية مقاس 10 سم ، يبلغ القطر المناسب حوالي 3.3 بوصة. يمكن أن يكون الحامل أسطوانة من الخشب أو المعدن أو البلاستيك أو أي مادة أخرى يمكنك تصنيعها. يمكن أن يكون حتى علبة طعام رطل واحد أو حاوية أسطوانية ثقيلة أخرى إذا كان القاع مسطحًا. (الدائرة المقطوعة من صينية اللحم الرغوية تجعل سطحًا مسطحًا جيدًا لوضع علبة الطعام) يمكن أن تكون الحلقة التي تمسك القطيفة عبارة عن مشبك خرطوم كبير ، أو بعض الأشياء الأخرى التي تم العثور عليها ، أو حتى شريط مطاطي كبير.

بالطبع ، يجب تعقيم القطيفة ، وعادة ما يحتاج القطيفة القطنية المقطوعة حديثًا إلى إزالة الوبر بقطعة من شريط التقنيع قبل تعقيمها. الأوتوكلاف وجففها جيدا. نحن نستخدم مربعات بحجم ستة بوصات ، نقوم بتكديسها ولفها في الورق ، وتعقيمها ، ثم تجفيفها في مكان التفريغ. في حالة عدم توفر الأوتوكلاف ، جففهم في فرن دافئ أو اتركهم على المنضدة حتى يجفوا. لإعادة استخدام المربعات القطيفة ، اشطفها بالماء العادي وأعد تعقيمها. يمكن استخدام الأقمشة الأخرى مثل عدة طبقات من شاش القطن بدلاً من القطن المخمل.

لنسخة طبق الأصل ، اقلب اللوحة الرئيسية ، التي عليها خميرة ، فوق القطيفة الموجودة على الحامل واضغط على اللوحة بقوة مقابل سطح القماش المعقم. ثم انزع اللوح ببطء ، تاركًا نسخة طبق الأصل أو طباعة من نمط الخلية على القطيفة. انقل النسخة المتماثلة الموجودة على القطيفة إلى واحدة أو سلسلة من الألواح المعقمة بالضغط على كل لوحة برفق على القطيفة ثم تفرقعها. من الممكن عمل ما يصل إلى 20 نسخة متماثلة من لوحة رئيسية واحدة إذا لزم الأمر. الإجراء موضح في الشكل 13.

تتحكم الطريقة التي تزيل بها الصفيحة من القطيفة في كمية الخميرة المنقولة من القطيفة إلى الطبق أو من الصفيحة إلى القطيفة. إذا قمت بتقشير اللوحة الرئيسية من القطيفة بحركة بطيئة ومتدحرجة ، فستبقى خميرة على المخمل أكثر مما لو قمت بفكها بحركة عمودية سريعة. من المستحسن نقل أقل عدد ممكن من الخلايا مع الاستمرار في رؤية طباعة الخلايا على لوحة النسخة المتماثلة.

ج. تقدير عدد خلايا الخميرة في الثقافة

هناك العديد من الطرق لعد الخلايا بشكل مباشر ، وأكثرها شيوعًا هو استخدام غرف العد للميكروسكوب أو عدادات الجسيمات الإلكترونية. هذه لها قيمة إرشادية قليلة في علم الوراثة ، وليست مناسبة للاستخدام العام في الفصول الدراسية. لذلك ، قمنا بتصميم تجارب لا تعتمد على تعداد دقيق للجسيمات. عندما تكون هناك حاجة إلى تعداد الخلايا ، نحددها من عدد المستعمرات على اللوحات (انظر إجراءات التخفيف والطلاء).

ومع ذلك ، تتطلب العديد من التجارب إجراء تقديرات تقريبية لعدد الخلايا في معلق سائل من أجل الحصول على عدد معقول من المستعمرات المطلية. لهذا سوف تستخدم واحدة من أكثر الأدوات البصرية تعقيدًا وحساسية في الوجود: العين البشرية. مع القليل من الممارسة بشكل مدهش ، يمكنك تعلم تقدير عدد الخلايا في التعليق بمجرد النظر إليها.

يعتمد التقدير المرئي لكثافة الخلية على عتبة العين الحادة إلى حد ما لرصد التعكر. عند عرضها في أنبوب قياسي 13 × 100 مم ، فإن معلقات الخميرة التي تقل عن مليون خلية لكل مل لا تكون عكرة بشكل واضح. فوق هذه الكثافة العتبة تكون غائمة بشكل واضح. عن طريق ضبط عدد الخلايا في التعليق حتى بالكاد تكون مرئية ، يمكنك الحصول على تعليق بكثافة معروفة (حوالي 1 × 106 خلية / مل) ثم استخدام التخفيفات التسلسلية للحصول على تركيزات أخرى. (انظر أيضًا التجربة التخفيفات التسلسلية وعدد الخلايا القابلة للحياة)

  • أنابيب معقمة ، مغطاة 13 × 100 مل
  • ماء معقم
  • ماصات معقمة سعة 1 مل (أنابيب بمصباح يمكن التخلص منها أو أنابيب مصلية ومضخة ماصة)
  • الماصات الدقيقة ونصائح معقمة (اختياري)

ك. إجراءات التخفيف والطلاء

في العديد من التجارب ، يجب على المرء أن ينشر عددًا معروفًا تقريبًا من الخلايا على صفيحة لتنمو في مستعمرات. نحن نستخدم التخفيفات المتسلسلة ، ونقوم بعمل عدة تخفيفات صغيرة ، واحدة تلو الأخرى ، بدلاً من تخفيف واحد كبير. تعمل هذه الطريقة على حفظ المواد وتجنب استخدام كميات كبيرة يصعب قياسها وتعقيمها.

