معلومة

هل تقليل تنظيم المستقبلات العصبية قابل للعكس تمامًا ، أي الانتعاش الكامل وإعادة التحسس؟

هل تقليل تنظيم المستقبلات العصبية قابل للعكس تمامًا ، أي الانتعاش الكامل وإعادة التحسس؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

هل تعطل / رفع مستوى التنظيم آليات متبادلة حقًا؟ بعد إزالة رابطة أو ناهض ملزم ، مثل الأدوية الموصوفة ، هل يمكن أن يحدث التنظيم وإعادة التحسس إلى مستوى يعادل تمامًا ويعكس تمامًا ويعوض تمامًا عن أي فقد للمستقبلات ، وتقارب الترابط ، وما إلى ذلك؟ هل يمكن أن يكون أي شيء دائمًا نظريًا؟ هل يلعب وقت / طول الوصفة الطبية أي دور في هذا ، بما في ذلك عند وصف البنزوديازيبين (كلونازيبام)؟


تطوير تحمل المواد الأفيونية: منظور حركية الدواء / الديناميكيات الدوائية

تُستخدم المواد الأفيونية بشكل شائع لعلاج الآلام الحادة والشديدة. يصل تناول المواد الأفيونية على المدى الطويل في النهاية إلى حد أقصى للجرعة يُعزى إلى البداية السريعة لتحمل المسكنات إلى جانب التطور البطيء للتسامح مع الآثار الجانبية غير المرغوبة للاكتئاب التنفسي والغثيان وانخفاض حركية الجهاز الهضمي. لا تزال هناك حاجة لتسكين فعال طويل الأمد. من أجل تطوير علاجات جديدة واستراتيجيات جديدة لاستخدام المسكنات الحالية ، يجب فهم العمليات التي تتوسط التسامح. تسلط هذه المراجعة الضوء على الحرائك الدوائية المحتملة (التغييرات في إنتاج المستقلب ، واستقلاب التعبير الإنزيمي ، ووظيفة الناقل) والديناميكا الدوائية (نوع المستقبل ، والموقع ، والتغييرات الوظيفية في مسارات الإشارة والتسامح المتبادل) لتطوير تحمل المواد الأفيونية ، وتقدم العديد من استراتيجيات النمذجة الدوائية التي تم استخدامها لوصف التوهين المعتمد على الوقت للتسكين الأفيوني.


تحمل نقص الأكسجين ونموذج "تيرتل"

بالنسبة للباحث ، يعتبر نقص التمثيل الغذائي الناجم عن استنفاد الأكسجين من أسهل النماذج التي يمكن معالجتها ودراستها تجريبياً. تمت دراسة نماذج الفقاريات الممتازة (مثل السلاحف والكارب) واللافقاريات (مثل الرخويات المختلفة وبعض الحشرات) على نطاق واسع لنقص الأكسجة و / أو تحمل نقص الأكسجين (على سبيل المثال De Zwaan and Putzer، 1985 Brooks and Storey، 1997 Lutz and Nilsson، 2004 Haddad، 2006). عادةً ما يكون التثبيط الأيضي الناجم عن نقص الأكسجين عميقاً ، على سبيل المثال ، يكون معدل الأيض اللاهوائي في الغالب أقل من 5٪ في الرخويات المدية و 10-20٪ في السلاحف من المعدل الهوائي المقابل عند نفس درجة الحرارة (De Zwaan and Putzer، 1985 Storey and Storey، 1990 Jackson، 2000). يسمح هذا التثبيط الأيضي القوي بإطالة قصوى للوقت الذي يمكن لاحتياطيات الكربوهيدرات الذاتية أن تدعم الحياة وتعوض ، على الأقل جزئيًا ، عن إنتاجية أقل بكثير من ATP من التخمير اللاهوائي للكربوهيدرات عبر تحلل السكر مقارنة مع العائد من أكسدة الوقود المعتمدة على الأكسجين (Hochachka and Somero ، 2002).

لدى مختبرنا اهتمام طويل الأمد بالآليات البيوكيميائية لتحمل نقص الأكسجين في الرخويات وسلاحف المياه العذبة والعديد من النماذج الأخرى ، بدءًا من دراسات الأيض الوسيط وتنظيم الإنزيم ، من خلال تحليل آليات نقل الإشارات داخل الخلايا ، وتقييم دور مضادات الأكسدة الدفاعات ومؤخرًا دراسات التعبير الجيني الناجم عن نقص الأكسجين (للمراجعات ، انظر Storey، 1996 Storey، 2004a Storey، 2007 Brooks and Storey، 1997 Hermes-Lima et al.، 2001 Larade and Storey، 2002). لقد فحص عملنا مع السلاحف ليس فقط نقص الأكسجين / نقص الأكسجين في الماء العذب البالغ ولكن أيضًا تحمّل التجميد وما يصاحبه من إجهاد نقص الأكسجة / نقص الأكسجة في السلاحف المصبوغة التي تفقس (تمت المراجعة في Storey ، 1996 Storey ، 2004a Storey ، 2006a Storey ، 2007). أدت اهتماماتنا في آليات تحمل نقص الأكسجين في السلاحف إلى الاتصال المتكرر بمختبر الدكتور بيتر لوتز ، وعلى مر السنين ، سافر أحدنا (كانساس) عدة مرات إلى فلوريدا (ليس من المستغرب ، خلال الشتاء الكندي) للتفاعل مع بيتر و "ذعره" ، كما نطقهم بروغته الاسكتلندية. تتوافق اهتمامات بيتر في الفسيولوجيا التنفسية والعصبية لتحمل نقص الأكسجين في السلاحف مع اهتمامات مختبرنا في الكيمياء الحيوية الأيضية ، مما أدى إلى مراجعة مشتركة عام 1997 حول التكيفات التنفسية والعصبية والكيميائية الحيوية للحيوانات مع انخفاض الأكسجين (Lutz and Storey ، 1997). أدت الأبحاث في كل من مختبرينا إلى إدراك الدور المركزي الذي يلعبه اكتئاب معدل الأيض في بقاء نقص الأكسجين. ركز عمل بيتر على توقف القناة الأيونية ودور الأدينوزين باعتباره الناقل العصبي الذي يتوسط في قمع النشاط العصبي في الدماغ ناقص الأكسجين (للمراجعات ، انظر Lutz and Nilsson ، 1997 Lutz and Nilsson ، 2004) ، بينما درس مختبرنا التحكم في الوسيط. التمثيل الغذائي أثناء نقص الأكسجين ، ولا سيما الدور الذي تؤديه الفسفرة العكوسة ، المحفزة بواسطة كينازات البروتين وفوسفاتازات البروتين ، في تثبيط وظيفة الإنزيم / البروتين في ظل ظروف نقص الأكسجين (للاطلاع على المراجعات ، انظر Storey، 1996 Storey، 2004a Storey، 2004b Storey and Storey، 1990 ستوري وستوري ، 2004). في الآونة الأخيرة ، بدأ كل من مختبرينا في استكشاف دور التعبير الجيني التفاضلي في بقاء نقص الأكسجين في السلاحف (Cai and Storey ، 1996 Willmore et al. ، 2001a Prentice et al. ، 2003 Prentice et al.، 2004 Milton et al.، 2006 Storey ، 2004a Storey، 2006b). لقد أوضحت مقالات المراجعة الحديثة من مختبرنا المساهمات المهمة لفهم تحمل نقص الأكسجين الطبيعي التي قدمها بيتر لوتز (ستوري ، 2007) وبيتر آخر - "الأب الروحي" للكيمياء الحيوية المقارنة ، بيتر دبليو هوشاتكا (ستوري ، 2004 ب). هذه المقالات وغيرها من المقالات الحديثة (Storey ، 2004a Storey and Storey ، 2004) درست تطور الأفكار في هذا المجال وأظهرت كيف أن التركيز الأولي على تنظيم استقلاب الطاقة اللاهوائية قدم الإطار الذي سمح منذ ذلك الحين للمختبرات الأخرى باستكشاف تنظيم العديد من المجالات الأخرى لوظيفة التمثيل الغذائي في نقص الأكسجين.


نتائج

لتوسيع فهمنا للآليات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء هذا الاضطراب ، قمنا بفحص ستة تم الإبلاغ عنها وراثية و من جديد الطفرات الموجودة في المقطع N-terminal القصير الموجود في السيتوبلازمي (الأحماض الأمينية 1 & # x0201324) (c.25G & # x02192T: pAla 9 & # x02192 Ser ، A9S) (3) ، مجال نقل أيونات الغشاء (الأحماض الأمينية 25 & # x02013533 ) (c.563T & # x02192C: Leu 188 & # x02192 Pro ، L188P c.1148G & # x02192A: Gly 383 & # x02192 Asp ، G383D) (5 ، 15) ، والمجال التنظيمي الأطول C- الطرفية (الأحماض الأمينية 534 & # x02013701) (c.1639G & # x02192T: Glu 547 & # x02192 Ter، E547 * c.1703G & # x02192A: Arg 568 & # x02192 Gln، R568Q c.1710G & # x02192A: Trp 570 & # x W52192 (Terp 570 & # W52192) 4 ، 12 ، 15 ، 19 ، 25 ، 58) من أطول متغير لصق للإنسان NHE6 (<"النوع": "entrez-nucleotide" ، "attrs": <"text": "NM_001042537.1" ، "term_id ":" 110227625 "،" term_text ":" NM_001042537.1 ">> NM_001042537.1 ، يُسمى أيضًا NHE6v1 ولكن يشار إليه فيما بعد باسم NHE6). يشار إلى مواضع هذه الأحماض الأمينية في منظمة الغشاء المستوي المتوقعة لـ NHE6 (الشكل 1). أ) استنادًا إلى الهيكل المقترح لـ NHE1 (59 ، 60). تحدث هذه الطفرات في مواقع محمية للغاية في أطباء تقويم NHE6 من الثدييات إلى ذباب الفاكهة ، مما يشير إلى أهمية وظيفية (الشكل 1). ب). تزيل النصوص التي تحتوي على طفرات كود الإيقاف المبكر للطرف C (E547 * و W570 *) الجزء الأكبر من المجال التنظيمي السيتوبلازمي (بمعنى آخر. آخر 155 و 132 من الأحماض الأمينية ، على التوالي) وقد يخضعون لاضمحلال mRNA الذي لا معنى له (61). ومع ذلك ، إذا تمت ترجمتها ، فقد تزيل مثل هذه الاقتطاعات تسلسلات الإشارات المفترضة المهمة لتهريب الأغشية و / أو تنظيم الناقل ، وبالتالي فهي تستحق مزيدًا من التحقيق حيث لا يُعرف سوى القليل عن هذه المنطقة من الناقل.

موقع الطفرات الخاطئة والهراء في متغيرات SLC9A6 / NHE6 لمرضى متلازمة كريستيانسون. أ، رسم تخطيطي مستوٍ لطوبولوجيا الغشاء المتوقعة لأطول متغير لصق للثدييات NHE6 وموقع الطفرات (دوائر صفراء). إجماعان نتم التحقق من مواقع الارتباط بالجليكوزيل المرتبطة (128 NVT و 145 NVS) داخل الحلقة خارج الخلية 2 بشكل تجريبي (البيانات غير معروضة) وهي موضحة في الرسم. ب، مقارنة النشوء والتطور للتسلسل الأولي للقطاعات التي تحتوي على الطفرات المختلفة في NHE6. المخلفات المصابة مظللة باللون الأسود.

النمذجة الهيكلية للمتغيرات L188P و G383D

من بين الطفرات الستة المذكورة أعلاه ، تم توطين اثنين (L188P و G383D) داخل مجال نقل الأيونات عبر الغشاء ، مما أتاح فرصة لتقييم الآثار الهيكلية والوظيفية النظرية لهذه البدائل عن طريق نمذجة التماثل الهيكلي. في هذا الصدد ، وصفنا سابقًا نموذجًا هيكليًا مفترضًا لمنطقة الغشاء الطرفية NHE6 N البشرية (تشمل المخلفات 74 & # x02013540) في حالتها الأحادية باستخدام الإحداثيات الذرية المكانية للتشكيل المواجه للخارج من ثيرموفيلوس Na + / H + antiporter NapA (57 ، 62). ومع ذلك ، فإن NHEs في الثدييات ، مثل متماثلاتها البكتيرية ، عادة ما تكون متجانسة (63). يتم الآن عرض نموذج شريط homodimer لـ NHE6 في تكويناته الأمامية والعلوية في الشكل 2 أ. في مبادل النوع البري (WT) ، يكون Leu 188 مجاورًا لمتبقي برولين متتاليين (Pro 189 و Pro 190) في منتصف اللولب الغشائي 4 (M4). عادةً ما يُتوقع أن يقاطع الشكل الأخير ثنائي البرولين ويفكك اللولب (64). ومع ذلك ، فإن إخضاع اللولب لمحاكاة الديناميات الجزيئية (MD) (للوصف ، انظر & # x0201c الإجراءات التجريبية & # x0201d) امتد إلى الجزء الذي يحتوي على بقايا البرولين بسبب عدم وجود روابط H في هذا الموقع ولكن لم يكسر التكوين الحلزوني بالكامل (موضحة في المونومر ، الشكل 2 ب, اللوحة اليسرى). على الرغم من ندرته الشديدة ، فمن الممكن أن يكون لديك برولين متتاليين دون تعطيل اللولب (65 ، 66). ومع ذلك ، فإن استبدال Leu 188 بالبرولين ينتج عنه ثلاثة برولينات متتالية ، والتي تنبأت بها محاكاة MD لكشف اللولب ، مما يؤدي إلى مقطع حلزوني أقصر بكثير (الشكل 2). ب, اللوحة اليمنى). نظرًا لأنه يُعتقد أن المقطع M4 المتماثل في الشكل الإسوي البلازمي NHE1 يشكل جزءًا مهمًا من مسار انتقال الأيونات (60 ، 67 ، 68) ، فمن المحتمل جدًا أن يؤثر استبدال L188P على وظيفة الناقل.

نمذجة التماثل الهيكلي لمتغيرات NHE6 عبر الغشاء المرتبطة بمتلازمة كريستيانسون. أ, أمام (جانب الغشاء ، اللوحة اليسرى) و أعلى (الجانب خارج الخلية ، اللوحة اليمنى) مناظر لنموذج تجانس هيكل ثلاثي الأبعاد لـ NHE6 بشري خافت بناءً على التركيب البلوري للبكتيريا T. ثيرموفيلوس Na + / H + antiporter NapA (TtNapA) (رمز دخول بنك بيانات البروتين 5bz3 2.30 & # x0212b ، هوية 15٪ ، تشابه 27٪) ، والتي وفرت أوسع تغطية ، وأعلى دقة ، وأفضل ملاءمة مكانية مقارنةً بالبكتيريا المتبلورة الأخرى Na + / H + مضادات الحمى. يتضمن الهيكل المقترح فقط الحلزونات الممتدة للغشاء (M2 & # x02013M12 الأحماض الأمينية 74 & # x02013540) التي تتماشى مع الأجزاء المتجانسة من TtNapA. ال منظر علوي يشمل مواقع البقايا المترجمة عبر الغشاء Leu-188 و Gly-383 التي تحورت في CS. ب، محاكاة الديناميات الجزيئية للتغيرات الهيكلية المتوقع حدوثها في TM4 (أبرزت باللون السماوي) عند استبدال Leu-188 بـ Pro (L188P). يتم توضيح الأشكال الأحادية لـ NHE6 WT و L188P. ج و د، الاضطرابات الهيكلية المتوقع حدوثها في إعادة الدخول داخل الغشاء (ص) حلقة بين الحلزونات M8 و M9 عند استبدال Gly-383 بـ Asp (G383D). ج, العلوي و الألواح السفلية عرض المنظر الأمامي والأعلى ، على التوالي ، لـ Gly-383 ، المعبأ بإحكام ضد الأحماض الأمينية Phe-373 و Ala-376 و Glu-377 (أعلى اليسار). سيؤدي تحور Gly-383 إلى Asp إلى اشتباكات فاصلة بين هذه المخلفات وتتداخل مع التعبئة بين هذه الأجزاء من الحلقة R. د، سيؤدي استبدال G383D أيضًا إلى تعطيل تفاعلات بقايا حلقة R Trp-379 و Phe-381 وخاصة Thr-382 مع البقايا Asp-92 و Ile-296 في الحلزون M7 والبقايا Ile-330 و Phe-331 و Ser- 334 في الحلزون M8.

من المتوقع أيضًا أن تؤدي عواقب طفرة G383D إلى اضطراب كبير في بنية البروتين ووظيفته. في هيكل WT النموذجي ، يقع Gly 383 بالقرب من منحنى حلقة الدخول الغشائية (حلقة R) بين الحلزونات M8 و M9 ومعبأة بإحكام ضد الأحماض الأمينية Phe 373 و Ala 376 و Glu 377 (الشكل 2). ج) ، وهو جزء متورط بقوة في نفاذ الأيونات (69 ، 70). سيؤدي استبدال Gly 383 ببقايا حمض الأسبارتيك إلى حدوث اشتباكات فاصلة بين هذه المخلفات وتتداخل مع التعبئة بين هذه الأجزاء من الحلقة R (الشكل 2). ج). علاوة على ذلك ، سيؤدي هذا الاستبدال أيضًا إلى تعطيل تفاعلات بقايا حلقة R Trp 379 و Phe 381 وخاصة Thr 382 مع البقايا Asp 292 و Ile 296 في اللولب M7 والبقايا Ile 330 و Phe 331 و Ser 334 في الحلزون M8 (الشكل. 2 د). والجدير بالذكر أن الأحماض الأمينية Asp 292 ثابتة في جميع NHEs الثدييات ، وبقاياها المتماثلة في NHE1 البشري (بمعنى آخر. Asp 267) أمر بالغ الأهمية للنشاط التحفيزي (71). وبالتالي ، فمن المحتمل أن الطفرة G383D قد تعطل أيضًا تشكيل ووظيفة NHE6.

