معلومة

F3. ارتباط الهيدروجين - علم الأحياء

F3. ارتباط الهيدروجين - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

اقترح Linus Pauling أولاً أن روابط H (بين الماء والبروتين وداخل البروتين نفسه) ستلعب دورًا مهيمنًا في طي البروتين واستقراره. تذكر جميع روابط intrachain H في اللولب؟ هل هم بشكل جماعي أكثر استقرارًا من روابط H بين الماء والببتيد في ملف (عشوائي)؟

عند التفكير في الدراسات التوافقية التي تتضمن ببتيدات صغيرة ، من المفيد تطبيق مبدأ Le Chatelier على التوازن أدناه:

ملف عشوائي ( rightleftharpoons ) الحلزون

أي شيء مضطرب (جزيئات صغيرة ، مذيب ، إلخ) من شأنه أن يتفاعل بشكل تفضيلي مع الشكل الحلزوني سيدفع التوازن إلى الشكل الحلزوني.

افترضت النماذج المبكرة أن روابط H داخل السلسلة كانت أكثر ملاءمة (بشكل حراري) من روابط H بين الببتيد والماء. ولكن لتكوين رابطة هيدروجينية يتطلب استرداد إنتروبيا لأن اللولب مرتب (إنتروبيا أقل) من الملف العشوائي (إنتروبيا أعلى). في درجات الحرارة المنخفضة ، يسود المحتوى الحراري ويفضل تكوين الحلزون في المحلول. عند درجة حرارة عالية ، يكون اللولب مستاءً من الانتروبيا. تخيل حالات الاهتزاز والدوران المتزايدة المسموح بها للذرات عند درجات حرارة أعلى. (تذكر التغييرات التوافقية العابرة إلى غوش في سلاسل أسيل من الأمفيفيلات ذات السلسلة المزدوجة مع زيادة درجة الحرارة ، مما يؤدي إلى الانتقال من مرحلة الهلام إلى الطور البلوري السائل في الحويصلات ثنائية الطبقة.) وتتنبأ الدراسات النظرية حول انتقالات الملف الحلزوني بما يلي:

  • مع زيادة طول السلسلة ، يصبح اللولب أكثر استقرارًا ؛
  • تؤدي زيادة الشحنة على الجزيء إلى زعزعة استقرار اللولب ، نظرًا لأن الملف ، مقارنةً باللولب الأكثر إحكاما ، يكون له كثافة شحن أقل ؛
  • المذيبات التي تفرز الأكسجين الكربوني (مثل حمض الفورميك) تزعزع استقرار اللولب ؛ و
  • تتنافس المذيبات التي تشكل روابط H قوية مع الببتيد وتزعزع استقرار اللولب. في المقابل ، تعمل المذيبات مثل CHCl3 و dimethylformamide (مذيب غير بروتي) على استقرار اللولب. وبالمثل ، فإن 2-كلورو إيثانول وثلاثي فلورو إيثانول ، اللذان لا يشكلان أي روابط H مع الببتيد أو أضعف من الماء ، يعملان على استقرار اللولب. (في حالة ثلاثي فلورو إيثانول ، أظهرت محاكاة الديناميكيات الجزيئية أن TFE يتفاعل بشكل تفضيلي مع (يذوب) الببتيد ، والذي يثبط روابط H من العمود الفقري للببتيد إلى الماء ، مما يؤدي إلى استقرار روابط H داخل الخلية.

تشير دراسات الملف الحلزوني هذه إلى أن روابط H مهمة في استقرار البروتين.

لكن هل هم حقا؟ لماذا يجب أن تختلف روابط H هذه عن تلك الموجودة في الماء؟ من الصعب معرفة ما إذا كانت موجودة نظرًا لوجود العديد من روابط H المحتملة (بين البروتين والماء والماء والماء والبروتين والبروتين) ، وتعتمد قوتها على اتجاهها وثابت العزل الكهربائي للوسط الذي تكون فيه تقع.

إذا كانت روابط السلسلة H داخل البروتين لا تختلف كثيرًا في الطاقة عن روابط H بين الجزيئات بين البروتين والماء ، وبالنظر إلى أن البروتينات مستقرة بشكل هامشي في درجات الحرارة الفسيولوجية ، فإن ذلك يعني أن الحالة المطوية يجب أن تحتوي على نفس عدد الروابط الهيدروجينية داخل الجزيئية داخل البروتين باعتباره روابط H بين الجزيئات الممكنة بين البروتين والماء ، وإلا فإن البروتين سيتكشف.

لحل هذه المشكلة ، وتحديد القوة النسبية للروابط H بين المتبرعين والمقبلين المحتملين المتنوعين ، تم إجراء العديد من الدراسات لمقارنة طاقة روابط H بين الجزيئات الصغيرة في الماء مع طاقة روابط H بين نفس الجزيئات الصغيرة ولكن في مذيب غير قطبي. يذهب المنطق على هذا النحو. إذا كان الجزء الداخلي من البروتين غير قطبي أكثر من الماء (ثابت عازل أقل من الماء) ، فيمكن عندئذٍ تشكيل روابط داخل البروتين H في البروتين من خلال النظر إلى روابط H بين الجزيئات الصغيرة في المذيبات غير القطبية وطرح السؤال ، هل الطاقة الحرة التغيير للعملية التالية <0:

Dw + Aw ( rightleftharpoons ) (DA) n ، DGo ، K.

حيث D هو مانح لرابطة الهيدروجين (مثل NH) و A هو متقبل لرابطة الهيدروجين ، (مثل C = O) ، w هو الماء (أي المانح والمستقبل في الماء) ، و n مذيب غير قطبي ، و DGo و K هي التغير القياسي في الطاقة الحرة وثابت التوازن ، على التوالي ، لتكوين رابطة H في مذيب غير قطبي من متبرع ومستقبل في الماء. يحاكي هذا التفاعل مساهمات الرابطة H في طي البروتين ، حيث يتم محاكاة رابطة H المدفونة بواسطة رابطة H في مذيب غير قطبي. رد الفعل المكتوب أعلاه هو بالفعل تجربة فكرية ، حيث سيكون من الصعب تهيئة الظروف اللازمة لإجراء القياس. ومع ذلك ، يمكننا حساب DGo لهذا التفاعل لأنه دالة حالة ولا يهم حقًا كيف ينجز المرء هذه العملية.

لنفكر في مثال محدد: تكوين روابط H بين جزيئين من N-methylacetamide (NMA) في الماء وفي مذيب غير قطبي. يصف مخطط التفاعل الموضح أدناه مجموعة من التفاعلات (دورة ديناميكية حرارية) تتضمن تكوين ثنائيات مرتبطة بـ H لـ NMA. A و B كلاهما جزيئات NMA ، إما في الماء (w) أو مذيب غير قطبي (n).

N- ميثيل أسيتاميد هو تقليد جيد لمانحي رابطة H ومقبلي رابطة الببتيد لسلسلة بولي ببتيد.

في مخطط التفاعل الموضح أعلاه ،

K1 هو ثابت التوازن لثنائي NMA في وسط غير قطبي. يمكن تحديد ذلك بسهولة ، وهو> 1 ، مما يعني أن DGo <0. (تذكر ، DGo = -RTlnKeq) لتقليل NMA في CCl4 ، DGo1 = -2.4 كيلو كالوري / مول.

K2 هو ثابت التوازن (فكر في الأمر كمعامل تقسيم) لنقل جزيئين NMA من الماء إلى مذيب غير قطبي (يمكن قياسه بسهولة مرة أخرى). لنقل NMA من الماء إلى CCl ، DGo2 = + 6.12 kcal / mol.

K3 هو ثابت التوازن لثنائي NMA في الماء. يمكن تحديد ذلك بسهولة ، وهو <1 ، مما يعني أن DGo> 0. لتقليل NMA في الماء ، DGo3 = +3.1 كيلو كالوري / مول.

K4 هو ثابت التوازن (فكر في الأمر كمعامل تقسيم) لنقل ثنائي مرتبط بالهيدروجين لـ NMA من الماء إلى مذيب غير قطبي. تحاول التفكير في طريقة لقياس ذلك! لا استطيع. هذا هو المكان الذي تأتي فيه الدورات الديناميكية الحرارية بشكل جيد. ليس عليك قياسه. يمكنك حسابها من K1-3 لأن DGo هي وظيفة حالة!

[ Delta G ^ o_2 + Delta G ^ o_1 = Delta G ^ o_3 + Delta G ^ o_4 hspace {15px} textrm {or} hspace {15px} -RT ln K_2 + -RT ln K_1 = -RT ln K_3 + -RT ln K_4 ]

[ ln K_2 + ln K_1 = ln K_3 + ln K_4 = ln (K_2K_1) = ln (K_3K_4) hspace {15px} textrm {or} hspace {15px} (K_2K_1) = (K_3K_4 ) ]

لنقل NMA من الماء إلى CCl ، D Go4 = + 0.62 kcal / mol.

(ملاحظة: يحب علماء الكيمياء الحيوية التحدث عن الدورات الديناميكية الحرارية التي قد تبدو جديدة بالنسبة لك. ومع ذلك ، صدق أو لا تصدق ، لقد رأيتها من قبل - في الكيمياء العامة - في شكل قانون هيس!)

من K1-4 وقيم DGo المقابلة ، يمكننا الآن حساب DGo5 لتكوين ثنائيات NMA المرتبطة بـ H في مذيب غير قطبي من جزيئين من NMA (aq). هذا التفاعل ، الذي نأمل أن يحاكي تكوين روابط داخل سلسلة H مدفونة في البروتينات على طي البروتين ، هو :،

Dw + Aw ( rightleftharpoons ) (DA) n ، والتي DGo5 = +3.72 (أي غير مفضل).

إذا كان هذا النموذج محاكاة جيدة لدراسة تكوين رابطة H على طي البروتين ، فإنه يشير إلى أن تكوين روابط H المدفونة أثناء طي البروتين لا يؤدي إلى طي البروتين.

ومع ذلك ، إذا كان نقل D و A (من بروتين كبير) من الماء إلى الوسط غير القطبي (على غرار K2) مدفوعًا بقوى أخرى (مثل تأثير كاره للماء) ، فإن القيمة الإيجابية لـ K1 ستفضل بشدة رابطة H المدفونة تشكيل. لذلك ، إذا حدث هذا في البروتينات ، فمن الواضح سبب حدوث الكثير من روابط H داخل السلسلة ، حيث أن K1 مفضل للغاية. قد لا تساعد روابط H في انهيار البروتين ، ولكنها تفضل التنظيم الداخلي داخل بروتين مضغوط. وهذا يعني أن روابط H لا تؤدي إلى طي البروتين في حد ذاته ، ولكنها تتشكل بحيث لا يتم زعزعة استقرار البروتين المطوي بسبب عدد كبير جدًا من روابط H.

هناك مشاكل محتملة مع هذا النموذج البسيط. الجزء الداخلي من البروتين ليس متجانسًا (أي أن العازل الفعال داخل البروتين يختلف). قوة الرابطة H أيضًا حساسة جدًا للهندسة. أيضًا ، هناك العديد من روابط H داخل البروتين ، لذا فإن الأخطاء الطفيفة في تقدير قوة الرابطة H قد تؤدي إلى أخطاء كبيرة في تحديد استقرار البروتين.

هناك حجة أخرى ضد كون روابط H هي العامل المحدد في طي البروتين واستقراره تأتي من دراسات تغيير طبيعة المذيبات. إذا كانت روابط intrachain H مهمة جدًا ، ألا يجب على المذيبات التي يمكن أن ترتبط H بالعمود الفقري أن تفسد البروتين؟ ألا يجب أن يكون الماء (55 م) بمثابة مفسد للطبيعة؟ ومع ذلك ، فهي لا تفعل ذلك. لا يُتوقع أن يفسد الديوكسان (الحلقة الحلقية غير المتجانسة المكونة من 5 أعضاء مع O) الذي يحتوي على مستقبل رابطة H فقط طبيعة البروتينات ، ولكنه يفعل ذلك. تزداد روابط H أيضًا في المذيبات غير القطبية. يمكن تحفيز الببتيدات التي لها هياكل عشوائية في الماء لتكوين حلزونات عند وضعها في محاليل كحولية (ثلاثي فلورو إيثانول ، على سبيل المثال) ، والتي تكون غير قطبية أكثر من الماء ، كما هو موضح أعلاه في دراسات الملف الحلزوني. إذا كانت روابط H هي العامل المهيمن في استقرار البروتين ، فإن الكحوليات ستثبت البروتينات. في التركيزات المنخفضة من الكحول ، تتزعزع البروتينات.

