معلومة

هل أتوقع أن يترسب الملح على ألياف الحمض النووي في محلول ماء كلوريد الصوديوم؟

هل أتوقع أن يترسب الملح على ألياف الحمض النووي في محلول ماء كلوريد الصوديوم؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد أجريت مؤخرًا تجربة في صفي للكيمياء الحيوية حيث اضطررنا إلى إضافة الحمض النووي إلى الماء المقطر ، ومحلول ملحي متساوي التوتر و 2.5 مولار كلوريد الصوديوم. لقد لاحظت جوانب فيزيائية مختلفة اعتمادًا على المذيب ، لكنني لست متأكدًا من كيفية تصنيفها. هذا ما رأيته:

  • المقطر: راسب ليفي ، سائل معكر
  • متساوي التوتر: بصراحة هل لاحظت تغييرًا هنا؟ ربما لم أكن أبحث بجد بما فيه الكفاية
  • 2.5 م: ترسب الملح في القاع والألياف

أعلم أن الحمض النووي قطبي ، لذا يجب أن تزداد قابلية الذوبان مع زيادة قطبية المذيب. ولكن حسب ما أذكره لم يختلف كثيرًا ما رأيته في 2.5 مليون ملحي مقابل الماء المقطر. ومع ذلك ، هناك دائمًا احتمال أنني قد ارتكبت بعض الأخطاء التجريبية التي أدت إلى ملاحظات غير دقيقة.

لذا ، هل يمكن لأي شخص أن يساعدني في استنتاج قابلية ذوبان الحمض النووي (ببساطة قابل للذوبان / غير قابل للذوبان) في كل من هذه المذيبات ، أو يحيلني إلى ورقة يمكنني قراءتها؟ شكرا لك مقدما!


عملية استخراج الحمض النووي من الخلية هي الخطوة الأولى للعديد من الإجراءات المختبرية في مجال التكنولوجيا الحيوية. يجب أن يكون العالم قادرًا على فصل الحمض النووي عن المواد غير المرغوب فيها للخلية برفق بما يكفي حتى لا يتفكك الحمض النووي.

من المثير للاهتمام والمهم فهم سبب بعض الخطوات في الإجراء أدناه. يستخدم البصل لأنه يحتوي على نسبة منخفضة من النشا ، مما يسمح برؤية الحمض النووي بوضوح. يحمي الملح أطراف الفوسفات السالبة للحمض النووي ، مما يسمح للأطراف بالاقتراب بحيث يمكن للحمض النووي أن يترسب من محلول الكحول البارد. يتسبب المنظف في انهيار غشاء الخلية عن طريق إذابة الدهون والبروتينات في الخلية وتعطيل الروابط التي تمسك غشاء الخلية معًا. ثم يشكل المنظف معقدات مع هذه الدهون والبروتينات ، مما يؤدي إلى ترسبها من المحلول.


اللوني

يعد الفصل اللوني للعمود أحد أكثر طرق تنقية البروتين شيوعًا. مثل العديد من التقنيات الموجودة في هذا الموقع ، فهو شكل فني بقدر ما هو علم. تختلف البروتينات بشكل كبير في خصائصها ، وتسمح لك الأنواع المختلفة من كروماتوغرافيا العمود باستغلال هذه الاختلافات. معظم هذه الطرق لا تتطلب تغيير طبيعة البروتينات.

لكي يكون البروتين عامًا جدًا ، يتم تمرير البروتين عبر عمود مصمم لاحتجاز أو إبطاء مرور البروتينات بناءً على خاصية معينة (مثل الحجم أو الشحن أو التركيب).

هناك ثلاث خطوات رئيسية لتنقية البروتين:

1. التقاط. تحتاج إلى الحصول على البروتين الخاص بك في صورة مركزة. على سبيل المثال ، إذا كنت تحاول عزل البروتين الذي صنعته في خلية الإشريكية القولونية ، يمكن أن تبحث في نسبة البروتين إلى الخردة 1: 1،000،000. لتنقية الالتقاط ، تحتاج إلى طريقة عالية السعة سريعة أيضًا. أنت بحاجة إلى طريقة سريعة لأن المحلول الخام الخاص بك من المحتمل جدًا أن يحتوي أيضًا على البروتياز ويمكن أن يمضغ البروتين بسرعة.

2. متوسط. يتطلب التنقية المتوسطة السرعة والقرار الجيد.

3. تلميع. لخطوة التنقية النهائية ، تحتاج إلى نظام يتمتع بالدقة والسرعة الجيدين. القدرة غير ذات صلة عادة في هذه المرحلة.

تتضمن بعض الأعمدة الأكثر شيوعًا ما يلي:

IEX: كروماتوغرافيا التبادل الأيوني. جيد للالتقاط والمتوسط ​​والتلميع.

HIC: عمود تفاعل كاره للماء. جيد للتنقية المتوسطة.

AC: اللوني تقارب. جيد للقبض والتنقية المتوسطة.

GF: الترشيح الهلامي (استبعاد الحجم) اللوني. خطوة تلميع جيدة.

لنلقِ نظرة على هذه الأنواع من الأعمدة بمزيد من التفصيل.

كروماتوغرافيا التبادل الأيوني

يعتمد كروماتوغرافيا التبادل الأيوني على شحنة البروتين الذي تحاول عزله. إذا كان البروتين الخاص بك يحتوي على شحنة موجبة عالية ، فستحتاج إلى تمريره عبر عمود بشحنة سالبة. ستعمل الشحنة السالبة على العمود على ربط البروتين موجب الشحنة ، وستمر البروتينات الأخرى عبر العمود. يمكنك بعد ذلك استخدام إجراء يسمى "التمليح" لتحرير البروتين موجب الشحنة من العمود سالب الشحنة. يُطلق على العمود الذي يقوم بذلك عمود التبادل الكاتيوني وغالبًا ما يستخدم المخلفات المسلفنة. وبالمثل ، يمكنك ربط بروتين سالب الشحنة بعمود موجب الشحن. يُطلق على العمود الذي يقوم بذلك عمود تبادل الأنيون وغالبًا ما يستخدم بقايا الأمونيوم الرباعية.

يملح سيطلق أو يزيل البروتين من العمود. تستخدم هذه التقنية محلولًا عالي التركيز الملح. سوف يتنافس محلول الملح مع البروتين في الارتباط بالعمود. بمعنى آخر ، يحتوي العمود على جاذبية أعلى لشحنة الأملاح مقارنة بالبروتين المشحون ، وسيطلق البروتين لصالح ربط الأملاح بدلاً من ذلك. ستتم إزالة البروتينات ذات التفاعلات الأيونية الأضعف عند مستوى ملح أقل ، لذلك سترغب غالبًا في التخلص من التدرج الملحي. يتم التخلص من البروتينات المختلفة بتركيزات مختلفة من الملح ، لذلك ستحتاج إلى التأكد من أنك تعرف جيدًا خصائص البروتين الخاص بك بأفضل النتائج.

اعلم أيضًا أن التغيرات في الأس الهيدروجيني تغير الشحنات في البروتينات. تأكد من أنك تعرف النقطة المتساوية الكهربية للبروتين (النقطة المتساوية الكهربية هي الرقم الهيدروجيني الذي تكون فيه شحنة البروتين صفرًا) وتأكد من ضبط درجة الحموضة في نظامك وتخزينها وفقًا لذلك.

الخطوات الأساسية لاستخدام عمود التبادل الأيوني هي:

1. تحضير العمود. قم بصب المخزن المؤقت فوق العمود للتأكد من موازنته مع الرقم الهيدروجيني المطلوب.

2. تحميل محلول البروتين الخاص بك. بعض البروتينات الموجودة في المحلول لا ترتبط ببعضها البعض وسوف تتم إزالتها خلال مرحلة التحميل هذه.

3. الملح خارج. زيادة تركيز الملح للتخلص من البروتينات المرتبطة. من الأفضل استخدام تدرج الملح للتخلص التدريجي من البروتينات ذات القوة الأيونية المختلفة. في النهاية ، يضرب النظام بتركيز ملح عالي جدًا (2-3 م) للتأكد من خروج جميع البروتينات من العمود.

