معلومة

الطرد المركزي للحمض النووي في الماء

الطرد المركزي للحمض النووي في الماء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

إذا كان لدي بكتيريا مخففة في الماء وقمت بالطرد المركزي بسرعة قصوى لمدة 15-30 دقيقة ، فمن الممكن أن أكسر الجدران بحيث يمكن للحمض النووي أن ينفصل ولا أحصل على أي حبيبات DNA؟ أم هل يجب أن أحصل عليه على شكل حبيبات كل شيء (دهون ، بروتينات ...) حتى لو كان الخليط مجرد بكتيريا مخففة في الماء؟


ليس مع أجهزة الطرد المركزي مقاعد البدلاء. البكتيريا لها جدار خلوي وهي صغيرة نوعًا ما. هذا يعطي جدار الخلية الكثير من القوة. لست متأكدًا حتى من أن أجهزة الطرد المركزي الفائقة ستعمل.

ما ستحصل عليه على الأرجح هو بيليه الخلية. إذا كنت تريد الحمض النووي ، فقم بتكوير الخلية واذهب إما إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل المباشر أو التسلسل. أو استخدم مجموعة استخراج الحمض النووي للحصول على الحمض النووي الذي تريده.


الطرد المركزي للحمض النووي في الماء - علم الأحياء

يتم توفير جميع المقالات المنشورة بواسطة MDPI على الفور في جميع أنحاء العالم بموجب ترخيص وصول مفتوح. لا يلزم الحصول على إذن خاص لإعادة استخدام كل أو جزء من المقالة المنشورة بواسطة MDPI ، بما في ذلك الأشكال والجداول. بالنسبة للمقالات المنشورة بموجب ترخيص Creative Common CC BY ذي الوصول المفتوح ، يمكن إعادة استخدام أي جزء من المقالة دون إذن بشرط الاستشهاد بالمقال الأصلي بوضوح.

تمثل الأوراق الرئيسية أكثر الأبحاث تقدمًا مع إمكانات كبيرة للتأثير الكبير في هذا المجال. يتم تقديم الأوراق الرئيسية بناءً على دعوة فردية أو توصية من قبل المحررين العلميين وتخضع لمراجعة الأقران قبل النشر.

يمكن أن تكون ورقة الميزات إما مقالة بحثية أصلية ، أو دراسة بحثية جديدة جوهرية غالبًا ما تتضمن العديد من التقنيات أو المناهج ، أو ورقة مراجعة شاملة مع تحديثات موجزة ودقيقة عن آخر التقدم في المجال الذي يراجع بشكل منهجي التطورات الأكثر إثارة في العلم. المؤلفات. يوفر هذا النوع من الأوراق نظرة عامة على الاتجاهات المستقبلية للبحث أو التطبيقات الممكنة.

تستند مقالات اختيار المحرر على توصيات المحررين العلميين لمجلات MDPI من جميع أنحاء العالم. يختار المحررون عددًا صغيرًا من المقالات المنشورة مؤخرًا في المجلة ويعتقدون أنها ستكون مثيرة للاهتمام بشكل خاص للمؤلفين أو مهمة في هذا المجال. الهدف هو تقديم لمحة سريعة عن بعض الأعمال الأكثر إثارة المنشورة في مجالات البحث المختلفة بالمجلة.


مقدمة

الطرد المركزي التفاضلي هو تقنية مستخدمة على نطاق واسع لعزل وتنقية الكائنات البيولوجية المختلفة ، مثل الفيروسات والخلايا والعضيات تحت الخلوية والبروتينات والأحماض النووية التي تذوب أو تشتت في المذيبات ذات الصلة بيولوجيًا 1. يسبب الطرد المركزي جزيئات أثقل من مذيب الرواسب. يحتوي المحلول الأصلي عادةً على خليط متعدد المكونات من الجسيمات التي تختلف في الأحجام والكثافة وبالتالي أيضًا في معدلات الترسيب. تحاول تقنية الطرد المركزي التفاضلية ترسيب مكونات الفائدة بشكل انتقائي ، وتحسين البروتوكول لعدة جولات من الطرد المركزي.