  • أنابيب معقمة ، مغطاة 13 × 100 مل
  • ماء معقم
  • ماصات معقمة سعة 1 مل (أنابيب بمصباح يمكن التخلص منها أو أنابيب مصلية ومضخة ماصة)
  • الماصات الدقيقة ونصائح معقمة (اختياري)
  • مشبك الورق أو الموزعة الزجاجية: يتم توزيع الخلايا على سطح الآجار باستخدام الناشرات.

الشكل 12: إستراتيجية الطلاء المخفف التسلسلي
أ. قم بإعداد تعليق يحتوي على حوالي 1 × 106 خلية / مل في ماء معقم باستخدام الإجراء الموضح في تقدير عدد خلايا الخميرة في الثقافة.
ب. امص 0.9 مل من الماء المعقم في كل من الأنابيب الثلاثة وقم بتسميتها. نوصي بعمل رسم تخطيطي في دفتر ملاحظاتك يوضح الإجراء ومعنى التسميات الخاصة بك.
ج. أعد تعليق الخلايا في التعليق الأصلي. قم بإزالة 0.1 مل باستخدام المرذاذ الصغير وطرف جديد وقم بنقله إلى أحد أنابيب الماء. ثم اضرب الأنبوب لتعليق الخلايا.
د. كرر الإجراء بشكل متسلسل ، باستخدام ماصة جديدة أو طرف ماصة لكل من الأنابيب المتبقية ، بحيث يحتوي كل أنبوب على 1/10 من عدد الخلايا كالسابق. يجب أن يحتوي التخفيف الثالث على حوالي 1 × 103 خلية / مل.

تصفيح التخفيفات:
إذا كنت تتوقع أن تنمو جميع الخلايا ، فإنك ستقوم فقط بصفيحة التخفيف النهائي ، حيث ستكون الأنابيب الأخرى شديدة التركيز وستحتوي الصفائح المصنوعة منها على عدد كبير جدًا من المستعمرات التي لا يمكن عدها. ومع ذلك ، في تجارب الإشعاع ، ستستخدم التخفيفات التي تحتوي على المزيد من الخلايا للتعويض عن انخفاض عدد الخلايا التي تنجو من التشعيع. بهذه الطريقة ستحصل على العدد الأمثل من الخلايا للعد في كل لوحة ، حتى عندما تكون معظم الخلايا ميتة.

ه. سيكون لديك بيانات أفضل إذا قمت بإجراء جميع اللوحات في نسختين أو ثلاث نسخ. قم أولاً بتسمية اللوحات باستخدام قلم تعليم (Pilot SC-UF أو Sharpie). (ستستخدم أيضًا هذا النوع نفسه من القلم لتمييز المستعمرات عند عدها.) نوصي بتحديد كل لوحة برقم السلالة ، والجرعة (للتجارب الإشعاعية) ، والتخفيف المصقول ، والأحرف الأولى من اسمك ، ولكن قد تفضل لتشفير هذه المعلومات في ملاحظاتك ووضع الرموز أو الأرقام على اللوحة. اكتب فقط على الغطاء أو بأحرف صغيرة على حافة القاع ، تاركًا الجزء السفلي واضحًا لتمييز المستعمرات عند عدهم.

F. أعد تعليق الخلايا في كل أنبوب عن طريق دفعه قبل أخذ عينة ، ثم الماصة 0.1 مل في وسط كل من اللوحات المكررة. إذا كنت تستخدم موزعات مشبك الورق ، فاخذ مفرشة معقمة من الظرف. إذا كنت تستخدم رشاش زجاج ، فقم بإزالته من الكحول ، وأشعل لهبًا ، وبعد احتراق اللهب ، المسه بأجار إحدى اللوحات بعيدًا عن الخلايا. انشر الخلايا على السطح باستخدام أي مفرشة ، مع الحرص على إبقاء الخلايا على بعد 0.5 سم على الأقل من حافة الأجار. (إذا كنت تستخدم ماصة طريقة الطلاء بالصب ، 0.1 مل من المعلق في 0.9 مل من الماء المعقم. اخلط الخلايا في الماء. صب كل الخليط على سطح الأجار ثم قم بإمالة اللوح وتدويره حتى ينتشر الخليط بالتساوي على سطح أجار.)