4. إزالة الأملاح. استخدم غسيل الكلى لإزالة الأملاح من محلول البروتين الخاص بك.

درجة الحرارة ليس لها تأثير كبير على كيمياء العمود. ومع ذلك ، فمن الأفضل العمل باردًا لأن البروتينات أكثر ثباتًا في البرودة.

تفاعل كروماتوغرافيا كارهة للماء

حيث يعتمد كروماتوغرافيا التبادل الأيوني على شحنات البروتينات لعزلها ، فإن كروماتوغرافيا التفاعل الكارهة للماء تستخدم الخصائص الكارهة للماء لبعض البروتينات. ترتبط المجموعات الكارهة للماء الموجودة على البروتين بمجموعات كارهة للماء على العمود. كلما كان البروتين أكثر كارهًا للماء ، زاد ارتباطه بالعمود.

قم بتحميل البروتينات في وجود تركيز عالٍ من كبريتات الأمونيوم (ليس الأمونيوم لكلكبريتات). كبريتات الأمونيوم عامل شوتروبيك. يزيد من الفوضى (الانتروبيا) في الماء ، وبالتالي يزيد من التفاعلات الكارهة للماء (كلما زاد اضطراب الماء ، زادت التفاعلات الكارهة للماء). تعمل كبريتات الأمونيوم أيضًا على استقرار البروتينات. لذلك كنتيجة لاستخدام عمود HIC ، يمكنك توقع أن يكون البروتين في أكثر صوره ثباتًا.

العمود المقاوم للماء معبأ بمصفوفة فينيل الاغاروز. في حالة وجود تركيزات عالية من الملح ، فإن مجموعات فينيل على هذه المصفوفة تربط الأجزاء الكارهة للماء من البروتينات. يمكنك التحكم في شطف البروتينات المختلفة المرتبطة بالعمود عن طريق تقليل تركيز الملح أو عن طريق إضافة المذيبات.

اللوني تقارب.

يعتمد كروماتوغرافيا التقارب على الوظائف البيولوجية للبروتين لربطه بعمود. النوع الأكثر شيوعًا يتضمن يجند ، وهو جزيء حيوي صغير محدد. يتم تجميد هذا الجزيء الصغير وإرفاقه بمصفوفة عمود ، مثل السليلوز أو بولي أكريلاميد. ثم يتم تمرير البروتين المستهدف من خلال العمود وربطه به بواسطة ليجنده ، بينما يتم التخلص من البروتينات الأخرى. عادة ما يتم شطف البروتين المستهدف عن طريق تمرير محلول في العمود يحتوي على تركيز عالٍ من الليجند الحر. هذه طريقة تنقية فعالة للغاية لأنها تعتمد على الخصوصية البيولوجية للبروتين المستهدف ، مثل تقارب الإنزيم مع الركيزة.

الترشيح الهلامي (استبعاد الحجم) اللوني د

يقوم الترشيح الهلامي ، أو استبعاد الحجم ، بفصل البروتينات على أساس حجمها. العمود معبأ بمصفوفة من الخرز المسامي الناعم.

إنه يعمل إلى حد ما مثل الغربال ، ولكن في الاتجاه المعاكس. تحتوي الخرزات بداخلها على ثقوب صغيرة جدًا. أثناء سكب محلول البروتين على العمود ، تدخل جزيئات صغيرة المسام في الحبيبات. يتم استبعاد الجزيئات الأكبر من الثقوب ، وتمر بسرعة بين الخرزات.

يتم التخلص من هذه الجزيئات الأكبر أولاً. تمتلك الجزيئات الأصغر مسارًا أطول للسفر ، حيث تتعثر مرارًا وتكرارًا في متاهة المسام التي تمتد من حبة إلى خرزة. لذلك ، تستغرق هذه الجزيئات الصغيرة وقتًا أطول لتشق طريقها عبر العمود ويتم التخلص منها أخيرًا.


خلفية

غالبًا ما تستخدم مجموعات استخراج الحمض النووي من أعمدة الطور الصلب القائمة على السيليكا مخزنًا مؤقتًا تشوشليًا يعمل كمحول للبروتين وعامل مساعد يعزز امتصاص NA. Chaotrope هو أيون يعطل الروابط الهيدروجينية ويضرب جزيئات الماء في بيئة مائية [14]. يتم تصنيف هذه الأيونات ضمن سلسلة Hofmeister من خلال قدرتها على تعزيز قابلية ذوبان البروتينات. وهكذا ، تلعب تفاعلات الماء وتأثيرات أيونات معينة دورًا رئيسيًا في إملاء ترتيب سلسلة هوفميستر [15 ، 16]. في محاليل الإلكتروليت البسيطة ، عند التحكم في الشحنة ، يتجلى هذا الترتيب من خلال توطين الشحنة على أيون معين [17]. تظهر أيونات Chaotropic زيادة في عدم تمركز الشحنة التي تعطل الروابط الهيدروجينية المجاورة وتؤدي مباشرة إلى زيادة ذوبان البروتين في الماء. وبالتالي ، فإن أيونات Chaotropic في الماء عادة ما ترتبط بزيادة تمسخ NA من خلال اضطرابات الاقتران القاعدي [18]. أظهر العمل السابق مع الحمض النووي أن إضافة جزيئات السيليكا إلى محلول تشوتروبيك سوف يؤدي إلى امتزاز الحمض النووي المعتمد على الأس الهيدروجيني على سطح الجسيمات [19].

ينتج الاعتماد على الرقم الهيدروجيني لامتصاص الحمض النووي والسيليكا والعشوائية من الشحنة السطحية للسيليكا والحمض النووي [20]. اعتمادًا على طريقة تصنيع العمود ، قد يحتوي سطح السيليكا على خليط من silanols مفرد و / أو silanols مع نقطة تساوي الكهرباء حول الأس الهيدروجيني 1.5-3.6 [21]. أظهرت الدراسات أن اثنين من ثوابت التفكك الحمضي الفعالة (pKأ) من السيليكا السيلانول هي درجة الحموضة 4.5 و 8.5 [22،23]. في سياق استخراج NA من العينات البيولوجية عند درجة حموضة فسيولوجية من 7.0-7.4 ، يجب من الناحية النظرية تغطية الغالبية العظمى من أسطح السيليكا المكشوفة بشحنات سالبة. علاوة على ذلك ، نظرًا لأن الحمض النووي له نقطة تساوي كهربية بالقرب من الرقم الهيدروجيني 5 ، فهو أيضًا سالب الشحنة في الغالب عند درجة الحموضة الفسيولوجية. ومن ثم ، من الصعب جدًا تفسير التقارب الظاهر بين السيليكا والحمض النووي داخل أعمدة استخراج NA باستخدام الحجج الكهروستاتيكية وحدها [15 ، 16 ، 24]. فيما يتعلق ببحوث التشخيص الطبي للموائع الدقيقة ، يجب على المرء محاولة فهم كيمياء السطح الأساسية عن طريق تحديد التفاعل بين جزيئات الحمض النووي والسيليكا والعشوائية كدالة للأس الهيدروجيني لتحسين إنتاجية استخلاص NA من العينات البيولوجية المعقدة غير المتجانسة [17].

درس العمل السابق تفاعلات الحمض النووي - السيليكا - Chaotrope بتركيزات الحمض النووي التي تزيد عن 1 ميكروغرام / مل [19،25،26]. في هذه التجارب ، غالبًا ما أدت تركيزات الدنا عالية المدخلات إلى تشبع سطح السيليكا [19،26]. وبالتالي ، من الصعب للغاية استقراء من هذه النتائج إلى بروتوكولات الاستخراج NA للعينات السريرية الشائعة التي لا تشبع سطح السيليكا: على سبيل المثال ، البول والبلازما والسائل النخاعي لديهم تركيزات الحمض النووي 40-200 نانوغرام / مل ، 17 نانوغرام / مل ، و 3 نانوغرام / مل DNA على التوالي [13،27،28]. وبالتالي ، من المهم فهم تفاعل الحمض النووي - السيليكا - Chaotrope عندما يكون الحمض النووي في المحلول هو الكاشف المحدد. في حين أن استخدام أعمدة السيليكا المصغرة ذات المسام الصغيرة يمكن أن يؤدي إلى امتصاص أكثر كفاءة وشطف لعينات NA المخففة ، فإن هذه الأعمدة يمكن أن تكون عرضة للانسداد أو التخميل السطحي بواسطة الجزيئات الحيوية الأخرى مثل البروتينات والدهون والكربوهيدرات [12،29].