يتكون الطرد المركزي التفاضلي من خطوات طرد مركزي متتالية مع زيادة قوى الطرد المركزي وفترات ، تهدف بشكل عام إلى عزل الأجسام الصغيرة عن الأجسام الأكبر. الجسيمات الأكبر حجمًا ، المخصصة لإزالتها في خطوات الطرد المركزي الأولى ، تترسب بشكل أسرع وتترك معظم الجسيمات الأصغر في المادة الطافية. سيتم طرد الطاف في الخطوات اللاحقة. ومع ذلك ، نظرًا لأن التوزيع الأولي لجميع الجسيمات داخل أنبوب الطرد المركزي متجانس ، فإن نسبة من الجسيمات الصغيرة المستهدفة تتراكم حتماً في الرواسب ويمكن أن تُفقد في الحبيبات المسحوبة للجسيمات الكبيرة. قد تنتهي الجسيمات الصغيرة التي تبدأ هجرتها في مواقع قريبة من الحبيبات في وقت واحد مع جزيئات أكبر تعبر مسافات أطول. يعمل الطرد المركزي التفاضلي بشكل جيد فقط عندما تختلف معاملات الترسيب للجسيمات المراد تمييزها اختلافًا كبيرًا (حسب الحجم) ويكون أقل نجاحًا عند ملاحظة اختلافات صغيرة فقط في معدلات الترسيب 2.

يعتبر التحليل النظري للطرد المركزي التفاضلي أن الجسيمات ترسب بشكل مستقل عن بعضها البعض. لذلك ، فإن النظرية مطابقة بشكل أساسي لتلك التي طورها الرواد 3،4 من التنبيذ التحليلي الفائق. ومع ذلك ، تظهر مشاكل محددة للطرد المركزي في الممارسات الحديثة الشائعة إلى حد ما باستخدام دوارات "الزاوية الثابتة" (التي كانت تسمى سابقًا "زاوية الرأس"). المحاولات المبكرة للوصف النظري لهذه الحالة 5،6 لم تنجح. بالعودة إلى هذا السؤال ، نقترح الآن وصفًا مناسبًا.

أحد المجالات سريعة النمو التي تطبق الطرد المركزي التفاضلي هو بحث الحويصلات خارج الخلية (EV). من المعروف أن الخلايا تفرز عددًا من الحويصلات الغشائية متباينة حسب أحجامها ومحتواها الجزيئي وآليات تكوينها 7،8،9،10،11،12 ، اعتمادًا على نوع الخلايا وحالتها الحالية. عادة ما يتم تمييز ثلاثة مجموعات رئيسية من EV: أجسام موت الخلايا المبرمج ، والحويصلات المتساقطة والإكسوسومات 9،10. تتكون أجسام موت الخلايا المبرمج ، وهي أكبر الحويصلات المعروفة التي يبلغ قطرها 800-5000 نانومتر ، من مكونات غشاء هيولي وبلازما لخلايا ما بعد موت الخلايا المبرمج. يتم إطلاق الحويصلات والإكسوسومات المتساقطة بواسطة الخلايا غير المبرمجة. تتولد الحويصلات المتساقطة ، التي يشار إليها أيضًا باسم "الجسيمات الخارجية" أو أحيانًا "الحويصلات الدقيقة" ، عن طريق نزيف غشاء البلازما ويعتقد أنها تغطي نطاقًا واسعًا من الأحجام (50-1000 نانومتر). ومع ذلك ، وفقًا للملاحظات الحديثة ، قد يكون نطاق أحجامها أضيق بكثير ، على الأقل بالنسبة لأنظمة مختارة 13 ، 14. Exosomes هي مجموعة الحويصلات الصغيرة (40-100 نانومتر) ذات الأصل الداخلي. تحتوي كل من exosomes والحويصلات المتساقطة على مجموعات محددة من البروتينات ، RNAs ، وكما تم وصفه مؤخرًا ، dsDNA ويتم التعرف عليها عمومًا كعوامل للتواصل بين الخلايا 16،17. توجد هذه الحويصلات في مزارع الخلايا وفي سوائل الجسم الطبيعية - في الدم واللعاب والبول وحليب الثدي.