ل. الفحص المجهري للخميرة

أسهل طريقة لفحص الخميرة تحت المجهر هي النظر إليها مباشرة على اللوحة. يعمل هذا فقط مع الأهداف منخفضة الطاقة (10x) لأن الأهداف ذات الطاقة الأعلى تقترب جدًا من الأجار والضباب. لرؤية المزيد من التفاصيل ، قم بعمل شريحة مبللة. ضع قطرة ماء على شريحة مجهر. انقل كمية صغيرة من الخميرة إلى الماء باستخدام عود أسنان معقم وحركه قليلاً. ثم ضع ساترة فوق تعليق الخميرة على الشريحة. إذا كان سيتم عرض الاستعدادات من قبل عدد من الطلاب ، فقم بإغلاق قسيمة الغطاء على الشريحة باستخدام طلاء أظافر الأصابع وستكون الشريحة قابلة للعرض لعدة ساعات. لا ينبغي أن يكون الغمر بالزيت ضروريًا ولمجرد ملاحظة أشكال الخلايا ، ليس من الضروري تلطيخها. باستخدام طرق التلوين المناسبة ، يمكن رؤية النواة ، لكن صبغيات الخميرة صغيرة جدًا بحيث لا يمكن رؤيتها باستخدام معظم المجاهر الضوئية.

بالنسبة للعروض التوضيحية في الفصل الدراسي ، قد ترغب في استخدام مجهر فيديو. هناك عدد من مجاهر الفيديو الجيدة جدًا المتوفرة في السوق. إذا لم يكن لديك واحد ، فمن الممكن الحصول على العديد من نفس النتائج باستخدام مجهر الفصل وكاميرا الفيديو المنزلية. عندما ننظر من خلال المجهر ، فإن أعيننا تركز على اللانهاية. إذا وضعنا كاميرا فيديو بالقرب من عين المجهر وضبطنا تركيز الكاميرا على ما لا نهاية ، فسوف "ترى" نفس الشيء مثل أعيننا. يساعد على قطع الضوء الذي يدخل من الجانب عن طريق لف عدسة الكاميرا ومجهر العين بقطعة قماش داكنة أو رقائق الألومنيوم.

تستفيد التجارب من السلالات التالية:

سلالات النوع البري: ستنمو على وسائط MV أو YED
HA0: نوع التزاوج أ
HB0: نوع التزاوج أ

سلالات حمراء تتطلب الأدينين من النوع البري لـ ADE2 ستنمو على وسائط YED أو MV + adenine
HA1: نوع التزاوج أ ade1
HB1: نوع التزاوج أ ade1

سلالات حمراء تتطلب الأدينين من النوع البري لـ ADE1 ستنمو على وسائط YED أو MV + adenine
HA2: نوع التزاوج أ ade2
HBR: مطابق لـ HA2
HB2: نوع التزاوج أ ade2
HBR: مطابق لـ HB2

ستنمو المسوخات المزدوجة الحمراء التي تتطلب الأدينين على وسائط YED أو MV + adenine
HA12: نوع التزاوج أ ade1 ade2
HB12: التزاوج من النوع أ ade1 ade2

أبيض ، يتطلب التربتوفان طفرات: سينمو على YED أو MV + tryptophan
القبعة: نوع التزاوج أ trp5
HBT: نوع التزاوج أ trp5

سوف تنمو طفرات مزدوجة حمراء تتطلب الأدينين وتتطلب التربتوفان على وسط YED
هارت: نوع التزاوج أ ade2 trp5
HBRT: نوع التزاوج أ ade2 trp5

ينمو اللون الأحمر ، الذي يحتاج إلى الأدينين ، والذي يحتاج إلى الليوسين على وسط YED
HA1L: نوع التزاوج أ ade1 ليو 2

سلالة حساسة للأشعة فوق البنفسجية ناقصة في إصلاح الختان والإصلاح المعرض للخطأ والتعطيل الضوئي
ينمو على وسائط MV أو YED
G948-1C / U: نوع التزاوج أ rad1 rad18 phr1

تُعرف السلالات أيضًا بالتعيينات البديلة التالية
BSCS علم الوراثة الخميرة الخضراء
مركز مخزون نص الإصدار
HA0 a1 XP837-S10
HB0 a1 XP837-S11

HA1 XP300-38B
HB1 XP823-S34

HA2 a2 XP832-S25
HAR a2 XP832-S25

HB2 a 2 XP820-S4
HBR a 2 XP820-S4

HA12 XP300-29C
HB12 XP300-40C

HAT a3 XP837-S5
HBT a 3 XP837-S6

هارت a4 XP837-S8
HBRT a 4 XP837-S9

ن. الخميرة المشعة بالأشعة فوق البنفسجية

تعد مصابيح UV-C القياسية المبيدة للجراثيم ، وهي عبارة عن أنابيب تصريف بخار الزئبق منخفضة الضغط ، مصدرًا مثاليًا للأشعة فوق البنفسجية
لإشعاع الخميرة من النوع البري بإنزيمات ترميم الحمض النووي الطبيعية. ضوء الشمس أو الكوارتز الهالوجين جيدة
مصادر الأشعة فوق البنفسجية لإشعاع السلالات الطافرة من الخميرة التي تعاني من نقص في إنزيمات ترميم الحمض النووي الطبيعية.