النضج الحيوي واستقرار متغيرات NHE6

لتصور وتقييم الأهمية الوظيفية للمتغيرات الفردية بشكل تجريبي ، قمنا بتصميمها في WT البشري NHE6 (كدنا) الذي تم دمجه عند نهايته C إما لبروتين الفلورسنت الأخضر المحسن (GFP) ، أو بروتين الفلورسنت الكرز الأحادي (ChFP) ، أو الإنفلونزا hemagglutinin (HA) -epitope (NHE6GFP، NHE6ChFPأو NHE6HA، على التوالى). لقد أظهرنا سابقًا أن الخصائص الجزيئية والخلوية لهذه التركيبات الكيميرية لا يمكن تمييزها عن NHE6 غير المعدل عند فحصها في خلايا AP-1 ، وهو خط خلوي مشتق من مبيض الهامستر الصيني يفتقر إلى مستويات يمكن اكتشافها من NHE6 الداخلي ، وبالتالي يعمل كنموذج خلية مفيد. لدراسة هذا الناقل (53).

لتقييم نضجها التخليقي الحيوي ، التعبير عن الثدييات البلازميدات التي تحتوي على NHE6GFP تم نقل البنى بشكل عابر في خلايا AP-1 ، وتمت مراقبة تعبيرها الخلوي الكلي على مدار 48 ساعة بواسطة النشاف الغربي. تمشيا مع النتائج السابقة (56) ، تم تجزئة ناقل WT المتجانس على هيئة نطاقات متعددة تتوافق مع النواة الجليكوزيلاتية المنفصلة والمركبة حديثًا (& # x0223c85 & # x0201390 كيلو دالتون) ، وجليكوسيلاتيد بالكامل (& # x0223c110 & # x031omeric30 كيلو دالتون الأنواع ، وشكلها الثنائي الغليكوزيلاتي بالكامل (& # x0003e250 كيلو دالتون) الذي لا ينفصل تمامًا في ظل ظروف SDS-PAGE القياسية (الشكل 3) أ) (53). لوحظ تجميع Dimeric لجميع التركيبات ، مما يشير إلى أن تشكيل هياكلها الرباعية لم يكن مضطربًا بشكل كبير. ومع ذلك ، في حين أن نضج قليل السكاريد بعد الترجمة استمر بشكل طبيعي بالنسبة لـ A9S و R568Q ، فإن نسبة الغليكوزيلاتي (مونومر وثنائي) إلى إجمالي التعبير البروتيني NHE6 كانت ضعيفة بشكل ملحوظ بالنسبة للطفرات الأربعة الأخرى مقارنة مع WT (الشكل 3). أ) ، تظهر تخفيضات كبيرة (& # x0223c70 & # x0201390٪ ثنائية الاتجاه ANOVA ، ص & # x0003c 0.05) عند ذروة التعبير (بين 24 و 32 ساعة بعد ترنسفكأيشن) كما تم قياسها بواسطة قياس الكثافة (انظر & # x0201c الإجراءات التجريبية & # x0201d للحصول على التفاصيل) (الشكل 3) ب). كما انخفض التعبير الكلي للبروتين عن هذه الطفرات الأخيرة بشكل ملحوظ في 48 ساعة بعد تعداء الجسم مقارنة مع WT ، مما يدل على زيادة تصفية البروتين.

تقييم نضج التخليق الحيوي لمتغيرات NHE6. أ، خلايا AP-1 تعبر بشكل عابر عن NHE6GFP تم تحليل المتغيرات المرتبطة بـ WT أو CS في النقاط الزمنية المحددة (6 & # x0201348 ساعة) بعد ترنسفكأيشن. تعرضت كميات متساوية من البروتينات (20 & # x003bcg) لـ SDS-PAGE والتكتل المناعي باستخدام جسم مضاد متعدد النسيلة مضاد لـ GFP. يهاجر NHE6 على شكل نطاقات متعددة: تمثل العصابات ذات الوزن الجزيئي الأعلى الحبيبات الغليكوزيلاتي بالكامل (fg) ولب غليكوزيلاتيد (cg) ديميريك (د) أشكال المبادل التي لا تنفصل تمامًا في ظل ظروف SDS-PAGE ، في حين أن العصابات ذات الوزن الجزيئي المنخفض تمثل أشكالًا كاملة الجليكوزيلات ولب الجليكوزيلات من المونومري المنفصل (م) بروتين. تم تجريد البقع وإعادة فحصها باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة للفأر مضاد لـ GAPDH للتحكم في تحميل البروتين. ب، نسب البروتين الغليكوزيلاتي بالكامل (مونومر وثنائي) / إجمالي بروتين NHE6 (fg / المجموع) عن طريق قياس كثافة أفلام الأشعة السينية المكشوفة في النطاق الخطي وتحليلها باستخدام برنامج ImageJ. تمثل القيم المتوسط ​​& # x000b1 S.D. من ثلاث تجارب مختلفة. تم تحديد الأهمية عن طريق ANOVA ثنائي الاتجاه مع اختبار Tukey اللاحق. متغيرات NHE6 مجمعة في مجموعتين: 1) WT و A9S و R568Q و 2) L188P و G383D و E547 * و W570 * ، مع متغيرات داخل كل مجموعة تسفر عن قيم إحصائية مماثلة. تختلف الوسائل السكانية لمتغيرات NHE6 اختلافًا كبيرًا (F القيمة = 26.4 ، ص القيمة = 1.5 & # x000d7 10 & # x0221216). يعني السكان كدالة زمنية تختلف اختلافًا كبيرًا (F القيمة = 48.6 ، ص القيمة = 1.9 & # x000d7 10 & # x0221219). & # x000a7 يشير إلى دلالة (ص & # x0003c 0.01) من وسائل متغيرات NHE6 داخل مجموعة بالنسبة إلى النقطة الزمنية التي تبلغ 12 ساعة. النجمة تشير إلى الأهمية (& # x02605 ، ص & # x0003c 0.05 ، و & # x02605 & # x02605 ، ص & # x0003c 0.01) للوسائل بين مجموعات متغيرات NHE6 في النقاط الزمنية المحددة.

تم فحص ثبات تركيبات NHE6 بشكل أكبر من خلال تجارب النبض & # x02013chase. بعد 24 ساعة من تعداء عابرة ، عولجت الخلايا باستخدام سيكلوهيكسيميد لمدة 4 & # x0201324 ساعة إضافية لتثبيط من جديد تخليق البروتين مع مراقبة مستويات الناقلات المركبة مسبقًا كدالة للوقت. كما هو مبين في الشكل 4 ، فإن مستويات الأشكال الجليكوزيلاتية الأساسية لـ WT و A9S و R568Q عند 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن تنضج إلى حالاتها الكاملة بالجليكوزيلات خلال 4 ساعات بعد معالجة سيكلوهكسيميد ثم تظل مستقرة نسبيًا على مدى 20- التالي. فترة ح. على النقيض من ذلك ، أظهرت المسوخات L188P و G383D و E547 * و W570 * انخفاض نضج قليل السكاريد ووفرة على مدار النبض وفترة الشراء # x02013. كعنصر تحكم في تحميل البروتين ، قمنا بقياس تعبير إنزيم حال السكر glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) ووجدناه ثابتًا خلال فترة العلاج. تتوافق هذه النتائج مع انخفاض استقرار هذه المتغيرات.

تقييم ثبات البروتين لمتغيرات NHE6. تم نقل خلايا AP-1 بشكل عابر باستخدام NHE6HA WT للمتغيرات المرتبطة بـ CS لمدة 24 ساعة ثم تعامل مع 150 & # x003bcg / ml cycloheximide (CHX) للنقاط الزمنية المحددة والمحللة ، وتم تحليل كميات متساوية من البروتين (20 & # x003bcg) بواسطة النشاف الغربي باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة للفأر مضاد لـ HA. تم استنساخ البقع بجسم مضاد أحادي النسيلة للفأر مضاد لـ GAPDH للتحكم في التحميل. البقع هي صور تمثيلية من أربع تجارب منفصلة. fg غليكوزيلاتي بالكامل cg ، نواة جليكوسيلاتيد د، قاتمة م، أحادي.

يمكن أن تنشأ المعالجة المتأخرة وتعزيز معدل دوران المسوخ L188P و G383D و E547 * و W570 * عن طريق إعادة توجيه الناقلات المعيبة إلى البروتيازومات و / أو الجسيمات الحالة. لتقييم هذا الاحتمال ، تم إجراء تجربة نبض & # x02013chase أخرى مع الخلايا المنقولة بشكل عابر (24 ساعة) معبرة عن تركيبات NHE6 المختلفة المحتضنة مع سيكلوهيكسيميد ومثبطات البروتوزومال (MG132) (72) أو الليزوزومي (ليوببتين زائد بيبستاتين ، ليوب) (73) ، 74) تحلل البروتين على مدى 8 ساعات. كما هو متوقع ، لم يكن لكلا النوعين من المثبطات تأثير ملموس على مستويات WT و A9S و R568Q مقارنةً بالضوابط المعالجة بواسطة السيارة (الشكل 5). على سبيل المقارنة ، أدى قمع البروتوزوم ، ولكن ليس الليزوزومات ، إلى خفض التحلل البروتيني جزئيًا من الفقد الخلوي لـ L188P و G383D و E547 * و W570 * وأدى إلى ظهور نطاق NHE6 فريد من نوعه عالي الوزن الجزيئي فوق النطاق الثنائي الغليكوزيلاتي بالكامل (يشار إليها بعلامة النجمة) لكل من هذه المتغيرات. على الرغم من أن طبيعة هذا النطاق لم يتم فحصها تجريبيًا ، فمن المحتمل أنها تمثل أشكالًا متعددة الأبعاد أو ربما مجمعة من هذه المتغيرات التي تراكمت عند تثبيط البروتوزوم. دفعنا عدم وجود تأثير لمثبطات البروتياز الليزوزومية ليوببتين وبيبستاتين ، اللذان يكونان فقط نفاذية معتدلة للخلايا ، إلى اختبار تأثير عامل الكلوروكين الموجه للجسيمات ، وهو قاعدة ضعيفة تتخلل بسهولة وتحييد العضيات الحمضية مثل الجسيمات الحالة ، مثل مثل هذا ، يقمع بشكل غير انتقائي إجراءات هيدرولازات الحمض المقيمة (73 ، 75). في ظل هذه الظروف ، أعاق الكلوروكين بشكل معتدل تخليصها عند 4 ساعات ، لكن هذا لم يستمر في النقطة الزمنية البالغة 8 ساعات بالنسبة إلى عناصر التحكم المعالجة بمخفف (الشكل 6). بشكل جماعي ، تشير هذه البيانات إلى دور تفضيلي للشبكة الإندوبلازمية ومسار التدهور المرتبط (ERAD) (76 ، 77) ، وبدرجة أقل الجسيمات الحالة ، في إزالة هذه المتغيرات.

تأثير مثبطات البروتوزوم والليزوزومات على التصفية الخلوية لمتغيرات NHE6. تم نقل خلايا AP-1 بشكل عابر باستخدام NHE6HA المتغيرات المرتبطة بـ WT أو CS لمدة 24 ساعة ثم يتم معالجتها بـ 150 & # x003bcg / ml cycloheximide (CHX) للنقاط الزمنية المحددة في وجود المادة المخففة (DMSO) ومثبط البروتوزوم MG-132 (40 & # x003bc m) أو المانع الليزوزومي leupeptin / pepstatin (ليوب ، 100 & # x003bcg / مل). تم تحليل lysates إجمالي الخلايا عن طريق النشاف الغربي باستخدام جسم مضاد HA أحادي النسيلة. تم فحص الأغشية أيضًا من أجل تعبير & # x003b2-tubulin كعنصر تحكم في التحميل. تمثل الحطام المناعية ثلاث تجارب منفصلة. fg غليكوزيلاتي بالكامل cg ، الأساسية جليكوسيلاتيد د، قاتمة م، أحادي.

تأثير عامل الكلوروكين الموجه للجسيمات الحالة على التصفية الخلوية لمتغيرات NHE6. تم نقل خلايا AP-1 بشكل عابر باستخدام NHE6HA المتغيرات المرتبطة بـ WT أو CS لمدة 24 ساعة ثم يتم معالجتها بـ 150 & # x003bcg / ml cycloheximide للنقاط الزمنية المحددة في وجود مادة مخففة (H2O) أو الكلوروكين (CQ ، 500 & # x003bc م). تم تحليل lysates إجمالي الخلايا عن طريق النشاف الغربي باستخدام جسم مضاد HA أحادي النسيلة. تم فحص الأغشية أيضًا من أجل تعبير & # x003b2-tubulin كعنصر تحكم في التحميل. تمثل الحطام المناعية أربع تجارب منفصلة. fg غليكوزيلاتي بالكامل cg ، نواة جليكوسيلاتيد د، قاتمة م، أحادي.

التوزيع الخلوي لمتغيرات NHE6

لتصور التوزيع الخلوي لبنى NHE6 المختلفة ، تم إجراء الفحص المجهري متحد البؤر ذو العلامات المزدوجة باستخدام NHE6ChFP والعلامات العضوية في خلايا AP-1 المنقولة بشكل عابر عند 48 ساعة. تم اختيار هذه النقطة الزمنية بناءً على مدى نضوج التخليق الحيوي لناقل WT الذي أظهر الارتباط الأساسي الاسمي بالجليكوزيل عند 48 ساعة بعد تعداء العدوى (معروض في الشكل 3) ، مما يشير إلى أن الجزء الأكبر من NHE6 المركب حديثًا قد خرج من ER ووصلت إلى حالة مستقرة من التوزيع الخلوي. تظهر الصور التمثيلية في الشكل 7 أ. كما هو متوقع ، كان ناقل WT موجودًا في ناقلات أنبوبية حويصلية موزعة في جميع أنحاء الخلية ، مع إشارات مضان مركزة في منطقة بارا جولجي / محيط المركز ولكن أيضًا مشتتة بشكل محيطي في نمط مكاني يتداخل بشكل كبير مع Alexa Fluor TM 488 & # x02013 ترانسفيرين متقارن (Tf- AF 488) ، علامة على كل من البطء المعتمد على Rab11 (محيط المركز) وإعادة التدوير السريع المعتمد على Rab4 (المحيطي) (78 ، 79). جزء WT NHE6ChFP التي تداخلت مع Tf-AF 488 في عدة خلايا تم قياسها كميًا عن طريق حساب معامل التوطين المشترك لـ Manders (MCC) (80 ، & # x0201382) ، والذي كشف عن درجة عالية من التواجد المشترك (متوسط ​​& # x000b1 SD ، WT -Tf ، 0.709 & # x000b1 0.062 ، ن = 6) (الشكل 7 ب). لوحظ أيضًا نمط مماثل لمتغير A9S (A9S-Tf: 0.622 & # x000b1 0.038 ، ن = 7 ، مقاييس متكررة أحادية الاتجاه ANOVA مع اختبار Dunnett اللاحق ، ص & # x0003e 0.05). تم توزيع متحولة R568Q بالمثل ، ولكنها كانت تميل أيضًا إلى التراكم بشكل أكثر وضوحًا على سطح الخلية ، مما أدى إلى انخفاض صغير ، ولكن مهم من الناحية الإحصائية ، في التوطين المشترك مع Tf-AF 488 الداخلي (R568Q-Tf: 0.519 & # x000b1 0.052 و ن = 6, ص & # x0003c 0.001) مقارنة بالوزن. أظهرت طفرات L188P و G383D تداخلًا أكثر تقييدًا وتقليصًا مع الإندوسومات Tf-AF 488 & # x02013 المسمى ، مع تداخل الإشارات جزئيًا فقط في المنطقة المحيطة بالمركز وأقل بشكل ملحوظ في محيط الخلية. وقد انعكس ذلك من خلال الانخفاض الكبير في قيم مركز عملائي الخاصة بهم من أجل التوطين المشترك مع Tf-AF 488 مقارنةً بـ WT (L188P-Tf: 0.522 & # x000b1 0.039 ، ن = 8 G383D-Tf: 0.467 & # x000b1 0.105 ، ن = 7 ص & # x0003c 0.001). بدلاً من ذلك ، تم تفريق أجزاء كبيرة من هذه الطفرات في نمط شبكي منتشر يوحي بالتراكم الجزئي في الشبكة الإندوبلازمية (ER). تم تأكيد ذلك من خلال التداخل المحسّن مع بروتين calnexin المقيم في ER (CANX) (L188P & # x02013CANX: 0.410 & # x000b1 0.060 ، ن = 11 G383D & # x02013CANX: 0.551 & # x000b1 0.096 ، ن = 10 ص & # x0003c 0.001) ، بينما أظهرت WT و A9S و R568Q الحد الأدنى من الترجمة المشتركة مع CANX (WT & # x02013CANX: 0.269 & # x000b1 0.036 ، ن = 8 A9S & # x02013CANX: 0.311 & # x000b1 0.057 ، ن = 8 R568Q & # x02013CANX: 0.257 & # x000b1 0.028 ، ن = 8) (الشكل 8 ، أ و ب). أظهرت إشارات التألق لـ E547 * و W570 * توطينًا مشتركًا أقل مع Tf-AF 488 (E547 * -Tf ، 0.312 & # x000b1 0.042 ، ن = 7 و W570 * -Tf: 0.348 & # x000b1 0.059 ، ن = 6 ص & # x0003c 0.001) (الشكل 7 ، أ و ب) وتداخل أكثر بروزًا مع CANX (E547 * & # x02013CANX: 0.648 & # x000b1 0.042 ، ن = 8 W570 * & # x02013CANX: 0.645 & # x000b1 0.066 ، ن = 9, ص & # x0003c 0.001) (الشكل 8 ، أ و ب) مقارنة بـ WT ، بما يتوافق مع التراكم الكبير في ER.

الكشف الخلوي عن متغيرات NHE6 في إعادة تدوير الإندوسومات في خلايا AP-1 المنقولة. أ، تم نقل خلايا AP-1 بشكل عابر باستخدام NHE6 الموسوم بالبروتين الفلوري mCherry (NHE6ChFP) المتغيرات المرتبطة بـ WT أو CS. ثمان وأربعون ساعة بعد ترنسفكأيشن ، تم تحضين الخلايا باستخدام علامة إعادة التدوير الداخلي Alexa Fluor 488 & # x02013 ترانسفيرين متقارن (Tf-AF 488، 10 & # x003bcg / ml) لمدة 45 دقيقة ، مثبتة في بارافورمالدهيد بنسبة 4٪ ، مثبتة على شرائح زجاجية ، و فحصها عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر. تظهر الصور كل قناة على حدة ، مع الصور المدمجة من NHE6ChFP و Tf-AF 488 قناة. أشرطة مقياس تمثل 10 & # x003bc م. ب، تقدير درجة تداخل NHE6 مع Tf-AF 488 كما تم تحديده من خلال حساب معامل ماندر العتبة (M1) باستخدام برنامج ImageJ والمكوِّن الإضافي JACoP. يتم رسم البيانات على شكل مخطط مربع ، بامتداد مربع أبيض مركزي مشيرا إلى المتوسط ​​، و علبة يمثل S.E. و شريط الاخطاء تظهر S.D. (ن = 6 & # x020138 خلايا). تم تحديد أهمية من WT من خلال إجراءات متكررة أحادية الاتجاه ANOVA (F القيمة = 6479.8 ، ص value = 5.6 & # x000d7 10 & # x022129) ، مع اختبار Dunnett اللاحق ، & # x02605 & # x02605 & # x02605 ، ص & # x0003c 0.001.