وبالتالي ، بناءً على دراسات الجزيئات الصغيرة ودراسة البروتين في المذيبات المختلفة ، فمن غير المرجح أن تكون روابط H هي المثبتات الكبيرة لبنية البروتين. 11٪ فقط من كل C = O's و 12٪ من كل NH في البروتين ليس لها روابط H (يتم تحديدها من خلال تحليل الهياكل البلورية للأشعة السينية). من بين جميع روابط H بـ C = O ، 43٪ للمياه ، و 11٪ إلى السلاسل الجانبية ، و 46٪ للسلسلة الرئيسية NH's. من بين جميع روابط H بـ NH ، 21٪ منها للمياه ، و 11٪ إلى سلاسل جانبية ، و 68٪ للسلسلة الرئيسية C = O. سنرى لاحقًا ، مع ذلك ، أنه يتم التوصل إلى نتيجة معاكسة من الدراسات التي تستخدم الطفرات الخاصة بالموقع.


غير الكنسي FLT3 طفرة حارس البوابة تعطل ربط gilteritinib وتمنح المقاومة

إيلي تراير ، جامعة أوريغون للصحة والعلوم ، 3181 SW Sam Jackson Park Road ، KR-HEM ، بورتلاند ، أو 97239.

معهد نايت للسرطان ، جامعة أوريغون للصحة والعلوم ، بورتلاند ، أوريغون ، الولايات المتحدة الأمريكية

قسم علم وظائف الأعضاء وعلم الأدوية ، كلية الطب ، جامعة أوريغون للصحة والعلوم ، بورتلاند ، أوريغون ، الولايات المتحدة الأمريكية

قسم أمراض الدم والأورام الطبية ، قسم الطب ، جامعة أوريغون للصحة والعلوم ، بورتلاند ، أوريغون ، الولايات المتحدة الأمريكية

معهد نايت للسرطان ، جامعة أوريغون للصحة والعلوم ، بورتلاند ، أوريغون ، الولايات المتحدة الأمريكية

قسم أمراض الدم والأورام الطبية ، قسم الطب ، جامعة أوريغون للصحة والعلوم ، بورتلاند ، أوريغون ، الولايات المتحدة الأمريكية

قسم الخلية والتطور وبيولوجيا السرطان ، جامعة أوريغون للصحة والعلوم ، بورتلاند ، أوريغون ، الولايات المتحدة الأمريكية

معهد نايت للسرطان ، جامعة أوريغون للصحة والعلوم ، بورتلاند ، أوريغون ، الولايات المتحدة الأمريكية

قسم أمراض الدم والأورام الطبية ، قسم الطب ، جامعة أوريغون للصحة والعلوم ، بورتلاند ، أوريغون ، الولايات المتحدة الأمريكية

معهد نايت للسرطان ، جامعة أوريغون للصحة والعلوم ، بورتلاند ، أوريغون ، الولايات المتحدة الأمريكية

قسم المعلوماتية الحيوية والبيولوجيا الحاسوبية ، قسم المعلوماتية الطبية وعلم الأوبئة السريري ، جامعة أوريغون للصحة والعلوم ، بورتلاند ، أوريغون ، الولايات المتحدة الأمريكية

معهد نايت للسرطان ، جامعة أوريغون للصحة والعلوم ، بورتلاند ، أوريغون ، الولايات المتحدة الأمريكية

قسم أمراض الدم والأورام الطبية ، قسم الطب ، جامعة أوريغون للصحة والعلوم ، بورتلاند ، أوريغون ، الولايات المتحدة الأمريكية

معهد نايت للسرطان ، جامعة أوريغون للصحة والعلوم ، بورتلاند ، أوريغون ، الولايات المتحدة الأمريكية

قسم المعلوماتية الحيوية والبيولوجيا الحاسوبية ، قسم المعلوماتية الطبية وعلم الأوبئة السريري ، جامعة أوريغون للصحة والعلوم ، بورتلاند ، أوريغون ، الولايات المتحدة الأمريكية

معهد نايت للسرطان ، جامعة أوريغون للصحة والعلوم ، بورتلاند ، أوريغون ، الولايات المتحدة الأمريكية

قسم أمراض الدم والأورام الطبية ، قسم الطب ، جامعة أوريغون للصحة والعلوم ، بورتلاند ، أوريغون ، الولايات المتحدة الأمريكية

قسم الخلية والتطور وبيولوجيا السرطان ، جامعة أوريغون للصحة والعلوم ، بورتلاند ، أوريغون ، الولايات المتحدة الأمريكية

معهد نايت للسرطان ، جامعة أوريغون للصحة والعلوم ، بورتلاند ، أوريغون ، الولايات المتحدة الأمريكية

قسم أمراض الدم والأورام الطبية ، قسم الطب ، جامعة أوريغون للصحة والعلوم ، بورتلاند ، أوريغون ، الولايات المتحدة الأمريكية

قسم الخلية والتطور وبيولوجيا السرطان ، جامعة أوريغون للصحة والعلوم ، بورتلاند ، أوريغون ، الولايات المتحدة الأمريكية

إيلي تراير ، جامعة أوريغون للصحة والعلوم ، 3181 SW Sam Jackson Park Road ، KR-HEM ، بورتلاند ، أو 97239.

ابيضاض الدم النخاعي الحاد (AML) هو مرض غير متجانس وراثيًا مع ما يقرب من 20000 حالة جديدة سنويًا في الولايات المتحدة. 1 يتمتع مرضى AML ببقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات بنسبة & lt25٪ ، وتُبذل جهود مكثفة لتطوير علاجات جديدة لتحسين البقاء على قيد الحياة. 2 طفرات في FMS مثل التيروزين كيناز 3 (FLT3) الجين من بين الانحرافات الجينية الأكثر شيوعًا في AML. الازدواج الترادفي الداخلي (ITD) في مجال الأغشية المجاورة لـ FLT3 موجودة في حوالي 20٪ من مرضى AML. تسبب هذه الطفرات نشاط كيناز التكويني ، وتؤدي إلى زيادة خطر الانتكاس وتقليل البقاء على قيد الحياة. مجموعة أخرى من الطفرات في مجال التيروزين كيناز (TKD) FLT3 تحدث في 5-10٪ من مرضى AML وتؤدي أيضًا إلى تنشيط FLT3. 3

تم تطوير العديد من مثبطات FLT3 التيروزين كيناز ويمكن فصلها إلى فئتين. مثبطات النوع الأول هي منافسات ATP الأساسية التي تربط موقع ربط ATP لـ FLT3 في التشكل النشط وتكون فعالة ضد طفرات ITD و TKD. على النقيض من ذلك ، تربط مثبطات النوع الثاني المنطقة الكارهة للماء المجاورة لمجال ربط ATP في التشكل غير النشط. مثبطات النوع الثاني فعالة ضد FLT3-ITD ، ولكن لا تمنع FLT3طفرات -TKD. Quizartinib ، مثبط من النوع الثاني ، له نشاط قوي ضد FLT3 و KIT و RET. على الرغم من معدلات الاستجابة العالية كعلاج وحيد في المرضى الذين يعانون من AML الانتكاس / المقاوم للعلاج ، فإن مدة الاستجابة لـ quizartinib هي حوالي 4 أشهر ، والمقاومة عبر طفرات FLT3-TKD شائعة. 4 ، 5 تحدث هذه الطفرات بشكل متكرر في بقايا حلقة التنشيط D835 وأقل شيوعًا في F691 الذي يمثل موضع "حارس البوابة" في FLT3. 6

Gilteritinib هو مثبط من الجيل الثاني يستهدف FLT3 و AXL. 7 باعتباره مثبطًا من النوع الأول ، فهو فعال ضد طفرات TKD التي تنقل مقاومة quizartinib. تمت الموافقة عليه كعلاج وحيد في المرضى الذين يعانون من الانتكاس / الحراريات مع AML بناءً على الدراسة السريرية العشوائية للمرحلة الثالثة (ADMIRAL) التي قارنت gilteritinib مع العلاج الكيميائي. 8 على الرغم من الفائدة الكبيرة للبقاء على قيد الحياة في ذراع gilteritinib ، فإن العلاج الأحادي يكون محدودًا بسبب تطور المقاومة ، والتي تحدث عادةً بعد 6-7 أشهر. تحدث مقاومة gilteritinib بشكل شائع من خلال اكتساب / توسيع NRAS الطفرات ، ومع ذلك تم أيضًا تحديد أقلية من المرضى الذين يعانون من طفرات حارس البوابة F691L. 7 للبحث عن طفرات مقاومة إضافية لـ gilteritinib ، Tarver وآخرون. استخدم مقايسة الطفرات ENU الراسخة وحدد Y693C / N و G697S على أنهما طفرات تمنح المقاومة في المختبر. 5 يبدو أن هذه الطفرات تعمل بشكل مشابه لطفرة حارس البوابة عن طريق منع ارتباط gilteritinib بـ FLT3 ، ولكن لم يتم الإبلاغ عنها في المرضى.

للتحقيق على نطاق أوسع في آليات مقاومة gilteritinib ، قمنا بتطوير نموذج من خطوتين للمقاومة يلخص دور البيئة الدقيقة للنخاع (الشكل 1 أ). في المرحلة الأولى من المقاومة ، أو المقاومة المبكرة ، كان FLT3يتم استزراع خطوط خلايا AML المطفرة MOLM14 و MV411 باستخدام روابط خارجية وعامل نمو الخلايا الليفية 2 (FGF2) ورابط FLT3 (FL) ، والتي يتم توفيرها عادة بواسطة خلايا انسجة النخاع. تسمح ظروف الاستنبات هذه للخلايا بأن تصبح مقاومة لـ gilteritinib دون الحاجة إلى طفرات مقاومة. 11 عندما تتم إزالة الترابط ، تستعيد الخلايا حساسيتها تجاه gilteritinib ، لكنها في النهاية تصبح مقاومة ، وهو ما نطلق عليه المقاومة المتأخرة. في هذه المرحلة ، تم تحديد طفرات المقاومة الجوهرية في جميع الثقافات عبر تسلسل الإكسوم الكامل. على غرار البيانات السريرية ، وجدنا أن الطفرات الأكثر شيوعًا تنشط الطفرات في NRAS. 12 كانت هناك ثقافة مقاومة متأخرة FLT3 F691L طفرة حارس البوابة ، وثلاث ثقافات كان لها FLT3 طفرة N701K ، والتي لم يتم الإبلاغ عنها مسبقًا (الشكل 1 ب). نظرًا لقربها من F691L (الشكل 1C ، D) ، افترضنا أن هذه الطفرة قد تعطل أيضًا ارتباط gilteritinib بـ FLT3.

لتحديد ما إذا كان ملف FLT3 طفرة N701K لها قدرة على تكوين الأورام ، قمنا بتقييم هذه الطفرة في مقايسة التحول Ba / F3. تعتمد خلايا Ba / F3 عادةً على IL-3 ولكن وجود بعض الجينات المسرطنة يحولها إلى النمو إلى أجل غير مسمى في غياب IL-3. 13 FLT3 N701K طفرة مماثلة ل FLT3 ITD و FLT3 D835Y ، عبارة عن طفرة نشطة وتعزز نمو خلايا Ba / F3 في غياب IL-3 ، في حين أن المتجه الأبوي الفارغ ، FLT3 النوع البري (FLT3 WT) أو FLT3 لم يمنح F691L نموًا مستقلًا لـ IL-3 (الشكل 1E).