تعد مصابيح UV-C القياسية القاتلة للجراثيم من أنابيب الفلورسنت الشائعة التي لا تحتوي على طلاء فلوري وبغلاف
هذا شفاف للأشعة فوق البنفسجية. يعتبر طيف الزئبق منخفض الضغط من الطيف الخطي الأكثر بروزًا
خط طوله الموجي 253.7 نانومتر. هذا قريب جدًا من 260 نانومتر الذي يعد مثاليًا لـ
امتصاص الحمض النووي.

كان تصميم الأشعة فوق البنفسجية. تملي غرفة الإشعاع عدة اعتبارات ، أهمها السلامة.
(انظر تعليمات بناء غرفة إشعاع فوق البنفسجي) سوف يسبب الإشعاع المنبعث من مصابيح مبيد الجراثيم
حروق مؤلمة وخطيرة للعيون والجلد لذلك يجب حمايتها بشكل فعال. لا يمكن أن يكون التعرض للخلايا
يتم التحكم فيها عن طريق تشغيل المصباح وإيقاف تشغيله لأن شدة خرج المصباح قوية
حسب درجة الحرارة. لذلك ، يجب أن يكون محاطًا بصندوق محمي بآلية مصراع حتى يمكن تسخينه
حتى درجة حرارة ثابتة قبل استخدامها. يجب أن يكون الباب والغالق متشابكين حتى لا يتمكنوا من كليهما
كن مفتوحًا في نفس الوقت.

إجراءات التشغيل لغرفة الأشعة فوق البنفسجية:

1. قم بتوصيل المصباح وتشغيله. يمكنك معرفة وقت تشغيل المصباح بأمان من خلال رؤية ضوء المؤشر.
2. اترك المصباح يسخن لمدة 30 دقيقة ، إن أمكن.
3. قم بتوسيط طبق بتري ليتم تعريضه للعلامة الموجودة في أسفل الصندوق ، ثم قم بإزالة غطاء اللوحة ، ثم قم بخفض الغطاء برفق
الباب وافتح المصراع. قم بقياس وقت التعريض الضوئي من وقت فتح المصراع. عندما ينقضي الوقت ،
أغلق المصراع ، ارفع الباب برفق ، ضع الغطاء على طبق بتري وقم بإزالته. تحريك الباب بسرعة كبيرة
يسبب اضطرابًا جويًا يحتمل أن يتسبب في تلوث ألواح أجار. إذا كان الصندوق مزودًا بمصباح UV-B
يمكن اتباع نفس الإجراء.

إجراء التعرض باستخدام أشعة الشمس أو مصابيح الهالوجين الكوارتز:

1. قم بتغطية الطبق بورق داكن ، وحين يظل مغطى ، ضع الطبق بزاوية 90 درجة مع الضوء
مصدر. إذا كنت تستخدم ضوء هالوجين كوارتز ، فقم بإزالة الغطاء الزجاجي من الضوء. بينما الشمس و
ينتج ضوء الفناء من الأشعة فوق البنفسجية أقل من أنبوب مبيد الجراثيم الذي يجب على المرء أن يتخذ الاحتياطات المعقولة. لا تفعل
انظر مباشرة إلى المصدر وتجنب أي تعرض مباشر طويل الأمد للجلد.

تنبيه: لمبة الهالوجين الكوارتز تسخن بشدة. يجب أن يكون استخدام هذا المصباح تحت الإشراف المباشر لـ
معلم.

2. قم بإزالة الغطاء الداكن من اللوحة وابدأ في قياس وقت التعرض. عندما ينقضي الوقت الغطاء
الطبق وانقله إلى الحاضنة. عادة لا يكون من الضروري إزالة الغطاء من أطباق بتري البلاستيكية عندما
كنت تستخدم أشعة الشمس أو الكوارتز الهالوجين كمصدر للأشعة فوق البنفسجية. معظم أطباق بتري البلاستيكية شفافة إلى
أطوال موجات الأشعة فوق البنفسجية التي تنتجها هذه المصادر. قد ترغب في تشغيل تجربة تجريبية على كل دفعة جديدة من بيتري
أطباق. إذا كنت تحصل على معدلات بقاء أعلى مما تتوقع ، فقد ترغب في إزالة الجفن أثناء الأشعة فوق البنفسجية
مكشوف. إذا أصبح التلوث مشكلة ، فقد ترغب في تغطية الأطباق بغطاء بلاستيكي رفيع أو بغطاء
كيس شطيرة. لن تمتص هذه الأغشية البلاستيكية الرقيقة كميات كبيرة من الأشعة فوق البنفسجية.

العودة للقمة
انقر هنا للعودة
آخر تحديث الأربعاء 24 فبراير 99 02:04:12


تربية المرق الفرعية

احصل على عدد 2 من أنابيب الاستزراع الزجاجي المعقم ، وزجاجة من Tryptic Soy Broth (TSB) ورف أنبوب اختبار. باستخدام قطع صغيرة من الشريط الملون ، قم بتسمية كل أنبوب باسمك وإما "S" للثقافة الفرعية ، أو "C" للتحكم. باستخدام تقنية التعقيم ، استخدم ماصة متدرجة 10 مل لنقل 2 مل من المرق إلى كل أنبوب.