التوطين الخلوي لبعض متغيرات CS في الشبكة الإندوبلازمية في خلايا AP-1 المنقولة. أ، تم نقل خلايا AP-1 بشكل عابر باستخدام NHE6 الموسوم بالبروتين الفلوري mCherry (NHE6ChFP) المتغيرات المرتبطة بـ WT أو CS. ثمان وأربعون ساعة بعد تعداء العدوى ، تم تلطيخ الخلايا المناعية لـ CANX الذاتية ، وتم تثبيتها في 4 ٪ بارافورمالدهيد ، مثبتة على شرائح زجاجية ، وفحصها بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. تظهر الصور كل قناة على حدة ، مع الصور المدمجة من NHE6ChFP وقنوات CANX. أشرطة مقياس تمثل 10 & # x003bcm. ب، التقدير الكمي لدرجة تداخل NHE6 مع CANX كما هو محدد من خلال حساب معامل Mander (M1) باستخدام برنامج ImageJ والمكوِّن الإضافي JACoP. يتم رسم البيانات كملف مخطط مربع، مع ال مربع أبيض مركزي مشيرا إلى المتوسط ​​، و علبة يمثل S.E. ، و شريط الاخطاء تظهر S.D. (ن = 6 & # x020138 خلايا). تم تحديد أهمية من WT من خلال إجراءات متكررة أحادية الاتجاه ANOVA (F القيمة = 3012.9 ، ص value = 1.7 & # x000d7 10 & # x0221210) ، مع اختبار Dunnett اللاحق ، & # x02605 & # x02605 & # x02605 ، ص & # x0003c 0.001.

لتقييم قدرة متغيرات NHE6 كيميائيًا على المرور إلى غشاء البلازما ، تم استخراج بروتينات البلازما باستخدام إجراء biotinylation على سطح الخلية وتحليلها بواسطة النشاف الغربي. لقد أظهرنا سابقًا أن & # x0223c5 ٪ من إجمالي المجموعة الخلوية لـ NHE6 يقع على سطح الخلية لخلايا AP-1 المنقولة (57). نظرًا لانخفاض مستويات التعبير عن بعض متغيرات NHE6 ، قمنا بتحميل كميات متفاوتة من البروتين في كل حارة (كما هو موضح) بحيث تكون شدة إشاراتها قابلة للمقارنة ويمكن تصورها بسهولة خلال تعرض فيلم واحد للأشعة السينية للكتل المناعية. كما هو معروض في الشكل 9 أ، تم اكتشاف جميع الطفرات في غشاء البلازما ، على الرغم من أن وفرة السطح الجزئي لـ L188P و G383D و E547 * و W570 * قد تم تقليلها بشكل ملحوظ مقارنةً بـ WT و A9S و R568Q بعد مراعاة الاختلافات في تحميل بروتين الهلام. بشكل ملحوظ ، على الرغم من مستوياتها المنخفضة ، كانت المسوخات L188P و G383D و E547 * و W570 * على سطح الخلية عبارة عن جليكوزيلاتي بالكامل (مونومر وثنائي). يشير هذا إلى أن هذه المتغيرات لديها القدرة على الطي بشكل صحيح والخضوع لنضج قليل السكاريد على طول مسار خروج الخلايا ، على الرغم من انخفاض الكفاءة إلى حد كبير. يتوافق عدم وجود الأشكال الأساسية للجليكوزيلات (المونومر والثنائي) في الكسور المعالجة بالبيوتين مع موقعها داخل الخلايا (بمعنى آخر. بشكل رئيسي ER). لمقارنة وفرة البلازما الخاصة بهم من الناحية الكمية ، استخدمنا مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). بالنسبة لهذه التجارب ، تم نقل خلايا AP-1 بشكل عابر باستخدام تركيبات NHE6 التي تحتوي على علامة حلقية ثلاثية العلم تم إدراجها في الحلقة الخارجية الأولى للوجه كما هو موضح سابقًا (53). تمشيا مع biotinylation على سطح الخلية ، أظهرت متغيرات WT و A9S مستويات مكافئة من التعبير السطحي. كانت الوفرة البلازمية لـ R568Q أعلى بشكل ملحوظ ، بما يتوافق مع تحليلات الصور ، لكن هذه الزيادة لم تصل إلى دلالة إحصائية (الشكل 9). ب). على النقيض من ذلك ، تم تقليل الوفرة السطحية للطفرات الأخرى بشكل ملحوظ بواسطة & # x0223c55 & # x0201370٪ ، خاصة بالنسبة لـ G383D و E547 * و W570 * (* ، ص & # x0003c 0.05 ، مقاييس متكررة أحادية الاتجاه ANOVA متبوعة باختبار Dunnett اللاحق).

تقييم الخصائص الوظيفية لمتغيرات NHE6. أ، التحديد البيوكيميائي لتهريب غشاء البلازما لـ NHE6GFP المتغيرات المرتبطة بـ WT أو CS باستخدام مقايسة biotinylation على سطح الخلية. تم تمييز بروتينات سطح الخلية بـ ن-هيدروكسي سلفوسوكسينيميديل & # x02013SS & # x02013 بيوتين في خلايا AP-1 التي تعبر عن NHE6GFP يبني بعد 48 ساعة. ليسيتس الخلية الكلية (اللوحة اليسرى تراوح تحميل البروتين من 10 إلى 50 & # x003bcg من البروتين لكل عينة كما هو محدد تحت البقعة) والكسور المعالجة بالبيوتينيل (اللوحة اليمنى التي تمثل 20 & # x02013100 ٪ من بروتينات غشاء البلازما المستخرجة لكل عينة) تم فحصها بواسطة النشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة متعددة النسيلة المضادة لـ GFP والأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة لـ GAPDH. تظهر بقع تمثيلية من ثلاث تجارب. ب و جوالتعبير السطحي والالتقام للعلامة الخارجية ثلاثية العلم & # x02013labeled NHE6 (3FNHE6HA) يبني في خلايا AP-1 المنقولة بشكل عابر (48 ساعة) باستخدام ELISA المستندة إلى الخلية. متوسط ​​شدة التألق (م.) تم تحديد الوحدات كدالة لتركيز البروتين الخلوي ثم تم تطبيعها كنسبة مئوية (وحدات MIF لـ WT (100٪): 25،100 & # x000b1 6،348 ، ن = 4). يتم رسم التعبير السطحي لكل بناء في الوقت 0 دقيقة (قبل بدء الاستيعاب) في ب (ن = 3 & # x020134 تجارب). تم تحديد الأهمية من الخلايا التي تعبر عن WT باستخدام مقاييس متكررة أحادية الاتجاه ANOVA (F القيمة = 463.3 ، ص القيمة = 0.0022) ، مع اختبار دونيت اللاحق * ، ص & # x0003c 0.05. يتم تقديم استيعاب النسبة المئوية لتركيبات NHE6 التي تم تطبيعها إلى نقطة الصفر الزمنية ج وتمثل المتوسط ​​& # x000b1 S.D. (ن = 3 & # x020134 تجارب). متغيرات NHE6 مجمعة في مجموعتين: 1) WT و A9S و R568Q و 2) L188P و G383D و E547 * و W570 * ، مع متغيرات داخل كل مجموعة تسفر عن قيم إحصائية مماثلة. تم تحديد الأهمية من خلايا WT في النقطتين الزمنيتين 5 و 15 دقيقة باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه (F القيمة = 9.43 ، ص value = 4.48 & # x000d7 10 & # x022125) ، مع اختبار Tukey اللاحق & # x02605 ، ص & # x0003c 0.05. د، امتصاص الترانسفيرين في خلايا هيلا المنقولة بشكل عابر (48 ساعة) باستخدام GFP أو NHE6GFP يبني. تم قياس الامتصاص الأولي (5 دقائق) لـ Alexa 633 & # x02013 المتحد الترانسفيرين (Tf-AF 633) في 1 & # x000d7 10 4 خلايا هيلا إيجابية GFP لكل تجربة عن طريق قياس التدفق الخلوي (وحدات MIF للتحكم في GFP: 10،204 & # x000b1 1554 و ن = 4). تم تطبيع البيانات كنسبة مئوية وعرضها كتغير في المائة من خلايا التحكم GFP. تم تحديد الأهمية من خلايا التحكم باستخدام مقاييس متكررة أحادية الاتجاه ANOVA (F القيمة = 320.7 ، ص value = 3.8 & # x000d7 10 & # x022124) ، مع اختبار DUNNET اللاحق & # x02605 & # x02605 ، ص & # x0003c 0.001. ه، إعادة تدوير الأس الهيدروجيني الداخلي (pHه) في خلايا AP-1 في غياب أو وجود منقولة بشكل عابر (48 ساعة) NHE6ChFP يبني عن طريق تحليل صورة نسبة التألق للمسبار الداخلي الحساس للأس الهيدروجيني المترافق مع FITC (Tf & # x02013FITC). تمثل البيانات متوسط ​​درجة الحموضة داخل الجسمه لكل خلية مجمعة من ثلاث تجارب منفصلة (8 & # x0201312 خلية لكل بناء / تجربة ن = 24 & # x0201336). تم تحديد الأهمية بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه (F القيمة = 40.02 ، ص value = 0) ، مع اختبار Tukey اللاحق & # x02605 & # x02605 ، ص & # x0003c 0.001. إدخال المعلومات ب ، د ، و ه تم رسمها كـ المخططات الصندوقية، مع ال مربع أبيض مركزي مشيرا إلى يعني علبة يمثلون S.E. و ال شريط الاخطاء تظهر S.D. fg غليكوزيلاتي بالكامل cg ، الأساسية جليكوسيلاتيد د، قاتمة م، أحادي.

بناءً على حساسية ELISA ، شرعنا في قياس الالتقام الخلوي لمتغيرات NHE6 المختلفة. بالنسبة لهذه التجارب ، تم وضع الخلايا التي تعبر بشكل عابر عن التركيبات المختلفة على الجليد واحتضانها بجسم مضاد للعلم أحادي النسيلة أساسي للفأر وجسم ثانوي مضاد للفأر من الماعز لتسمية سطح الخلية 3FNHE6HA، ثم بدأ الالتقام الخلوي للمجمع المسمى عن طريق احتضان الخلايا عند 37 & # x000b0C خلال فترة 15 دقيقة. كما هو مبين في الشكل 9 ج، كانت مستويات استيعاب A9S و R568Q ذات العلامات السطحية مكافئة لـ WT ، بينما تم نقل L188P و G383D و E547 * و W570 * بشكل أبطأ (ص & # x0003c 0.05) ، مما يدل على معالجتها التفاضلية بواسطة آلية تهريب الخلايا الداخلية.

تأثير متغيرات NHE6 على إعادة تدوير تهريب البضائع داخل الجسم ودرجة الحموضة

أظهرت الدراسات السابقة أن الإفراط في التعبير وضربات قاضية لـ NHE6 عززت التنظيم الأعلى والأسفل ، على التوالي ، من الالتقام الخلوي بوساطة الكلاذرين لبعض بروتينات غشاء البلازما المتكاملة ، مثل مستقبل الترانسفيرين المنشط بواسطة ligand (Tf & # x02013TfR) ولكن ليس نمو البشرة عامل مستقبل بطريقة تعتمد على قدرته على تعديل درجة الحموضة داخل الحويصلة (51 ، 53).

لتحديد تأثير متغيرات NHE6 على استيعاب Tf ، قمنا بقياس المعدل الأولي لامتصاص (فترة 5 دقائق) لـ Alexa Fluor TM 633- مترافق Tf (Tf-AF 633) عن طريق قياس التدفق الخلوي في خلايا هيلا الحية التي تعبر بشكل عابر باستخدام GFP وحده (التحكم) أو بنيات NHE6 الموسومة بـ GFP كما هو موضح سابقًا (53). في هذه التجارب ، تم استخدام خلايا هيلا لأن مستويات TfR الخاصة بها أعلى بعدة أضعاف مما كانت عليه في خلايا AP-1 ، وبالتالي قدمت نسبة إشارة إلى ضوضاء أقوى لاكتشاف الامتصاص الأولي لـ Tf-AF 633 (53). كانت أنماط التخليق الحيوي للبروتين ونضج قليل السكاريد لتركيبات NHE6 المختلفة في خلايا هيلا المنقولة مكافئة لتلك التي لوحظت في خلايا AP-1 (البيانات غير معروضة). تم تحليل أعداد مكافئة من خلايا هيلا الحية الإيجابية لـ GFP (10 4 خلايا GFP +) لكل بنية تم تمييز الخلايا الحية عن الخلايا غير القابلة للحياة من خلال قدرتها على استبعاد الصبغة الفلورية ذات الغشاء الخالي من الغشاء 7-amino-actinomycin D. خلايا هيلا overexpressing WT أظهر A9S و R568Q زيادات كبيرة (& # x0223c25 & # x0201335٪) في امتصاص Tf-AF 633 مقارنة بالخلايا التي تعبر عن GFP فقط (ص & # x0003c 0.001 ، مقاييس متكررة أحادية الاتجاه ANOVA متبوعة باختبار Dunnett اللاحق) (الشكل 9) د). ومع ذلك ، فإن هذا التنظيم الأعلى قد تقلص إلى حد كبير أو غائب في الخلايا التي تعبر عن طفرات L188P و G383D و E547 * و W570 * (ص & # x02265 0.05).

يعتمد تنظيم الاتجار بالجسم من قبل NHE6 على قدرته على تنظيم درجة الحموضة داخل الجسمه، على الرغم من أن الآلية الأساسية التي تربط وظيفة الناقل بتهريب الحويصلات غير معروفة. NHE6 ، مثل غيره من أفراد عائلة NHE ، هو ناقل ثانوي نشط ينقل الكاتيونات أحادية التكافؤ إلى أسفل تدرجات التركيز الخاصة بكل منها ، وبالتالي في حالة مستقرة ، يجب أن تعمل كمسار & # x0201cH + تسرب & # x0201d (بمعنى آخر. آلية قلونة) لمواجهة التحمض الناتج عن الفراغ H + -ATPase. لفحص ما إذا كانت هذه الخاصية قد تأثرت ، قمنا بقياس الرقم الهيدروجينيه من إعادة تدوير الإندوسومات فى الموقع عن طريق تحليل صورة مقياس التألق (FRIA) (83) باستخدام فلوروفور فلورسين أيزوثيوسيانات حساس لدرجة الحموضة (FITC) مترافق مع ترانسفيرين (Tf & # x02013FITC) كمسبار. باختصار ، تم نقل خلايا AP-1 بشكل عابر (48 ساعة) باستخدام ChFP وحده أو NHE6 المختلفة.ChFP يبني ، تليها حضانة لمدة 60 دقيقة مع Tf & # x02013FITC عند 37 & # x000b0C للسماح بالتراكم الكافي للمسبار عبر مسار إعادة التدوير الداخلي. درجة الحموضة المستقرةه تم تحديد طيف الحويصلات أو النقاط النقطية تحت كل حالة من خلال تحليل إشارات التألق المجمعة من إجمالي 25 & # x0201336 خلية (& # x0223c2700 & # x020135300 حويصلات تم جمعها من 8 إلى 12 خلية في كل تجربة ، تتكرر ثلاث مرات). في كل حالة ، يكون الرقم الهيدروجينيه أظهر طيف الحويصلات توزيعًا أحاديًا (انظر الشكل S1). عندما تم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ​​درجة الحموضة داخل الجسمه لكل خلية ، كان مستوى خلايا AP-1 التي تفتقر إلى NHE6 حمضيًا جدًا عند درجة الحموضةه 5.79 & # x000b1 0.11 (يعني & # x000b1 SD ، ن = 27 خلية) (الشكل 9 ه). على النقيض من ذلك ، درجة الحموضة داخل الجسمه كانت قيم الخلايا التي تعبر عن WT- و A9S- و R568Q أكثر قلوية بشكل ملحوظ ومكافئة لبعضها البعض بالنسبة لخلايا AP-1 الأبوية (WT: 6.23 & # x000b1 0.16 ، ن = 28 A9S: 6.22 & # x000b1 0.19 ، ن = 34 R568Q: 6.20 & # x000b1 0.15 ، ن = 28 ص & # x0003c 0.001 ، ANOVA أحادي الاتجاه متبوعًا باختبار Tukey اللاحق). في المقابل ، درجة الحموضة داخل الجسمه كانت مستويات الخلايا المعبرة عن L188P و G383D وسيطة ومختلفة بشكل كبير عن كل من عناصر التحكم و WT-transfectants (L188P: 6.05 & # x000b1 0.15 ، ن = 36 G383D: 5.96 & # x000b1 0.13 ، ن = 34 ص & # x0003c 0.001). هذه وسيطة درجة الحموضةه يمكن أن تعكس القيم التوزيع غير الكامل لمتغيرات NHE6 في جميع أجزاء إعادة التدوير التي تحتوي على Tf & # x02013FITC (بمعنى آخر. متوسط ​​درجة الحموضةه من الإندوسومات التي تحتوي على NHE6 وغير المحتوية على إعادة التدوير) ، ولكنها قد تنتج أيضًا عن ضعف نشاطها التحفيزي (بمعنى آخر. تناقص تدفق H +) في إعادة تدوير الجسيمات الداخلية أو مزيج من كلا الاحتمالين. أخيرًا ، لم يكن للمتغيرات E547 * و W570 * تأثير كبير على إعادة تدوير الأس الهيدروجيني الداخليه مقارنة بخلايا AP-1 الأبوية (AP-1: 5.79 & # x000b1 0.11 ، ن = 27 E547 *: 5.90 & # x000b1 0.13 ، ن = 35 واط 570 *: 5.88 & # x000b1 0.12 ، ن = 25 ص & # x0003e 0.05) ، وهي نتيجة متوقعة بالنظر إلى استبقاءها الواضح في ER.