على عكس خلايا Ba / F3 التي تعبر عن FLT3 D835Y ، خلايا Ba / F3 ذات FLT3 كان N701K أقل حساسية تجاه gilteritinib مع زيادة تقريبية بمقدار 8.5 ضعف في IC50 (الشكل 1 و). لاختبار ما إذا كان FLT3 عزز N701K أيضًا مقاومة gilteritinib في وجود FLT3 طفرات ITD (الشكل 1 ب) ، أنشأناها FLT3 ITD + N701K و FLT3 ITD + F691L المسوخ المزدوج والتعبير عنها في خلايا Ba / F3. وفقا للدراسات السابقة ، 6 FLT3 أظهر متحولة ITD + F691L زيادة تقريبية بمقدار 11 ضعفًا في IC50 إلى gilteritinib مقارنة بـ FLT3-ITD وحده. ال FLT3 كانت خلايا ITD + N701K Ba / F3 متطابقة تقريبًا مع FLT3 ITD + F691L الخلايا في مقاومتها ل gilteritinib (الشكل 1G). كعنصر تحكم ، FLT3 كانت خلايا WT Ba / F3 المزروعة باستخدام IL-3 غير حساسة لجيلتيريتينيب بجرعات مماثلة.

بعد ذلك ، قمنا بتقييم تأثير FLT3 طفرات N701K على مسارات إشارات FLT3 المصب. تحولت خلايا Ba / F3 مع FLT3 N701K ، FLT3 ITD ، FLT3 ITD + F691L و FLT3 نتج عن ITD + N701K جميعًا فسفرة FLT3 (Y589 / 591) و STAT5 (Y694) و AKT (S473) و ERK (T202 / Y204) (الشكل S1A). ومع ذلك ، فقط FLT3 ITD + N701K أو FLT3 أظهر ITD + F691L وجود phospho-FLT3 مع زيادة تركيزات gilteritinib (الشكل 1H) ، مما يشير إلى أن كلا الطفرات تمنع تثبيط gilteritinib لـ FLT3 ، خاصة عند الجرعات المنخفضة. يعكس نشاط كيناز FLT3 كما يتجلى في الفسفرة FLT3 فحوصات الجدوى في الشكل 1G.

نظرًا لأن طفرات حارس البوابة F691L معروفة بأنها تدفع المقاومة لمثبطات FLT3 المتعددة ، 6 ، 7 ، 14 ، 15 تعاملنا معها FLT3 ITD ، FLT3 ITD + N701K و FLT3 ITD + F691L خلايا Ba / F3 مع ميدوستورين وكرينولانيب وكويزارتينيب. بالرغم ان FLT3 ITD + F691L و FLT3 كان ITD + N701K غير حساس إلى حد كبير لمثبطات النوع الأول midostaurin و crenolanib ، الخلايا ذات FLT3 كان ITD + N701K أكثر حساسية بشكل ملحوظ لمثبط النوع الثاني quizartinib (الشكل S2) ، مما يشير إلى أن N701K يمنع ارتباط gilteritinib لمثبطات النوع الأول بشكل أكثر فعالية من النوع الثاني. كان هذا واضحًا أكثر من نمذجة FLT3 طفرة N701K. بينما ال FLT3 قد تتداخل طفرة N701K بشكل معقد مع ارتباط gilteritinib ، ولا يبدو أن ارتباط quizartinib يتأثر (الشكل S3).

من خلال دراستنا حددنا الرواية FLT3 طفرة N701K بالإضافة إلى FLT3 طفرة حارس البوابة F691L. استخدمنا نظام Ba / F3 لإثبات أن N701K يحظر ارتباط gilteritinib بـ FLT3 ، على غرار حارس البوابة F691L ، ويعزز مقاومة gilteritinib. تتلاءم بياناتنا بشكل جيد مع البيانات الحديثة من شاشة الطفرات لخلايا Ba / F3 مع FLT3-ITD الذي حدد F691L بالإضافة إلى D698N و G697S و Y693C / N كطفرات تدفع مقاومة gilteritinib. 5 تشير نمذجة هذه الطفرات إلى أنها تسبب فقدان الرابطة الهيدروجينية التي تتلاءم مع السلسلة الجانبية لـ FLT3 ، مما يؤدي إلى صدام فلكي بين الحلقة الرباعية الهيدروجين من gilteritinib و FLT3. 5 نظرًا لقرب N701K من هذه الطفرات ، فإننا نتوقع أن آلية مقاومة gilteritinib التي توفرها هذه الطفرة متشابهة (الشكل S3). الأهم من ذلك ، تحدد هذه الطرق التكميلية نقطة ساخنة مشتركة لطفرات مقاومة gilteritinib (الشكل S4). بالنظر إلى الاستخدام المتزايد لـ gilteritinib في العيادة ، نتوقع أنه من المحتمل تحديد طفرات مقاومة إضافية في المرضى. تجدر الإشارة إلى أن طفرة N701K تبدو أكثر مقاومة لمثبطات النوع الأول ولكنها تحتفظ بالحساسية لمثبطات النوع الثاني مثل quizartinib (الشكل S2) ، مما يشير إلى أن تبديل فئة TKI يمكن أن يكون وسيلة واعدة للتخفيف من تطور مقاومة gilteritinib. يعد استخدام مثبطات النوع الأول FLT3 بعد اكتساب مقاومة مثبطات النوع الثاني منهجًا راسخًا للتغلب على المقاومة. ومع ذلك ، فإن ما يجعل حالة طفرة N701K مثيرة للاهتمام هو الحساسية المكتسبة لمثبط من النوع الثاني بعد تطوير مقاومة لمثبط من النوع الأول ، وهو مفهوم لم يتم تقديره إلى حد كبير. يمكن استخدام هذه المعرفة للمساعدة في التسلسل المنطقي لمثبطات FLT3 عند تطوير المقاومة.


المواد والأساليب

تخليق الحمض النووي الريبي وتحضير العينات

تم تحضير 15 نيوكليوتيدات ثلاثي الفوسفات المسمى N ، كما هو موصوف سابقًا (16 ، 17) ، من الإشريكية القولونية يزرع على M9 متوسط ​​الحد الأدنى مزود بـ 15 N NH 4 C1 كمصدر وحيد للنيتروجين. تم تحضير 15 جزيءًا من جزيئات الحمض النووي الريبي المسمى N (hpGA و 5SDE و 5SE ، انظر الشكل 1) بواسطة في المختبر النسخ باستخدام بوليميراز T7 RNA (18 ، 19) من قوالب DNA مزدوجة الشريطة الاصطناعية (MWG Biotech) أو DNA البلازميد الخطي (5SDE ، 5SE) التي تحتوي على التسلسلات المناسبة. تمت تنقية هذه الجزيئات على عمود DEAE Sepharose FF (Amersham Pharmacia Biotech) تم تطويره باستخدام تدرج خطوة من أسيتات الصوديوم ثم بواسطة HPLC على عمود C18 تحضيري (Vydac 218TP510) ، تمت معايرته بـ 50 ملي مولار KH 2 ص 42 HPO 4 و 2 ملي مولار من كبريتات الهيدروجين رباعي الأمونيوم عند الرقم الهيدروجيني 5.9 في الماء باستخدام تدرج أسيتونيتريل. في حالة hpGA و 5SDE ، لم يتم فصل كمية صغيرة من منتج N + 1 عن المنتج الرئيسي. تم دمج قالب 5SE في تسلسل ريبوزيم رأس المطرقة. خضع النص الناتج للانقسام الذاتي في 3 نهاية 5SE (20) ولم يلاحظ أي منتجات إضافية (N + 1 ، N-1) في هذه الحالة. تم تحلية المنتجات المجففة بالتبريد باستخدام عمود ترشيح جل NAP-25 (Amersham Pharmacia Biotech) وترسبت مرتين مع 5 حجم 2٪ (وزن / حجم) فوق كلورات الليثيوم في الأسيتون. تم تغيير طبيعة HPGA عند 95 درجة مئوية بتركيز 0.03 ملي مولار في محلول NMR مخفف 10 أضعاف (100 ملي كلوريد الصوديوم ، 10 ملي مولار NaH 2 ص 4 / نا 2 HPO 4 ، 2.5 مم EDTA ، الرقم الهيدروجيني 6.9) وتم تبريده ببطء إلى درجة حرارة الغرفة على مدى 3 ساعات. تم طي 5SDE و 5SE في شكل دبوس شعر أحادي عن طريق تغيير الطبيعة عند 95 درجة مئوية بتركيز 0.25 ملي مولار والتخفيف اللاحق بمقدار 5 أضعاف في ماء بارد مثلج وتم استبداله أخيرًا في محلول NMR (5 ملي KH 2 ص 42 HPO 4 ، 60 ملي بوكل و 8 ملي كلوريد الكالسيوم 2 ، درجة الحموضة 5.75 لـ 5SDE أو 20 ملي مولار NaH 2 ص 4 / نا 2 HPO 4 ، 0.1 مول كلوريد الصوديوم ، 4 ملي MgCl 2 ، 3 ملي نان 3 ، الرقم الهيدروجيني 7.2 للمجمع 5SE-L25) باستخدام مركزات Centricon-3 الدقيقة (Amicon ، Inc.). تم تحضير بروتين الريبوسوم L25 وتم تكوين مركب 5SE-L25 بالمعايرة كما هو موضح سابقًا (20). كانت تركيزات العينة النهائية ∼1.7 مم لـ 5SDE و 0.8 مم لـ hpGA ومجمع 5SE-L25.

مطيافية الرنين المغناطيسي النووي

تم إجراء تجارب الرنين المغناطيسي النووي على وحدة فاريان اينوفا 600 ميغا هرتز ، وحدة فاريان اينوفا 750 ميجاهرتز أو مطياف وسيط DMX 600 ميجاهرتز. تمت معالجة جميع الأطياف وتحليلها باستخدام Vnmr و Xeasy (21) و NMRpipe (22). تم تسجيل أطياف الرنين المغناطيسي النووي في 95٪ H. 2 يا / 5٪ د 2 O عند درجة حرارة 10 درجة مئوية (hpGA) أو 25 درجة مئوية (مجمع 5SDE و 5SE-L25) باستخدام نظام إخماد المياه WATERGATE (23) بما في ذلك نبضات الانقلاب المائي (24).

تم تسجيل طيف 1 H- 1 H-NOESY عند 750 ميجاهرتز لـ hpGA مع مصفوفة بيانات تتكون من 400 (t 1 × 960 (ر 2 ) نقاط البيانات المعقدة. تم استخدام عرض كنس قدره 9000 و 16000 هرتز في F1 و F2 ، على التوالي ، وزمن خلط NOE قدره 150 مللي ثانية. ما مجموعه 128 بالاشعة لكل ر معقد 1 تم جمع الزيادة. تم وضع الحامل 1 H في 6.8 مساءً. خلال 1 وفي H 2 يا صدى أثناء ر 2 والناقل 15 N في 195 مساءً تم استخدام 15 N فصل أثناء الحصول على البيانات. تم ملء البيانات بصفر إلى نقاط بيانات معقدة 4K × 4K وتم تحويلها باستخدام وظائف جيب التمام المربعة في كلا البعدين قبل تحويل فورييه.

المتواليات والتراكيب الثانوية لجزيئات الرنا المستخدمة في هذه الدراسة. أزواج قاعدة Non-Watson-Crick مع روابط هيدروجين NH-N مظللة. HPGA ، الهيكل الثانوي لـ hpGA. تشير المنطقة المعبأة إلى التسلسل الذي درسه وو وآخرون. (4). يُشار إلى محور التناظر (الزائف) ثنائي الطي للجزيء بواسطة شكل بيضاوي أسود. مخطط الترقيم حسب (4). 5SDE ، البنية الثانوية لـ 5SDE ، والتي تحتوي على نيوكليوتيدات 70-106 من بكتريا قولونية 5S الريبوسوم RNA. 5SE ، البنية الثانوية لـ 5SE ، والتي تحتوي على نيوكليوتيدات 70-82 و 94-106 من بكتريا قولونية 5S الريبوسوم RNA. يشار إلى منطقة الانتفاخ الداخلية المعروفة باسم الحلقة الإلكترونية لـ 5SDE و 5SE.