كما هو موضح ، استخدم حلقة تلقيح معقمة باللهب لالتقاط من سطح م. لوتس زراعة لوحة الخطوط ، مستعمرة واحدة (إذا كانت صغيرة) أو جزء من مستعمرة (إذا كانت كبيرة) ونقلها إلى المرق في الأنبوب المسمى "S." لا تضف شيئًا إلى الأنبوب الثاني "C" والذي سيكون بمثابة أداة تحكم في التعقيم. لاحظ كيف تبدو المرق فورًا بعد تلقيحها (يجب أن تبدو شفافة في الغالب). يشار إلى النمو البكتيري في المرق من خلال تطور المظهر الغائم. إذا بدا المرق الملقح حديثًا غائمًا في البداية ، فلن يكون لديك طريقة لتحديد ما إذا كان هذا بسبب نمو البكتيريا خلال فترة الحضانة. إذا بدا مرقك عكرًا ، فتخلص منه واصنع مرقًا آخر باستخدام بكتيريا أقل.

ضع ثقافات المرق الفرعية في حاضنة في درجة الحرارة والوقت المحددين من قبل معلمك.


1 المقدمة

لدى ناسا حاليًا خطط لإعادة البشر إلى القمر ، وفي النهاية تهبط بعثات مأهولة على المريخ. هذا الهدف غير قابل للتحقيق ما لم نتمكن من ضمان سلامة وصحة طاقم رواد الفضاء والبيولوجيا الأرضية الأخرى في تلك المهمات. الهدف من هذا إنطباع هو تقديم مقدمة موجزة لأمثلة من التقنيات السابقة والحالية في أبحاث بيولوجيا الفضاء ، وكيفية تأثيرها على تطوير تقنيات المستشعر الحيوي للبعثات المستقبلية إلى الفضاء السحيق. كانت المرة الأخيرة التي أجرت فيها وكالة ناسا تجارب في البيولوجيا الفضائية خارج مدار الأرض المنخفض (LEO) أثناء مهمة أبولو 17 في عام 1972. ومنذ ذلك الحين ، اقتصرت البعثات طويلة الأمد على المدار الأرضي المنخفض ، مثل تلك التي كانت إلى محطة الفضاء الدولية (ISS).

تتميز بيئة الفضاء السحيق بالإشعاع المؤين وانخفاض الجاذبية ، وكلاهما يمكن أن يكون لهما آثار ضارة على علم الأحياء. خارج الغلاف المغناطيسي للأرض و # x02019s ، ستتعرض البيولوجيا لهطول مستمر منخفض التدفق من الإشعاع المؤين عالي الطاقة ، مثل الأشعة الكونية المجرية (GCRs) وأحداث الجسيمات الشمسية (SPEs). يتسبب الإشعاع المؤين في إلحاق الضرر بالبيولوجيا من خلال عدة وسائل ، بما في ذلك الضرر المباشر للحمض النووي مثل الانكسارات المزدوجة الجديلة والأضرار غير المباشرة مثل تلك التي تسببها أنواع الأكسجين التفاعلية [1]. تؤدي الجاذبية الصغرى أيضًا إلى مخاطر صحية مثل ضمور العضلات وفقدان كثافة العظام لدى البشر. يمكن أن يكون لانخفاض الجاذبية تأثيرات على المستوى تحت الخلوي أيضًا ، مما يؤثر على التعبير الجيني ومسارات نمو الخلايا [2]. على سبيل المثال ، في النباتات ، تؤدي ظاهرة على المستوى الخلوي تسمى الجاذبية إلى نمو الجذور إلى أسفل ، ولكن في الفضاء تنمو جذورها بشكل عشوائي [3]. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن العديد من البكتيريا تُظهر ضراوة متزايدة ومقاومة للمضادات الحيوية عند تعرضها لبيئة الفضاء [4].

لسوء الحظ ، يكاد يكون من المستحيل تقليد الظروف المعقدة للفضاء باستخدام منشآت على الأرض. تقتصر محاولات نمذجة البيئة الفضائية على مسرعات الجسيمات ومصادر الإشعاع أحادية العنصر لمحاكاة الإشعاع الكوني وأوعية الجدران الدوارة أو الأدوات المماثلة لمحاكاة الجاذبية الصغرى. ومع ذلك ، لا يمكن حتى للمنشآت التي تقوم بنمذجة GCR من خلال تعريض العينات البيولوجية على التوالي لجسيمات مفردة عالية الطاقة أن تتداخل مع كل من الإشعاع والجاذبية الصغرى لتعكس ظروف الفضاء. وبالتالي ، فإن مهمات الطيران ضرورية لاكتساب نظرة ثاقبة أساسية حول كيفية عمل علم الأحياء في مثل هذه البيئة الفريدة والعدائية.