هنا ، نهدف إلى توصيف تفاعلات الحمض النووي - السيليكا - chaotrope ، بتركيزات الحمض النووي ذات الصلة سريريًا ، كدالة لدرجة الحموضة. تم اختيار قيم الأس الهيدروجيني 3 و 5.2 و 8 على أساس pKأ قيم مجموعات سطح السيليكا ، وتنقية الحمض النووي (أقل من الرقم الهيدروجيني 2) ، وانحلال السيليكا (أعلى من الرقم الهيدروجيني 8) [30]. تم تحديد كمية امتزاز وشطف الحمض النووي من سطح السيليكا في ظل ظروف تحاكي تلك المستخدمة بشكل شائع في المجموعات التجارية وأجهزة التشخيص المتكاملة POC التي تعزل NAs من العينات البشرية [31-33]. ومع ذلك ، فقد قمنا باحتضان جزيئات الحمض النووي والسيليكا لفترة أطول بكثير مما تتطلبه معظم بروتوكولات الاختبار للتأكد من الوصول إلى التوازن. لمزيد من التركيز على نطاق بحثنا ، نظرنا فقط في جزيئات السيليكا التجارية المصنوعة من أجل المقايسات البيولوجية ، و λ-phage DNA كمدخلات NA. أخيرًا ، قمنا بتقييد العواطف المستخدمة في الجوانيدينيوم (CH6ن3 أو Gu) وأيونات الثيوسيانات (SCN) ، وهي شائعة الاستخدام في مجموعات الاستخراج التجارية NA [4،34].


تأثير كلوريد الصوديوم / الأس الهيدروجيني على الغرواني النانوي الناتج عن تفريغ شرارة نبضية

تمت دراسة الطريقة الخضراء ، باستخدام التفريغ النبضي لتصنيع الذهب الغرواني ، في هذه الأطروحة. تستخدم PSD تصريف شرارة لتجميع جزيئات الذهب النانوية (AuNPs) في الماء منزوع الأيونات (DIW) و / أو الإيثانول (EtOH). في حين أن للجسيمات النانوية الذهبية تطبيقات واسعة النطاق في العديد من المجالات ، خاصة بالنسبة لجسم الإنسان ، يجب أن تتغلب في استخدامها على تأثير كلوريد الصوديوم وقيمة الأس الهيدروجيني ، لذلك تضيف هذه الدراسة كلوريد الصوديوم إلى PSD-AuNPs لمحاكاة جسم الإنسان لدراسة استقراره. علاوة على ذلك ، تمت إضافة مجموعة متنوعة من الواقيات في محاولة لتحديد أفضل حماية لـ AuNPs وتحسين الفعالية المتوافقة بيولوجيًا. من نتائج هذه الدراسة ، فإن إضافة البوليمر طويل السلسلة Carboxymethyl cellulose (CMC) أو Polyvinyl pyrrolidone (PVP-k30) يمكن أن يمنع nanogold من التجميع والترسيب في NaCl أو قيمة pH مختلفة والحفاظ على خاصية تشتت nanogold عن طريق رفع قوة التنافر بين الجسيمات. يمكن أن تكون نتائج هذه الدراسة مرجعًا لتطبيق nanogold في العلوم الطبية الحيوية.

1 المقدمة

تم تطوير طريقة تفريغ شرارة النبض (PSD) واستخدامها لتصنيع محلول AuNPs [1-5] ، والذي يتضمن تمرير تيار نبضي عبر قطبين من الذهب [6-8] ، مغموران في الماء منزوع الأيونات أو الإيثانول. تتضمن العديد من طرق إنتاج AuNPs إدخال المواد الخافضة للتوتر السطحي من أجل تحسين تعليق جزيئات الذهب. ومع ذلك ، فإن جسيمات الذهب النانوية المصنعة بطريقة تفريغ شرارة النبض (PSD) في الماء منزوع الأيونات أو الإيثانول بدون أي مواد خافضة للتوتر السطحي أو مثبتات تتميز بأنها غروانية مستقرة ، والتي يمكن تخزينها لفترة طويلة في وعاء زجاجي في درجة حرارة الغرفة دون ترسيب مرئي ( لا يوجد راسب ظاهر). DIW_nanogold آمن لجسم الإنسان ، مثل العلاج المستهدف وناقلات الأدوية ، ستقترح هذه الدراسة التجارب ومحاكاة نتائج الذهب الغروي [9-13] داخل اختبار NaCl و pH.

يتم تطبيق جزيئات الذهب النانوية على نطاق واسع في جسم الإنسان ولكنها تتطلب التغلب على تأثيرات كلوريد الصوديوم وقيمة الأس الهيدروجيني. يُعرَّف رقم الذهب [14] على أنه كمية (مجم) من البوليمر المطلوبة لمنع تراكم 10 سم 3 من محلول الذهب مع إضافة 1 سم 3 10٪ كلوريد الصوديوم. تقترح هذه الدراسة أيضًا طريقة فعالة لأرقام الذهب (يتم إجراء نسخة أكثر كفاءة من طريقة Zsigmondy [15] في التجربة التي أجريت هنا) من أجل تحديد عدد الذهب لمثبتات الذهب الغروية المحتملة. بدلاً من تغيير كمية الفاعل بالسطح المضافة ، يتم إضافة كميات متزايدة من كلوريد الصوديوم إلى محلول من الذهب الغروي مع 0.1 مجم من المثبت ، وبالتالي محاكاة المعايرة المستمرة. أيضًا ، يمكن أيضًا استخدام التأثير الحراري الضوئي لـ AuNPs كعلاج للسرطان [16]. يمكن إنتاج المستشعرات الحيوية الكهروضغطية البيولوجية المتفوقة ، من خلال التوافق الحيوي ، والتوصيل الكهربائي ومساحة السطح العالية لجزيئات الذهب النانوي [17]. يمكن أن تنطبق خصائص الجسيمات النانوية على المعدن لإنتاج تفاعل مفيد للحفاز [18]. تحاكي هذه الدراسة جسم الإنسان أو محلول ملحي طبيعي في كلوريد الصوديوم من أجل مناقشة التأثيرات على جزيئات الذهب النانوية من DIW_nanogold ، تحت عوامل وقائية مختلفة متوافقة بيولوجيًا ، لتحسين الفاعلية المتوافقة بيولوجيًا. تمت مقارنة التأثيرات والتغيرات في تعليق قيمة الأس الهيدروجيني لجسيمات الذهب النانوية (DIW_nanogold و chem._nanogold و ethanol nanogold) المصنَّعة بطرق أخرى ، بالإضافة إلى التغيرات في الامتصاصية وطول الموجة.

2. الإعداد التجريبي

تستخدم هذه الدراسة نظام PSD المطور كطريقة تحضير ، حيث يتمثل المبدأ في استخدام مادة شريطية (Au) ، والتي سيتم إنشاؤها في مادة نانومترية حيث لا يوجد اتصال مباشر بين القطبين الكهربائيين العلوي والسفلي ، وبالتالي لا يوجد مادي. القوة الناتجة بين الاثنين ، باستخدام الكهرباء المحولة إلى طاقة حرارية ، يتم إنشاء نوع من طريقة الانصهار الساخن للقطب الكهربائي سريع الذوبان. الغرفة هي مركز المعالجة الرئيسي. يتم استخدام الماء منزوع الأيونات ، الذي يحتوي على عزل جيد ، أو الإيثانول ، كسائل عازل. يتم غمر الأقطاب العلوية والسفلية في سائل عازل لتسبب انتشار الجسيمات النانوية المتولدة بالتساوي وتخزينها مباشرة في السائل العازل.