الخلايا من نوع واحد تطلق كل من exosomes والحويصلات المتساقطة وبالتالي ، يتم إثراء البيئة خارج الخلية بأنواع مختلفة من الحويصلات خارج الخلية 9،10. حتى عندما تتشكل من نوع الخلية المتطابق ، فإن فئات مختلفة من الحويصلات تتميز بمظهر أحماض نووية مميزة 18. ومع ذلك ، لا يزال التنميط الشامل للإكسوسومات يمثل تحديًا لأنه لا يوجد نهج موثوق متاح للحصول على مجموعات نقية من exosomes ذات عائد مرتفع بدرجة كافية.

تجتذب Exosomes اهتمامًا بحثيًا هائلاً لأنها واعدة في تطبيقات طبية مهمة 19. قد تعمل Exosomes كأدوات تشخيصية 20،21،22 لأنها حاملة للواسمات الجزيئية للعديد من الأمراض 20،23،24 ، بما في ذلك السرطان 25،26 وكنظام تسليم محتمل للعديد من العوامل العلاجية 22،27،28،29.

الطريقة الأكثر استخدامًا لعزل الإكسوسوم هي الطرد المركزي التفاضلي 9،30،31. تهدف الجولات المتعاقبة من الطرد المركزي إلى تكوير أجسام موت الخلايا المبرمج وحطام الخلية وحويصلات التساقط والإكسوسومات على التوالي. ومع ذلك ، نظرًا للتشابه بين خصائص الترسيب لأنواع مختلفة من الحويصلات خارج الخلية ، غالبًا ما يُظهر الطرد المركزي التفاضلي المطبق على عزل exosome نتائج غير مرضية ، مما يوفر عوائد منخفضة نسبيًا 32 ونقاء غير كافٍ من السكان الخارجيين 33،34،35. علاوة على ذلك ، يتم تطبيق بروتوكولات الطرد المركزي المتطابقة بشكل شائع مع دوارات مختلفة وبدون احتساب الاختلافات في لزوجة المحاليل 36 ، مما يؤدي غالبًا إلى اختلاف البيانات التي تم الحصول عليها من قبل مجموعات البحث المختلفة. والجدير بالذكر أن عدم التجانس هذا هو المسؤول على الأرجح عن الاختلافات في النسب المبلغ عنها من exosomes والحويصلات المتساقطة.

في هذه الدراسة ، نقوم نظريًا بتحليل ترسيب الحويصلات من خلال تقنية الطرد المركزي التفاضلي باستخدام أنواع مختلفة من الدوارات. تأخذ النظرية في الاعتبار المعلمات الهندسية للدوار وسرعة الدوران ومدة الطرد المركزي ولزوجة المحلول وتسمح بتقييم نسبة الحويصلات ذات الأحجام والكثافة المحددة. يمكن اختيار بروتوكول الطرد المركزي التفاضلي "الفردي" ، المناسب للعضو الدوار المستخدم ، من خلال تقديرات نظرية بسيطة نسبيًا.


تجزئة بالطرد المركزي التفاضلي

لتجانس خلية نموذجية ، 10 دقيقة. يؤدي الدوران بسرعة منخفضة (400-500 × جم) إلى إنتاج بيليه يتكون من أنسجة غير مكسورة وخلايا كاملة ونواة خلوية وحطام كبير. تسمى الحبيبات منخفضة السرعة تقليديا بـ بيليه نووي. 10 دقائق. تدور بسرعة معتدلة ، مما ينتج عنه قوى من 10000 إلى 20000 × جم يؤدي إلى انخفاض الميتوكوندريا جنبًا إلى جنب مع الجسيمات الحالة والبيروكسيسومات. لذلك تسمى الحبيبة الثانية في مخطط تجزئة الخلية التقليدي بـ بيليه الميتوكوندريا.