نظرًا لأن المتغيرات L188P و G383D و E547 * و W570 * أظهرت تراكمًا كبيرًا في ER ، قمنا بعد ذلك بتقييم ما إذا كانت تؤثر على درجة الحموضة اللمعيةه من هذه المقصورة. تحقيقا لهذه الغاية ، تم نقل خلايا AP-1 بشكل مشترك باستخدام NHE6 الذي يحمل علامة mCherry (NHE6).ChFP) يبني و GFP حساس لدرجة الحموضة (بمعنى آخر. pHluorin2 أو pH2) (84) يحتوي على تسلسل إشارة ER من الكالريتيكولين عند نهايته N وتسلسل احتفاظ ER (KDEL) عند نهايته C (بناء يسمى ERpH2). ER الرقم الهيدروجينيه في خلايا AP-1 كان 7.28 & # x000b1 0.11 (يعني & # x000b1 SD ، ن = 8 خلايا) (الشكل S2) ، قيمة قابلة للمقارنة مع درجة الحموضة ERه (الرقم الهيدروجيني 7.1 & # x020137.4) تم الإبلاغ عنه لأنواع الخلايا الأخرى (85 ، & # x0201387). كما هو متوقع ، لم يتغير هذا المستوى في الخلايا التي تعبر بشكل مشترك عن إعادة تدوير WT المصنف من الداخل (7.23 & # x000b1 0.12 ، ن = 14) ، A9S (7.22 & # x000b1 0.10 ، ن = 13) أو R568Q (7.29 & # x000b1 0.13 ، ن = 14). لم يتأثر الرقم الهيدروجيني ER أيضًا بـ L188P (7.26 & # x000b1 0.15 ، ن = 16) ، G383D (7.16 & # x000b1 0.18 ، ن = 13) ، E547 * (7.29 & # x000b1 0.11 ، ن = 15) و W570 * (7.24 & # x000b1 0.13 ، ن = 14) متغيرات ، مما يشير إلى أنها ليست نشطة بشكل واضح عند الاحتفاظ بها في ER. أظهرت تجارب التحكم الإضافية باستخدام الفلورين 2 المترجمة السيتوبلازمية (CytopH2) أن درجة الحموضة السيتوبلازمية (pH)ج 7.59 & # x000b1 0.17 ، ن = 21) أيضًا بدون تغيير في وجود NHE6ChFP WT أو متغيراته (انظر الشكل S3).

تأثير متغيرات NHE6 على صلاحية الخلية

كشفت الدراسات السابقة أن الاضطراب الجيني لتعبير NHE6 يتسبب في انحطاط مجموعة فرعية من الخلايا العصبية داخل القشرة ، والحصين ، وخاصة المخيخ ، الذي يُظهر فقدانًا واسعًا لخلايا بركنجي مع تقدم العمر (32 ، 34 ، 35). الخلايا العصبية في مناطق الدماغ الأخرى ، على الرغم من فقدان التعبير NHE6 ، لا تظهر على أنها تتأثر بشدة. سبب هذه الاختلافات في حيوية الخلية غير واضح. تظهر أيضًا خلايا AP-1 ، التي تفتقر أيضًا إلى NHE6 ، أدلة قليلة على موت الخلايا في ظل ظروف الاستنبات الطبيعية (53). ومع ذلك ، فإن التعبير خارج الرحم عن متغير الحذف داخل الإطار المرتبط بـ CS لـ NHE6 (p.E287 & # x02013S288del ، & # x00394 287 ES 288) في خلايا AP-1 وفي الخلايا العصبية الحصينية للماوس الأولي يمكن أن يؤدي إلى موت الخلية المبرمج (53). وبالتالي ، تعمل خلايا AP-1 بمثابة وكيل مفيد لتقييم الإمكانات في المختبر عواقب متغيرات NHE6 على بقاء الخلية. تحقيقا لهذه الغاية ، تم نقل خلايا AP-1 بشكل عابر باستخدام GFP وحده أو متغيرات NHE6 الموسومة بـ GFP لمدة 48 ساعة. تم تحضين هذه الخلايا بعد ذلك في وجود الملحق الفلوري في V & # x02013 متقارن allophycocyanin (الملحق في V & # x02013APC) و propidium iodide (PI) ، وتم تحليل الخلايا الإيجابية GFP (10 4 خلايا لكل تجربة) عن طريق قياس التدفق الخلوي لتحديد الكسر من الخلايا المبرمج كما هو موضح سابقًا (53). تمثل خلايا Annexin V & # x02013APC الإيجابية والسلبية المراحل المبكرة من موت الخلايا المبرمج ، في حين أن الملحق في V & # x02013APC / PI & # x02013 الخلايا الإيجابية المزدوجة هي خلايا أبوطوزية متأخرة أو نخرية ، وتعتبر خلايا PI-only & # x02013 نخرية. كما هو معروض في الشكل 10 ، تم اكتشاف نسبة أعلى بكثير من الخلايا الأبوطوزية المبكرة في الخلايا التي تعبر عن L188P و G383D و E547 * و W570 * (& # x0223c22 & # x0201327 ٪) مقارنة مع WT أو A9S أو R568Q (& # x0223c12 & # x0201314٪) (ص & # x0003c 0.001). في هذه المرحلة الزمنية ، لم تكن هناك زيادات كبيرة في الخلايا المبرمجة أو النخرية المتأخرة بين المتغيرات المرتبطة بـ CS بالنسبة إلى WT. من الغريب أن التعبير عن WT و A9S و R568Q أدى أيضًا إلى زيادة كبيرة في النسبة المئوية للخلايا الأبوطوزية بالنسبة لخلايا AP-1 (ص & # x0003c 0.001) ، ولكن ليس بدرجة كبيرة مثل المتغيرات المعيبة الأربعة الأخرى. سبب ذلك غير واضح وسيتطلب مزيدًا من الدراسة. ومع ذلك ، تشير هذه النتائج إلى أن L188P و G383D و E547 * و W570 * لديها القدرة على تقليل قابلية بقاء الخلية بالنسبة إلى WT ، على الرغم من أن الآليات الأساسية تظل غامضة.

تم تحسين موت الخلايا المبرمج في خلايا AP-1 التي تعبر عن طفرات L188P و G383D و E547 * و W570 *. قياس موت الخلايا المبرمج عن طريق تحليل التدفق الخلوي لخلايا AP-1 المنقولة باستخدام NHE6GFP يتم عرض المتغيرات المرتبطة بـ WT و CS. ثمان وأربعون ساعة بعد ترنسفكأيشن ، تم تصنيف الخلايا بالملحق في V & # x02013APC و PI ، وتم فحص الخلايا الإيجابية 1 & # x000d7 10 4 GFP عن طريق قياس التدفق الخلوي لكل طور عدوى. أتمثل الخلايا المزدوجة السالبة الملحق V و PI خلايا قابلة للحياة. ب، تمثل الخلايا الإيجابية لـ PI خلايا نخرية. ج، الملحق في V & # x02013 الخلايا الموجبة تمثل خلايا موت الخلايا المبرمج المبكرة. د، تمثل الخلايا الموجبة المزدوجة الملحق V و PI خلايا موت الخلايا المبرمج المتأخرة. تظهر النتائج على أنها تعني & # x000b1 S.D. من ثلاث تجارب مستقلة. تم تحديد الأهمية بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه (أ ، واو القيمة = 27.7 ، ص القيمة = 8.5 & # x000d7 10 & # x022128 ب ، واو القيمة = 2.1 ، ص القيمة = 0.11 ج ، واو القيمة = 40.9 ، ص القيمة = 4.9 & # x000d7 10 & # x022129 د ، واو القيمة = 5.4 ، ص القيمة = 0.0025) ، مع اختبار Tukey اللاحق & # x02605 ، ص & # x0003c 0.05 & # x02605 & # x02605 ، ص & # x0003c 0.01 و & # x02605 & # x02605 & # x02605 ، ص & # x0003c 0.001.


ارتفاع مستوى LDL-C ومخاطر الإصابة بـ ASCVD

الأسباب الوراثية لارتفاع LDL-C

كما هو موضح أعلاه ، فإن FH هو اضطراب وراثي سائد وراثي مرتبط بمستويات مرتفعة من LDL-C و ASCVD المبكر ، ويقدم بعض الأدلة الأكثر إقناعًا للدور السببي لـ LDL-C في تصلب الشرايين. اكتشف براون وجولدشتاين مسار LDLR ووجدوا أن الطفرات في Ldlr يسبب الجين FH (300). الزيجوت المتغاير لطفرات فقدان الوظيفة لها مستويات كوليسترول تبلغ ضعف المعدل الطبيعي ، وهؤلاء الأشخاص معرضون لخطر متزايد للإصابة بمرض التطرف العنيف المبكر. على النقيض من ذلك ، فإن الأفراد الذين يعانون من FH متماثل الزيجوت لديهم مستويات عالية للغاية من LDL-C (& # x0003e 500 مجم / ديسيلتر) وغالبًا ما يصابون بتصلب الشرايين التاجي الشديد وتضيق الأبهر فوق الصمامي في مرحلة الطفولة المبكرة. يبلغ معدل انتشار FH متغاير الزيجوت حوالي 1 / 200-250 في الولايات المتحدة ، في حين أن FH متماثل الزيجوت نادر للغاية حيث يؤثر فقط على حوالي 1 / 160.000 إلى 1 / 250.000 فرد (436). ومع ذلك ، فإن حوالي 20٪ من الأشخاص الذين يعانون من احتشاء عضلة القلب (MI) قبل سن الأربعين يعانون من فرط إفراز متغاير الزيجوت. وبالتالي ، يوفر FH فرصة مهمة لاستهداف العلاجات للوقاية من تصلب الشرايين (437) ، لكن FH لا يزال غير معترف به مع الأدلة الحديثة التي تشير إلى أنه تم تحديد 1-10 ٪ فقط من الأشخاص المصابين بـ FH (438). لا يعاني معظم الأفراد المصابين بفرط كوليسترول الدم الكبير من خلل شحميات الدم الوراثي السائد أحادي المنشأ الكلاسيكي ، ولكن العوامل متعددة الجينات التي تساهم في القابلية للتأثر بالعوامل البيئية تكمن وراء الزيادة الملحوظة في مستويات LDL-C. تشير دراسة حديثة إلى أنه من بين الأفراد الذين يعانون من كوليسترول LDL & # x02265190 mg / dl ، حدد التسلسل الجيني طفرة أحادية المنشأ في FH فقط في & # x0003c2 ٪ من الأشخاص (439). ومع ذلك ، بالنسبة لأي كوليسترول LDL تمت ملاحظته ، فإن حاملي طفرة FH ​​معرضون بشكل كبير لخطر الإصابة بأمراض القلب التاجية (439). تمثل المتغيرات المسببة للأمراض في ثلاثة جينات (LDLR و APOB و PCSK9) غالبية حالات FH أحادية المنشأ. حددت دراسات الارتباط على مستوى الجينوم (GWAS) مؤخرًا أكثر من 50 موقعًا وراثيًا منفصلاً مرتبطة بزيادة خطر الإصابة بمرض CVE (440،441). ترتبط العديد من هذه المواقع الجينية بالجينات المعروفة سابقًا بتأثيرها على مستويات LDL-C ومخاطر القلب والأوعية الدموية (على سبيل المثال. Ldlr, APOB, PCSK9) ، ولكن تم أيضًا تحديد مواقع جديدة تؤثر على مستويات LDL-C ومخاطر MI ، على سبيل المثال سورتلين -1 (SORT1) (442،443). الأهم من ذلك ، المستويات المنخفضة الموروثة من LDL-C بسبب طفرات فقدان الوظيفة في PCSK9 لقد ثبت ارتباط الجين بانخفاضات كبيرة في مخاطر الإصابة بأحداث ASCVD في دراسة مخاطر تصلب الشرايين في المجتمعات (444). ومن ثم ، فإن الاضطرابات الوراثية في استقلاب البروتين الدهني تقدم دليلًا قويًا على أن تأثير LDL-C على تطور تصلب الشرايين يعتمد على الجرعة والوقت (445) ، مما يدعم دورًا سببيًا لـ LDL-C في تصلب الشرايين.

خفض LDL-C يقلل ASCVD

قدمت تجارب النتائج العشوائية الكبيرة لأدوية خفض الكوليسترول دليلاً حاسمًا على فرضية الكوليسترول (446). وجد مشروع الأدوية التاجية ، الذي تم إجراؤه بين عامي 1966 و 1975 ، أن علاج النياسين أظهر فائدة متواضعة في تقليل احتشاء عضلة القلب المتكرر غير المميت بنسبة 26٪ (10.2٪ لمجموعة النياسين مقابل 13.8٪ لمجموعة الدواء الوهمي) (447). ومع ذلك ، لم تكن هناك فائدة في نقطة النهاية الأولية ، إجمالي الوفيات. بشكل مثير للإعجاب ، مع متابعة متوسطة لمدة 15 عامًا ، ما يقرب من 9 سنوات بعد إنهاء التجربة ، كانت الوفيات الناجمة عن جميع الأسباب أقل بنسبة 11 ٪ في مجموعة النياسين عنها في مجموعة الدواء الوهمي (448). كانت تجربة Lipid Clinics Research تجربة نتائج رئيسية مبكرة أخرى لإظهار أن خفض الكوليسترول يقلل من أحداث القلب والأوعية الدموية. أدى العلاج بالكوليسترامين ، وهو مثبط لربط حمض الصفراء ، إلى انخفاض بنسبة 12٪ في مستويات LDL-C وانخفاض بنسبة 19٪ في أحداث أمراض الشرايين التاجية (449). كانت التجارب المبكرة لخفض الدهون في القلب والأوعية الدموية محدودة بسبب الافتقار إلى الأساليب الفعالة للغاية لخفض مستويات LDL-C ، وأثارت العديد من التجارب مخاوف من أن خفض الكوليسترول لم يقلل الوفيات الإجمالية وقد يزيد من خطر الإصابة بالسرطان والوفاة العرضية والانتحار (446) ). قدم ظهور فئة العقاقير المخفضة للكوليسترول (مثبطات اختزال HMG-CoA) نهجًا أكثر فاعلية لخفض LDL-C وتخفيف المخاوف التي أثارتها التجارب السابقة. كانت تجربة 4S تجربة سريرية بارزة لخفض الكوليسترول مع سيمفاستاتين في المرضى الذين يعانون من مرض الشريان التاجي (CAD) والمستويات المرتفعة بشدة من LDL-C التي تم تصميمها للنظر في إجمالي الوفيات كنقطة نهاية أولية (450). أظهر 4S لأول مرة أن خفض مستويات LDL-C بنسبة 35 ٪ مع سيمفاستاتين أدى إلى انخفاض بنسبة 30 ٪ في إجمالي الوفيات مع انخفاض بنسبة 42 ٪ في وفيات أمراض القلب التاجية وانخفاض بنسبة 34 ٪ في مخاطر الأحداث التاجية الكبرى (450) . قام عدد كبير من التجارب اللاحقة بتوسيع هذه النتائج إلى السكان المصابين بأمراض القلب التاجية بمستويات منخفضة من LDL-C ولأشخاص ليس لديهم CAD (الوقاية الأولية) مع مستويات عالية أو منخفضة من LDL-C (451). من المهم أن نلاحظ أن العلاقة بين خفض LDL-C أثناء العلاج والحد من الأحداث القلبية الوعائية في تجارب الوقاية الثانوية كانت متشابهة لكل من نهج الستاتين وغير الستاتين لخفض مستويات LDL-C. أظهر التحليل التلوي الكبير لـ 26 تجربة ستاتين شملت أكثر من 170000 شخصًا أن علاج الستاتين لمدة 5 أعوام و 20103 عامًا قلل من حدوث الأحداث التاجية الكبرى ، وإعادة الأوعية التاجية ، والسكتة الدماغية بنسبة 20٪ لكل 1 مليمول / لتر (38.7 ملجم / ديسيلتر) انخفاض في LDL-C (452). تم توسيع هذه النتائج من خلال تحليل تلوي كبير حديث لـ 49 تجربة تتضمن 9 تدخلات مختلفة لخفض LDL والتي شملت أكثر من 300000 مريض وحوالي 40.000 حالة وعائية رئيسية ، كل 1 مليمول / لتر (38.7 ملجم / دل) انخفاض في LDL-C كان مرتبطًا بانخفاض نسبي بنسبة 23 ٪ في مخاطر الأحداث الوعائية الرئيسية (453). أثار هذا السؤال عما إذا كان المزيد من خفض الدهون سيكون ذا فائدة إضافية. مع التطور الأخير لمثبطات البروتين المحول للبروتينات السوبتيليزين / kexin من النوع 9 (PCSK9) ، أصبح من الممكن الآن خفض LDL الإضافي الدرامي بنسبة تصل إلى 50-70٪. في تجربة FOURIER ، حقق المرضى الذين يعانون من CAD المستقرة سابقًا والذين تلقوا مثبط PCSK9 ، evolocumab ، بالاقتران مع العلاج بالستاتين ، مستويات LDL-C متوسطة تبلغ 30 مجم / ديسيلتر. ارتبط هذا بانخفاض بنسبة 15٪ في نقطة النهاية المركبة للموت القلبي الوعائي ، احتشاء عضلة القلب ، السكتة الدماغية ، الاستشفاء بسبب الذبحة الصدرية غير المستقرة أو إعادة تكوين الأوعية التاجية (454). وبالمثل ، أظهر ODYSSEY أن إعطاء اليروكوماب لمرضى متلازمة الشريان التاجي الحادة الذين يخضعون بالفعل للعلاج بأقصى قدر من الستاتين أدى إلى قيم LDL-C & # x0003c50 mg / dl وكان مرتبطًا بانخفاض بنسبة 15 ٪ في نقطة النهاية المركبة للوفاة من أمراض القلب التاجية ، احتشاء عضلة القلب غير المميت ، أو السكتة الدماغية الإقفارية ، أو الذبحة الصدرية غير المستقرة التي تتطلب دخول المستشفى ، وقد اقتربت هذه الفائدة من 24٪ في المجموعة الفرعية من المرضى الذين لديهم قيم LDL-C الأولية & # x0003e100 mg / dL (455). معًا ، تعزز نتائج تجارب PCSK9 هذه الفرضية & # x0201clower أفضل & # x0201d.