2.1. التحضير لاختبار كلوريد الصوديوم

تم اختبار العوامل الأربعة عشر المدرجة في الجدول 1 لقدرتها على الحفاظ على التعليق الغرواني الذهبي. مع محاكاة كلوريد الصوديوم بنسب مماثلة لتلك الموجودة في سوائل جسم الإنسان (0.9٪) ، أو نسبة كلوريد الصوديوم في محلول ملحي عادي ، يتم خلط الذهب الغروي بمحلول كلوريد الصوديوم عالي التركيز ، مما ينتج عنه

الأيونات تهاجم الجهد الكهربائي السطحي لـ AuNPs. مع فقدان إمكانات زيتا ، تفقد الجسيمات النانوية التنافر المتبادل والتكتل. من أجل تجنب تدمير إمكانات زيتا ، يلزم استخدام عامل حماية مناسب حتى يتمكن غرواني الذهب من البقاء في مثل هذا المحلول الغني بالأيونات. حللت هذه الدراسة تأثيرات عوامل الحماية المختلفة (يجب أن تكون متوافقة حيوياً للاستخدام في التطبيقات الطبية) على تكتل PSDAuNPs-DIW ويمكن استخدام العامل كعامل حماية لـ PSD-AuNPsDIW.

أولاً ، يتم وضع 10 مل من محلول الذهب الغروي 30 جزء في المليون في كل حاوية من 15 حاوية ، مرقمة Au (0)

Au (14) بعد ذلك ، يتم تحضير مجموعة ثانية عن طريق وضع 10 مجم من 14 مثبتًا في 10 مل من DIW لتركيز 0.1٪ (وزن / حجم) ، والتي تحمل علامة S (1)

ق (14). ثم يتم أخذ 0.1 مل من كل من S (1)

Au (14) بحيث يكون 0.1 مجم من العامل موجودًا. لم تتم إضافة أي عوامل إلى حل التحكم Au (0). يتم استخدام خليط من 1 جرام من الملح اللامائي ، مع 10 مل من الماء ، للمعايرة بمقدار 0.1 مل (لكل جولة) ، ويلاحظ تغير اللون بعد كل معايرة. أضف 0.1 مل من محلول كلوريد الصوديوم 10٪ في كل جولة. بعد الجولة العاشرة ، تكون نسبة كلوريد الصوديوم (1/11) هي الكمية التي شوهدت ، في المتوسط ​​، في سوائل جسم الإنسان (0.9٪) ، لذلك يمكن إيقاف التجربة عند هذه النقطة. ستظهر المعايرة المستمرة ، من خلال مستوى تغيير اللون ، أي عامل التثبيت هو الأكثر فاعلية. يقدم الشكل 1 مخطط تدفق (أ) طريقة Zsigmondy و (ب) يقدم النسخة الأكثر كفاءة من طريقة Zsigmondy.

2.2. تحضير اختبار الأس الهيدروجيني

بالنسبة إلى الإيثانول النانوي ، والإيثانول النانوي (الإيثانول (1/2) + DIW (1/2)) ، و DIW_nanogold ، و chem._ nanogold ، يتم استخدام ست زجاجات من 10 مل من كل نوع كمجموعة عينة. تضيف كل مجموعة عينة حمض الهيدروكلوريك لاختبارات الحمض وهيدروكسيد الصوديوم لاختبارات القاعدة ، ثم يتم ملاحظة تغيير درجة الحموضة ، والملاحظة البصرية لمجموعة العينة ، وتغيرات اللون ، والتكتل. يتم إجراء تحليل UV-Vis للعينات غير المتكتلة ويتم تحليل تأثيرات الأس الهيدروجيني على الامتصاص والعدد الموجي ، من أجل اكتساب المزيد من الفهم للعلاقات بين تعليق جزيئات الذهب النانوية المختلفة ودرجة الحموضة. يعرض الشكل 2 مخطط تدفق تحليل تأثير الأس الهيدروجيني لـ DIW_nanogold و chem._nanogold و ethanol nanogold.

3. النتائج والمناقشة

3.1. نتائج ومناقشة اختبار كلوريد الصوديوم

يعرض الجدول 2 عدد جولات كل مادة خافضة للتوتر السطحي مطلوبة قبل ملاحظة تغيير كبير في اللون. بمجرد ملاحظة إحداها ، لم تتم إضافة المزيد من جولات كلوريد الصوديوم.

المرجع هو الجولة 0: إذا لوحظ تغير اللون بعد خلط المثبت بالذهب الغرواني ، ولكن قبل إضافة أي NaCl ، يتم تسجيل الجولة 0. يتم تحليل التماثيل على النحو التالي: (1) جزيئات نانوغولد التي يتغير لونها بعد إضافة محلول الملح مباشرة: Au (6) و Au (10). (2) جسيمات نانوغولد التي تجمعت أو ترسبت أو تحولت إلى اللون الأبيض: Au (2) و Au (11). (3) جزيئات نانوغولد التي تحولت إلى اللون الأزرق البنفسجي: Au (1) ، Au (3) ، Au (4) ، Au (5) ، Au (8) ، Au (9) ، Au (13) ، Au (14) ). (4) جسيمات نانوغولد غير متكتلة: Au (7) و Au (12).

لذلك تم تحديد أن حلول CMC و PVP-k30 توفر أفضل حماية ضد التكتل في الذهب النانوي الغرواني. من بين هؤلاء ، يعد CMC الخيار الأكثر أمانًا ، لأنه لا يسبب أي ضرر لجسم الإنسان ، بل إنه يستخدم في بعض المواد الغذائية للحفاظ على تعليق جزيئات الطعام.

3.2 نتائج ومناقشة اختبار درجة الحموضة

Chem._nanogold في حالة HCl و NaOH ، العلاقة بين الامتصاصية وطول الموجة مع الأس الهيدروجيني ، كما هو موضح في الأشكال 3 (أ) و 3 (ب) و 3 (ج). AuNPs-DIW في حالة HCl و NaOH ، علاقة الامتصاصية وطول الموجة مع الرقم الهيدروجيني ، كما هو موضح في الأشكال 4 (أ) و 4 (ب) و 4 (ج). الإيثانول النانوي في حالة HCl و NaOH ، العلاقة بين الامتصاصية وطول الموجة مع الرقم الهيدروجيني ، كما هو موضح في الأشكال 5 (أ) و 5 (ب) و 5 (ج). يوضح الجدول 3 الامتصاصية وانحراف الطول الموجي عند مختلف النانو مقابل الأس الهيدروجيني.


أساسيات استخراج الحمض النووي

ربما سمعت & # 8217 عن الكود الجيني أو مخطط الحياة ، تشير هذه المصطلحات إلى الحمض النووي. تحتوي جميع الكائنات الحية ، بما في ذلك الحيوانات والنباتات والبكتيريا ، على الحمض النووي في خلاياها. الحمض النووي هو جزيء طويل جدًا يتكون من سلسلة من النيوكليوتيدات وترتيب هذه النيوكليوتيدات هو ما يجعل الكائنات الحية تشبه الكائنات الأخرى من نوعها ومع ذلك تختلف كأفراد. الجينات هي أقسام داخل جزيء الحمض النووي الطويل هذا.

من أجل دراسة الحمض النووي ، عليك أولاً أن تخرجه من الخلية. في الخلايا حقيقية النواة ، مثل الخلايا البشرية والنباتية ، يتم تنظيم الحمض النووي ككروموسومات في عضية تسمى النواة. الخلايا البكتيرية ليس لها نواة. يتم تنظيم الحمض النووي الخاص بهم في حلقات أو بلازميدات دائرية موجودة في السيتوبلازم. تحرر عملية استخراج الحمض النووي الحمض النووي من الخلية ثم تفصله عن السائل الخلوي والبروتينات بحيث يتبقى لك الحمض النووي النقي.

الخطوات الثلاث الأساسية لاستخراج الحمض النووي هي 1) التحلل ، 2) الترسيب ، 3) التنقية.