المتواليات والتراكيب الثانوية لجزيئات الرنا المستخدمة في هذه الدراسة. أزواج قاعدة Non-Watson-Crick مع روابط هيدروجين NH-N مظللة. HPGA ، الهيكل الثانوي لـ hpGA. تشير المنطقة المعبأة إلى التسلسل الذي درسه وو وآخرون. (4). يُشار إلى محور التناظر (الزائف) ثنائي الطي للجزيء بواسطة شكل بيضاوي أسود. مخطط الترقيم حسب (4). 5SDE ، البنية الثانوية لـ 5SDE ، والتي تحتوي على نيوكليوتيدات 70-106 من بكتريا قولونية 5S الريبوسوم RNA. 5SE ، البنية الثانوية لـ 5SE ، والتي تحتوي على نيوكليوتيدات 70-82 و 94-106 من بكتريا قولونية 5S الريبوسوم RNA. يشار إلى منطقة الانتفاخ الداخلية المعروفة باسم الحلقة الإلكترونية لـ 5SDE و 5SE.

تم تسجيل أطياف 3D 1 H- 1 H- 15 N-NOESY-HSQC عند 750 ميجاهرتز لـ 5SDE ومجمع 5SE-L25 مع 192 (t 1 × 44 (ر 2 ) × 512 (ر 3 ) نقاط بيانات معقدة ، وثماني عمليات مسح لكل زيادة ، وعرض طيفي يبلغ 11300 هرتز ، و 2190 هرتز ، و 16000 هرتز في F1 ، و F2 ، و F3 ، على التوالي ، ووقت خلط NOE يبلغ 80 مللي ثانية. تم وضع الحامل 1 H في 6.8 مساءً. خلال 1 وفي H 2 يا صدى أثناء الاستحواذ. تم وضع الناقل 15 N في الساعة 120 مساءً. و 15 N فصل تم استخدامه أثناء الاستحواذ. تم ملء البيانات بصفر إلى 1K × 128 × 1K من نقاط البيانات المعقدة في F1 و F2 و F3 ، على التوالي ، وتم تحويلها باستخدام وظائف جيب التمام في جميع الأبعاد قبل تحويل فورييه.

2 ي HN - تم تسجيل تجارب 1 H- 15 N-HSQC عند 600 ميجاهرتز إما كبوابة مائية تقليدية (23) انعكاس مائي (24) 1 H- 15 N-HSQC (hpGA) أو وفقًا لـ Sklenar وآخرون. (25) (5SDE ، 5SE-L25 complex) مع ضبط تأخيرات النقل INEPT على 10 مللي ثانية. تتكون مصفوفات البيانات من 256 (t 1 ) × 800 (طن 2 ) نقاط البيانات المعقدة. إجمالي 64 عملية مسح ضوئي لكل طن 1 تم جمع الزيادة. كان العرض الطيفي 7000 هرتز في 15 نيوتن و 12000 هرتز في البعد 1 إتش. تم إجراء التجارب مع الناقل H 1 الموجود في H. 2 رنين O وحامل 15 N في 195 مساءً تم ملء البيانات بصفر إلى 2K × 2K من نقاط البيانات المعقدة وتم تحويلها باستخدام وظائف جيب التمام في كلا البعدين قبل تحويل فورييه. الكمي J NN تم إجراء تجارب HNN-COZY كما هو موضح سابقًا (1). تتكون مصفوفات البيانات من 128 (t 1 ) × 800 (طن 2 ) (5SE-L25 مجمع) أو 350 (ر 1 × 800 (طن 2 نقاط البيانات المعقدة (5SDE و hpGA). ما مجموعه 64 (5SDE ، hpGA) أو 256 (5SE-L25) بالمسح لكل طن 1 تم جمع الزيادة. كان العرض الطيفي 7000 هرتز في 15 نيوتن و 12000 هرتز في البعد 1 إتش. تم إجراء التجارب مع الناقل H 1 الموجود في H. 2 O الرنين والحامل 15 N في 153 مساءً لـ 1 H-15 N-INEPT وفي 194 مساءً خلال خطوة NN-COZY. تم استخدام وقت خلط قدره 30 مللي ثانية لنقل NN-COZY. تم ملء البيانات بصفر إلى 512 × 2K من نقاط البيانات المعقدة وتم تحويلها باستخدام وظائف جيب التمام في كلا البعدين قبل تحويل فورييه. القياس الكمي لـ 2 س J NN - تم تنفيذ ثوابت الاقتران على النحو الموصوف سابقًا دون تصحيح لتقليل قدره 10-20٪ بسبب عرض نطاق الإثارة المحدود لنبضات التردد الراديوي 15 N (1).

احالة 2 س J NN اقتران HPGA بزوج قاعدة GA مع رابطة هيدروجين G N1H1-A N1. ( أ ) هندسة زوج قاعدي GA مرتبط بإيمينو-هيدروجين (يسار) بالمقارنة مع زوج قاعدي Watson-Crick GC (يمين). ( ب ) مقطع عرضي أحادي البعد من طيف ثنائي الأبعاد 1 H - 1 H-NOESY مأخوذ عند التحول الكيميائي للهيدروجين G5 / G5 ′ H1 الذي يظهر ذروة NOE القوية إلى الهيدروجين A4 / A4 ′ H2. ( ج ) طيف HNN-COZY من hpGA يظهر ارتباطات متقاطعة بين هيدروجين G H1 و G N1 و C N3 nitrogens (خطوط سوداء متقطعة) نموذجي لأزواج قاعدة Watson-Crick GC وبين هيدروجين G5 / G5 H1 و G5 / G5 N1 و A4 / A4 N1 نيتروجين (خط أحمر). ( د ) 2 ي HN - 1 H- 15 N-HSQC من طيف hpGA يوضح ارتباط الهيدروجين A4 / A4 H2 بالنيتروجين A4 / A4 N1 و N3 (الخط الأزرق). يشار إلى نطاقات التحول الكيميائي النموذجية لذرات النيتروجين ذات الصلة في الجانب الأيمن من الطيف.

احالة 2 س J NN اقتران HPGA بزوج قاعدة GA مع رابطة هيدروجين G N1H1-A N1. ( أ ) هندسة زوج قاعدي GA مرتبط بإيمينو-هيدروجين (يسار) بالمقارنة مع زوج قاعدي Watson-Crick GC (يمين). ( ب ) مقطع عرضي أحادي البعد من طيف ثنائي الأبعاد 1 H - 1 H-NOESY مأخوذ عند التحول الكيميائي للهيدروجين G5 / G5 ′ H1 الذي يظهر ذروة NOE القوية إلى الهيدروجين A4 / A4 ′ H2. ( ج ) طيف HNN-COZY من hpGA يظهر ارتباطات متقاطعة بين هيدروجين G H1 و G N1 و C N3 nitrogens (خطوط سوداء متقطعة) نموذجي لأزواج قاعدة Watson-Crick GC وبين هيدروجين G5 / G5 H1 و G5 / G5 N1 و A4 / A4 N1 نيتروجين (خط أحمر). ( د ) 2 ي HN - 1 H- 15 N-HSQC من طيف hpGA يوضح ارتباط الهيدروجين A4 / A4 H2 بالنيتروجين A4 / A4 N1 و N3 (الخط الأزرق). يشار إلى نطاقات التحول الكيميائي النموذجية لذرات النيتروجين ذات الصلة في الجانب الأيمن من الطيف.


المفاتيح الجزيئية في GPCRs

تعد GPCRs لاعبين رئيسيين في الاتصالات الخلوية وتمرير الإشارة عبر العمل المنسق للمفاتيح.

هناك نوعان من المفاتيح: مفاتيح التبديل والأقفال.

يمكن أن يكون عمل المفاتيح دائمًا أو مؤقتًا.

يرتبط تنشيط المستقبلات بكسر الحواجز الكارهة للماء وتدفق جزيئات الماء.

تمكّن المفاتيح الجزيئية في GPCRs من تمرير الإشارة من موقع الربط الناهض ، والذي يقع عادةً بالقرب من السطح خارج الخلية ، إلى الجزء داخل الخلايا من المستقبل. عادةً ما ترتبط المفاتيح بزخارف هيكلية محفوظة على حلزونات الغشاء (TMs) ، وتكون مصحوبة ببقايا مجاورة توفر الإشارة إلى البقايا المركزية في مفتاح التبديل. في حالة كون الأقفال عبارة عن مفاتيح جزيئية ، فإنها تنكسر (بشكل دائم أو مؤقت) عند ارتباط ناهض. يرتبط العمل المتتالي للمفاتيح بتدفق جزيئات الماء لتشكيل مسار يربط بين جانبي المستقبل. تزيل المفاتيح الحواجز الكارهة للماء وتسهل حركة الماء بينما تساعد جزيئات الماء في إعادة ترتيب شبكة الروابط الهيدروجينية داخل المستقبل.


2 هيكل الجينوم والميزات البيولوجية لمرض السارس COV-2

تنتمي فيروسات كورونا إلى رتبة Nidovirales في عائلة Coronaviridae. كورونافيرينا و توروفيرينا تنقسم العائلات الفرعية عن الأسرة. الفصيلة كورونافيرينا ينقسم كذلك إلى أربعة أجناس: ألفا-, بيتا-, جاما- و دلتاكورونافيروس. كشف التحليل التطوري 15 أن فيروس كورونا SARS-CoV-2 وثيق الصلة بفيروسات بيتا التاجية. على غرار الفيروسات التاجية الأخرى ، فإن جينوم SARS-CoV-2 هو الحمض النووي الريبي أحادي الشريطة الموجب [(+) ssRNA] مع ذيل 5′-cap ، 3'-UTR poly (A). يبلغ طول جينوم SARS-CoV-2 أقل من 30 كيلو بايت ، حيث يوجد 14 إطار قراءة مفتوح (ORFs) ، ترميز البروتينات غير الهيكلية (NSPs) لعمليات تكرار الفيروس وتجميعه ، والبروتينات الهيكلية بما في ذلك spike (S) ، الغلاف (E) ، الغشاء / المصفوفة (M) والنيوكليوكابسيد (N) ، والبروتينات الملحقة. 16 ، 17 يحتوي أول ORF على ما يقرب من 65 ٪ من الجينوم الفيروسي ويترجم إلى متعدد البروتين pp1a (nsp1-11) أو pp1ab (nsp1–16). من بينها ، ستة nsps (NSP3 و NSP9 و NSP10 و NSP12 و NSP15 و NSP16) تلعب أدوارًا مهمة في التكاثر الفيروسي. تقوم ORFs الأخرى بتشفير البروتينات الهيكلية والإضافية. 18 ، 19 بروتين S هو بروتين عبر الغشاء يسهل ربط الغلاف الفيروسي بمستقبلات الإنزيم المحول للأنجيوتنسين 2 (ACE2) المعبر عنها على أسطح الخلايا المضيفة. وظيفيًا ، يتكون بروتين السنبلة من وحدات فرعية ملزمة للمستقبلات (S1) ودمج غشاء الخلية (S2). 20 يرتبط البروتين N بالجينوم الفيروسي ويشارك في تكاثر الحمض النووي الريبي وتشكيل الفيريون والتهرب المناعي. يتفاعل بروتين nucleocapsid أيضًا مع بروتينات nsp3 و M. 21 يعد بروتين M أحد أكثر البروتينات وفرة وحفظًا جيدًا في بنية virion. يعزز هذا البروتين تجميع وتبرعم الجزيئات الفيروسية من خلال التفاعل مع N والبروتينات الإضافية 3 أ و 7 أ. 22 ، 23 البروتين E هو أصغر مكون في بنية SARS-CoV-2 الذي يسهل إنتاج ونضج وإطلاق الفيروسات. 18