من الأهمية بمكان بالنسبة لمستقبل استكشاف الفضاء إجراء المزيد من الدراسات البيولوجية للاستعلام عن بيئة الفضاء السحيق ، ومع ذلك ، فإن إرسال البشر إلى الفضاء أمر مكلف وخطير. تتمثل إحدى طرق تبسيط التجارب البيولوجية في استخدام الكائنات الحية النموذجية ، بما في ذلك الميكروبات والنباتات واللافقاريات والقوارض. منذ عام 1972 ، قامت وكالة ناسا بالعديد من المهام داخل المدار الأرضي المنخفض التي استخدمت كائنات نموذجية لفهم التأثيرات البيولوجية لبيئة الفضاء. تعطي حقيقيات النوى متعددة الخلايا ذات الترتيب الأعلى مثل القوارض أو الرئيسيات معلومات أكثر صلة بالإنسان. ومع ذلك ، فإنها غالبًا ما تتطلب تقنية معقدة وضخمة وتتطلب موارد مكثفة للحفاظ عليها. في حين تم إجراء العديد من التجارب الفضائية باستخدام حقيقيات النوى الأعلى ، فإن المهمات المخطط لها حاليًا خارج المدار الأرضي المنخفض تشمل فقط الميكروبات وبذور النباتات [5،6]. ستحمل مركبة ناسا Artemis-1 خمس حمولات بيولوجية تتجاوز المدار الأرضي المنخفض أربعة ستكون داخل كبسولة Orion متعددة الأطقم تحمل كائنات نموذجية مثل الفطريات والطحالب وبذور النباتات ، وسيحمل القمر الصناعي BioSentinel الخميرة الناشئة خميرة الخميرة [7]. تم اختيار هذه الكائنات الحية النموذجية ليس فقط لأنها تشترك في أوجه التشابه مع الخلايا البشرية ، ولكن أيضًا لأنها يمكن أن تظل قابلة للحياة في حالة ركود لفترات طويلة من الزمن. تتطلب جداول الإطلاق الحالية تكامل الحمولة حتى عام أو أكثر قبل تاريخ الإطلاق المتوقع. بمجرد التكامل ، ستكون التجارب بدون دعم للحياة ، وستكون معرضة لدرجة الحرارة والرطوبة المحيطة بمنشأة التخزين ، حتى تبدأ المهمة. وبالتالي ، فإن العامل المحدد الذي يمنع استخدام خلايا الثدييات في منصات CubeSat الحالية هو ظروف ما قبل التشغيل الحالية ، وليس قيود التكنولوجيا. تشمل الفوائد الإضافية لاستخدام الميكروبات ككائنات نموذجية ، مقارنةً بحقيقيات النوى الأعلى ، أنها تتطلب الحد الأدنى من الرعاية والتفاعل وأنه يمكن إجراء الاختبارات البيولوجية والكيميائية الحيوية ذات الصلة باستخدام أدوات صغيرة منخفضة التكلفة.

من خلال الجمع بين الميكروبات وتصغير وأتمتة التقنيات الجديدة ، من الممكن إجراء تجارب معقدة للغاية. يتطلب البحث البيولوجي في الفضاء أجهزة متخصصة للغاية ، مثل الموائع الدقيقة وأجهزة استشعار الكشف ، فضلاً عن التشغيل الآلي الموثوق به ومعالجة البيانات. الأقمار الصناعية الصغيرة المعروفة باسم CubeSats هي منصات يمكنها تلبية هذه المتطلبات ، ويمكن استخدامها للإجابة على أسئلة حول تأثيرات بيئة الفضاء على علم الأحياء. في السنوات الأخيرة ، تم استخدام المستشعرات الحيوية المشتقة من الميكروبات الموجودة على CubeSats ، على سبيل المثال ، للتحقق من تأثير الجاذبية الصغرى على مقاومة المضادات الحيوية في البكتيريا المسببة للأمراض ودراسة تأثير مبيد الفطريات على خلايا الخميرة [8،9]. تم بناء هذه الدراسات الحديثة على أساس عقود من أبحاث بيولوجيا الفضاء.


حماية

لا ينبغي تخزين الطعام أو الشراب أو استهلاكه في مختبر يستخدم في علم الأحياء الدقيقة. لا ينبغي لأحد أن يلعق الملصقات أو يضع مستحضرات التجميل أو يمضغ العلكة أو يمتص الأقلام أو أقلام الرصاص أو يدخن في المختبر. يجب غسل اليدين بالصابون المطهر بعد التعامل مع الثقافات الميكروبية وعند مغادرة المختبر. في حالة الاشتباه في تلوث اليدين ، يجب غسل اليدين فورًا بصابون مطهر. لضمان عدم إصابة أي جروح أو جروح أو خدوش بالعدوى أو انتقال العدوى ، قم بحمايتها باستخدام الضمادات المقاومة للماء أو ارتداء القفازات الجراحية التي تستخدم لمرة واحدة.


إجراء للحصول على الثقافة الفطرية | علم النبات

يقوم عالم الفطريات بإثارة الثقافة النقية للفطر لدراسة الفطر بالتفصيل فيما يتعلق بالتكاثر وعلم وظائف الأعضاء وعلم الوراثة.

قد تكون الثقافة النقية على مادة صلبة / وسط سائل وفي الحصول على الثقافة النقية للكائن الحي ، يستخدم أخصائي الفطريات إجراءً معينًا.