الخطوة 1: التحلل
في هذه الخطوة ، يتم فتح الخلية والنواة لتحرير الحمض النووي بالداخل ، وهناك طريقتان للقيام بذلك. أولاً ، يؤدي الاضطراب الميكانيكي إلى كسر الخلايا. يمكن القيام بذلك باستخدام أداة تجانس الأنسجة (مثل الخلاط الصغير) ، أو باستخدام ملاط ​​ومدقة ، أو عن طريق تقطيع الأنسجة إلى قطع صغيرة. يعد الاضطراب الميكانيكي مهمًا بشكل خاص عند استخدام الخلايا النباتية لأنها تحتوي على جدار خلوي صلب. ثانيًا ، يستخدم التحلل المنظفات والإنزيمات مثل بروتيناز K لتحرير الحمض النووي وحل البروتينات الخلوية.

الخطوة 2: الترسيب
عند إكمال خطوة التحلل ، يتم تحرير الحمض النووي من النواة ، ولكن يتم خلطه الآن بأجزاء الخلية المهروسة. يفصل الترسيب الحمض النووي عن هذا الحطام الخلوي. أولاً ، تعمل أيونات الصوديوم + (الصوديوم) على تحييد الشحنات السالبة على جزيئات الحمض النووي ، مما يجعلها أكثر استقرارًا وأقل قابلية للذوبان في الماء. بعد ذلك ، يضاف الكحول (مثل الإيثانول أو الأيزوبروبانول) ويتسبب في ترسب الحمض النووي من المحلول المائي لأنه غير قابل للذوبان في الكحول.

الخطوة الثالثة: التنقية
الآن بعد أن تم فصل الحمض النووي عن المرحلة المائية ، يمكن شطفه بالكحول لإزالة أي مادة متبقية غير مرغوب فيها والحطام الخلوي. عند هذه النقطة ، يتم عادةً إذابة الحمض النووي المنقى في الماء لسهولة التعامل معه وتخزينه.

توقعات مستوى الصف في ألاسكا المستهدفة
[9] SC1.1 يوضح الطالب فهمًا لكيفية تفسير العلم للتغييرات في أشكال الحياة بمرور الوقت ، بما في ذلك الجينات والوراثة وعملية الانتقاء الطبيعي والتطور البيولوجي من خلال إدراك أن جميع الكائنات الحية لها صبغيات مكونة من الحمض النووي وأن الحمض النووي يحدد الصفات.


تأثيرات المذيبات على الأنشطة التحفيزية للأنزيمات والريبوزيمات

يمكن أن يؤدي استخدام المذيبات العضوية إلى توسيع وظيفة الإنزيمات والريبوزيمات عن طريق زيادة قابلية الذوبان في الركائز الكارهة للماء. تم استخدام كمية منخفضة نسبيًا من المذيبات (على سبيل المثال ، DMSO بأقل من 10 & # x000a0vol٪) أثناء اختيار الحمض النووي المحفز والحمض النووي الريبي في المختبر وفي تفاعلات Diels-Alder (Seelig and J & # x000e4schke 1999 Chandra and Silverman 2008) و aldol التفاعلات (Fusz et al. 2005) التي تحفزها هذه الجزيئات. تفاعل ربط الحمض النووي الريبي المحفز بواسطة aptazymes DNA في وجود مبيدات الأعشاب (الألاكلور والأترازين) يستمر بسرعة أكبر وبإنتاجية أعلى عند إضافة 10 & # x000a0٪ ميثانول ، إيثانول ، DMSO ، أسيتون ، أو DMF. قد تسهل المذيبات المشتركة إطلاق المنتج ، وتثبت هياكل معينة ، وتمنع تكوين مطابقة غير نشطة ، و / أو تحسن الارتباط بين الحمض النووي والركائز (Behera et al. 2013). نظرًا لأن الهياكل النشطة تحفيزيًا للحمض النووي الريبوزي والريبوزيمات يتم الحفاظ عليها من خلال التفاعلات الضعيفة مقارنة بالهياكل الثانوية المزدوجة ، فإن ظروف المذيبات التي تعطل تفاعلات الحمض النووي الريبي بشكل كبير ليست مناسبة للاستخدام.

يترافق تكوين هياكل الريبوزيمات الطبيعية التي تحفز انشقاق روابط الفوسفوديستر الخاصة بالموقع في الحمض النووي الريبي بإطلاق الماء وربط أيونات المعدن (Rangan and Woodson 2003 Bevilacqua et al. 2004 Doudna and Lorsch 2005 Lilley 2005 Toor et al. 2008). تم الإبلاغ عن آثار تأثير الضغط الاسموزي على الأنشطة التحفيزية للريبوزيم المعتمد على الرصاص وريبوزيم دبوس الشعر. يتكون الريبوزيم المعتمد على الرصاص ، والذي يُطلق عليه اسم الرصاص ، من بنية حلقة جذعية قصيرة (الشكل & # x000a0 5a) ويشق الحمض النووي الريبي في وجود Pb 2+. تم إنشاء هذا الريبوزيم في البداية عن طريق الاختيار في المختبر من مكتبات التسلسل العشوائي (Pan and Uhlenbeck 1992) ، وتم العثور على نفس الأشكال المتسلسلة في الحمض النووي الريبي الخاص بخميرة فينيل ألانين وفي الرنا المرسال البشري (Barciszewska et al. 2005). تعمل إضافة PEG ذات الوزن الجزيئي المنخفض (2.5 & # x020137.5 & # x000a0vol٪) على تعزيز النشاط التحفيزي لـ 11-mer leadzyme في وجود 25 & # x000a0mM Pb 2+ بنحو عامل 2 (Giel-Pietraszuk و Barciszewski 2012). يُعزى هذا التعزيز إلى انخفاض النشاط المائي الذي يسهل إطلاق الماء أثناء التحفيز. تم العثور على ريبوزيمات دبوس الشعر في الحمض النووي الريبي الساتلي لفيروسات النبات مثل فيروس حلقة التبغ (Buzayan et al. 1986 Hampel and Tritz 1989). تتكون هذه الريبوزيمات من حلقة مجال ربط الركيزة ومجال الحلقة التحفيزية (الشكل & # x000a0 5a) ، وتشق الحمض النووي الريبي في وجود أيونات معدنية ثنائية التكافؤ. نظرًا لزيادة مقدار PEG منخفض الوزن الجزيئي إلى 10 & # x000a0 ٪ ، فإن معدل الانقسام في ضلع دبوس الشعر 85 مير في وجود 1 & # x000a0mM & # x000a0Mg 2+ يزيد من خلال عدة أضعاف PEG من المحتمل أن يسهل الطي الثلاثي ، والذي يترافق مع إطلاق جزيئات الماء ، بينما لا يوجد دليل على تأثير ثابت العزل في هذا النظام (Herve et al.2006).

أ تراكيب الريبوزيم الموصوفة في النص ومواقع انشقاقها (السهام الحمراء). ب قطع اعتماد تركيز كلوريد الصوديوم على ثابت معدل الانقسام لريبوزيم رأس المطرقة بالنسبة للاعتماد في غياب المذيبات (س ك ج /س ك ث) مقابل ثابت العزل الكهربائي (& # x003b5 ص أو & # x003b5 ص & # x022121) من الحلول المختلطة بكمية 10 أو 20 & # x000a0wt٪ cosolvents (Nakano et al. 2014b). يتم رسم مقاسات المنحنى بناءً على الحساب الذي تم إجراؤه في الشكل & # x000a0 4f. ج دورة التفاعل لتشكيل الشكل النشط حفازًا من الريبوزيمات في محلول مائي ومحلول مختلط بمذيب ثابت عازل كهربائي منخفض