إن أكثر مكونات جينوم الفيروسات التاجية تعقيدًا هو مجال ربط المستقبلات (RBD) في بروتين سبايك. 24 ، 25 ستة من الأحماض الأمينية RBD ضرورية لربطها بمستقبلات ACE2 واستضافة فيروسات كورونا شبيهة بـ SARS-CoV. وفقًا لمحاذاة التسلسل المتعدد ، فهي Y442 و L472 و N479 و D480 و T487 و Y4911 في SARS-CoV و L455 و F486 و Q493 و S494 و N501 و Y505 في SARS-CoV-2. 26 لذلك ، يختلف SARS-CoV-2 و SARS-CoV فيما يتعلق بخمسة من هذه المخلفات الستة. كانت تسلسل جينوم سارس SARS-CoV المستمدة من البشر قريبة جدًا من تلك الموجودة في الخفافيش. ومع ذلك ، تم تحديد العديد من الاختلافات بين التسلسل الجيني للجين S وتسلسل الجين ORF3 و ORF8 الذي يشفر بروتينات الارتباط والاندماج وبروتينات النسخ ، على التوالي. تم إثبات أن سلالات معينة من MERS-CoV مشتقة من الإبل متطابقة مع تلك المستخرجة من البشر ، باستثناء الاختلافات بين المناطق الجينومية S و ORF4b و ORF3. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت التجارب القائمة على تسلسل الجينوم أن سلالات MERS-CoV البشرية مرتبطة نسبيًا بسلالات الخفافيش. ومع ذلك ، بالنسبة لبروتينات S ، فإن الأنواع لها هياكل جينوم وبروتينية متشابهة. 29 بناءً على دراسات إعادة التركيب لجينات ترميز orf1ab و S ، تم اشتقاق MERS-CoV من تبادل العناصر الجينية بين فيروسات كورونا في الإبل والخفافيش. بالمقارنة ، مع تحديد شامل بنسبة 96 ٪ ، فإن البروتياز الأولي محمي بشدة بين SARS-CoV-2 و SARS-CoV. 29-31

يوجد بروتين ACE2 في العديد من أنسجة الجسم في الثدييات ، وبشكل أساسي في الرئتين والكلى والجهاز الهضمي والقلب والكبد والأوعية الدموية. 32 مستقبلات ACE2 هي عناصر حيوية في تنظيم مسار نظام الرينين - أنجيوتنسين - الألدوستيرون. بناءً على التجارب الهيكلية والدراسات الكيميائية الحيوية ، يبدو أن SARS-CoV-2 يحتوي على RBD الذي يرتبط بشدة بمستقبلات ACE2 للبشر والقطط والقوارض والكائنات الأخرى ذات المستقبلات المتماثلة. 33

تبين أن تسلسل جينوم SARS-CoV-2 في يناير 2020 مطابق بنسبة 96٪ لجينوم فيروس الخفافيش (BatCoV) RaTG13 و 80٪ مطابق لجينوم SARS-CoV. 34 ومع ذلك ، توجد اختلافات كبيرة. على سبيل المثال ، تسلسل البروتين 8a في جينوم SARS-CoV غائب في 2019-nCoV ، وتسلسل البروتين 8b لـ SARS-CoV-2 أطول بـ 37 حمضًا أمينيًا من ذلك الموجود في SARS-CoV. 35

يشير تحليل تسلسل المحاذاة لجينوم CoV إلى أن البروتينات غير الهيكلية والبروتينات الهيكلية متطابقة بنسبة 60 ٪ و 45 ٪ ، على التوالي ، بين أنواع مختلفة من CoVs. 36 تظهر هذه البيانات أن nsps أكثر تحفظًا من البروتينات الهيكلية. تحتوي فيروسات الحمض النووي الريبي على حمل طفري أعلى نتيجة لأوقات النسخ المتماثل الأقصر (الشكل 1). 36 بناءً على الدراسات الجينية المقارنة بين فيروسات كورونا SARS-CoV-2 والفيروسات التاجية الشبيهة بالسارس ، هناك 380 بديلًا للأحماض الأمينية في جينات nsps و 27 طفرة في الجينات التي تشفر البروتين الشائك S لـ SARS-CoV-2. قد تفسر هذه الاختلافات الأنماط السلوكية المختلفة لـ SARS-CoV-2 مقارنةً بـ SARS-CoVs. 8 على سبيل المثال ، يمكن أن تؤدي الطفرة الأولية N501 T في بروتين سبايك الخاص بـ SARS-CoV-2 إلى زيادة كبيرة في تقاربها الملزم بـ ACE2. 37

2.1 التسبب في السارس- CoV-2

يعتمد دخول فيروس SARS-CoV-2 في الخلايا المضيفة وإطلاق جينوماتها في الخلايا المستهدفة على سلسلة من الخطوات. يستخدم الفيروس ارتفاع البروتين ، وهو أمر مهم لتقييم الانتثار وانتقال الفيروس. بالإضافة إلى ذلك ، يستهدف SARS-CoV-2 الخلايا الظهارية التنفسية البشرية بمستقبلات ACE2 ، مما يشير إلى بنية RBD مماثلة لـ SARS-CoV. 38 بعد ربط S1-RBD بمستقبل ACE2 ، تعمل بروتياز سطح الخلية المضيفة مثل TMPRSS2 (عبر الغشاء سيرين بروتياز 2) على موقع انقسام حرج على S2. 38 هذا يؤدي إلى اندماج الغشاء والعدوى الفيروسية.بعد دخول الفيروس ، يتم ترجمة الحمض النووي الريبي الجينومي غير المطلي إلى بروتينات متعددة (pp1a و pp1ab) ثم يتم تجميعها في مجمعات النسخ / النسخ مع حويصلات الغشاء المزدوج التي يسببها الفيروس (DMVs). بعد ذلك ، يقوم هذا المركب بتكرار وتوليف مجموعة متداخلة من الحمض النووي الريبي تحت الجينوم عن طريق نسخ الجينوم ، وترميز البروتينات الهيكلية وبعض البروتينات الإضافية. يتم تجميع جزيئات الفيروس المتكونة حديثًا عن طريق التوسط في الشبكة الإندوبلازمية ومركب جولجي. أخيرًا ، تتبرعم جزيئات الفيروس ويتم إطلاقها في حجرة البيئة خارج الخلية. وهكذا ، تبدأ كل من دورة التكاثر الفيروسي والتقدم. 10

داخل الخلايا المضيفة ، يتم الحفاظ على بقاء COVs من السارس من خلال استراتيجيات متعددة للتهرب من آلية المناعة للمضيف ، والتي يمكن أيضًا تعميمها على SARS-CoV-2. 39 ، 40 نتيجة لنقص الأنماط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة على DMVs الناشئة عن الخطوة الأولى من عدوى SARS-CoVs ، لم يتم التعرف عليها من خلال مستقبلات التعرف على الأنماط للجهاز المناعي المضيف. يمكن أن يعيق Nsp1 استجابات الإنترفيرون (IFN) -I من خلال عدة آليات ، مثل إسكات نظام الترجمة المضيف ، وتحريض تدهور mRNA المضيف وقمع محول إشارة عامل النسخ ومنشط النسخ (STAT) 1 فسفرة. يعادي Nsp3 إنتاج الإنترفيرون والسيتوكين عن طريق منع الفسفرة لعامل تنظيم الإنترفيرون 3 (IRF3) ومقاطعة مسار إشارات العامل النووي كابا ب (NF-B). تتعاون NSPs 14 و 16 لتشكيل غطاء فيروسي 5 مماثل لتلك الموجودة في المضيف. وبالتالي ، لا تتعرف خلايا الجهاز المناعي على جينوم الحمض النووي الريبي الفيروسي. 41 يمكن للبروتينات الملحقة ORF3b و ORF6 تعطيل مسار إشارات IFN عن طريق تثبيط تعبير IFNβ المعتمد على IRF3 و NF-KB وحجب مسار إشارات JAK-STAT ، على التوالي. أيضًا ، يتم تسطيح إشارات IFN بواسطة البروتينات الهيكلية M و N ، مما يؤدي إلى اضطراب في إشارات Kinase 1 (TBK1) / IKB kinase ε و TRAF3 / 6-TBK1-IRF3 / NF-ΚB / AP1. 22 ، 39 نظرًا لوجود طفرة D614 G في بروتين الارتفاع الخارجي للفيروس ، فإن هذا يجذب قدرًا كبيرًا من الاهتمام من جهاز المناعة البشري وبالتالي قد يضعف قدرة SARS-CoV-2 على تجنب المناعة التي يسببها اللقاح. D614 G غير موجود في RBD ، على الرغم من أنه يشارك في التفاعل بين بروتومرات السنبلة الفردية التي تنظم شكلها الثلاثي الناضج على سطح الفيريون عن طريق الرابطة الهيدروجينية. 42 كوربر وآخرون. ذكرت أن متغير SARS-CoV-2 في بروتين D614 G أصبح مؤثرًا في جميع أنحاء العالم. على الرغم من السريرية و في المختبر تشير الدلائل إلى أن D614 G يغير النمط الظاهري للفيروس ، وتأثير الطفرة على التكاثر ، والتسبب في المرض ، واللقاح وتطوير العلاج غير معروف نسبيًا. 43 من في المختبر والأدلة السريرية ، من الواضح أن D614 G له نمط ظاهري مميز ، على الرغم من أنه ليس من الواضح ما إذا كان هذا هو نتيجة التكيف الذي تم التحقق منه مع ACE2 البشري ، وكذلك ما إذا كان يعزز قابلية الانتقال ، أو سيكون له تأثير كبير. 43

2.2 تشخيص COVID-19

يلعب التشخيص المبكر وعزل المرضى المشتبه بهم دورًا حيويًا في السيطرة على هذه الفاشية. 44 تختلف خصوصية وحساسية تقنيات التشخيص المختلفة بين السكان وأنواع المعدات المستخدمة. 45 تمت التوصية بعدة إجراءات لتشخيص COVID-19:

لوحظت أعراض COVID-19 بعد حوالي 5 أيام من الحضانة. 46 متوسط ​​وقت ظهور الأعراض من حضانة COVID-19 هو 5.1 يومًا ، ويظهر المصابون بالأعراض لمدة 11.5 يومًا. 47 ثبت أن هذه المدة مرتبطة ارتباطًا وثيقًا بجهاز المناعة لدى المريض وعمره. تشمل أعراض الجهاز الهضمي الإسهال والقيء وفقدان الشهية ، والتي سجلت في حوالي 40٪ من المرضى. 48 ، 49 ما يصل إلى 10٪ من المرضى الذين يعانون من أعراض الجهاز الهضمي لا تظهر عليهم علامات الحمى أو التهابات الجهاز التنفسي. كما تم ربط 50 COVID-19 بمرض فرط التخثر ، مما يزيد من خطر الإصابة بالتجلط الوريدي. 51 هناك أيضًا سجلات لأعراض عصبية (مثل التعب والدوار واضطراب الإدراك) والسكتات الدماغية الإقفارية والنزفية وتلف العضلات. 52 تشمل العديد من الأعراض خارج الرئة مظاهر جلدية وعينية. حدد باحثون إيطاليون مظاهر جلدية في 20٪ من المرضى. 53 يمكن أن تتفاقم النظرة السريرية للأطفال بشكل تدريجي نتيجة لفشل الجهاز التنفسي ، والذي لا يمكن تصحيحه في غضون 1-3 أيام عن طريق الأكسجين التقليدي (أي قسطرة الأنف 54) في الحالات الشديدة ، تكون السمات المميزة هي الصدمة الإنتانية ، والإنتان ، والنزيف الشديد والمستمر. نتيجة تشوهات التخثر والحماض الأيضي. 55

يمكن أن تسبب الصدمة الإنتانية أضرارًا بالغة وتضر بالعديد من الأعضاء ، بالإضافة إلى الإصابة بعدوى رئوية شديدة. عندما يحدث خلل في الجهاز خارج الرئة ، بما في ذلك الدورة الدموية والجهاز الهضمي ، تكون الصدمة الإنتانية محتملة ، ويزيد معدل الوفيات بشكل كبير. 55 الولادة المبكرة ونقص الأكسجة داخل الرحم يحدث عندما يحرم قبل الأوان من بيئة مناسبة من الأكسجين. تتطلب الأعراض الخبيثة رعاية خاصة عند بعض الأطفال حديثي الولادة والخدج. أشارت التقارير إلى تشخيص جيد للأطفال في غضون أسبوع أو أسبوعين. 55 الأطفال عرضة للاستجابة الشديدة للالتهابات لـ COVID-19 على غرار مرض كاواساكي ، والذي يستجيب بشكل جيد للإدارة ، والتي يتم صياغة مصطلح جديد لها. 56