على الرغم من أن العقاقير المخفضة للكوليسترول فعالة جدًا في الوقاية من مرض التطرّف العنيف ، إلا أن العديد من المرضى الذين يتناولون العقاقير المخفضة للكوليسترول لا يزالون يعانون من CVE ، وهي ظاهرة يشار إليها بالمخاطر المتبقية (456). من المحتمل أن يُعزى هذا الخطر المتبقي إلى الالتهاب جزئيًا على الأقل. في الواقع ، جاء الدعم النهائي لهذه الفرضية مؤخرًا من دراسة نتائج التخثر المضاد للالتهاب في كاناكينوماب (CANTOS) ، حيث نجح إعطاء الجسم المضاد لـ IL1 & # x003b2 للمرضى الذين يعانون من احتشاء عضلي سابق و hsCRP المصل المرتفع في تقليل CVE المتكرر بشكل مستقل عن خفض الدهون ( & # x0003e90٪ من المرضى يتلقون العلاج المتزامن بالستاتين (457). أظهر تحليل ثانوي لتجربة FOURIER أيضًا أنه في حين أن الخطر النسبي لنقطة النهاية القلبية الوعائية الأولية كان متسقًا عبر المجموعات ، كان الحد من المخاطر المطلقة باستخدام evolocumab أكبر في المرضى الذين يعانون من ارتفاع hsCRP (458). تشير هذه النتائج إلى أن استهداف كلاً من LDL والالتهاب سيوفر أفضل استراتيجية لتقليل مخاطر ASCVD.

مستويات LDL-C و ApoB-100 والكوليسترول غير HDL و LDL-P كمؤشرات لمخاطر ASCVD.

استنادًا إلى قوة الارتباط المباشر لمستويات LDL-C وخطر الإصابة بـ ASCVD ، ركزت الإرشادات الخاصة بعلاج فرط كوليسترول الدم على مستويات LDL-C لتقييم المخاطر والتقسيم الطبقي وتوصيات العلاج. في الواقع ، غالبًا ما يتم استخدام المصطلحين LDL-C و LDL بالتبادل في الممارسة ، على الرغم من عدم صحة ذلك. من المهم أن نفهم أن LDL عبارة عن مجموعة من الجزيئات المحددة بالكثافة (d = 1.019 & # x02013 1.063 g / ml) غير المتجانسة ، وتتكون من مجموعة كبيرة ومتنوعة من الدهون والبروتينات (459). بالإضافة إلى ذلك ، تختلف جزيئات LDL من حيث الحجم ومحتوى الكوليسترول. العلاقة بين مستويات LDL-C ومخاطر ASCVD هي & # x0201cJ على شكل & # x0201d ، والقيمة التنبؤية لمستويات LDL-C أفضل عند المستويات الأعلى من LDL-C. من المثير للدهشة أن غالبية الأشخاص الذين يذهبون إلى المستشفى يعانون من متلازمة الشريان التاجي الحادة ليس لديهم مستويات مرتفعة من LDL-C ، ولكن لديهم مستويات منخفضة من HDL-C وارتفاع الدهون الثلاثية (460). كان هناك اهتمام كبير فيما إذا كانت المقاييس الأخرى لـ LDL ، بما في ذلك المجموعات السكانية الفرعية ، apoB100 ، أو عدد الجسيمات ، يمكن أن تكون بمثابة تنبؤات أفضل لـ CVE من قياس محتوى الكوليسترول LDL.

وصفت الدراسات الرائدة التي أجراها Krauss وزملاؤه (461) نمطين رئيسيين للمجموعات السكانية الفرعية LDL بناءً على حجم وكثافة جزيئات LDL. يتميز النمط A بجزيئات LDL عالية الطفو (lbLDL) ، بينما يرتبط النمط B بـ LDL صغير كثيف (sdLDL). الأهم من ذلك ، يرتبط sdLDL بزيادة مستويات الدهون الثلاثية وانخفاض HDL-C ، والذي يشار إليه باسم ثالوث الدهون ، وهو نمط ظاهري شائع في مقاومة الأنسولين. ومن ثم ، يُلاحظ النمط B بشكل شائع في الأشخاص المصابين بالسمنة ومتلازمة التمثيل الغذائي ومرض السكري من النوع 2. أفاد عدد من الدراسات أن النمط B مرتبط بزيادة خطر الإصابة بمرض CVE (462). تم استخدام العديد من الطرق المختلفة لتوصيف الأنماط الظاهرية لـ LDL ، بما في ذلك التدرج الكهربائي للهلام ، والطرد المركزي الفائق (المتسلسل والعمودي) ، وحركة الأيونات والرنين المغناطيسي النووي (NMR) (462،463). تم اقتراح عدد من الآليات التي تكمن وراء الخصائص الأولية لـ sdLDL ، بما في ذلك زيادة التعرض للأكسدة (464) والجليكشن (465) ، مما يعزز احتباس الشرايين وزيادة تكوين خلايا الرغوة الضامة. بروتين نقل الكوليسترول استر (CETP) ، الذي ينقل CE من HDL إلى VLDL / LDL والدهون الثلاثية في الاتجاه المعاكس ، والليباز الكبدي ، الذي يحلل الدهون الثلاثية ، يؤثر على تكوين الدهون وحجم sdLDL. على هذا النحو ، فإن المستويات المتزايدة من sdLDL لديها القدرة على توفير معلومات إضافية بشأن مخاطر CVE لدى الأفراد الذين لديهم مستويات LDL-C طبيعية ولكن لديهم مستويات مرتفعة من الدهون الثلاثية وانخفاض HDL. بدلاً من ذلك ، تم اقتراح أن التأثير الحقيقي لـ sdLDL يرجع إلى زيادة عدد جزيئات LDL.

يحتوي كل جسيم LDL على جزيء واحد من apoB100 ، ومعظم جزيء apoB100 في البلازما موجود على جسيمات LDL (466). ومن ثم ، فإن مستويات apoB100 ترتبط مباشرة برقم جسيمات LDL (LDL-P). أظهر عدد كبير من الدراسات أن مستويات apoB100 هي علامات متفوقة لمخاطر ASCVD مقارنة بـ LDL-C (467). نظرًا لاختلاف كتلة الكوليسترول في جزيئات LDL ، فإن مستويات LDL-C ستؤدي إلى المبالغة في تقدير مستويات apoB وعدد جزيئات LDL ، عندما تكون جزيئات LDL غنية بالكوليسترول (الشكل 8) وتقليل عدد جزيئات apoB و LDL عندما تكون الجسيمات كوليسترول مستنفد (الشكل 8) (468).

الشكل 8.

رسم تخطيطي للعلاقة بين قياسات LDL-C مقابل ApoB100 عدد الجسيمات في السكان البشريين المتوافقين والمتعارضين. الأشخاص الذين يعانون من ارتفاع شحوم الدم لديهم زيادة في أعداد LDL الكثيف الصغير حيث يتم تخصيب كل جسيم في الدهون الثلاثية (TG) والفقير نسبيًا في محتوى الكوليسترول استر (CE) مقارنة بالمواضيع العادية ، وقياس LDL-C يقلل من أرقام الجسيمات ومستويات apoB100. قام أشخاص آخرون بتوسيع جزيئات LDL المخصب بـ CE وقياس LDL-C يبالغ في تقدير عدد جسيمات LDL وجزيئات apoB100. وبالتالي ، فإن عدد جزيئات LDL أو مستويات apoB100 هي مؤشر أكثر دقة لمخاطر القلب والأوعية الدموية في تحديد الاختلاف بين النسب المئوية لمقاييس الكوليسترول التي يحملها LDL (LDL-C أو Non-HDL-C) ورقم الجسيمات (apoB100 أو LDL- ص). مقتبس من Sniderman، A.D. et al. Curr Opin Lipidol 2014 ، 25: 461 & # x02013467.

علاوة على ذلك ، تحتوي جميع البروتينات الدهنية الرئيسية المسببة لتصلب الشرايين على apoB (LDL ، وبقايا غنية بالدهون الثلاثية من VLDL ، و IDL ، وبقايا chylomicron ، و Lp (a)). يتم حساب LDL-C بشكل روتيني باستخدام صيغة Friedewald (LDL-C = TC & # x02013 HDL-C & # x02013 TG / 5) ، ولكن هذه الصيغة ليست دقيقة عندما تكون مستويات TG في الدم & # x0003e 400 مجم / ديسيلتر. من المعروف منذ فترة طويلة أن LDL-C يقلل من مخاطر ASCVD في حالة ارتفاع شحوم الدم (467). الكوليسترول غير HDL هو كتلة الكوليسترول في جميع الجزيئات المحتوية على apoB: Non-HDL-C = TC & # x02013 HDL-C. أوصت إرشادات ATPIII باستخدام Non-HDL-C لتقدير مخاطر ASCVD ، عند TG & # x0003e 200 مجم / ديسيلتر (469،470). تحليل تلوي بواسطة سنيدرمان وآخرون. وجد أن Non-HDL-C كان علامة أفضل قليلاً لمخاطر ASCVD من LDL-C ، لكن apoB كان أعلى بكثير من Non-HDL-C (471). يعد التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي طريقة أخرى لقياس تركيزات LDL-P. يتضمن الجدول 2 النسب المئوية المختارة للمستويات المتوسطة لمختلف العلامات ذات الصلة بـ LDL من دراسة Framingham Offspring (472). في تحليل لدراسة Framingham Offspring ، كان LDL-P الذي حدده NMR أكثر ارتباطًا بأحداث الأمراض القلبية الوعائية الحادثة من مستويات LDL-C ، وكانت قدرة Non-HDL-C على التنبؤ بالمخاطر أقل من LDL-P ، ولكن أفضل من LDL-C (473). بالإضافة إلى ذلك ، وجدوا أن أرقام LDL-P المنخفضة كانت مؤشرًا أفضل لخطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية المنخفضة من LDL-C المنخفض (473). في المقابل ، وجد تحليل تلوي سابق من Emerging Risk Factors Collaboration أن LDL-C و Non-HDL و apoB علامات مكافئة لـ CVE (474). قد يتعلق نقص الاختلاف بالسكان المدروسين. عندما تحتوي جزيئات LDL على نسبة طبيعية من الكوليسترول ، فإن LDL-C و Non-HDL و apoB هي علامات مكافئة (الشكل 8) للمخاطر (471،473). ومن المثير للاهتمام ، أن البيانات المأخوذة من دراسة متعددة الأعراق لتصلب الشرايين (MESA) أظهرت أنه عندما يكون LDL-C و LDL-P متعارضين (الشكل 8) ، فإن LDL-P يثبت أنه أفضل تنبؤ لخطر الأحداث القلبية الوعائية الحادثة من LDL- ج (475).

الجدول 2.

النسب المئوية المكافئة في دراسة ذرية فرامنغهام

النسبة المئويةLDL-C مجم / ديسيلترغير HDL-C ملجم / ديسيلترApoB mg / dLLDL-P nmol / L
2708354720
20100119781100
50130153971440
801601871181820
951912241402210

مقتبس من Contois JH et al. الكيمياء السريرية 2009 55:407-419

لعدة عقود ، ركزت المبادئ التوجيهية لعلاج فرط كوليسترول الدم على مستويات LDL-C لتصنيف المخاطر وكهدف رئيسي للعلاج لمنع ASCVD. في الواقع ، تم التوصية بالأهداف العلاجية لـ LDL-C لـ & # x0003c 100 mg / dL و & # x0003c 70 mg / dL للأشخاص المعرضين لمخاطر عالية وعالية جدًا من CVE ، على التوالي ، من خلال تحديث عام 2004 لـ NCEP ATPIII ، المبادئ التوجيهية (469.470). تخلت إرشادات ACC / AHA لعام 2013 عن علاج فرط كوليسترول الدم عن هذه الأهداف لصالح التوصية باستخدام الستاتينات عالية الكثافة في الأفراد المعرضين لمخاطر عالية (476) ، وهناك مجموعات عديدة من الإرشادات التي حافظت على التوصية الخاصة بأهداف LDL-C ، بما في ذلك تلك الخاصة بجمعية الدهون الوطنية (NLA) (477) ، والجمعية الأمريكية لأخصائيي الغدد الصماء السريريين (478) ، والمبادئ التوجيهية الأوروبية (479). تتضمن الإرشادات الكندية أهدافًا لمستويات apoB (480) ، وتتضمن إرشادات NLA أهدافًا لكل من LDL-C و Non-HDL-C (477). يتضمن الجدول 2 النسب المئوية للمستويات المتوسطة لعلامات LDL المختلفة من دراسة Framingham Offspring. تتطابق مستويات LDL-C الموضحة في الجدول 2 عن كثب مع المستويات التي تم استخدامها على نطاق واسع في المبادئ التوجيهية لإدارة الدهون لاتخاذ القرار فيما يتعلق بالمستويات التي يبدأ عندها العلاج وأهداف العلاج. توصي إرشادات NLA الأخيرة باستخدام LDL-C و Non-HDL-C كأهداف للعلاج مع مجموعتين فقط من الأهداف: LDL-C & # x0003c 70 mg / dL و Non-HDL-C & # x0003c 100 mg / dL للمواضيع عالية الخطورة و LDL-C & # x0003c 100 mg / dL و Non-HDL-C & # x0003c 130 mg / dL للأشخاص ذوي الخطورة العالية أو المتوسطة أو المنخفضة (المؤهلين للعلاج بالعقاقير). في الآونة الأخيرة ، نشرت AHA / ACC نسخة جديدة من المبادئ التوجيهية لإدارة الكوليسترول (481). تضمنت هذه الإرشادات دليلاً من تجربتين سريريتين عشوائيتين كبيرتين للنقاط النهائية لمثبطات PCSK9 (454،455) وتجربة ezetimibe التي طال انتظارها في المرضى الذين يعانون من متلازمات الشريان التاجي الحادة الحديثة (482). أعادت الإرشادات الجديدة تقديم أهداف علاج LDL-C في بعض مجموعات المرضى المعرضين للخطر ، مثل أولئك الذين لديهم مخاطر عالية للإصابة بـ ASCVD وأولئك الذين لديهم LDL-C أساسي مرتفع جدًا. كما ذكرت إرشادات AHA / ACC الجديدة أن ارتفاع عدد جزيئات apoB ، وارتفاع Lp (a) ، وارتفاع شحوم الدم كلها عوامل خطر إضافية لـ ASCVD.

ثبت أن Lp (a) عامل خطر مستقل لأحداث تصلب الشرايين ، بما في ذلك النوبات القلبية والسكتة الدماغية وأمراض الأوعية الدموية الطرفية ، في دراسات مستقبلية متعددة (451 ، 483). قائمة إرشادات AHA / ACC الجديدة مرتفعة Lp (a) أحد عوامل تعزيز المخاطر لتطوير ASCVD (481). يتكون Lp (a) من جسيم LDL يرتبط فيه apoB100 تساهميًا عبر جسر ثنائي كبريتيد إلى apo (a) ، وهو بروتين سكري مع وحدات Kringle التي تشترك في التماثل مع البلازمينوجين. على الرغم من أن الكبد (أ) يصنعه الكبد ، فإن جزيئات Lp (a) لا تتشكل في الكبد بل في البلازما. على الرغم من كونها جسيمات LDL معدلة ، إلا أن مستويات Lp (a) مستقلة عن مستويات LDL-C. هدم Lp (a) غير مفهوم جيدًا ، لكن Lp (a) لا يتم مسحه بواسطة LDLR (484). إن عدد وحدات Kringle المتكررة متغير للغاية ولكن يتم تحديده وراثيًا إلى حد كبير ، وهذا يساهم في عدم تجانس هائل في حجم Lp (a). تختلف مستويات Lp (a) في البلازما بشكل كبير في البشر ، وترتبط مستويات Lp (a) في البلازما بشكل عكسي بحجم apo (a) isoform (485). وهكذا ، فإن جسيمات Lp (a) الأصغر مع عدد أقل من تكرار Kringle موجودة عند مستويات أعلى في البلازما. في القوقازيين الأمريكيين ، تفسر المستويات المتزايدة لجسيمات Lp (a) الأصغر حجمًا إلى حد كبير بحجم LPA الجين ، بناءً على حجم KIV المتكرر2 المجال (486) ، والذي يُعتقد أنه يرجع إلى صعوبة الإفراز الكبدي للأشكال الإسوية الأكبر لـ apo (a). ومع ذلك ، فإن هذه العلاقة تختلف في مجموعات عرقية مختلفة. اقترحت الدراسات المبكرة أنه على الرغم من أن مستويات Lp (a) أعلى لدى الأمريكيين من أصل أفريقي ، إلا أن مستويات Lp (a) لا يبدو أنها عامل خطر مستقل لأحداث القلب والأوعية الدموية في هذه المجموعة (487). ومع ذلك ، من خلال تحديد تركيزات Lp (a) الخاصة بالأليل ، أظهر تحليل أكبر وأكثر حداثة أن مستويات Lp (a) المرتفعة المرتبطة بأحجام الشكل الإسوي الصغيرة apo (a) تعمل كعامل خطر مستقل لـ CHD في كل من الأمريكيين الأفارقة والقوقازيين (488) ). وبالمثل ، وجدت دراسة متابعة لمدة 20 عامًا لمجموعة ARIC أن المستويات المرتفعة من Lp (a) ترتبط بدرجة مماثلة من المخاطر في كل من الأمريكيين الأفارقة والقوقازيين (489). قام تحليل تلوي حديث من قبل Emerging Risk Factors Collaboration بتقييم 36 دراسة مستقبلية مع 126،634 شخصًا وجد أن Lp (a) هو عامل خطر مستقل لأمراض الشرايين التاجية (490). على عكس الدراسات السابقة التي أشارت إلى أن Lp (a) كان ذا صلة فقط كعامل خطر عندما كانت المستويات مرتفعة للغاية ، أظهر التحليل التلوي أن المخاطر وأن مستويات Lp (a) مرتبطة باستمرار بمخاطر أمراض القلب التاجية (490). يرتبط تعدد الأشكال Ile4399Met (rs3798220) في المجال الشبيه بالبروتياز لـ apo (a) بشكل خاص بزيادة خطر الإصابة بأمراض القلب التاجية الشديدة (491). بعد ذلك ، كلارك وآخرون. وجد أن المتغيرات rs3798220 و rs10455872 كانت مرتبطة بحجم شكل إسوي صغير apo (a) ، وزيادة مستويات Lp (a) وزيادة خطر الإصابة بأمراض القلب بشكل كبير (492). علاوة على ذلك ، دراسة عشوائية مندلية بواسطة Kamstrup وآخرون. أظهر أن مضاعفة مستويات Lp (a) في البلازما المحددة وراثيًا تؤدي إلى زيادة بنسبة 22٪ في خطر الإصابة باحتشاء عضلة القلب ، مما يدعم بقوة الدور السببي للمستويات المرتفعة من Lp (a) وخطر الإصابة بـ MI (493).