يتطلب المزيد من تجزئة الخلايا بواسطة الطرد المركزي التفاضلي استخدام جهاز طرد مركزي فائق. تم تصميم هذه الأداة لتدوير الدوارات بسرعات زاوية عالية لتوليد قوى g عالية جدًا. يجب ضخ الهواء خارج الغرفة لتجنب تراكم الحرارة بسبب احتكاك الهواء. في الواقع ، فإن العديد من الدوارات المصممة لأجهزة الطرد المركزي الفائقة لا يتم بناؤها حتى بشكل ديناميكي هوائي ، حيث يتم تدويرها في فراغ. ينتج عن تشغيل جهاز طرد مركزي فائق السرعة لمدة ساعة واحدة والذي يولد قوة تصل إلى 80.000 x g حبيبات ميكروسومال. تشتمل الميكروسومات على أجزاء من الغشاء ، بما في ذلك غشاء الخلية والشبكة الإندوبلازمية. تشكل شظايا الغشاء حويصلات عندما تتعطل في وسط مائي ، لذلك يكشف الفحص عن العديد من الحويصلات الغشائية ذات الأحجام المختلفة. يمكن فصل الحويصلات نفسها على أساس الكثافة ، بسبب اختلاف محتوى البروتين. لكن هذا موضوع لوثيقة أخرى.

تدور لعدة ساعات عند 150000 × جم أو نحو ذلك ، ويمكنك التخلص من الريبوسومات وحتى أكبر الجزيئات الكبيرة. يتكون الطاف المتبقي من مكونات قابلة للذوبان في السيتوبلازم ، بما في ذلك الأملاح والجزيئات الكبيرة الصغيرة وجزيئات السلائف والغازات المذابة.


الطرد المركزي للحمض النووي في الماء - علم الأحياء

تنبذ فائق الكثافة التدرج التحضيري للحمض النووي
(SM Carr & amp OM Griffiths.1987. Biochem Genet 25:385-390)

تحت قوة الطرد المركزي العالية ، محلول كلوريد السيزيوم (CsCl) الجزيئات الثقيلة سي اس + ستُجبر الذرات على الابتعاد عن المركز باتجاه الطرف الخارجي للأنبوب ، لكنها في نفس الوقت منتشر مرة أخرى نحو قمة الأنبوب ، مما يشكل تدرج كثافة ضحل. الحمض النووي ستنتقل الجزيئات الموضوعة في هذا التدرج إلى النقطة التي يكون فيها لها نفس كثافة التدرج ( طفو محايد أو نقطة متساوية). التدرج كافٍ لفصل أنواع الحمض النووي مع اختلافات طفيفة في الكثافة بسبب الاختلاف [G + C] المحتوى ، أو الشكل المادي (على سبيل المثالخطي عكس جزيئات دائرية).

في التجربة أعلاه ، بعد الطرد المركزي لمدة 10 ساعات في 100000 دورة في الدقيقة (450.000 س ز) ، شريطين متميزين ، يتوافقان مع المنفصمة الحمض النووي الخطي أعلاه و DNA الميتوكوندريا الدائري أدناه ، مرئية تحت الضوء فوق البنفسجي. ال الحمض النووي تم خلطه مع بروميد إيثيديوم الصبغ المقحم ، مما يعزز اختلاف الكثافة بين الشكلين ويسبب تألق الحمض النووي. يتم جمع الأشرطة المنفصلة عن طريق ثقب ثقب في قاع الأنبوب. يتوفر mtDNA السليم لمزيد من التحليل البيولوجي.


الطرد المركزي لجزيئات البروتين النووي الريبي النووي لأجنة قنفذ البحر في كبريتات السيزيوم

مشاهدات المقالات هي مجموع تنزيلات النصوص الكاملة للمقالات المتوافقة مع COUNTER منذ نوفمبر 2008 (بتنسيق PDF و HTML) عبر جميع المؤسسات والأفراد. يتم تحديث هذه المقاييس بانتظام لتعكس الاستخدام حتى الأيام القليلة الماضية.

الاقتباسات هي عدد المقالات الأخرى المقتبسة من هذه المقالة ، ويتم حسابها بواسطة Crossref ويتم تحديثها يوميًا. العثور على مزيد من المعلومات حول عدد الاقتباسات Crossref.