تم العثور على ريبوزيمات رأس المطرقة في سواتل الحمض النووي الريبي لفيروسات النبات وفي الجينوم بما في ذلك تلك الخاصة بالبشر (Bourdeau et al. 1999 Martick et al. 2008 de la Pena and Garcia-Robles 2010 Hammann et al. 2012). تتكون هذه الريبوزيمات من ثلاثة سيقان (الشكل & # x000a0 5a) ، وتشق الحمض النووي الريبي في وجود أيونات معدنية ثنائية التكافؤ (Forster and Symons 1987 Uhlenbeck 1987 Haseloff and Gerlach 1988 Martick and Scott 2006 Lee et al. 2008). المذيبات مثل الأسيتونيتريل والميثانول و DMF و DMSO و ethylene glycol و glycerol لها تأثيرات طفيفة على معدل وعائد الانقسام بين الجزيئات لركيزة 17-mer بواسطة ريبوزيم 38 مير في 10 & # x000a0mM & # x000a0Mg 2+ ولكن في تركيزات أعلى من 60 & # x000a0vol٪ ، هذه المذيبات تمنع تفاعل الانقسام تمامًا (Feig et al. 1998 Mikulecky and Feig 2002). أظهرت دراسة باستخدام نموذج ريبوزيم مشابه (الانقسام الجزيئي لركيزة 15 مير بواسطة ريبوزيم 43 مير) أن 20 & # x000a0 وزن محاليل من مشتقات الإيثيلين جلايكول والكحولات الأولية الصغيرة والمركبات غير البروتينية تعزز معدل انقسام الحمض النووي الريبي بعدة أضعاف. في وجود 10 & # x000a0mM & # x000a0Mg 2+ وبأكثر من 10 أضعاف بتركيزات Mg 2+ أقل (ناكانو وآخرون 2009 ، 2015 أ). نظرًا لأن البنية الثلاثية للريبوزيم المستخدم في الدراسة ليست مستقرة جدًا ، فإن كفاءة ربط Mg 2+ مهمة لتشكيل الهيكل النشط التحفيزي ومعدل الانقسام. إن MgCl2 التركيز المطلوب للتحفيز السريع ، حيث يتم تغيير ارتباط Mg 2+ بواسطة تفاعلات محددة ، في المحاليل المختلطة. تركيز MgCl2 الانخفاضات الضرورية مع انخفاض ثابت العزل الكهربائي للحلول ، على سبيل المثال ، ينخفض ​​التركيز أكبر من عامل 10 في 20 & # x000a0wt٪ 1،2-dimethoxyethane (& # x003b5 ص& # x02009 = & # x0200962) مقارنة بغياب المذيبات (ناكانو وآخرون 2015 أ).

في التفاعل المحفز بواسطة ريبوزيم رأس المطرقة ، يمكن استبدال أيونات المعادن ثنائية التكافؤ بكاتيونات أحادية التكافؤ إذا كانت التركيزات عالية بدرجة كافية (Murray et al. 1998). يتم التوسط في التحفيز في وجود Na + ولا يوجد كاتيون ثنائي التكافؤ من خلال تفاعلات ضعيفة التعاون وغير محددة مع الكاتيونات المنتشرة التي تساهم في الطي في الشكل النشط الحفزي. اعتماد تركيز كلوريد الصوديوم على ثابت معدل الانقسام ك (س ك& # x02009 = & # x02009 & # x02202ln ك/ & # x02202ln [NaCl] ، في اعتماد خطي) يتم تغييره في وجود المذيبات (Nakano et al. 2014b). يتناقص الاعتماد مع ثابت العزل الكهربائي للمحلول (الشكل & # x000a0 5b) ، وحوالي 40 & # x000a0٪ أقل من Na + مطلوب في 20 & # x000a0wt٪ 1،2-dimethoxyethane (& # x003b5 ص& # x02009 = & # x0200962) مقارنة بغياب cosolvents. بافتراض أن معدل انشقاق الركيزة يتم تحديده من خلال مقدار الهيكل النشط الحفاز المتكون ، ودرجة ارتباط Na + عند تكوين الهيكل النشط (& # x02206& # x003a8، وهو ما يتناسب مع س ك) ينخفض ​​في محاليل ثابتة عازلة منخفضة (س ك ج /س ك w & # x02009 & # x0003c & # x020091 وبالتالي & # x02206& # x003a8 ج / & # x02206& # x003a8 w & # x02009 & # x0003c & # x020091). وبالتالي ، فإن التحليل باستخدام دورة التفاعل في الشكل & # x000a0 5c يشير إلى ارتباط أكبر لـ Na + بأشكال غير نشطة أقل تكثيفًا (& # x02206& # x003a8 لو) than to the catalytic active form (∆Ψ af), analogous to the case of a duplex formation. About a 40 % decrease in Na + binding in the medium with ε ص of about 60 is greater than the decreases observed for duplex formation (60� %) given in Fig.  3 , possibly because of greater Na + -induced collapse upon formation of the active structure of the ribozyme than occurs during duplex formation.

Water-soluble organic polymers are used as macromolecular crowding agents to mimic the crowded environment in cells (Minton 1998). Addition of high-molecular-weight PEG or dextran in the amount of 5� wt% enhances the RNA cleavage activity of group I ribozyme (195-mer RNA), human delta virus (HDV)-like ribozyme (76-mer RNA), and hairpin ribozyme (intermolecular cleavage of a 48-mer substrate by a 35-mer ribozyme) by several fold in a low concentration of Mg 2+ , around 1 mM (Kilburn et al. 2010 Strulson et al. 2013 Desai et al. 2014 Paudel and Rueda 2014). The rate enhancements result from increased compactness of the RNA structures through the excluded volume effect of the polymer additives. In the case of a hammerhead ribozyme motif (43-mer ribozyme and 15-mer substrate), the addition of high-molecular-weight PEG increases the cleavage rate at unsaturated concentrations but not at saturated concentrations of Mg 2+ (Nakano et al. 2009). This study showed that the Mg 2+ concentration required for fast catalysis is decreased in the presence of PEG with an average molecular weight of 8000, as is also the case for smaller cosolvents (Nakano et al. 2015a). Because polymer crowding substantially modifies the water activity and the dielectric constant (Nakano et al. 2004, 2012a), the effects of polymer additives may, at least partly, arise from changes in these solvent properties. Consistent with this possibility, values of ∆Ψ for the hybridization of 15, 25, 33, and 35 base pairs of DNA decrease linearly with the concentration of PEG with an average molecular weight of 3000 (0� wt%) (Markarian and Schlenoff 2010). It has also been reported that PEG with an average molecular weight of 8000 at 20 wt% shortens the length of a single-stranded oligonucleotide but not the length of a duplex (Nakano et al. 2008). In addition, the magnitude of the effect of polymer additives is sensitive to the ionic strength because the cation concentration affects the size of unfolded RNAs (Denesyuk and Thirumalai 2013). These results indicate that polymer solutions have effects on cation binding to nucleic acids in addition to their excluded volume effect.


Minipreps of DNA from Chlamydomonas Cultures

Try Scott Newman’s method, described in Genetics 126:875. I’ve found it quick & reliable. No problems with polysaccharides that I know of.

Here is Scott Newman’s protocol, as currently followed in the Boynton-Gillham laboratory. Cells can be grown as patches on agar plates, or as 1 ml aliquots of cells in multiwell plates.

  • Scrape cells off plate into 1.5 ml Eppendorf tube that contains 0.5 ml TEN buffer.
  • Resuspend vigorously by vortexing, spin for 10 sec. and aspirate off supernatant.
  • Resuspend cells in 150 ul H2O on ice and add 300 ul of SDS-EB buffer, vortex to mix.
  • Extract once with 350 ul phenol/CIA(1:1) for few min by vortexing, separate phases by centrifugation for 5 min., transfer aq. phase to a new tube.
  • Extract once with 300 ul CIA (24:1), transfer aq. to a new tube.
  • Add 2 volumes abs. ethanol, incubate on ice for 30 min., centrifuge for 10 min., wash pellet once with 200 ul 70% ethanol.
  • Dry pellet and resuspend in ca. 40 ul H2O. For Southern analysis use about 1-3 ul.

TEN = 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 150 mM NaCl.

SDS-EB = 2% SDS, 400 mM NaCl, 40 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl, pH 8.0.

From Mark Buchheim, University of Tulsa
[email protected]

The following is a general mini-prep protocol we have been using to extract both RNA and DNA from green micro-algae (including lots of Chlamys). If you are not interested in the RNA, you may want to opt for a protocol that eliminates the RNA with RNAase.