عادة ما تكون نتائج معظم اختبارات الدم غير محددة ولكنها يمكن أن تساعد في تحديد أسباب المرض. يُظهر تعداد الدم الكامل عادةً عددًا طبيعيًا أو منخفضًا من خلايا الدم البيضاء واللمفوبيا. تمت زيادة معدل ترسيب البروتين C التفاعلي (CRP) بشكل عام ، والذي يمكن إعادة فحصه على النحو الأمثل في الأيام 3 و 5 و 7 بعد القبول. يمكن زيادة مستويات الكرياتين كيناز بالإضافة إلى الميوغلوبين والأسبارتات أمينوترانسفيراز والألانين أمينوترانسفيراز ونزع الهيدروجين اللاكتات و D-dimer ومستويات فوسفوكيناز الكرياتين في الأشكال الشديدة من مرض COVID-19. أثناء العدوى الفيروسية البكتيرية ، قد ترتفع مستويات البروكالسيتونين. 59 ، 60 في مراجعة منهجية ودراسة التحليل التلوي ، Pormohammad وآخرون. قام 61 بالتحقيق في النتائج المختبرية التي يمكن الوصول إليها والتي تم الحصول عليها بين 2361 مريضًا من SARS-CoV2 ، وأظهرت النتائج 26٪ قلة الكريات البيض ، و 13.3٪ زيادة عدد الكريات البيضاء ، و 62.5٪ من اللمفاويات. أيضًا ، من بين 2200 مريض ، أظهر 91 ٪ و 81 ٪ ارتفاعًا في الصفائح الدموية (كثرة الصفيحات) و CRP ، على التوالي. 61 بالإضافة إلى ذلك ، حددت مراجعة لدراسات الحالة التشخيص السريري وتعديل المعلمة السريرية لرجل يبلغ من العمر 47 عامًا تم تشخيصه بالمرض من Wuweian. 62

للتحقيق في تأثير الفيروس التاجي خلال المرحلة الحادة من المرض ، سيتوكينات البلازما / عامل نخر الورم الكيميائي (TNF) -α والإنترلوكين (IL) -1β, تم قياس IL1RA و IL2 و IL4 و IL5 و IL-6 و IL-10 و IL13 و IL15 و IL17A. 1، 63 أظهرت إحدى الدراسات أن الخلايا الضامة والخلايا التغصنية تلعب دورًا مهمًا في جهاز المناعة التكيفي. تحتوي هذه الخلايا على السيتوكينات والكيماويات الالتهابية ، مثل IL-6 و IL-8 و IL-12 و TNF-α و monocyte chemoattractant protein-1 وعامل تحفيز مستعمرة الخلايا الضامة المحببة وعامل تحفيز مستعمرة المحببات. يمكن أن تسبب هذه التفاعلات الالتهابية التهابًا جهازيًا. 64

قد يُظهر فحص الصدر بالأشعة السينية خصائص أو أنماط تصوير متنوعة في مرضى COVID-19 مع اختلاف شدة المرض ومدته. تختلف نتائج التصوير بناءً على عمر المريض ومرحلة المرض أثناء الفحص والكفاءة المناعية وبروتوكولات العلاج الدوائي. 66 من ناحية أخرى ، يعد التصوير المقطعي المحوسب (CT) ضروريًا لمراقبة تطور المرض وتقييم الفعالية العلاجية. يمكن إعادة فحصه بعد يوم إلى يومين من القبول ، بناءً على لائحة بروتوكولات التشخيص والعلاج (DTPR). 67

كانت السمة المميزة لـ COVID-19 هي عتامة زجاج الأرض المتعددة والثنائية والخلفية والمحيطية مع أو بدون الدمج الرئوي ، وفي الحالات الشديدة ، تسلل الظلال. 68 أظهر تحليل تشريح جثة مريض مصاب بفيروس كورونا COVID-19 تراكم السوائل وتشكيل غشاء زجاجي في الجدران السنخية ، والذي قد يكون المحرك المرضي الأساسي لعتامة الزجاج الأرضي. 69

ومع ذلك ، أشارت دراسات أخرى إلى أن الظلال الصغيرة غير المكتملة ، والتغيرات الجنبية ، والخط المنحني تحت الجنبة ، وعلامات الهالة المعكوسة تُلاحظ بشكل عام في مرضى COVID-19. 70 ، 71 تم عرض الخطوط داخل الفصيص والحاجز السميك بين الفصوص في نمط رصف مجنون على خلفية عتامة الزجاج الأرضي. 67 أيضًا ، يمكن العثور على العديد من الآفات الفصيّة في الجهاز التنفسي لدى الأطفال المصابين بعدوى شديدة. أظهرت الأدلة أن مظاهر التصوير المقطعي المحوسب على الصدر (الوذمة الرئوية) المبلغ عنها بالنسبة لـ COVID-19 قريبة بشكل عام من السارس ومتلازمة الشرق الأوسط التنفسية. 69

يركز التشخيص السريري لـ COVID-19 بشكل أساسي على البيانات الوبائية والأعراض السريرية وبعض التقنيات المساعدة ، مثل الكشف عن الحمض النووي والفحوصات المناعية. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب عزل SARS-CoV-2 معدات عالية الإنتاجية (مستوى السلامة الحيوية -3) لضمان سلامة الأفراد. علاوة على ذلك ، لم يتم التحقق من صحة الاختبارات المصلية. في مجال التشخيص الجزيئي ، هناك ثلاث قضايا رئيسية: (1) تقليل عدد السلبيات الخاطئة من خلال الكشف عن الحد الأدنى من كميات الحمض النووي الريبي الفيروسي (2) تجنب عدد الإيجابيات الخاطئة من خلال التمييز الصحيح للإشارات الإيجابية بين مسببات الأمراض المختلفة و ( 3) قدرة عالية للاختبار السريع والدقيق لعدد كبير من العينات في وقت قصير. 73

2.3 كشف الحمض النووي

هناك تقنيتان مستخدمتان على نطاق واسع للكشف عن الحمض النووي SARS-CoV-2 هما RT-PCR (rRT-PCR) في الوقت الحقيقي والتسلسل عالي الإنتاجية. ومع ذلك ، ونتيجة للاعتماد على المعدات والتكاليف المرتفعة ، فإن التسلسل عالي الإنتاجية في التشخيص السريري مقيد. ساعد الوصول إلى بنية الجينوم الكاملة لـ SARS-CoV-2 في تصميم بادئات محددة وقدم أفضل بروتوكولات التشخيص. 47 ، 74 في التقارير المنشورة الأولى حول تطبيق rRT-PCR في تشخيص COVID-19 ، أظهر استهداف منطقة الجين المرتفع (S) لـ SARS-COV-2 خصوصية ملحوظة وحساسية محدودة. 68 في وقت لاحق ، تم تحسين حساسية هذه التقنية بشكل كبير عن طريق استخدام مجسات محددة للجينات الأخرى الخاصة بالفيروس ، بما في ذلك RNA بوليميريز المعتمد على RNA (RdRp) في منطقة ORF1ab ، Nucleocapsid (ن) و Envelop (ه). لتجنب التفاعل المتبادل مع فيروسات كورونا البشرية الأخرى ومنع الانجراف الجيني المحتمل لـ SARS-CoV-2 ، يجب إشراك هدفين جزيئيين في هذا الاختبار: هدف واحد غير محدد للكشف عن CoVs الأخرى ، وهدف واحد محدد لـ SARS-CoV-2 . أظهرت مقارنة النتائج التي تم الحصول عليها من استهداف جميع الجينات المدروسة أن RdRp الجين هو الهدف الأنسب بأعلى حساسية. تم التحقق من صحة فحوصات RdRp في ما يقرب من 30 مختبرًا أوروبيًا باستخدام تقنية الأحماض النووية الاصطناعية. 73 حاليا ، تشان وآخرون. اقترح 75 اختبارًا جديدًا لـ RT-PCR يستهدف سلسلة من RdRp / Hel يمكن أن يكتشف انخفاض حمل SARS-CoV-2 في عينات الجهاز التنفسي العلوي والبلازما واللعاب دون أي تفاعل متقاطع مع فيروسات الجهاز التنفسي الشائعة الأخرى. على الرغم من أن المقايسات الموصى بها من قبل مراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها في الولايات المتحدة تعتمد على نوعين من البروتينات nucleocapsid N1 و N2 ، توصي منظمة الصحة العالمية بمقايسة الجين E كفحص للخط الأول ، متبوعًا بمقايسة الجين RdRp كاختبار تأكيدي. استنادًا إلى أحدث الأدلة ، لوحة QIAstat-Dx SARS-CoV-2 ، وهي عبارة عن نظام PCR متعدد الإرسال في الوقت الحقيقي يستهدف الجينات RdRp و ه ، تظل حساسة للغاية على الرغم من اختلافات النيوكليوتيدات التي تؤثر على التلدين لمقايسة PCR. 76

بشكل عام ، يتميز RT-qPCR الكمي (RT-PCR) بخصوصية عالية كمقايسة قياسية ذهبية للتشخيص النهائي لـ COVID-19. ومع ذلك ، يمكن أن تكون حساسيته متغيرة بناءً على الحمل الفيروسي وتقنية استخراج الحمض النووي الريبي ومصدر أخذ العينات ومرحلة المرض خلال وقت أخذ العينات. في الواقع ، ترتبط النتائج الإيجابية الكاذبة لـ RT-PCR بالتلوث المتبادل للعينات ومعالجة الأخطاء. على النقيض من ذلك ، قد تؤدي عدم الدقة أثناء أي مرحلة من مراحل جمع العينات وتخزينها ومعالجتها إلى نتائج سلبية خاطئة. كشفت بعض الدراسات أن العينات المأخوذة من الجهاز التنفسي العلوي (أسفل فتحات الأنف والبلعوم) مرغوبة أكثر لمقايسة RT-PCR نتيجة للعديد من النسخ الفيروسية. 77 علاوة على ذلك ، تشمل أوجه القصور الأخرى في فحوصات RT-qPCR مخاطر السلامة البيولوجية الناشئة عن الحفاظ على عينات المرضى والعمل عليها ، فضلاً عن عملية الكشف عن الحمض النووي المرهقة والمستهلكة للوقت. 66 ، 68

لتحسين تقنيات التشخيص الجزيئي لـ COVID-19 ، يجري حاليًا تطوير طرق قائمة على التضخيم الحراري. يستخدم التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP) بوليميريز الحمض النووي و 4 إلى 6 بادئات مختلفة مرتبطة بالتسلسلات المميزة على الجينوم المستهدف. 78 في تفاعلات LAMP ، يُشار إلى الحمض النووي المتضخم عن طريق التعكر الناتج عن منتج ثانوي للتفاعل ، أو لون يمكن اكتشافه ناتج عن صبغة حساسة للأس الهيدروجيني ، أو مضان ناتج عن صبغة فلورية. 79 يحدث هذا النهج عند درجة حرارة واحدة ، في أقل من ساعة واحدة ، وبأدنى حد من إشارات الخلفية. يعد اختبار LAMP التشخيصي لـ COVID-19 أكثر تحديدًا وحساسية مقارنة بمقايسات RT-PCR التقليدية ولا يعتمد على معدات المختبرات المتخصصة مثل جهاز التدوير الحراري. ومع ذلك ، نتيجة لتعدد البادئات المستخدمة في هذه الطريقة ، فإن تحسين ظروف التفاعل يمثل تحديًا كبيرًا. 80 ، 81