درجة الانتباه Altmetric هي مقياس كمي للانتباه الذي تلقته مقالة بحثية عبر الإنترنت. سيؤدي النقر فوق رمز الكعكة إلى تحميل صفحة على altmetric.com تحتوي على تفاصيل إضافية حول النتيجة ووجود وسائل التواصل الاجتماعي للمقالة المحددة. يمكنك العثور على مزيد من المعلومات حول "نقاط الانتباه البديلة" وكيفية احتساب النتيجة.

ملحوظة: بدلاً من الملخص ، هذه هي الصفحة الأولى للمقالة.


أنواع الطرد المركزي

  1. التكوير التفاضلي (الطرد المركزي التفاضلي)
  • إنه النوع الأكثر شيوعًا من أجهزة الطرد المركزي المستخدمة.
  • يتم تجانس الأنسجة مثل الكبد عند 32 درجة في محلول السكروز الذي يحتوي على عازلة.
  • ثم يتم وضع المتجانسة في جهاز طرد مركزي ويتم تدويرها بقوة طرد مركزي ثابتة عند درجة حرارة ثابتة.
  • بعد مرور بعض الوقت ، تتكون رواسب في قاع جهاز طرد مركزي يسمى بيليه ومحلول مغطى يسمى طاف.
  • ثم يتم وضع المحلول المغطى في أنبوب طرد مركزي آخر يتم تدويره بعد ذلك بسرعات أعلى في خطوات التقدم.
  1. الطرد المركزي المتدرج الكثافة
  • يستخدم هذا النوع من الطرد المركزي بشكل أساسي لتنقية الفيروسات والريبوزومات والأغشية وما إلى ذلك.
  • يتم إنشاء تدرج كثافة السكروز عن طريق تراكب تركيزات منخفضة من السكروز بلطف على تركيزات أعلى في أنابيب أجهزة الطرد المركزي
  • يتم وضع الجسيمات موضع الاهتمام فوق التدرج وجهاز الطرد المركزي في أجهزة الطرد المركزي الفائقة.
  • تنتقل الجسيمات عبر التدرج اللوني حتى تصل إلى النقطة التي تتطابق فيها كثافتها مع كثافة السكروز المحيطة.
  • يتم إزالة الكسر وتحليله.
  1. معدل-كثافة-متدرجة الطرد المركزي
  • يُعرف الطرد المركزي النطاقي أيضًا باسم الطرد المركزي النطاقي أو التدرج
  • يعتمد على مفهوم معامل الترسيب (أي حركة الرواسب عبر الوسط السائل)
  • في هذه التقنية ، يتم إنشاء تدرج كثافة في أنبوب اختبار يحتوي على سكروز وكثافة عالية في الأسفل.
  • توضع عينة البروتين فوق التدرج اللوني ثم يتم طردها بالطرد المركزي.
  • مع الطرد المركزي ، تتحرك جزيئات الترسيب الأسرع في العينة قبل الجسيمات الأبطأ ، أي العينة مفصولة كمناطق في التدرج.
  • يتم جمع رواسب البروتين وفقًا لمعامل الترسيب ويتم جمع الكسور عن طريق إنشاء ثقب في قاع الأنبوب.
  1. الطرد المركزي Isopynic
  • يتم تحميل العينة في الأنبوب بمحلول تشكيل التدرج (أعلى أو أسفل التدرج اللوني المُشكل مسبقًا ، أو مختلطًا مع التدرج الذاتي التكوين)
  • يتم توزيع محلول العينة البيولوجية وملح السيزيوم بشكل موحد في أنبوب طرد مركزي ويتم تدويره في جهاز طرد مركزي فائق.
  • تحت تأثير قوة الطرد المركزي ، يتم إعادة توزيع أملاح السيزيوم لتشكيل تدرج كثافة من الأعلى إلى الأسفل.
  • تتحرك الجسيمات إلى النقطة حيث تساوي كثافتها الطافية ذلك الجزء من التدرج وتشكل العصابات. هذا يعني أن جزيئات العينة تنتقل إلى المنطقة التي تساوي فيها كثافتها كثافة التدرج.
  • إنه إجراء توازن "حقيقي" لأنه يعتمد على كثافات الكائنات الحية ، وليس على السرعات

على سبيل المثال: تدرجات CsCl و NaI للجزيئات الكبيرة والنيوكليوتيدات - تدرجات "ذاتية التكوين" تحت قوة الطرد المركزي.