1. إعداد الثقافة الإعلامية:

تنظيف الأواني الزجاجية:

يجب تنظيف جميع الأواني الزجاجية المستخدمة في الدراسات الميكروبيولوجية أو المرضية بشكل صارم. يجب أن يتم التنظيف الأولي بالصابون أو باستخدام فرشاة.

يمكن أخيرًا غسلها بالمزيج التالي:

يمكن استخدام نفس الخليط عدة مرات. بعد الغسل بهذا المزيج ، تُغسل الأواني الزجاجية أحيانًا في ماء الصنبور الجاري ، ثم في النهاية بالماء المقطر ويُترك لتجف في الهواء.

يعتمد اختيار الوسيلة على نوع الكائن الدقيق المراد زراعته مع مراعاة المتطلبات الغذائية لشكل معين.

من بين عدد كبير من هذه الوسائط ، يتم وصف بعضها أدناه:

(ط) بناءً على الاتساق ، فإن وسائط الثقافة من نوعين:

(أ) الوسائط السائلة أو المرق:

هذه الوسائط سائلة في تناسق وتستخدم في الحالات التي يتم فيها فصل النمو الميكروبي في شكل نقي لإجراء مزيد من الدراسات.

يمكن ترسيخ الوسائط السائلة بإضافة Agar-Agar ، وهي مادة تشبه الهلام يتم استخلاصها من عشب البحر ، Gelidium. إضافة حوالي 1.5٪ من هذه المادة عند أو بالقرب من الرقم الهيدروجيني المحايد كافٍ لجعل الوسط صلبًا.

(2) بناءً على التكوين ، قد تكون وسائط الثقافة من نوعين:

(أ) وسائل الإعلام الطبيعية:

تتضمن هذه الوسائط بعض المواد المتوفرة بشكل طبيعي من & # 8220 إلى حد ما & # 8221 تكوين غير معروف. بعض الأمثلة على هذه الوسائط هي: Malt extract agar. مستخلص التربة أجار. أجار دقيق الشوفان وأجار دكستروز البطاطس.

يشيع استخدام أجار دكستروز البطاطس في الدراسات المرضية للنبات.

يتم إعطاء تركيبة أجار البطاطس دكستروز (PDA) أدناه:

يُسمح لشرائح البطاطس أن تنضج في 500 مل. يضاف الماء المقطر ، المستخلص المصفى بواسطة قماش موسلين ، سكر العنب ومسحوق أجار أجار ، الحجم يصل إلى 1000 مل ويغلي.

(ب) الوسائط الاصطناعية:

هذه الوسائط لها مكونات معروفة.

من أمثلة الوسائط التركيبية وسائط تركيبية قياسية ووسائط Czapek-Dox ، ويرد تركيبها أدناه:

يتم وزن جميع المكونات من الماء المقطر المضاف ويسخن الخليط حتى الغليان. سيكون من الأفضل إضافة K.2HPO4 أو KH2ص4 في النهاية لتجنب هطول الأمطار. يتم ضبط الأس الهيدروجيني حسب الرغبة عن طريق إضافة محلول NaOH أو حامض الستريك بالكمية المطلوبة.

ترشيح الوسائط والاستغناء عنها في أنابيب الاستزراع أو Flasك:

إلى قمع كبير ، يتم تركيب أنبوب مطاطي مع محبس توقف. يتم ترشيح الوسيط من خلال قطعة قماش موسلين ويتم توزيع الكميات المناسبة في أنابيب الاستزراع (6 & # 8243 × 3/4 & # 8243) أو قوارير (سعة 250 مل) ، عن طريق ضبط محبس الإيقاف.

يجب أن تكون جميع الأواني الزجاجية التي سيتم الاستغناء عنها في الوسط موصولة بصوف قطني. يجب أن تستقبل أنابيب الثقافة التي يُقصد بها أن تكون منحدرات أجار حوالي 10 مل من الوسط بينما تلك المستخدمة في النهاية للطلاء (في القوارير) حوالي 50 مل. يجب وضع الوسط المتبقي في قوارير ، وسدها بقطن قطني واستخدامها حسب الحاجة.

تعقيم الوسط: التعقيم بالبخار المضغوط:

يجب تعقيم الوسائط التي يتم الاستغناء عنها بالبخار في الأوتوكلاف لمدة 15 مترًا عند ضغط 16 رطلاً / بوصة. للراحة ، يتم ترتيب أنابيب الاستزراع في سلة سلكية ثم يتم وضعها في الأوتوكلاف. قبل فتح الأوتوكلاف ، يُسمح للضغط أن ينخفض ​​إلى الصفر.

يجب إخراج أنابيب الاستزراع التي تحتوي على 10 مل من الوسط والمخصصة للاستخدام كأنابيب مائلة من الأوتوكلاف بينما تكون ساخنة ، وتدور قليلاً ، وتوضع في وضع مائل على رف مائل وتترك لتبرد.

الوسيط بسبب وجود أجار أجار سيتصلب عند التبريد. شجيرات أجار جاهزة الآن للعمل الثقافي.