  • 1. Harvest cells by centrifugation in sterile centrifuge tubes
  • 2. Wash cells in 50mM Tris HCl (pH 9.0). Discard wash.
  • 3. Resuspend and break material in 500 ul lysing buffer (Su and Gibor, 1988, Anal. Biochem. 174:650-657) with ultrasonic probe (10-20 pulses). Check cell breakage by microscopy
  • 4. Add 50 ul Guanidine HCl (8 M) to broken cell extract (precipitates polysaccharide and SDS). Vigorously mix for 1 minute
  • 5. Add equal volume (550 ul) of 49:1 in fume hood
    • mix for 2 minutes
    • spin (at max.) for 2 minutes
    • mix for 2 minutes
    • spin (at max.) for 2 minutes
    • mix for 2 minutes
    • spin (at max.) for 2 minutes
    • 21d. Add 2 volumes (800 ul) ethanol to DNA
    • 22d. Freeze for at least 2 hours or overnight
    • 23d. Pellet DNA by centrifugation (10-20 min, max speed)
    • 24d. Discard supernatant
    • 25d. Dry pellet in DNA SpeedVac caps open
    • 26d. Resuspend pellet in 200 ul water (ART tips)
    • 27d. Sample ready for UV spectrophotometry
    • 28d. Add 2 volumes (ca. 400 ul) ethanol to remaining nucleic acid preps
    • 29d. Freeze for at least 2 hours or overnight
    • 30d. Pellet nucleic acid by centrifugation
    • 31d. Discard supernatant
    • 32d. Dry pellet in DNA SpeedVac caps open
    • 33d. Resuspend nucleic to standard volume (1 ug/ul) in water (ART tips)

    From Tony Palombella, University of Colorado
    [email protected]

    Here’s a protocol I came up with a year or so ago to quickly make up enough genomic DNA for PCR reactions. since then, the Chlamy Newsletter has published a similar miniprep protocol.

    • 1) Resuspend one to several loopfuls of Chlamydomonas in 100 ml of lysis buffer (10mM Tris pH 8.0, 1mM EDTA, 3% SDS) in a microfuge tube, or pellet 1ml of liquid culture 30″ in a microfuge. Remove the supernatant by aspiration and resuspend the pellet in 100 ml lysis buffer.
    • 2) Incubate 15′ at room temperature, mixing occasionally.
    • 3) Add 500 ml TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA) in order to help separate phases in subsequent extractions. Add 1/10 volume 3M NaOAc, pH 5.2.
    • 4) Phenol extract once. Chloroform extract twice.
    • 5) Add 1.1 volumes isopropanol. Pellet 15′ in microfuge. Wash with 70% ethanol and air dry. Resuspend in 50 ml TE. A typical yield is 1 – 2 ug of genomic DNA. I use about 5 ul in a PCR reaction.

    More recently, I’ve tried other methods, including:

    • 1) Resuspend a couple of healthy loopfuls of cells in SDS extraction buffer (from Weeks et al. Anal. Biochem. 152:376- 3851986): 2% SDS, 400mM Nacl, 40mM EDTA, 100mM Tris-HCl, pH 8.0. Mix thoroughly, but try not to introduce too many bubbles. The volume used depends on the amount of cells used. Incubate 15′ @ RT or 65 C (depending on how clumpy the cells are).
    • 2) Phenol extract. If the aqueous phase is cloudy, add a couple hundred microliters of water to the tube and spin again.
      Chloroform extract.
    • 3) There’s enough salt in the aqueous phase to isopropanol precipitate directly.

    I get more than a few micrograms of digestable DNA from this protocol, but I haven’t tried it in a PCR reaction.

    I’ve only had problems with polysaccharides when doing CsCl preps. Even then, when I’ve had starch in my preps, a quick spin in a microfuge gets it out of the way after the prep is resuspended.

    From Gernot Gloeckner, University of Freiburg
    [email protected]

    Take 2 ml of a very dense grown culture and spin it down in 2 ml Eppendorff tubes at 3000 rpm.

    Resuspend the pellet in 500 ul of CTAB-Buffer.

      • 2% (w/v) CTAB
        • 100 mM Tris-HCl, pH 8
          • 1,4 M NaCl
            • 20 mM EDTA (pH 8)
            • 2 % (v/v) beta-Mercaptoethanol

            Incubate the solution at 65 degree C for 1 h.

            Extract with 500 ul of Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol (25:24:1).

            Take the upper phase and pellet it with 0.7 volumes of isopropanol for 15 min at 4 degree C. Spin down at 12000 rpm for 20 min.Wash the pellet

            From Terri Dunahay, National Renewable Energy Lab

            In response to the request for a miniprep protocol for Chlamy DNA, I have some preliminary information that might help. There was a paper published in Biotechniques recently (Goodwin and Lee, 1993, 15:438-444) “Microwave Miniprep of Total Genomic DNA from Fungi, Plants, Protists, and Animals for PCR”.

            A temporary technician in our lab tried this for DNA isolation from a green alga Monoraphidium. This is a very tough, tiny alga from which it is very difficult to isolate unsheared, clean DNA. In a preliminary experiment using the microwave technique, she was able to isolate about a microgram of digestable DNA from 40 ml of a medium density culture. Unfortunately, she left the lab and we haven’t had a chance to pursue this further, but it looked promising. Granted, its not as “mini” a prep as the one devised by Scott Newman, but it may be more useful for cells that are more difficult to lyse than Chlamy.

            PREPARATION OF DNA USING XANTINE

            For transformant analysis and prep of DNA from wt cells

            1. Centrifuge 5-15 ml of cells for 5 minutes at maximum speed using table-top at 3000 rpm. Use polypropylene 15 ml conical tubes.

            2. Remove medium very well. Cells can be frozen at -70 C at this stage.

            3. Add 2 ml of Xantine buffer and vortex the tube to resuspend cell pellet.

            4. Place the tube in a 65 C water bath and incubate for 40 minutes.

            5. Centrifuge for 5 minutes as in #1. Collect supernatant to fresh 5 ml polypropylene conical tube. Discard pellet.

            6. Add 5 ml of 95% ethanol (2.5 volume ). اخلط جيدا. At this point tubes can be stored in -70 C freezer.

            7. Centrifuge 5 min. at 3000 RPM to collect DNA. Discard ethanol. Centrifuge the tubes for 1 minute and remove remaining ethanol with capillary tip. Remove all alcohol.

            8. Resuspend pellet in 300 ul of TE buffer (or water). Transfer the DNA solution to microfuge 1.5 ml tube.

            9. Add 150 ul of 7.5 M ammonium acetate. Mix well by inverting several times.

            10. Add 1000 ul of 95% ethanol and mix well.

            11. Centrifuge for 10 minutes in microcentrifuge. Discard supernatant.

            12. Wash pellet twice with 700 ul of cold 70% ethanol. Centrifuge for 30 sec after last ethanol wash to collect remaining ethanol from the centrifuge tube wall. Remove ethanol with capillary tip.

            13. Resuspend pellet in 300 ul of TE buffer. Add 10 ul of DNase free RNase A and 1 ul of RNase T1. Mix well and incubate for 30 minutes at 37 C.

            14. Add 150 ul of 7.5 M ammonium acetate. Note: Ammonium acetate must be fresh, i.e., not stored more than 1-2 weeks. Mix well by inverting 3-4 times.

            15. Add 1000 ul of 95% ethanol. Mix well by inverting 4-5 times.

            16. Centrifuge for 10 minutes at room temperature. Discard supernatant.

            17. Wash pellet 2 times with 700 ul cold 70% ethanol. Remove last drop of ethanol as described above after last wash.

            18. Resuspend pellet in 20-50 ul of sterilized water. Store in -20C. Concentration of DNA is 2-5 ug/ul. Note: You should expect 750 g DNA from 10 ml of cells. Note: Scale up DNA preparation by using multiple tubes not a larger volumes.