3 خطوات رئيسية متضمنة في استخلاص الحمض النووي

في البداية ، كان عزل الحمض النووي عملية طويلة وصعبة ومختلة مع كميات كبيرة من كولون الحمض النووي ومختلطة. يتطلب استخراج الحمض النووي من النباتات والحيوانات والبكتيريا أن يتم تحرير الأكياس الخلوية وتحويلها إلى محلول. نظرًا لأن البكتيريا أحادية الخلية ولا تحتوي على عظام أو دهون أو غضروف وما إلى ذلك ، فمن السهل نسبيًا استخراج الحمض النووي.

على النقيض من ذلك ، يجب في كثير من الأحيان طحن العينات المأخوذة من ani & shymals والنباتات إلى أجزاء صغيرة قبل المتابعة. نظرًا لأن الخلايا النباتية لها جدران خلوية صلبة جدًا ، يجب على الباحث كسر الخلايا ميكانيكيًا في الخلاط ، أو إضافة إنزيمات تحلل خاصة لهضم مكونات جدار الخلية.

وبالمثل ، لاستخراج الحمض النووي من ذيل الفأر ، تتم إضافة الإنزيمات لتحطيم الأنسجة الموصلة والخاملة وتشتيت الخلايا. أسهل طريقة للحصول على الحمض النووي إلى حد بعيد هي استخراجه من البكتيريا. ستوفر بضع قطرات من مزرعة بكتيرية الكثير من الحمض النووي لمعظم الأغراض. أولاً ، يتم هضم جدار الخلية البكتيرية بسهولة بواسطة الليزوزيم ، وهو إنزيم يحط من طبقة الببتيدوغليكان لجدار الخلية.

علاج ناجح وخالي من المنظفات يذيب الدهون في غشاء الخلية. تُستخدم أيضًا عوامل مخلبية ، مثل EDTA (Ethylene Diamine Tetra acetate) ، خاصة مع البكتيريا سالبة الجرام ، لإزالة أيونات المعادن التي تربط مكونات الميم الخارجي والشيبرين معًا. في جميع هذه العينات ، يتم بعد ذلك تحرير محتويات السليل والشيلي ، بما في ذلك الحمض النووي ، إلى محلول ويتم تنقيتها بواسطة سلسلة خطوات من الفراء والشيثر.

استخراج الحمض النووي: الخطوة 2.

تنقية الحمض النووي:

يتم استخدام نوعين عامين من الإجراءات لتنقية الحمض النووي:

مبدأ الطرد المركزي هو كما يلي:

يتم غزل العينة بسرعة عالية وتؤدي قوة الطرد المركزي والطرد المركزي إلى ترسب المؤلفات الأكبر أو الأثقل في قاع الأنبوب. على سبيل المثال ، تدمير الجدار الخلوي للبكتيريا والشيريا بواسطة الليزوزيم والمنظفات يترك محلولًا يحتوي على أجزاء صغيرة من جدار الخلية والحمض النووي. عندما يتم الطرد المركزي للعينة ، يتم ترسيب الحمض النووي وبعض المكونات الكبيرة الأخرى في بوت وغلاف الأنبوب.

شظايا جدار الخلية ، إلى & خجول مع العديد من المكونات الأخرى القابلة للذوبان ، تبقى في المحلول ويتم التخلص منها. ثم تتم إعادة إذابة الحمض النووي المترسب في محلول منظم مناسب. لا يزال يحتوي على الكثير من البروتين والحمض النووي الريبي مختلطًا به.

يتم إزالتها بشكل عام بالوسائل الكيميائية. خطوة واحدة تستخدم في العديد من تنقية الحمض النووي هي استخلاص الفينول والسينول. الفينول ، المعروف أيضًا باسم حامض الشيبوليك وحمض السيارات ، مادة أكالة للغاية وخجولة للغاية لأنها تذوب وتفسد البروتينات التي تشكل 60 إلى 70 في المائة من جميع المواد الحية. وبالتالي ، يمكن استخدام الفينول لإذابة وإزالة جميع البروتينات من عينة من الحمض النووي.