2.4 تقنية تعتمد على ميكروأري

يمكن استخدام تقنيات الكشف عن المستضد والمناعة من أجل التشخيص السريع والفعال من حيث التكلفة في نفس الوقت مع توفير بديل للطرق الجزيئية. التقنيات المناعية بما في ذلك مقايسة التألق المناعي ، واختبار الأجسام المضادة الفلورية المباشرة ، ومقايسة الكشف عن البروتينات النووية ، ورقاقة البروتين ، ونقاط الكم لأشباه الموصلات ومقايسة المعادلة الدقيقة تحدد الارتباط بين مستضد فيروسي وجسم مضاد محدد. 88-91 هذه الطرق المناعية سهلة التشغيل ولكنها منخفضة النوعية / الحساسية. في حالة COVID-19 ، يمكن ملاحظة مورفولوجيا الفيروس بالمجهر الإلكتروني وفقًا لمسلمات كوخ التقليدية. 92 ، 93 الاختبارات المصلية يمكن أن تحسن الكشف عن فيروس كورونا مثل أن المستضدات المرتبطة والأجسام المضادة وحيدة النسيلة يمكن أن تمثل نهجًا تشخيصيًا جديدًا للتطور المستقبلي (الشكل 2). 94 ، 95

يمكن أن تكون الاختبارات المصلية خاصة بنوع واحد من الغلوبولين المناعي ، ويمكنها قياس الأجسام المضادة IgM و IgG بشكل متزامن ، أو قد تكون فحوصات الأجسام المضادة المطلقة ، والتي غالبًا ما تقيس الأجسام المضادة IgA. 96 بناءً على الإجراء والجهاز المحدد ، سيتم إجراء هذه التجارب عادةً في غضون ساعة إلى ساعتين بعد وصول العينة إلى المختبر وتحميلها على المنصة المناسبة. 97 قوه وآخرون. أشار 98 إلى أن الأجسام المضادة IgA و IgM لها معدلات إيجابية تبلغ 93.0٪ و 85.5٪ بعد 3-6 أيام على التوالي. كما تم الكشف عن 78.0٪ من الأجسام المضادة IgG الإيجابية خلال 10-18 يومًا. كفاءة الكشف عن طريق مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم IgM (ELISA) أعلى من تلك الخاصة بـ qPCR بعد 5.5 يومًا من ظهور الأعراض. بعد 5 أيام ، يكون اكتشاف IgM ELISA أكثر كفاءة من qPCR.

علاوة على ذلك ، أدى الجمع بين PCR و IgM ELISA إلى زيادة معدل الكشف بنسبة 98.5٪. 98 شيانغ وآخرون. 99 تم اختبار 63 مريضًا مصابًا بفيروس SARS-CoV-2 تم ​​إدخالهم إلى مستشفى جينينتان في ووهان ، هوبي ، الصين. تم تقييم عينات مصل المريض باستخدام ELISA والتقاط ELISA IgG غير المباشر. تشير نتائج الدراسة إلى أن IgM كان موجباً وبدقة 64.3٪ وحساسية 44.4٪ ونوعية 100٪ في 28 عينة من أصل 63. كما أظهر تحديد العينة المكونة من 52 حالة اختبار IgG إيجابيًا مع حساسية 82.54٪ ونوعية 100٪ ودقة 88.8٪. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحقيق حساسية 87.3٪ باستخدام تحليل توليفة IgM و IgG. 99

2.5 تقنية كريسبر

يعد اكتشاف الحمض النووي باستخدام CRISPR-Cas13a / C2c2 عبارة عن منصة للكشف الجزيئي عالية السرعة وحساسة ومحددة ، والتي قد تساعد في علم الأوبئة والتشخيص والسيطرة على المرض. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لـ Cas13a / C2c2 اكتشاف التعبير عن النصوص في الخلايا الحية والأمراض المختلفة. 101 ، 102 زانج وآخرون. قدم بروتوكولًا للكشف عن COVID-19 باستخدام تقنية SHERLOCK المستندة إلى التشخيص من CRISPR (تقنية SHERLOCK المحددة عالية الحساسية للمراسل الأنزيمي). تساعد شظايا الحمض النووي الريبي لفيروس SARS-CoV-2 في اكتشاف التسلسل المستهدف لما يقرب من 100 نسخة. يتم إجراء التجربة عن طريق تضخيم متساوي الحرارة للحمض النووي المستخرج من عينات المرضى ثم تضخيم تسلسل الحمض النووي الريبي الفيروسي عبر Cas13 ويتم قراءتها أخيرًا بواسطة مقياس عمق ورقي في أقل من ساعة واحدة. 103 ، 104 هوانغ وآخرون. 105 أسس مقايسة قائمة على CRISPR بواسطة مجمع CRISPR Cas12a / gRNA المخصص. لقد استخدموا مسبار الفلورسنت لتحديد الأمبليكونات المستهدفة التي تنتجها RT-PCR القياسي أو تضخيم بوليميراز إعادة التركيب المتساوي الحرارة. أظهرت هذه الطريقة اكتشافًا محددًا في الأماكن غير المجهزة بأنظمة PCR اللازمة لاختبارات التشخيص qPCR في الوقت الفعلي. يسمح التحليل بتحديد العينات الإيجابية لـ SARS-CoV-2 مع وقت اختبار للاستجابة يبلغ حوالي 50 دقيقة وحد اكتشاف لنسختين من كل عينة ليتم اكتشافها. كانت نتائج اختبار CRISPR على عينات الأنف التي تم جمعها من الأشخاص المصابين بـ COVID-19 قابلة للمقارنة مع البيانات المتطابقة التي تم الحصول عليها من اختبار RT-qPCR المعتمد من CDC. 105

جلبت على وآخرون. وصف 106 تطوير اختبار تدفق جانبي سريع (& lt 40 دقيقة) سهل التنفيذ ودقيق قائم على CRISPR-Cas12 لتشخيص SARS-CoV-2 من مستخلص الحمض النووي الريبي من مسحة الأنف. باستخدام عينات مرجعية اصطناعية وعينات سريرية من مرضى ، تضم مرضى تم تشخيص إصابتهم بمرض COVID-19 و 42 مريضًا يعانون من أمراض تنفسية أخرى ، أكدوا العملية. قدم هذا النهج القائم على CRISPR خيارًا بديلاً مرئيًا وأسرعًا لطريقة RT-PCR في الوقت الحقيقي لـ SARS-CoV-2 المستخدمة في المراكز الأمريكية لمكافحة الأمراض والوقاية منها ، مع اتفاق تنبؤي سلبي بنسبة 100٪ و 95٪ تنبؤية إيجابية. اتفاق. 106

2.6 تقنية تعتمد على المصباح

التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP) هو طريقة جديدة لتضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة بكفاءة عالية. يستخدم هذا لتضخيم الحمض النووي الريبي والحمض النووي بدرجة عالية من الخصوصية والحساسية نتيجة لميزة التضخيم الأسي وستة متواليات مستهدفة معينة يتم تشخيصها بواسطة أربعة بادئات منفصلة. 107 يعتبر اختبار LAMP سريعًا ولا يحتاج إلى كواشف أو معدات باهظة الثمن. علاوة على ذلك ، يتم استخدام طريقة الفصل الكهربائي للهلام على نطاق واسع للتحقيق في العناصر المضخمة لاكتشاف نقاط النهاية. ومن ثم ، فإن اختبار LAMP سيساعد في تقليل تكلفة اكتشاف فيروس كورونا. يتم هنا تحديد العديد من الاستراتيجيات لاكتشاف الفيروس التاجي بناءً على LAMP ، كما تم تطويرها وتنفيذها في التشخيص السريري. 108

بون وآخرون. أبلغ 109 عن اختبار LAMP بسيط في دراسة SARS وأظهر جدوى هذه الطريقة لاكتشاف SARS-CoV.تم اختيار موقع SARS-CoV ORF1b لاكتشاف السارس وتم تضخيمه في وجود ستة بادئات عبر تفاعل LAMP ، ثم تم تقييم المنتجات المضخمة بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام. مستويات الحساسية والكشف في اختبار LAMP لمرض السارس قريبة من تلك الموجودة في التقنيات التقليدية القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل. بيرك وآخرون. 110 تم تطبيق LAMP بشكل فعال على اكتشاف HCoV-NL63 بحساسية وخصوصية مرغوبة في مزارع الخلايا المتنقلة والعينات السريرية. على وجه الخصوص ، تم العثور على نسخة متماثلة واحدة من قالب RNA لتكون مسؤولة عن تقييد الكشف. لوحظ التضخيم كصبغة فلورية أو ترسيب بيروفوسفات المغنيسيوم. يمكن تحقيق هذه التقنيات في الوقت الفعلي من خلال مراقبة تعكر البيروفوسفات أو الفلورة ، والتي تتغلب بشكل صحيح على قيود اكتشاف نقطة النهاية. 110

شيراتو وآخرون. طور 111 مقايسة RT-LAMP مفيدة للتشخيص والرصد الوبائي لمتلازمة MERSCoV البشرية. كانت هذه الطريقة محددة للغاية ، دون أي تفاعل تبادلي مع فيروسات الجهاز التنفسي المحددة الأخرى ، واكتشفت ما لا يقل عن 3.4 نسخ من الحمض النووي الريبي. 111 بعد ذلك ، طوروا اختبار RT-LAMP عن طريق الكشف عن علامة باستخدام مسبار التبريد (QProbe) ، الذي له نفس كفاءة اختبار RT-PCR المعتاد في الوقت الحقيقي فيما يتعلق باكتشاف MERSCoV. 112

بناءً على أدلة أخرى ، تم تطوير طريقة تصور الحمض النووي التي تجمع بين RT-LAMP وشريط تصور التدفق العمودي لاكتشاف MERS. 113

2.7 تقنية Penn RAMP

بناءً على الفعالية التي أبلغ عنها Zhang وآخرون. 104 باستخدام LAMP الأقل حساسية نسبيًا ، الحساسية المحسنة لتقنية Penn-RAMP التي حققتها Huang وآخرون. 114 ، الذي يُعزى إلى بروتوكول LAMP المحدث المكون من خطوتين ، يمكن أن يكون فعالًا إلى حد كبير كتشخيص. لتضخيم أهداف محددة عن طريق تضخيم بوليميراز إعادة التركيب ، حيث يتم تضخيم جميع الأهداف في وقت واحد ، يتطلب Penn-RAMP تفاعلًا أوليًا مع بادئات LAMP الخارجية. ثم يتم تشغيل تفاعل تالٍ عالي الدقة لـ LAMP. على وجه الخصوص ، تستخدم المرحلة الأولى بادئات LAMP الخارجية F3 و B3 ، بينما يتم خلط البادئات RAMP الأربعة الأخرى في المرحلة 2. مقارنةً بـ LAMP العادي ، أدى هذا المفهوم "المتداخل" إلى تحسين حساسية LAMP بنحو 10-100 مرة تقريبًا ، خاصة عند العمل بالعينات المقطرة والخام. 115 بالإضافة إلى ذلك ، عند توسيع نطاقها لتشمل التجارب الوهمية ، تم منح منهجية Penn-RAMP معدل موافقة بنسبة 100٪ عند 7-10 نسخ من الحمض النووي الريبي الفيروسي لكل تفاعل ، مقارنة بمعدل الموافقة بنسبة 100٪ عند 700 نسخة من الحمض النووي الريبي الفيروسي اللازمة لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل. 114 ، 115

2.8 القطرة الرقمية PCR

من أجل التحديد المباشر والقياس الكمي لأهداف DNA و RNA ، يشتمل PCR الرقمي للقطيرات (ddPCR) على تقنية حساسة للغاية. 116 وقد استخدم على نطاق واسع في حالات الأمراض المعدية ، لا سيما بسبب قدرته على تحديد نسخ قليلة من الجينوم الفيروسي بدقة وكفاءة. 117 إذا كان تحديد الوجود الفيروسي منخفض المستوى و / أو المتبقي مناسبًا ، فإن البيانات الكمية ddPCR تكون أكثر ثاقبة من تلك التي توفرها اختبارات RT-PCR العادية. في ضوء الحاجة إلى تقييد النتائج السلبية الخاطئة (قدر الإمكان) في تشخيص COVID-19 ، يمكن أن يوفر استخدام ddPCR دعمًا حيويًا. ومع ذلك ، لا يزال اختبار ddPCR نادرًا جدًا للدراسة في البيئات السريرية ولا يوجد حاليًا أي دليل متاح للحالات الأوروبية. 118