تظل الآليات الأولية لـ Lp (a) غير مفهومة تمامًا ، لكن الدراسات الحديثة تشير إلى دور مهم في التعديل التأكسدي لـ Lp (a) بواسطة الفوسفوليبيدات المؤكسدة (OxPL) (251). تدعم الأدلة المتزايدة دورًا مهمًا لـ OxPLs في تطور تصلب الشرايين (251). ومن المثير للاهتمام ، أن OxPLs ترتبط بـ Lp (a) في تفضيلها على جزيئات LDL الأصلية في البلازما البشرية (250). ومن ثم تم اقتراح دور فسيولوجي لـ Lp (a) لربط ونقل OxPL في البلازما (251). على الرغم من أن Lp (a) موجود فقط في البشر وقرود العالم القديم ، فقد تم تطوير الفئران التي تعبر عن Lp البشري (a) لفحص دور Lp (a) في تصلب الشرايين واستقلاب البروتين الدهني. تم إنشاء الفئران المعدلة وراثيا الأولى التي تعبر عن مستويات عالية من apoB100 البشري باستخدام جزء من الحمض النووي الجيني البشري بحجم 79.5 كيلوبايت يحتوي على الإنسان بأكمله APOB الجين المعزول من مكتبة P1 العاثية ، وعبور هذه الفئران مع الفئران المعدلة وراثيًا apo (أ) أنتج مستويات عالية من Lp البشري (a) في البلازما (494). في دراسة أجريت على الفئران المعدلة وراثيًا التي تعبر عن تركيزات عالية ومنخفضة من Lp (a) ، تم العثور على مستويات عالية من OxPLs في الفئران المعدلة وراثيًا مع مستويات عالية جدًا من Lp (a) ، ولكن ليس في LDL لفئران التحكم المعدلة وراثيًا apoB (495). تدعم هذه الدراسات مفهوم التحويل التفضيلي لـ OxPL إلى Lp (a). في دراسة دالاس للقلب ، ارتبطت مستويات OxPL في apoB ارتباطًا وثيقًا بمستويات Lp (a) ، وكانت مرتبطة عكسياً بحجم apo (a) isoforms (496). في الدراسة الأوروبية المستقبلية للسرطان (EPIC) & # x02013Norfolk دراسة مستقبلية كان تأثير مستويات OxPL و Lp (a) على مخاطر أمراض الشرايين التاجية مضافًا (497). هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتحديد إلى أي مدى يكون الارتباط التفضيلي لـ OxPL بواسطة Lp (a) مسؤولاً عن التوسط في زيادة مخاطر حدوث تجلط عصيدي يعزى إلى Lp (a).

يعتبر Lp (a) عامل خطر ناشئًا ، لكن نهج إدارة المرضى ذوي المستويات المرتفعة من Lp (a) لم يتم إثباته جيدًا. المستويات المرتفعة من Lp (a) لا تستجيب بشكل جيد للتغيرات في النظام الغذائي أو العلاج بالستاتين. أظهر تحليل البيانات المأخوذة من دراسة علاج تصلب الشرايين العائلي (FATS) أن التخفيض الكبير في LDL-C (مع لوفاستاتين بالإضافة إلى كوليستيبول أو نياسين بالإضافة إلى كوليستيبول) في الأشخاص الذين يعانون من CAD و apoB100 المرتفع أزال المخاطر المتزايدة التي تعزى إلى وجود Lp مرتفع جدًا (أ) (498). أظهرت تجربة JUPITER أن علاج الأشخاص الذين يعانون من مستويات منخفضة من LDL-C ، ولكن مع زيادة hsCRP ، مع rosuvastatin (20 مجم) قلل من CVE. في JUPITER ، كان Lp (a) المرتفع محددًا مهمًا للمخاطر المتبقية ، لكن الانخفاض في المخاطر النسبية مع rosuvastatin كان مشابهًا بين المشاركين ذوي Lp (a) المرتفع أو المنخفض (499،500). يقلل العلاج بالنياسين Lp (a) بنسبة 20-30٪ ، وتوصي الإرشادات الأوروبية بمعالجة المرضى الذين يعانون من ارتفاع Lp (a) المعرضين لمخاطر متوسطة إلى عالية للإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية مع إطالة إطلاق النياسين للحصول على مستويات Lp (a) & # x0003c 50 مجم / ديسيلتر (501). ومع ذلك ، فإن الفشل الأخير لدراسات AIM-HIGH و HPS-2 THRIVE قد ألقى بظلال من الشك على استخدام النياسين ممتد المفعول في موضوعات تتلاءم مع ملف تلك الدراسات (CAD مع LDL عولج جيدًا على الستاتين). تمت الموافقة على فصادة LDL وهي فعالة لخفض Lp (a) في الأفراد الذين يعانون من CVE المتكرر في وضع مستويات عالية جدًا من Lp (a). هناك عدد من العلاجات الجديدة التي قد تكون مفيدة في علاج المرضى الذين يعانون من ارتفاع مستويات Lp (a). تقلل الأجسام المضادة أحادية النسيلة التي تمت الموافقة عليها مؤخرًا لـ PCSK9 بشكل ملحوظ Lp (a) بحوالي 30٪ بالإضافة إلى خفض LDL-C بنسبة 30-50٪. علاوة على ذلك ، أبلغت تجربة سريرية من المرحلة الأولى من الجيل الثاني من مضادات الحس لـ apo (أ) عن تخفيضات انتقائية فعالة تعتمد على الجرعة في البلازما Lp (a) (502). هذا النهج له جاذبية استهداف apo (a) على وجه التحديد لتقليل مستويات Lp (a). نأمل أن تؤدي هذه الأساليب الجديدة في النهاية إلى نهج فعال لمستويات منخفضة من Lp (a) يترجم إلى أحداث قلبية وعائية منخفضة.


الآليات السمية المتصاعدة التي تم تشغيلها بواسطة SOLUBLE A & # x003b2 OLIGOMERS أو ADDLs

نظرًا لأن الخلل الوظيفي التشابكي يبدو أنه أحد النظريات الفيزيولوجية المرضية الرئيسية لميلاد AD [19،257،285] ، فمن المهم العثور على تفسير مسبب للتغير في الإشارات التشابكية. في مظهره الأولي ، ادعى شلال الأميلويد المنقح أن الخلل الوظيفي المشبكي هو أحد العروض التقديمية الأولى لعلم أمراض الزهايمر الناجم عن سمية A & # x003b2 ولكنه لم يصف المسار (المسارات) الجزيئي الذي من خلاله يحقق A & # x003b2 وظيفته السمية الافتراضية. [19]. يتجلى الخلل الوظيفي المشبكي في الإنسان و AD-Tg على أنه عجز في النقل العصبي والقياس التشابكي [156،267] ، وانخفاض كثافة التشابك والعجز في اللدونة المشبكية [19،103،118،226]. ومع ذلك ، فإن التداخل الموصوف لـ ADDLs مع فعالية الإرسال المشبكي يشير إلى تغييرات محتملة في التنسيق المعقد لبروتينات متخصصة متعددة تشارك إما في تهريب الحويصلات المشبكية أو هيكل ومرونة قبل و / أو ما بعد التشابك [286]. الآليات الكامنة وراء تأثيرات الذوبان A & # x003b2 على خلل المشابك ليست معروفة تمامًا ، على الرغم من أن A & # x003b2 تزعج عددًا كبيرًا من العمليات الخلوية التي قد تؤدي في النهاية إلى انخفاض قابلية الخلية للبقاء. من المحتمل أن تعمل العديد من المسارات التنكسية في وقت واحد.

أظهرت مقارنة التعبير الجيني في 3 مختلفة من AD-Tg في عمرين مختلفين تطابقًا جيدًا بين الجينات ذات التنظيم الأعلى والأسفل في هذه الفئران وما تم الإبلاغ عنه سابقًا في أدمغة الإنسان بمرض الزهايمر [139،141]. تتألف الفئة الرئيسية من الجينات التي يتم تنظيمها بشكل شائع في هذه الفئران ومرض الزهايمر ، من الجينات المشاركة في إشارات الكالسيوم والكيناز ، وعامل النمو وإشارات مستقبلاتها ، ونسخ الجينات ، وحماية الإجهاد التأكسدي ، واستقلاب الدهون والكوليسترول ، والالتصاق الخلوي ، وتنشيط الليزوزومات والالتهابات . بينما ، تنتمي الجينات الرئيسية التي يتم تنظيمها إلى مجموعات الجينات المشاركة في إشارات الكيناز والفوسفاتاز ، والعوامل الغذائية والنمو ، والقنوات الأيونية ، واستقلاب البروتين ، وإنزيمات الميتوكوندريا ، والنسخ والترجمة ، والنقل المتشابك والحويصلات. أثر انخفاض تنظيم الجينات المثيرة للاهتمام بشكل خاص ، في ضوء فرضية الفشل المشبكي ، على تلك الترميز لمستقبلات الغلوتامات NMDA و AMPA وقنوات البوتاسيوم والكالسيوم و & # x003b1CamKII. يتعلق التنظيم اللاحق الذي حدث لاحقًا بجينات بروتين تنشيط Ras GTPase ، ومستقبلات Ephrin ، ومستقبل GABA-A ، وبروتينات نقل الحويصلة المشبكية ، وبروتين ربط عامل النمو الشبيه بالأنسولين و BDNF (لمزيد من التفاصيل ، انظر [141]). تفاقمت التغييرات في التعبير الجيني عندما كانت كميات كبيرة من رواسب A & # x003b2 موجودة ولكنها كانت ملحوظة بالفعل في أوقات إنتاج A & # x003b2 القابل للذوبان. وبالمثل ، تم تعديل الجينات أكثر بخمس مرات في الزهايمر الثابت مقارنة ببداية الميلاد [139]. تتوافق هذه النتائج مع بعض العمليات المرضية التي تم الإبلاغ عنها سابقًا بما في ذلك اللدونة والبنية المشبكية غير الطبيعية.

سنركز هنا على العمليات الخلوية التي يمكن أن تُعزى إلى أشكال أوليغومرية محددة A & # x003b2 ويمكن وضعها في سلسلة مسببات الأمراض. ظهرت بعض الآليات مؤخرًا كما هو موضح في الشكل. ( & # x200B 3 3 ). يمكن العثور على مزيد من التفاصيل في المراجعات التالية [156،235،287،288].

تلخيص آليات السمية العصبية لـ ADDLs المرتبطة بالتشابك.

المسار الميكانيكي المقترح لـ ADDLs المرتبطة بالتشابك المتورط في تحريض الانحرافات في تكوين العمود الفقري الشجيري والتشكل وكيف ترتبط هذه الآلية بخلل وظيفي متشابك وفقدان الاتصال في AD. يمكن أن تتراكم A & # x003b2 الناتجة عن انقسام APP وتعتمد مطابقات قليلة القسيمات من نوع ADDL الذي سيرتبط بمستقبل غشاء ما بعد المشبكي (البروتين X) لم يتم تحديده بعد ولكنه موجود بشكل مفترض في مجمع NMDA-R مما يؤدي إلى تدفق Ca2 + متبوعًا بتغييرات مختلفة في نشاط الكينازات / الفوسفاتيز الذي يؤدي إلى: 1) إعادة تنظيم المستقبلات الأساسية للذاكرة (NMDA-R و AMRA-R و EphB و InsR) من سطح الخلية على الأرجح بسبب خلل في الالتقام الخلوي. تم اقتراح آليات مختلفة: تورط أحدها في الإفراط في التعبير عن القوس في سحب AMRA-R ، بينما اقترح آخر أن الالتقام الخلوي NMDA-R ينتج عن التنشيط الناجم عن ADDL لـ a7nAchR ومشاركة جزيئات الإشارة مثل STEP و Fyn. تم أيضًا اقتراح تعديلات في الدينامين 2 والإندوفيلين ، وهو إنزيم متورط في آلية الالتقام التي تتحكم في دوران المستقبلات. 2) تحرير ديناميكيات الهيكل الخلوي للأكتين والتي قد تنتج عن تنشيط القوس. في هذا المستوى ، تتم إعادة الترتيب داخل شبكة البروتين المرتبطة بالأكتين ، والتي تتكون جزئيًا من Arc و Drebrin و Cofilin و Spinophilin ، مما يؤدي إلى تعطيل محرك التشكل & # x0201cspine & # x0201d وبالتالي اللدونة المتشابكة المناسبة. يُعتقد أن أنشطة PAK و RhoGTPases تلعب دورًا رئيسيًا في ديناميكيات الهيكل الخلوي للأكتين ، حيث يؤدي انخفاض نشاطها إلى فقدان drebrin وتفعيل cofilin ، وهو جزيء يعمل على إزالة بلمرة الأكتين. 3) تعديلات على شبكة الأنابيب الدقيقة التي تم فحصها من خلال فرط فسفرة تاو والتعديلات في توبولين و MAP2 (غير ممثلة هنا). 4) التداخل المحتمل مع التعبير عن البقاء على قيد الحياة و & # x0201ckiller & # x0201d الجينات من خلال مسار CREB. لغرض الوضوح ، تم حذف العوامل المحتملة الأخرى (مثل الإجهاد التأكسدي ، والخلل الوظيفي في الميتوكوندريا ، وإطلاق الناقل العصبي قبل المشبكي) التي قد تكون متورطة في التعبير عن المستقبل المشبكي وتشكل العمود الفقري.

الاكسدة

الإجهاد التأكسدي هو أحد أقوى التفسيرات لخلل الخلايا العصبية المرتبط بتغيير آليات الإشارات العصبية وقد تم وصفه على نطاق واسع في مكان آخر [65،289،290]. قد ينتج تثبيط LTP بواسطة A & # x003b2 القابل للذوبان عن تنشيط كينازات الإجهاد ووسطاء الإجهاد التأكسدي من خلال مستقبلات الموت NMDARs و mGluR5 و TNF & # x003b1 أو & # x003b1v إنتجرين [235،289]. تسببت الأشكال المختلفة للقليل من A & # x003b2 في الإجهاد التأكسدي [279]. بالإضافة إلى ذلك ، تعرض بعض جينات البروتين المشبكي قابلية بارزة للتلف الناتج عن الإجهاد التأكسدي ويمكن تقليلها [291].

خلل الكالسيوم

ترتبط زيادة تدفق الكالسيوم ارتباطًا وثيقًا بوجود أشكال مختلفة من A & # x003b2 وقد تم وصفها على نطاق واسع (انظر التعليقات [292،293]). بتعبير أدق ، تسببت الببتيدات A & # x003b2 المودعة في الشجرة التغصنية في زيادة شجيري Ca 2+ [294] والأشواك التغصنية المحلية [278].

مشاركة مستقبلات الجلوتامات

بدأ للتو فهم الوظائف التي تمارسها آلاف البروتينات التي تشكل المشبك بتعريف كيفية تفاعل بعضها مع بعضها البعض في تلك الحيز العصبي الفريد. تم تمييز جزء منها فقط بشكل جيد مما يجعل فهم الآلية الجزيئية الدقيقة المستخدمة بواسطة ADDLs المرتبطة بالتشابك أكثر صعوبة. أحد أفضل المكونات التي تمت دراستها وظيفيًا لمركب الآلات التشابكية هو ما يسمى بمركب NMDA-R / مجمع MAGUK المرتبط بالإشارات (NRC / MASC) الذي يحتوي على

185 بروتينًا [295] مع العديد من التفاعلات الوظيفية الممكنة التي تشكل حجر الزاوية في اللدونة المشبكية. في مثل هذا النظام المكرر ، من المفهوم أن أي إزاحة أو تغيير (على سبيل المثال بسبب التغييرات اللاحقة للترجمة أو بنية البروتين المعدلة) لعدد قليل من المكونات سيكون له تأثير ضار كبير على الوظائف المشبكية.

وصفت العديد من الدراسات التعبير المتغير لمستقبلات الغلوتامات في قرن آمون من مرض الزهايمر. أي تغيير في التعبير والتوزيع سيكون له عواقب وخيمة على وظيفة المشبك والتوازن العصبي بسبب دورهما في الانتقال التشابكي الاستثاري.

انخفض التعبير عن الوحدات الفرعية NMDAR 1 و 2 B ، التي تم تحليلها في قرن آمون طوال تطور مرض الزهايمر ، بشكل ملحوظ مقارنة بأدمغة التحكم [296 ، 297]. في نموذج زرع الحصين لدينا ، تسببت ADDLs في انخفاض كل من NR2B و NR1 على مستوى غشاء البلازما [226259]. يستلزم ضعف LTP القابل للذوبان A & # x003b2 الناجم عن القليل من LTP تنشيط المجموعة الأولى من تنشيط مستقبلات الغلوتامات الأيضية [234].

ومع ذلك وجدنا ارتباطًا بين ADDLs و NMDAR [226] ، لا نعرف ما إذا كان ذلك من خلال تفاعل مباشر. ومع ذلك ، فإن منع فقدان العمود الفقري التغصني الناتج عن ADDL بواسطة ميمانتين ، وهو مضاد NMDAR غير قادر على المنافسة مفتوح القناة [226] والتداخل مع مسار إشارات NMDAR في وجود أوليغومرات المفرزة بشكل طبيعي [278] تشير بقوة إلى مساهمة NMDAR في الذوبان A & # x003b2 السمية المشبكية. يستخدم ميمانتين لعلاج أعراض مرض الزهايمر ويعمل عن طريق تقليل A & # x003b2 & # x0201chyperactivation & # x0201d من NMDAR [298] وبالتالي توفير فوائد للذاكرة ربما عن طريق تقليل تدفق الكالسيوم الناجم عن ADDL وما يرتبط به من إشارات متتالية بالإضافة إلى زيادة التعبير عن القوس. تم الإبلاغ عن أن التنشيط المفرط لـ NMDAR يؤدي إلى فقدان العمود الفقري [299] والذي من شأنه أن يتفق مع الفكرة القائلة بأن الذوبان A & # x003b2 بواسطة & # x0201coverexciting & # x0201d تسبب NMDAR في فقدان العمود الفقري الموصوف أعلاه.