عند إضافة الفينول إلى الماء ، لا يختلط السائلين لتكوين محلول واحد بدلاً من ذلك ، يشكل الفينول الأكثر كثافة طبقة منفصلة تحت الماء. عند الاهتزاز ، تختلط الطبقتان مؤقتًا ، وتذوب البروتينات في الفينول.

عندما يتوقف الاهتزاز والخجل ، ينفصل محلول الحمض النووي والبروتينات المحتوية على الفينول إلى طبقتين (الشكل 3.1). لضمان عدم احتباس الفينول مع الحمض النووي ، يتم طرد العينة لفترة وجيزة. ثم يتم امتصاص الماء الذي يحتوي على DNA و RNA وحفظه. بشكل عام ، يتم إجراء العديد من عمليات استخراج الفينول الناجحة والخطيرة لتنقية البروتينات من الحمض النووي.

تم تطوير مجموعة متنوعة من التقنيات الحديثة التي تتجنب استخراج الفينول. تتضمن معظم هذه العناصر تنقية الحمض النووي عن طريق تمريره عبر عمود يحتوي على راتنج يربط الحمض النووي وليس مكونات الخلية الأخرى.

التكنولوجيا واللامعة في هذا الصدد من نوعين التاليين

1. تقارب اللوني:

هذا يستخدم راتنجات السيليكا. ترتبط راتنجات السيليكا بالتيار المتردد النووي والخجول بسرعة وبشكل خاص عند درجة الحموضة المنخفضة وتركيزات الملح العالية. يتم إطلاق الأحماض النووية عند درجة حموضة أعلى وتركيز ملح منخفض.

2. كروماتوغرافيا التبادل الأيوني:

راتنجات التبادل والشيون ، مثل ثنائي إيثيل أمينو-إيثيل-سليلوز ، مشحونة بشكل إيجابي وتربط الحمض النووي عبر مجموعات الفوس والشيبات سالبة الشحنة. في هذه الحالة ، يحدث الارتباط عند تركيزات منخفضة من الملح ويتم التخلص من الأحماض النووية بتركيزات عالية من الملح ، مما يؤدي إلى تعطيل الترابط الأيوني.

استخراج الحمض النووي: الخطوه 3.

إزالة الحمض النووي الريبي غير المرغوب فيه:

تقوم إنزيمات خاصة بإزالة الحمض النووي الريبي الملوث من عينة الحمض النووي. يقوم clease الشريط الإنزيمي بتحطيم الحمض النووي الريبي إلى قليل النوى وشيتيدات قصير ولكنه يترك جزيء الحمض النووي العملاق دون تغيير. يتم أولاً تحضين خليط من الحمض النووي والحمض النووي الريبي مع نوكلياز الريبون في درجة الحرارة المثلى ودرجة حرارة الشيمال لنشاط الإنزيم.

بعد ذلك ، يتم إضافة كمية متساوية من الكحول. يترسب الكحول جزيئات كبيرة ، بما في ذلك سلاسل طويلة من الحمض النووي ، خارج المحلول. ومع ذلك ، تظل شظايا الحمض النووي الريبي الصغيرة ذائبة.

وتجدر الإشارة إلى أن العلاج بالكحول ليس محددًا للغاية وسيؤدي إلى ترسيب معظم الكربوهيدرات الكبيرة والعديد من البروتينات وكذلك الجزيئات الكبيرة السليمة لكل من DNA و RNA. وبالتالي ، لا يمكن استخدام ترسيب الكحول إلا بعد إزالة هذه المكونات من الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي واستخراج الفينول.

بعد ذلك ، يتم ترسيب الحمض النووي في قاع الأنبوب عن طريق الطرد المركزي ، ويتم التخلص من المحلول الطاف الذي يحتوي على شظايا وخجول الحمض النووي الريبي (الشكل 3.2). غالبًا ما تكون الحبيبة الصغيرة من الحمض النووي المتروكة في قاع الأنبوب غير مرئية. ومع ذلك ، فإنه يحتوي على bil & shylions من جزيئات الحمض النووي ، وهو ما يكفي لمعظم التحقيقات.