تعقيم الأواني الزجاجية:

1. التعقيم بالحرارة الجافة:

يتضمن ذلك تسخين الأواني الزجاجية (خاصة الزبدة المخصصة لأعمال الزراعة) في فرن كهربائي & # 8216an على درجة حرارة 150 درجة مئوية لمدة 30 مترًا. يجب أن يتم تغليف البتريدات بكميات مناسبة في ورق الخيزران وربطها بخيط ثم وضعها في الفرن.

2. التعقيم بالبخار:

بالنسبة لنوع معين من أعمال الثقافة ، يجب استخدام هذه الطريقة. يجب أن يتم توصيل الأواني الزجاجية بقطن الصوف وتعقيمها بالبخار في الأوتوكلاف بضغط 15 إيبس / بوصة لمدة 15 مترًا.

يجب أن يتم ذلك في غرفة استزراع معقمة عن طريق تبخير الكبريت أو الفورمالين. يجب تنظيف الطاولة التي سيتم تنفيذ العملية عليها بقطعة قطن مغموسة في الكحول.

ستساعد كل هذه الخطوات في التحقق من تلوث الأطباق بالكائنات الحية الدقيقة غير المرغوب فيها. يجب استخدام وسط القارورة للطلاء. إذا تجمد الوسيط الموجود في القوارير ، فيجب صهره في حمام مائي.

يجب نقل القوارير إلى غرفة الاستزراع ، وفتح السدادة القطنية ، وتسخين الفم بلطف على اللهب ، والغطاء العلوي للبتريد مرفوعًا قليلاً ، ويتم سكب الوسط في الغرفة ، واستبدال الغطاء ، والسماح للوسط بالتبريد.

يجب تنفيذ عملية طلاء الوسيط في أقل وقت ممكن لتجنب أي تلوث. الآن ، أصبحت النباتات المزروعة بوسط الاستزراع جاهزة للتلقيح بالكائنات الحية الدقيقة.

2. عزل الكائنات الدقيقة من التربة:

تم ابتكار طرق مختلفة لعزل الثقافات النقية للكائنات الحية الدقيقة عن التربة.

يشيع استخدام الطرق التي تنتج طيفًا واسعًا نسبيًا من الكائنات الحية الدقيقة من قبل علماء أمراض النبات لعزل مسببات الأمراض التي تنتقل عن طريق التربة ويتم وصفها هنا:

يتم نقل فتات التربة التي يبلغ قطرها حوالي 1 سم بواسطة ملقط معقم إلى مركز نبات معقم يحتوي على وسط أجار صلب. يتم تحضين طبق بتري عند 28-30 درجة مئوية ويتم قطع الفطريات المشعة من فتات التربة ونقلها إلى مائل أجار.

يتم نقل كمية صغيرة من التربة إلى نبات معقم بمساعدة ملعقة معقمة. يضاف 20 مل من وسط الآجار المذاب والمبرد إلى التربة المحتوية على بتري وشيدش ويتم اهتزازها بلطف بحيث تتشتت جزيئات التربة في جميع أنحاء وسط الآجار.

يتم تحضين النبات الذي تم الحصول عليه بهذه الطريقة عند 28 درجة -30 درجة مئوية لبضعة أيام وبعد ذلك تبدأ الفطريات في الظهور. يتم الحصول على الثقافات النقية للفطر المرغوب فيه عن طريق نقل تلك الفطريات المعينة إلى شجيرات أجار.

3. طرق تخفيف التربة:

10 جرام. من عينة التربة تؤخذ في دورق مخروطي سعة 250 مل. يضاف إلى ذلك 100 مل من الماء المعقم ويتم رج القارورة بقوة لبضع دقائق حتى يتم الحصول على محلول التربة.

سيمثل هذا 1:10 أو 1/10. يؤخذ 10 مل من محلول 1/10 هذا ويضاف 90 مل من الماء المعقم ويكون المحلول الناتج 1/100. بنفس الطريقة ، يتم إجراء تخفيفات أخرى مثل 1/1000 و 1/10000 و 1/100000.

يُسكب واحد مل من التخفيف المرغوب في طبق بتري معقم ويضاف إليه 20 مل من وسط أجار مذاب ومبرد. يتم تدوير طبق بتري يدويًا لتفريق الوسط وتعليق التربة.

ثم يتم تحضين أطباق بتري عند 28 درجة مئوية إلى 30 درجة مئوية لبضعة أيام وبعدها يحدث نمو الفطريات. ثم يتم الحصول على الثقافات النقية للفطريات عن طريق نقلها إلى مائل أجار.

يتم الحصول على الاستنبات الفطري بشكل نقي عن طريق تلقيح بوغ واحد أو قطعة من الفطريات على وسط أجار في مائل الأنبوب أو في نباتات نباتية كما هو موضح في الشكل 17.11. يتم تغطية لوحة أجار الملقحة ويتم توصيل أنبوب الأنبوب بصوف قطني غير ماص.

ثم يتم وضعها في حاضنة يتم الاحتفاظ بها عادة عند درجة حرارة 30-37 درجة مئوية لبضعة أيام وبعد ذلك ستظهر لوحات وشرائح الآجار نموًا فطريًا في شكل نقي.


شاهد الفيديو: اضرار اليوريا - ماذا يحصل لو زادت كمية اليوريا للنبات (قد 2022).