يُعتقد أن إطلاق وامتصاص الناقل العصبي الغلوتامات معطل وظيفي في مرض الزهايمر ، مما يؤدي إلى زيادة تدفق الخلايا العصبية للكالسيوم مما يؤدي إلى مسارات سمية عصبية في اتجاه مجرى النهر ، وهي سلسلة تنكسية عصبية يمكن تخفيفها جزئيًا بواسطة ميمانتين.

في دراسة أنيقة ، تم اقتراح أن التنشيط بواسطة A & # x003b2 لـ & # x003b17nAchR و STEP التيروزين الفوسفاتيز المصب مطلوب لاستنباط NMDAR في الخلايا العصبية الحُصينية المستزرعة [265]. تنشيط STEP هو المسؤول عن نزع الفسفرة من NR2B وتثبيط Fyn ، وهو آخر من التيروزين كيناز يمكنه الفسفرة NR2B. تؤدي هذه الأحداث إلى انخفاض مستقبلات NMDAR السطحية عن طريق التدخل في مسار الالتقام وانسداد خروج الخلايا من NMDAR الجديد على السطح [300].

يمكن للأنواع A & # x003b2 الارتباط بشكل انتقائي بتقارب بيكومولار بـ & # x003b17 nAChR [301] ، وتعديل nAChRs مباشرةً [302] ، ومنع الاستجابات الوسيطة & # x003b17 nAChR [303] وتنشيط سلسلة بروتين كيناز (MAPK) الذي ينشط الميثوجين عبر & # x003b17 nAChRs [304]. بالإضافة إلى ذلك ، للنيكوتين ومضادات النيكوتين تأثيرات ضد سمية A & # x003b2 [305]. ومع ذلك ، فإن انسداد a7nAchR بواسطة & # x003b1-bungarotoxin لم يكن كاملاً مما يشير إلى احتمال تورط آليات مستقبلات إضافية في السمية المشبكية A & # x003b2.

AMPARs

يخفف A & # x003b242 وظيفة AMPAR [306] ، ويقلل من اتساع وتردد التيارات المثيرة بعد المشبكية بوساطة AMPAR في الخلايا العصبية الحُصينية CA1 ويقلل من احتمالية الفتح ووقت فتح القناة [266،267]. تم تنظيم كل من التيارات AMPAR و NMDAR في شرائح الحصين المحتضنة بفيروس يحتوي على hAPP [59]. تنخفض وحدة AMPAR الفرعية GluR2 بشكل ملحوظ في AD قبل تكوين NFT [307]. يعد GluR2 ضروريًا للحفاظ على AMPAR غير منفذة لأيونات الكالسيوم ، وبالتالي فإن انخفاضه يؤثر بشكل كبير على الوظيفة المشبكية وحيوية الخلايا العصبية. لم تظهر البيانات الخاصة بمستويات GluR1 في أدمغة الزهايمر أي ارتباط مع شدة المرض [308].

علاوة على ذلك ، يحدث استيعاب AMPAR في اتجاه مجرى نشاط المجموعة 1 mGluR [309] ، ويمكن أن يفسر التحلل الكامل للاستجابات القوية قصيرة المدى التي لوحظت بعد التعرض A & # x003b2-oligomer في تجارب LTP [116،118]. يستخدم الالتقام الخلوي لـ AMPAR تحت التعرض A & # x003b2 مسارات تأشير لـ LTP مثل p38MAPK و calcineurin / PP2B [266]. يبدو أن نشاط PP2B مطلوب أيضًا لسحب NMDAR [265].

MGluRs

عادةً ما يرتبط استطالة العمود الفقري بزيادة معتدلة في مستويات الكالسيوم داخل الخلايا الناتجة عن إطلاق المخزن داخل الخلايا الناتج عن تنشيط مستقبلات التمثيل الغذائي مثل المجموعة 1 mGluRs [310]. يعد تنشيط المجموعة 1 mGluRs أمرًا بالغ الأهمية بالنسبة للانحلال القابل للذوبان الناجم عن A & # x003b2 ، ويوفر رابطًا معقولًا بين استطالة العمود الفقري الملحوظ والتعرض لـ ADDL.

لقد ثبت أن تنشيط mGluR يؤدي إلى زيادة سريعة في تراكم polyribosomes وزيادة حجم العمود الفقري [310]. تم افتراض مشاركة mGluRs في التخفيض A & # x003b2 بوساطة انتقال الجلوتامات ، بينما يتم زيادة تنشيط هذا النوع من النقل المتشابك من خلال تنشيط ما قبل المشبكي & # x003b14 & # x003b22 nAchRs [311].

مستقبل EphB المرتبط بـ NMDAR

تمثل كينازات التيروزين لمستقبل EphB مستقبلًا متشابكًا آخر ضروريًا لللدونة المشبكية الحصينية والتخصص المناسب بعد المشبكي [312]. يؤدي تنشيطه إلى تفاعل خارج الخلية مع NMDAR1 [313] تعزيز تدفق NMDAR Ca2 + المحسن وتجميع NMDAR مع & # x003b1CaMKII المعين إلى PSD لنقل متشابك مناسب [313]. ومن المثير للاهتمام ، أن الفئران التي تعبر عن شكل مبتور من EphB2 بدون موقع التيروزين كيناز قدمت كثافة عمودًا فقريًا أقل وطولًا أطول للعمود الفقري [314].

يعمل تنشيط EphB2 على تعزيز التوظيف المشبكي لـ Rho-GEF kalirin وتفعيل Rac1 ومستجيبه PAK ، وهو المستجيب المصب لعائلة Rho / Rac من GTPases الصغيرة [315]. ينظم تنشيط PAK شلالات الإشارات التي تسبب إعادة ترتيب الأكتين وتشكل العمود الفقري [316] وقد ارتبط تثبيطه بالتخلف العقلي الشديد وعجز الذاكرة [317]. يتسبب التعرض العصبي لأوليغومرات A & # x003b2 في خسارة مباشرة في إشارات PAK العصبية مما يشير إلى أن فقدان NR1 السطحي عن طريق معالجة ADDL قصيرة المدى قد يؤدي بعد ذلك إلى تقليل كثافة سطح EphB2. يُعتقد أن فقدان هذه المستقبلات عند المشبك يؤدي إلى حدوث عيوب في مسار إشارات PAK ، ويفترض أن يكون ذلك من خلال التغييرات في التجنيد المتشابك للكاليرين وراك 1. تم اقتراح التغييرات في هذا المسار لتكون مسؤولة عن فقدان drebrin وبنية العمود الفقري الشاذة التي لوحظت مع علاج ADDL [317].

قد يتكهن المرء بأن هذه السلسلة من الأحداث هي المسؤولة عن فقدان الاتصال المسؤول عن عجز الذاكرة في دماغ AD ، حيث أن مستقبلات NMDAR و AMPAR و EphB مهمة للبنية اللدونة والعمود الفقري.

عدم تنظيم مديرية الأمن العام

بالتزامن مع التغييرات المبلغ عنها في المستقبلات الأساسية للذاكرة (انظر أعلاه) ، تم إثبات أن A & # x003b2 يحرض على تدهور PSD95 ، a & # x0201cm متعدد الشركاء & # x0201d جزيء ربط السقالات وبروتينات الهيكل الخلوي وكذلك الالتصاق والإشارة الجزيئات و مستقبلات الغلوتامات [248]. يمثل مجمع PSD95 شبكة من المكونات الجزيئية توفر تجزئة وخصوصية لكل من التنظيم الزماني والمكاني في مسارات الإشارات [318]. ينظم PSD95 تهريب مستقبلات AMPAR و NMDAR [319،320] والذي من شأنه أن يفسر لماذا يكون التحلل الناجم عن الذوبان الناتج عن A & # x003b2 متزامنًا مع التعبير السطحي المنخفض لمستقبلات الغلوتامات [264].

تلف مركب الهيكل الخلوي F-Actin (Arc و Drebrin و Cofilin) ​​واشتراك RhoGTPases Signaling Cascade (Rac / Rho / cdc42 ، PAK ، LIMK)

تعتمد اللدونة المورفولوجية للعمود الفقري على الهيكل الخلوي السليم للعمود الفقري الذي يتميز بشبكة كثيفة من الخيوط الدقيقة المحتوية على الأكتين (مراجعة في [321] والمرجع فيها) والعديد من البروتينات المرتبطة بالهيكل الخلوي التي تربط خيوط الأكتين المتصالبة بغشاء البلازما والـ مديرية الأمن العام نفسها [322]. يتم تحديد مستوى F-actin في العمود الفقري عن طريق التوازن بين الأكتين المبلمر والمنزوع البلمرة (الشكل. & # x200B 3 3 ) ، وهي ظاهرة يتم التحكم فيها بشكل كبير بواسطة بروتينات رابطة وتنظيم الأكتين (مثل ADF / cofilin ، profilin) ​​التي تتم مزامنتها بواسطة شبكة PSD [323]. ترتبط التغييرات الديناميكية في F-actin بـ NMDAR بعد المشبكي [324] وتحدد قدرة العمود الفقري على المرور بالتغيرات المورفولوجية [325]. تمت مراجعة المسارات الرئيسية التي تقترن بإعادة تشكيل الأكتين و NMDAR مؤخرًا [312]. كما هو مذكور أعلاه ، قد تتسبب التغييرات التي يسببها A & # x003b2 في تعبير مستقبلات NMDAR و EphB2 على السطح المشبكي ، دون تغيير مقدارها الإجمالي ، في حدوث عيوب في إشارات المصب في مسار PAK. قد تؤدي بعض تعديلات الإشارة هذه إلى إعادة ترتيب الأكتين ، وبالتالي معاداة حركة العمود الفقري وإضعاف اللدونة المشبكية مما يؤدي إلى عرض غير تقليدي لهيكل العمود الفقري الشجيري والكثافة التي لوحظت مع علاج ADDL المطول.

يخضع المسار الرئيسي لتنظيم RhoA و Rac1 (RhoGTPases الصغيرة ، [327]) ، وهما وسطاء رئيسيان من اللدونة المشبكية [327]. يلعب Rac1 دورًا رئيسيًا في تنظيم بلمرة F-actin ، مما يشير إلى تورطه في صيانة وإعادة تنظيم الهياكل التغصنية ، على مستوى ثباتها وحركتها [326،328]. يعزز تنشيط Rac1 تكوين العمود الفقري الشبيه بالعمود الفقري (العمود الفقري المطول دون نمو رؤوس العمود الفقري) على حساب العمود الفقري الطبيعي بينما يرتبط تثبيطه بانخفاض كثافة العمود الفقري. على العكس من ذلك ، يؤدي تنشيط RhoA إلى تقليل طول العمود الفقري وكثافته بينما يؤدي تثبيطه إلى حركة العمود الفقري الجديد [326،329،330]. بالنظر إلى مورفولوجيا العمود الفقري وتغيرات الكثافة التي لوحظت في الخلايا العصبية القابلة للذوبان A & # x003b2 المعالجة بالقليل من الخلايا ، يبدو أن كلا المسارين يمكن أن يحدثا في وقت واحد عبر التشعبات وربما بشكل مختلف بين العمود الفقري الشجيري. هذا من شأنه ، على الأقل لفترة محددة ، أن يؤدي إلى مزيج من انسحاب العمود الفقري وتمدد العمود الفقري الذي لاحظناه بعد حضانة ADDL للخلايا العصبية الحُصين [226]. ثبت أن تنشيط Rac1 يحدث بعد التطبيق الخارجي لـ A & # x003b2 [104،331] ويلاحظ في أدمغة AD و AD-Tg [332]. يُعتقد بشكل مستقل أن PAK ، ومستجيب Rac1 ، و ADF / cofilin ، وهو بروتين يعمل على إزالة بلمرة الأكتين ، متورط بشكل مستقل في AD [317]. يحدث تقليل تنظيم cofilin بعد الفسفرة من خلال مسار PAK / LIMK [333334] ، وبالتالي فإن تقليل PAK و LIMK مثل ما لوحظ في AD و AD-Tg سيؤدي إلى تنظيم الكوفيلين وإفساد مركب الأكتين. في الواقع ، يبدو أن PAK يلعب دورًا أساسيًا في السلسلة السامة للمشابك للأوليغومرات القابلة للذوبان A & # x003b2 لأن الإفراط في التعبير يمنع فقدان الدريبرين الناجم عن قلة القسيمات A & # x003b2 بينما يؤدي تثبيطه إلى فقدان الدريبرين وعجزًا واضحًا في الذاكرة [317]. تم الإبلاغ عن Rac1 أيضًا ليكون ضروريًا في سلسلة الإشارات التي يسببها A & # x003b2 والتي تؤدي إلى توليد ROS في خلايا الورم النجمي [335]. يعتبر Rho مسؤولاً عن تنظيم التكتل بين F-actin والبروتينات المرتبطة بالأكتين مثل السبينوفيلين والنيورابين. لذلك ، من المتوقع في حالة السمية المشبكية A & # x003b2 أن تحدث تغييرات في قياس متكافئ البروتين المشبكي بين F-actin و drebrin و Arc و spinophilin و cofilin.

ومن المثير للاهتمام ، لقد أبلغنا أن أوليغومرات A & # x003b2 القابلة للذوبان استهدفت المشابك العصبية في عصبونات حصين الفئران المستزرعة حيث أدت إلى زيادة التعبير المستمر عن الجين المبكر المبكر Arc [114،115،122]. يلعب بروتين القوس دورًا أساسيًا في تكوين الذاكرة طويلة المدى واللدونة المشبكية [223،336] ومن المعروف أنه ينظم حالة شبكة F-actin وشبكة الأنابيب الدقيقة من خلال التفاعل مع MAP2. لقد توقعنا أن ADDL من خلال زيادة تعبير القوس من شأنه أن يتداخل مع تعبير مستقبلات الجلوتامات على السطح ويسبب انحرافات في شكل العمود الفقري [122]. تم تأكيد هذا التوقع إلى حد كبير [226،259،265،266]. علاوة على ذلك ، تم منح Arc وظيفة في تهريب AMPAR من خلال تعزيز الالتقام الخلوي للمستقبلات بعد التفاعل مع بروتينين من غشاء الحويصلة الداخلية (الدينامين والإندوفيلين) [337]. متوافق مع التأثير الضار لـ A & # x003b2 عند نقاط الاشتباك العصبي ، أدى تعبير Arc overexpression إلى تقليل تنظيم التعبير السطحي AMPAR [338] ، مما أدى إلى تقليل الإرسال المتشابك بوساطة AMPAR [339] وحظر الزيادة المتوازنة في وظيفة AMPAR [340]. على الرغم من أن تنظيم NMDAR من سطح الخلية يتنبأ بانخفاض في ترجمة Arc mRNA عند المشبك ، فقد يتم تحرير تعبير Arc ورفعه عند سحب AMPAR من الغشاء لأنها تعمل عادةً كمنظم سلبي لنسخ القوس [341]. لا نعرف حتى الآن ما إذا كان القوس يمكن أن يعطل دورة المستقبلات المشبكية الأخرى المطلوبة لدونة التشابك.

يجمع Spinophilin الأكتين ، ولكنه يسهل أيضًا الانتقال المشبكي عن طريق تجنيد فوسفاتاز البروتين إلى المشبك لتعديل نشاط مستقبلات الجلوتامات [342]. تمت مراجعة تأثير التنظيم غير المتوازن داخل آلية تنظيم الأكتين بعد المشبكي (فقدان الدريبرين المرتبط بزيادة الكوفيلين المزوَّد بالفوسفور) ودوره في خصائص الخلل الوظيفي المتشابك لـ AD و DS بشكل جيد في مكان آخر [184]. ينظم نشاط NMDAR [325] هذا الدريبرين / البروتينات المنظمة للأكتين / مركب F- أكتين.

Tyrosine Kinases و MAP Kinases

تشير الدلائل أيضًا إلى أن أوليغومرات A & # x003b2 ترتبط ببروتينات الغشاء العصبي [119،121] مما يؤدي إلى تنشيط مسارات تحويل إشارة كيناز [101،343،234]. تم عرض A & # x003b2 لتنظيم وظيفة PKA و calcineurin و CREB [344،345].

A & # x003b21-42 ، في ظل التشكل الليفي أو القابل للذوبان ، يمكن أن يحفز التنشيط المستمر لمسار إشارات ERK1 / 2 الذي يمكن أن يؤدي بعد ذلك إلى فرط فسفرة تاو [271،346،347]. في حالة أوليغومرات A & # x003b2 القابلة للذوبان (A & # x003b2Os) ، يؤدي تنشيط caspase-3 بعد تحفيز مسار إشارات ERK1 / 2 إلى انقسام بروتيني لـ tau [272] دون تنكس المشبك. هذا يشير إلى أن القلة يمكن أن تسبب تلف الأنابيب الدقيقة.

تم اقتراح مسارات أخرى تتضمن PKC [348] و JNK و cdk5 و p38 MAPK [234] للسمية A & # x003b2 بوساطة التي تنطوي على احتمال تنشيط مسار إشارات مختلف قد يكون جيدًا جدًا بسبب استخدام أنواع مطابقة مختلفة A & # x003b2 أو الخصائص في البروتوكولات التجريبية المستخدمة.

أشارت دراسات أخرى إلى أن Fyn ، وهو أحد أفراد عائلة SRC التيروزين كيناز ، في سمية أوليغومرات A & # x003b2 القابلة للذوبان. أشارت المظاهرات الأولية بأناقة إلى Fyn كعنصر أساسي في السمية المشبكية حيث أن خروج Fyn في الخلايا وفئران hAPP-Tg يحمي من سمية A & # x003b2 [101،343] بينما أدى تعبير Fyn الزائد إلى تفاقم فقدان العلامات المشبكية وخلل الذاكرة اللاحق [343،349 ].