رابعا. فئات الدوار

  • تحقق من صفحات دليل المنتج أو عبوات الأنبوب للحصول على ملاحظات حول حجم العينة الموصى به والسرعة القصوى.
  • قم دائمًا بتشغيل أنابيب رقيقة الجدران محكمة الغلق ممتلئة بزاوية ثابتة أو دوار رأسي.
    أمثلة:
    - أنبوب علوي مفتوح مع مجموعة إحكام متعددة
    - إعادة إحكام إغلاق الأنابيب
    - Ultracrimp & # 174 and Clearcrimp & # 174 Tubes
  • أنابيب الأوتوكلاف فقط عند الضرورة القصوى وفقط عند 121 & # 176 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  • تجنب تنظيف الأنابيب البلاستيكية في غسالات الأطباق الآلية أو غسالات الأواني الزجاجية ، والتي قد تنتج درجات حرارة شديدة الارتفاع.
  • نوصي بتنظيف الأنابيب باستخدام منظف مختبري معتدل في ماء دافئ وشطفها وتجفيفها في الهواء الرقيق.
  • يجب مطابقة الأنبوب بعناية مع نوع الدوار لمنع فقد العينة و / أو الفشل كما هو موضح في الجدول 5 أدناه.

حالات كبسولات فج T3 / T7: الطرد المركزي بكثافة الطفو والتبريد EM

تحتوي عاثيات الحمض النووي الناضجة مزدوجة السلسلة على قفيصة ذات أصداف متناظرة تقاوم عادةً الاضطراب ، كما يجب عليها البقاء على قيد الحياة في البرية. ومع ذلك ، فإن المرونة والديناميكية المرتبطة بها تساعد في الوظيفة. نحن نصف الإجراءات الموجهة للكيمياء الحيوية المستخدمة لإيجاد مرونة غامضة سابقًا لكبسولات العاثيات ذات الصلة ، T3 و T7. الإجراءات الأولية هي تنبيذ فائق الكثافة قائم على الترطيب وتنقية مجهرية إلكترونية تعتمد على الجسيمات (cryo-EM). نقوم بمراجعة الطرد المركزي بكثافة الطفو بالتفصيل. الكبسولة الناضجة والمستقرة T3 / T7 عبارة عن منتج تحويل مشتق من المرونة من مادة procapsid المجمعة في البداية (capsid I). أثناء تغليف الحمض النووي ، يتوسع كابسيد I ويفقد بروتين سقالة ليشكل كابسيد II. فيما يلي الملاحظات التي تم إجراؤها باستخدام capsid II. (1) تولد عبوة الحمض النووي في الجسم الحي من النوع البري T3 الكبسولة الثانية التي لديها تمدد مفرط طفيف (1.4٪) مكتشف بالتبريد EM بالنسبة إلى قفيصة الملتهمة الناضجة. (2) تولد عبوات الحمض النووي في بعض الظروف المتغيرة تمددًا مفرطًا أكثر شمولاً للقفيصة الثانية ، والتي تم اكتشافها في البداية عن طريق الطرد المركزي القائم على الترطيب بكثافة الطفو التحضيري في تدرجات كثافة Nycodenz. (3) يحدث تقلص الكبسيد أحيانًا ، على سبيل المثال ، أثناء التسرب الكمي للحمض النووي من قفيصة T3 الناضجة بدون ذيل.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


شاهد الفيديو: Centrifugation. Separation Methods. Physics (قد 2022).


تعليقات:

  1. Freowine

    أجدك تعترف بالخطأ. سوف نفحص هذا.

  2. Noah

    يبدو أنه مغري تمامًا

  3. Vudotaur

    Igor Zhzhot))) وليس أنت الذي أشعل النار عن طريق الخطأ إلى المنزل هناك ؟؟

  4. Alcides

    ليس موضوع سيء



اكتب رسالة