            Potassium ethyl xanthogenate (from Fluka cat # 60040) Synonym: Carbonodithioic, o-ethyl ester. MW 160.3

            RECIPE FOR XANTINE BUFFER:

            Ingredient, Amount/100 ml, Concentration

              • Potassium ethyl xanthogenete, 200.0 mg, 12.5mM
                • 1 M Tris-HCl pH 7.5, 10 ml, 100 mM
                  • 0.5 M EDTA pH 8.0, 2.0 ml, 10 mM
                    • NaCl, 4.09 g, 700mM
                    • Water to 100 ml

                    Adapted and modified from: Methods in Molecular and Cellular Biology 1992, 315-22.


                    CONCLUSIONS

                    Use of the TRIzol supplemented with sarkosyl followed by removal of DNA with the TURBO DNA-مجانا kit (Option 1) is an efficient and effective means of extracting RNA from a diverse array of plants, especially those that are woody, aromatic, or aquatic. With the addition of the traditional CTAB method prior to the TRIzol (Option 2), even the most stubborn taxa were mostly successful and gave consistent RNA quality measures. Option 3, which has been used successfully in many laboratories (including our own, e.g., Buggs et al., 2009 Johnson et al., 2012 ) for RNA isolation, is not the most efficient or robust method for obtaining high-quantity and -quality RNA in transcriptomics across the Embryophyta. Despite the success of the protocols described here, our methods were not successful for some plants that contain high amounts of mucilage, such as أبونتيا ص.


                    CONCLUSIONS

                    We have proposed a simple and universal model for the dependence of oligocation ligand concentration needed to induce DNA condensation (EC50) on the DNA (جص) and monovalent salt (جملح) concentrations. The DNA condensation is well described for a range of conditions, by a model combining the established and uniform salt dependence of the oligocation–DNA dissociation constant with the necessity to neutralize about 90% of the DNA charge. These two assumptions, together with the approximation that the fraction of DNA charge neutralized by bound counterions is dominated by oligocations (نcritنcrit L ), leads to Equation (3). The virtue of this phenomenological relation is that it relates the DNA condensation behavior to its dependence on the experimental conditions in a very clear and simple way. Equation (3) connects two well-studied phenomena of DNA polyelectrolyte solution behavior, namely DNA oligocation-induced condensation and the salt-dependent DNA oligocation binding in a novel way. The appearance of one salt dependent and one salt-independent regime in this condensation follows naturally within this model. This model gives a qualitatively correct prediction of the salt and DNA concentration dependent ε-oligolysine induced DNA condensation. For the simple cations Spd 3+ , Spm 4+ and CoHex 3+ , the description is good in the high salt regime as well as in the low salt regime at higher DNA concentrations (PA data), while the prediction fails in the low-salt and low-DNA concentration limit. To our knowledge, this is the first study reporting a direct and simple connection between oligocation binding to DNA (كد value) and DNA condensation.

                    Implications to في الجسم الحي شروط

                    The dynamic units of the histone–DNA interaction in chromatin are the histone tails with net positive charge from +8 to +14 and average charge density of one lysine or arginine per every three amino acids ( 70). The ε-oligolysines studied in this work can be considered as a simplified model of the histone tails with respect to positive charge and charge density. To a certain extent, the ε-oligolysines with high positive charge, ض = +31 (εK31) and ض = +20 (εRK110, εYRK10, εLYRK10) may serve as a simplified model for the nonspecific interaction between DNA and basic proteins of similar net positive charge (e.g. histones).

                    The concentration of the DNA in the cell nucleus is very high ( 71, 72). Recent fluorescent measurements give average concentration of 116 µM of nucleosomes (جص = 46.4 mM) with the highest concentration 260 µM of nucleosomes in heterochromatin (جص = 104 mM) ( 73). Extrapolating the EZ50 عكس جملح dependencies to such high DNA concentrations ( Figure 7), it is clear that under physiological concentration of salt (K + in the range 50–300 mM), condensation of DNA should always proceed in the salt-independent regime for all natural oligocations (histones, protamines, basic domains of the nuclear proteins, polyamines, etc.). At physiological concentration of salt, the critical degree of DNA neutralization needed to induce DNA condensation would be somewhat lower, in the range نneut = 0.5 – 0.7, than the higher values نneut = 0.7 – 0.95 observed at low salt concentration (جKCl = 10–20 mM). In addition, other factors such as the presence of Mg 2+ , polyamines as well as the crowded environment of the cell cytoplasm, would facilitate DNA condensation. Therefore, it is reasonable to suggest that the conditions of DNA in the nucleus are very close to the borderline separating the extended and collapsed DNA phases. Since DNA in the nucleus is in the salt-independent regime of condensation, the principal factor regulating DNA condensation should be any addition/removal of cationic (or any other) components facilitating the DNA collapse. As a result, there exist powerful ‘brakes’ for overproduction of the basic components (polyamines, protamines, histones), such that any excess of these components would result in DNA condensation blocking access to DNA for the transcription/replication machinery. On the other hand, insufficient amount of DNA condensing agents will lead to DNA expansion that might be damaging and harmful in the crowded space of the cell nucleus ( 74). The tight stoichiometry between DNA and the histones has recently been illustrated by the في الجسم الحي observation of strong correlation between the amount of the core histones, linker histones and nucleosome repeat length in the chromatin ( 75, 76).

                    Counter-intuitively, the presence of a certain excess of DNA-condensing agents in chromatin may also facilitate access to DNA of the proteins responsible for replication and transcription. From the ITC observation that DNA condensation proceeds with higher affinity than the preceding non-specific (charge neutralizing) interaction, it follows than when the amount of condensing agent exceeds the critical value, the onset of DNA condensation triggers a redistribution of the ligand between the two phases of DNA. Thus, in the region of coexistence between the condensed and extended DNA states, the soluble phase of DNA is depleted of cationic ligands. The remaining uncondensed DNA binds أقل ligand than under the conditions before the onset of condensation. For the cell nucleus it means that increase in cationic components may lead to DNA condensation (formation of heterochromatin). This will be accompanied by a نضوب of oligocations for the rest of chromatin, thus making the euchromatin more open and accessible for transcription. Such an unexpected consequence of excessive concentration of the condensing agents in the chromatin might explain the observation of higher concentration of the polyamines in the eukaryotic cells with high metabolic activity (e.g. in cancer cells) ( 77).

                    Our study demonstrates that the electrostatic mechanism is a universal one and salt-dependence of binding constant (and free energy) of ligand–DNA interaction is expected to be similar for the ligand–DNA interaction in solution and in condensed state. The apparent independence of EC50 on salt concentration simply indicates that the DNA condensation is in salt-independent regime and that dissociation constant of ligand–DNA complex is very low so that كدجص in Equation (3). The net positive charge of the histone octamer forming the basic unit of eukaryotic chromatin, the nucleosome core particle, is about +147 ( 70). Therefore, from the salt dependence of oligocation–DNA-binding constant one can predict that the total electrostatic binding energy of the histone octamer to the nucleosomal DNA (the sum of binging energies of the all basic domains in the octamer) must be significant: Δجيربط el = RTlnكد = RT[lnكد(1M) + Zblnجملح] ≈ − 150Kcal/mol [assuming ض = +147, جملح = 0.15M, ب = 0.9 and lnكد(1M) ≈ 0]. This estimation demonstrates that the NCP and chromatin in general is an extremely stable polycation–polyanion complex, which challenges the view of a marginal stability of chromatin ( 78). This evaluation for the electrostatic free energy of chromatin formation is a rather low estimate. Some additional favorable contributions to this term might originate from the non-stoichiometric charge ratio between DNA and the histones ( 70, 79, 80). Notably, favorable electrostatic free energy greatly exceeds the unfavorable contributions to the formation of the NCP [mostly due to energy cost of the DNA bending ( 81, 82)] that was confirmed by early experimental observation ( 83) and by theoretical analysis based on the counterion condensation model ( 84). More detailed presentation of the arguments in support of a high stability of chromatin originating from nonspecific histone–DNA interaction as well as the consequence of the high stability of chromatin for its statics and dynamics and for the conditions for the protein machines operating on the chromatin template, is discussed in our earlier work ( 70, 80, 85).


                    شاهد الفيديو: تحضير محلول قياسي من مادة صلبههيدروكسيد الصوديوم (قد 2022).