مسار الأنسولين

لقد ثبت مؤخرًا أن الأوليغومرات القابلة للذوبان A & # x003b2 تتداخل مع مستقبلات الأنسولين الموجودة في الدماغ والتي توفر أساسًا لمقاومة الأنسولين في الجهاز العصبي المركزي في AD [115،263]. لم يتم وصف آليات انسحاب InsR الناجم عن ADDL من سطح الخلية حتى الآن ، ولكن أصبح من الواضح أن الذوبان A & # x003b2 يقلل بشكل كبير من استجابة الخلايا العصبية للأنسولين. بالتزامن مع ذلك ، أظهر تقرير أن الأوليغومرات المفرزة بشكل طبيعي تتداخل مع ERK / MAPK و CaMKII و PI3K / Akt ، وهي التأثيرات التي يُفترض أنها ناتجة عن ارتباط أوليغومرات A & # x003b2 بـ InsR [350] ، إذا كان الأمر كذلك ، فمن المتوقع أن يوفر الأنسولين الحماية ضد بعض التأثيرات السمية المتشابكة التي يسببها A & # x003b2. تؤدي المنافسة بين A & # x003b2 والأنسولين لموقع ربط InsR إلى انخفاض في الإشارات التي تتم بوساطة InsR [263،350-352]. في الواقع ، يمكن للأنسولين أن يحمي من السمية الخلوية A & # x003b2 في مزارع خلايا الحصين [353] ويمكن أن ينظم عملية الالتقام الخلوي لـ AMPAR [354].

أحداث أخرى ذات صلة بالسمية المشبكية

تم الإبلاغ عن تغييرات في الاتجار الحويصلة المشبكية في الخلايا العصبية المعرضة لأنواع A & # x003b2 [355]. باختصار ، يؤدي A & # x003b2 إلى زيادة الكالسيوم داخل الخلايا على الأرجح من خلال تنشيط قنوات الكالسيوم ذات الجهد الكهربائي. هذا ينشط فيما بعد إنزيم الكالبين الذي يحتوي على الدينامين -1 للركيزة. Dynamin-1 هو بروتين GTPase الذي يشارك في آليات exo / endocytosis من خلال المساعدة في إعادة تدوير الحويصلات المشبكية من غشاء البلازما بعد إطلاق الناقل العصبي [356]. وبالتالي يبرز A & # x003b2 إطلاق الناقل العصبي.

في الوقت نفسه ، يمكن أن يتسبب A & # x003b2 أيضًا في حدوث خلل وظيفي في البروتوزوم عن طريق تثبيط ubiquitin C-terminal hydrolase [357] والذي قد يؤدي بدوره على سبيل المثال إلى تراكم تاو [358] ودوران غير لائق لبروتين PSD [264] وبالتالي فهو شرعيًا لافتراض أن الأحداث المختلفة الموصوفة أعلاه ستؤدي في النهاية إلى تكوين غير طبيعي لـ PSD.


Interleukin-6 في علم الأحياء والطب

يركز هذا الفصل على بنية وتعبير إنترلوكين 6 (IL-6) ، وهو سيتوكين له أنشطة متعددة الاتجاهات التي تلعب دورًا مركزيًا في دفاع المضيف. يمكن أن يمارس IL-6 أنشطة تحفز النمو وتثبيط النمو وتحفز التمايز ، اعتمادًا على الخلايا المستهدفة. تشمل هذه الأنشطة (1) التمايز النهائي (إفراز الغلوبولين المناعي) في الخلايا البائية و (2) تعزيز النمو في الخلايا البائية المختلفة. يتورط IL-6 في أمراض العديد من الأمراض بما في ذلك المايلوما المتعددة والتهاب كبيبات الكلى التكاثري المسراق والتهاب المفاصل الروماتويدي ومتلازمة نقص المناعة المكتسب (الإيدز). قد يكون للتثبيط الانتقائي لتخليق أو لعمل IL-6 فائدة علاجية ضد الأمراض المرتبطة بـ IL-6. من ناحية أخرى ، يحتوي IL-6 على نشاط قوي مضاد للأورام ضد أنواع معينة من الأورام. يعد استخدام IL-6 واعدًا في علاج السرطان وكذلك في علاج كبت النخاع الناجم عن العلاج الإشعاعي أو الكيميائي. تعد بيولوجيا الخلية للأحداث داخل الخلايا التي تربط التنبيغ بتنظيم الجينات مجالًا مهمًا ، ويساعد العمل على هذه الموضوعات في فهم ظواهر مثل الوظائف المتعددة لـ IL-6 والتأثيرات ثنائية الاتجاه لنمو الخلية اعتمادًا على نوع الخلية.


دور TRPCs في إصابة الدماغ الدماغية

تم ربط إصابة الدماغ بعد الإهانة الإقفارية البؤرية بنقص إمدادات الأكسجين والمغذيات (الجلوكوز) لمنطقة الدماغ المصابة (ليبتون ، 1999 لو وآخرون ، 2003). على حد سواء في الجسم الحي نموذج MCAO و في المختبر يشيع استخدام نموذج OGD لتقييم مشاركة وآليات قنوات TRPC في موت الخلايا العصبية المرتبط بالسكتة الدماغية. كما هو الحال مع الأمراض التنكسية العصبية الأخرى التي نوقشت أعلاه ، كشفت هذه الدراسات عن الأدوار المعقدة لقنوات TRPC المختلفة في إصابة الدماغ الدماغية.

بالنسبة لـ TRPC1 ، اقترح كل من نموذج MCAO ومقايسة OGD أن TRPC1 يلعب دورًا وقائيًا ضد الإصابات العصبية الناجمة عن نقص التروية الدماغية / ضخه من خلال قمع توليد ROS (Xu et al. ، 2018). تبين أن تعبير TRPC1 خاضع للتنظيم ليس فقط في أنسجة دماغ الفئران التي خضعت لـ 90 دقيقة من MCAO متبوعًا بإعادة ضخ 24 ساعة ، ولكن أيضًا في خط خلايا الحصين الفئران المستزرعة ، HT22 ، التي تعرضت لثقافة OGD لمدة 4 ساعات ثم تم وضعها في الوسط الطبيعي المعاد الأكسجين لـ 6 & # x201324 ساعة. تم إثبات أن سعة إدخال Ca 2+ الذي يتم تشغيله في المتجر في خلايا الحصين تم تصحيحه بشكل إيجابي بالتعبير TRPC1 ، ولكنه مرتبط سلبًا بنشاط NADPH أوكسيديز ، ولا علاقة له بالتعبير عن STIM1 و Orai1 وكذلك توليد ROS للميتوكوندريا . ومع ذلك ، لم يتم تقديم أي دليل يشير إلى وجود تأثير مثبط مباشر لـ Ca 2+ على نشاط NADPH أوكسيديز. بدلاً من ذلك ، قام TRPC1 بتثبيط إنتاج ROS بوساطة NADPH أوكسيديز من خلال التفاعل الجسدي مع مكون حفاز من أوكسيديز ، Nox4 ، مما سهّل تدهور Nox4 جنبًا إلى جنب مع الاحتفاظ السيتوبلازمي للوحدات الفرعية العصارية الخلوية لمركب NADPH أوكسيديز ، p47phox و p67phox (Xu et al. 2018). هذا الدور الوقائي لـ TRPC1 هو عكس نتائج عمل سابق ، والذي أظهر أن SKF96365 منع موت الخلايا العصبية القشرية الناجم عن 1.5 ساعة OGD و 24 ساعة إعادة الأكسجة (Wang et al. ، 2016). نظرًا لأن SKF96365 هو دواء غير محدد يثبط جميع قنوات TRPC ، وجميع أشكال إدخال Ca 2+ التي تعمل بالمخزن والمستقبلات ، فإنه لم يبلغ عن نوع القناة المحدد الذي كان مسؤولاً عن التأثير الوقائي.

من ناحية أخرى ، تم الإبلاغ عن الفئران TRPC3 / 6/7 بالضربة القاضية الثلاثية لتكون مقاومة لإصابة الدماغ التي يسببها MCAO متبوعًا بإعادة ضخه (Chen X. et al. ، 2017). هنا ، يُعزى الدور الضار لقنوات TRPC3 / 6/7 جزئيًا على الأقل إلى الخلايا النجمية ، حيث ساهمت هذه القنوات في تحسين الفسفرة NF - & # x03BAB ، وتقليل الفسفرة AKT وزيادة موت الخلايا المبرمج بعد OGD وعلاج إعادة الأكسجة (Chen X وآخرون ، 2017). كيف ترتبط وظيفة TRPC3 / 6/7 ، التي تعزز موت الخلايا النجمية ، أو تنسق مع داء النجوم ، وهو تكاثر غير طبيعي للخلايا النجمية في الدماغ لوحظ بعد السكتة الدماغية وأظهر أنه ينظم بشكل إيجابي بواسطة TRPC3 (Shirakawa et al. ، 2010 Munakata et al.، 2013 Belkacemi et al.، 2017) ، هو سؤال مثير للاهتمام يحتاج إلى معالجة في الدراسات المستقبلية.

على الرغم من الإبلاغ عن زيادة تعبير TRPC6 في الخلايا العصبية القشرية للفأر بعد نقص تروية الدماغ / ضخه في الجسم الحي و OGD / إعادة الأكسجة في المختبر، وساهمت هذه الزيادة في إصابة الخلايا العصبية بطريقة تعتمد على مستقبلات NMDA (Chen J. et al. ، 2017) ، تجادل جميع الدراسات الأخرى تقريبًا بالدور الوقائي لـ TRPC6 في الضرر العصبي المرتبط بالسكتة الدماغية. تم اقتراح الدور الوقائي العصبي لـ TRPC6 من خلال تنشيط إشارات بروتين ربط عنصر استجابة cAMP (CREB) ، والتي تتعطل بعد نقص التروية الدماغي بسبب تحلل بروتينات TRPC6 في الخلايا العصبية عن طريق الانقسام التحلل للبروتين بوساطة كالبين ، تنشيط بروتياز السيستين غير الليزوزومي. نتيجة [Ca 2+]أنا الارتفاع من تنشيط مستقبلات NMDA عن طريق الغلوتامات المرتفعة خارج الخلية (Du et al. ، 2010). وقد وجد أن التخفيف من تدهور TRPC6 بوساطة كالباين يمكن أن يكمن وراء التأثيرات الوقائية العصبية للعديد من المركبات الطبيعية ، مثل ريسفيراترول ، نيوروبروتكتين D1 ، و (& # x2013) -epigallocatechin-3-gallate (المكون الرئيسي للشاي الأخضر) ، و calycosin (Lin et al.، 2013a Yao et al.، 2013، 2014 Guo et al.، 2017). تم تجاهل هذه التأثيرات الوقائية عن طريق تثبيط بروتين كيناز كيناز المنشط بالميتوجين (MEK) و / أو كالمودولين كينازات تشير إلى أن هذه الكينازات تتوسط في تنشيط CREB في اتجاه مجرى النهر من TRPC6 (Lin et al.، 2013b Yao et al.، 2013). من ناحية أخرى ، فإن زيادة تعبير TRPC6 أو وظيفته من خلال الإفراط في التعبير أو العلاج باستخدام hyperforin أدى أيضًا إلى تثبيط وظيفة مستقبل NMDA ونشاط كالبين المكبوت (Li et al. ، 2012 Lin et al. ، 2013b) ، مما يدل على اللوائح المتبادلة بين مستقبلات TRPC6 و NMDA / كالبين. بمجرد اقتراحه على أنه ناهض TRPC6 (Leuner et al. ، 2007) ، تم العثور على hyperforin لزيادة تعبير TRPC6 في حصين الفأر بعد نقص التروية / إعادة التروية (Lin et al. ، 2013b). تم الإبلاغ أيضًا عن Hyperforin بعدم تغيير نشاط قناة TRPC6 ، ولكنه يعمل بشكل مستقل عن TRPC6 باعتباره بروتونوفور ، مما قد يفسر آثاره المضادة للاكتئاب (Sell et al. ، 2014). علاوة على ذلك ، تم الإبلاغ أيضًا عن تنشيط انقسام كالبي لـ TRPC6 بواسطة إنترلوكين 17 (IL-17) (Zhang et al. ، 2014) ، وهو سيتوكين مشتق من الخلايا التائية يُظهر أنه يساهم في إصابة الدماغ الدماغية (Gelderblom et al. ، 2012) ، مما يشير إلى وجود تفاعل عصبي مناعي يؤدي إلى تفاقم الضرر العصبي الإقفاري من خلال تقليل تنظيم TRPC6.

على عكس المعلومات الغنية عن TRPC6 ، لا يُعرف الكثير عن أدوار TRPC4 و TRPC5 في إصابة الدماغ المرتبطة بالسكتة الدماغية. في إحدى الدراسات ، تم الإبلاغ عن زيادة التعبير البروتيني لـ TRPC4 في الخلايا العصبية القاتلة للجرذان والحصين في 12 ساعة إلى 3 أيام بعد MCAO (Gao et al. ، 2004). استندت دراسات أخرى تكهنت بالوظيفة الضارة لـ TRPC5 في حالات العجز العصبي بعد السكتة الدماغية إلى تنشيط TRPC5 عن طريق الأكسدة ، دون تجربة في نموذج السكتة الدماغية (Ishii et al.، 2011 Park et al.، 2019، 2020). في دراسة حديثة جدًا ، وجد أن TRPC5 يتفاعل مباشرة مع سكرامبلاز الفوسفوليبيد 1 (PLSCR1) على غشاء البلازما لتسهيل إخراج الفوسفاتيديل سيرين (PS) وموت الخلايا المبرمج للخلايا العصبية القشرية استجابة لنقص التروية الدماغي / ضخه (Guo et al. ، 2020 ). من المحتمل أن يشتمل مجمع البروتين نفسه أيضًا على TRPC1 و TRPC4. في حين أن فحص الشرائح الدماغية للحيوانات المعرضة لنقص التروية / إعادة التروية كشف عن انخفاض تخارج PS وموت الخلايا المبرمج في الفئران بالضربة القاضية TRPC5 ، ما إذا كانت هذه تترجم إلى حماية ضد احتشاء دماغي و / أو ضعف عصبي سلوكي (Guo et al. ، 2020) . من ناحية أخرى ، أدى الإفراط في التعبير عن TRPC5 في الحبل الشوكي عبر الفيروسات المرتبطة بالغدية إلى إضعاف نقص تروية الحبل الشوكي / إصابة إعادة التروية في الفئران (Shen et al. ، 2020). قد ينتج هذا عن وظيفة الأوعية الدموية لـ TRPC5 التي تخفف الالتهاب الناجم عن الإصابة. في الواقع ، تم الإبلاغ عن TRPC5 لتعزيز نمو الخلايا البطانية ، وتكوين الأوعية الدموية ، ونضح الدم في الأنسجة الدماغية من خلال تنشيط العامل النووي للخلية التائية المنشطة (NFAT) isoform c3 و angiopoietin-1 (Zhu et al. ، 2019). لذلك ، قد يكون تأثير TRPC4 / C5 على إصابة الدماغ الدماغية معقدًا للغاية ، بما في ذلك كل من اللوائح الإيجابية والسلبية التي تؤدي إما إلى تفاقم أو منع موت الخلايا العصبية.


مقدمة

المواد الأفيونية هي أقوى الأدوية المستخدمة لتسكين الآلام. ومع ذلك ، يمكن أن تكون إمكاناتهم العلاجية محدودة لأن الاستخدام المطول سيؤدي إلى تحمل الآثار المسكنة التي تتطلب جرعات متصاعدة مرتبطة بالآثار الجانبية مثل الاكتئاب التنفسي. تم تكريس عمل ضخم لفك شفرة الآليات الجزيئية للتسامح. من الثابت الآن أن إزالة حساسية مستقبلات المواد الأفيونية (OR) وآلياتها الجزيئية مرتبطة ارتباطًا وثيقًا بهذه الظاهرة. منذ بداية 1980 & # x00027s عندما تم استحضار التوازي بين التسامح وإزالة التحسس ، خرجت العديد من الدراسات حول الآليات الجزيئية الكامنة وراء أو إزالة التحسس. زاد عدد المنشورات المتعلقة بإزالة التحسس من OR بشكل كبير مع استنساخ مستقبلات الأفيون بعد 10 سنوات. في هذه المراجعة ، بذلنا جهدًا لتلخيص كمية كبيرة من هذه البيانات والإشارة إلى نتائج متضاربة من خلال مناقشة الظروف الأولية (نماذج الخلايا ، العلاجات الناهضة & # x02026). قمنا أيضًا بدمج آخر التطورات التي تم الحصول عليها بشأن دور الاتجار بالمستقبلات في إزالة التحسس والتسامح ومفهوم التحيز التحيز.


الآليات الجزيئية والخلوية لموت العصبونات السامة للإثارة

يلعب النقل العصبي الاستثاري بوساطة مستقبلات الجلوتامات دورًا رئيسيًا في التطور العصبي والتمايز واللدونة المتشابكة. ومع ذلك ، فإن التحفيز المفرط لمستقبلات الجلوتامات يؤدي إلى السمية العصبية ، وهي عملية تم تعريفها على أنها سمية الإثارة. تعتبر السمية المفرطة آلية رئيسية لموت الخلايا في عدد من أمراض الجهاز العصبي المركزي بما في ذلك السكتة الدماغية وصدمات الدماغ والصرع والاضطرابات التنكسية العصبية المزمنة. لسوء الحظ ، ارتبطت التجارب السريرية مع مضادات مستقبلات الجلوتامات ، والتي من شأنها أن تمنع بشكل منطقي تأثيرات التنشيط المفرط للمستقبلات ، بآثار جانبية غير مرغوب فيها أو فائدة سريرية قليلة. لذلك ، فإن الكشف عن المسارات الجزيئية المتضمنة في موت العصبونات السامة للإثارة له أهمية حاسمة في التطوير المستقبلي للعلاج السريري للعديد من الاضطرابات العصبية التنكسية حيث تكون السمية الإثارة متورطة. تناقش هذه المراجعة الفهم الحالي للآليات الجزيئية والخلوية للسمية المثيرة ودورها في التسبب في أمراض الجهاز العصبي المركزي.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


شاهد الفيديو: كيف تتجنب الوقوع في اخطاء عند تحرير المشاعر كي لا تلوم نفسك (قد 2022).