2.9 تقنية الجيل التالي المستندة إلى تسلسل (NGS)

تأتي فيروسات الحمض النووي الريبي بتشكيلة كبيرة من الأصناف ، وهم متخصصون في علم المسببات للعديد من الأمراض المعدية التي تصيب الإنسان والحيوان. 119

تشكل فيروسات الحمض النووي الريبي (RNA) التنوع الرئيسي وهي العوامل المسببة للأمراض المعدية جدًا في البشر والحيوانات مثل السارس والتهاب الكبد والإنفلونزا و IB (التهاب الشعب الهوائية المعدية للطيور). تلعب تقنية NGS عالية الإنتاجية دورًا حيويًا في التشخيص الأولي والدقيق. 120 بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لطريقة NGS اكتشاف ما إذا كانت الأنواع المختلفة من الفيروسات تشتمل على العامل الممرض أم لا. طورت التقنية الجديدة السريعة للفيروسات بواسطة NGS ، بما في ذلك تسلسل الحمض النووي وتسلسل الحمض النووي الريبي ، تحديد التنوع الفيروسي. 121 يعد تحديد مجموعة كبيرة من العوامل الممرضة باستخدام تقنيات NGS مهمًا أيضًا للتحكم في العدوى الفيروسية التي يسببها ممرض جديد. 122 في السنوات الأخيرة ، مكننا تقدم طريقة NGS عبر تسلسل RNA من إحراز تقدم كبير في التعرف السريع على فيروسات RNA الجديدة. RNA-يكشف التسلسل عن الملايين من شظايا الحمض النووي المنسوخة عكسيًا من عينات الحمض النووي الريبي المعقدة في نفس الوقت باستخدام الاشعال العشوائي. 123 تشين وآخرون. أبلغ 122 عن فيروس كورونا جديد للبط باستخدام طريقة تسلسل الحمض النووي الريبي ، والتي تختلف عن تلك الموجودة في الدجاج IBV (فيروس التهاب الشعب الهوائية المعدي). 122 كان فيروس كورونا الجديد الخاص بالبط نوعًا جديدًا محتملاً داخل جنس فيروس جاما ، كما يتضح من تسلسل الجين الفيروسي 1 ب من ثلاث مناطق.

في الختام ، ظهر تفشي فيروس جديد في نهاية ديسمبر 2019. انتشر COVID-19 على الفور وتحدى الطب والاقتصاد والصحة العامة في جميع أنحاء العالم. اقترحت العديد من الأدلة أن مستقبلات الإنزيم المحول للأنجيوتنسين 2 تشتمل على بروتينات هيكلية حاسمة لتبرعم الفيروس ودخوله إلى الخلايا المضيفة. تم التعرف على كل من الانتقال من مضيفات وسيطة غير محددة إلى الأنواع المتقاطعة ومن الإنسان إلى الإنسان. ومن ثم ، فإن الاكتشاف المبكر والعزل للمرضى المشتبه بهم يمكن أن يلعب دورًا أساسيًا في السيطرة على هذه الفاشية. حاليًا ، تعد طرق تشخيص COVID-19 عديدة ، ومن ثم ، من الضروري اختيار بروتوكول اكتشاف مناسب. كل من التقنيات الموصوفة لها عيوبها ومزاياها الخاصة. يوصى باستخدام كل من اختبارات التصوير المقطعي المحوسب للصدر واختبار RT-PCR لمرضى COVID-19. ومع ذلك ، فإن استخدام PCR يتطلب معدات مختلفة ومختبرًا راسخًا. يمكن اكتشاف LAMP بأعداد منخفضة من قوالب الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي في غضون ساعة واحدة. تعتبر تقنية Microarray طريقة باهظة الثمن لتشخيص COVID-19 ، كما تتطلب الطرق الأخرى المطورة حديثًا تحقيقًا إضافيًا لتحقيق التطور السريع والكشف في المستقبل. بالنظر إلى أن عدد الحالات المصابة يتزايد بسرعة ، يجب أن تكشف الدراسات المستقبلية عن أسرار المسارات الجزيئية للفيروس فيما يتعلق بتطوير اللقاحات المستهدفة والعلاجات المضادة للفيروسات.


الملخص

تُستخدم الطرق الوظيفية للكثافة لفحص الأشكال الهندسية وطاقة الجزيئات التي تحتوي على حلقة فينيل مرتبطة بالثنائي الهرمي ثلاثي الزوايا SF3 إطار العمل. تتمتع حلقة فينيل بتفضيل قوي للوضع الاستوائي. يبقى هذا التفضيل عند واحد أو اثنين من الأثير −CH2OCH3 تضاف مجموعات إلى حلقة فينيل ، أورثو إلى SF3، حيث يوجد هيكل قمي أعلى بحوالي 30 كيلو كالوري / مول. سواء كان استوائيًا أو قميًا ، يتم تثبيت الجزيء بواسطة رابطة كالكوجين S ··· O ، والتي يتم زيادتها أحيانًا بواسطة روابط CH ··· F أو CH ··· O H. تقدر قوة رابطة S ··· O داخل الجزيئية في النطاق بين 3 و 6 kcal / mol. التأثير الثانوي لرابطة الكالكوجين S ··· O هو استطالة روابط S · F. يقوي ذوبان الجزيء تفاعل S ··· O. إن إضافة البدائل إلى حلقة فينيل لها تأثيرات متواضعة فقط على قوة رابطة S ··· O. ينشأ التعزيز عندما يتم وضع بديل يسحب الإلكترون أورثو إلى الأثير و ميتا إلى SF3، بينما تنتج الأنواع التي تطلق الإلكترون تأثيرًا معاكسًا.


F3. الرابطة الهيدروجينية

اقترح Linus Pauling أولاً أن روابط H (بين الماء والبروتين وداخل البروتين نفسه) ستلعب دورًا مهيمنًا في طي البروتين واستقراره. قد يبدو الأمر منطقيًا لأن الأحماض الأمينية ثنائية القطب والبنية الثانوية شائعة. تذكر ، مع ذلك ، أن سندات H لن توجد فقط في الحالة الأصلية ولكن أيضًا في الحالة المشوهة. هل يساهمون بشكل مختلف في استقرار دولتي D مقابل N؟ تم إجراء العديد من الدراسات التجريبية والنظرية لفحص اللولب & lt === & gt (عشوائي) انتقالات الملف في الببتيدات الصغيرة. تذكر جميع روابط intrachain H في اللولب؟ هل هم بشكل جماعي أكثر استقرارًا من روابط H بين الماء والببتيد في ملف (عشوائي)؟

عند التفكير في الدراسات التوافقية التي تتضمن ببتيدات صغيرة ، من المفيد تطبيق مبدأ Le Chatelier على التوازن أدناه:

أي شيء مضطرب (جزيئات صغيرة ، مذيب ، إلخ) من شأنه أن يتفاعل بشكل تفضيلي مع الشكل الحلزوني سيدفع التوازن إلى الشكل الحلزوني.

افترضت النماذج المبكرة أن روابط H داخل السلسلة كانت أكثر ملاءمة (بشكل حراري) من روابط H بين الببتيد والماء. ولكن لتكوين رابطة هيدروجينية يتطلب استرداد إنتروبيا لأن اللولب مرتب (إنتروبيا أقل) من الملف العشوائي (إنتروبيا أعلى). في درجات الحرارة المنخفضة ، يسود المحتوى الحراري ويفضل تكوين الحلزون في المحلول. عند درجة حرارة عالية ، يكون اللولب مستاءً من الانتروبيا. تخيل حالات الاهتزاز والدوران المتزايدة المسموح بها للذرات عند درجات حرارة أعلى. (تذكر التغييرات التوافقية العابرة إلى غوش في سلاسل أسيل من الأمفيفيلات ذات السلسلة المزدوجة مع زيادة درجة الحرارة ، مما يؤدي إلى الانتقال من مرحلة الهلام إلى الطور البلوري السائل في الحويصلات ثنائية الطبقة.) وتتنبأ الدراسات النظرية حول انتقالات الملف الحلزوني بما يلي:

  • مع زيادة طول السلسلة ، يصبح اللولب أكثر استقرارًا
  • تؤدي زيادة الشحنة على الجزيء إلى زعزعة استقرار اللولب ، نظرًا لأن الملف ، مقارنةً باللولب الأكثر إحكاما ، له كثافة شحن أقل
  • المذيبات التي تفرز الأكسجين الكربوني (مثل حمض الفورميك) تزعزع استقرار اللولب و
  • تتنافس المذيبات التي تشكل روابط H قوية مع الببتيد وتزعزع استقرار اللولب. في المقابل ، تعمل المذيبات مثل CHCl3 و dimethylformamide (مذيب غير بروتي) على استقرار اللولب. وبالمثل ، فإن 2-كلورو إيثانول وثلاثي فلورو إيثانول ، اللذان لا يشكلان أي روابط H مع الببتيد أو أضعف من الماء ، يعملان على استقرار اللولب. (في حالة ثلاثي فلورو إيثانول ، أظهرت محاكاة الديناميكيات الجزيئية أن TFE يتفاعل بشكل تفضيلي مع (يذوب) الببتيد ، والذي يثبط روابط H من العمود الفقري للببتيد إلى الماء ، مما يؤدي إلى استقرار روابط H داخل الخلية.

تشير دراسات الملف الحلزوني هذه إلى أن روابط H مهمة في استقرار البروتين.

لكن هل هم حقا؟ لماذا يجب أن تختلف روابط H هذه عن تلك الموجودة في الماء؟ من الصعب معرفة ما إذا كانت موجودة نظرًا لوجود العديد من روابط H المحتملة (بين البروتين والماء والماء والماء والبروتين والبروتين) ، وتعتمد قوتها على اتجاهها وثابت العزل الكهربائي للوسط الذي تكون فيه تقع.

إذا كانت روابط السلسلة H داخل البروتين لا تختلف كثيرًا في الطاقة عن روابط H بين الجزيئات بين البروتين والماء ، وبالنظر إلى أن البروتينات مستقرة بشكل هامشي في درجات الحرارة الفسيولوجية ، فإن ذلك يعني أن الحالة المطوية يجب أن تحتوي على نفس عدد الروابط الهيدروجينية داخل الجزيئية داخل البروتين باعتباره روابط H بين الجزيئات الممكنة بين البروتين والماء ، وإلا فإن البروتين سيتكشف.

لحل هذه المشكلة ، وتحديد القوة النسبية للروابط H بين المتبرعين والمقبلين المحتملين المتنوعين ، تم إجراء العديد من الدراسات لمقارنة طاقة روابط H بين الجزيئات الصغيرة في الماء مع طاقة روابط H بين نفس الجزيئات الصغيرة ولكن في مذيب غير قطبي. يذهب المنطق على هذا النحو. إذا كان الجزء الداخلي من البروتين غير قطبي أكثر من الماء (ثابت عازل أقل من الماء) ، فيمكن حينئذٍ تشكيل روابط داخل البروتين H في البروتين من خلال النظر إلى روابط H بين الجزيئات الصغيرة في المذيبات غير القطبية وطرح السؤال ، هل الطاقة الحرة التغيير للعملية التالية & lt 0:

حيث D هو مانح لرابطة الهيدروجين (مثل NH) و A هو متقبل لرابطة الهيدروجين ، (مثل C = O) ، w هو الماء (أي المتبرع والمستقبل في الماء) ، و n مذيب غير قطبي ، و DG o و K هي التغير القياسي في الطاقة الحرة وثابت التوازن ، على التوالي ، لتكوين رابطة H في مذيب غير قطبي من متبرع ومستقبل في الماء. يحاكي هذا التفاعل مساهمات الرابطة H في طي البروتين ، حيث يتم محاكاة رابطة H المدفونة بواسطة رابطة H في مذيب غير قطبي. رد الفعل المكتوب أعلاه هو بالفعل تجربة فكرية ، حيث سيكون من الصعب تهيئة الظروف اللازمة لإجراء القياس. ومع ذلك ، يمكننا حساب D G o لهذا التفاعل نظرًا لأنه دالة حالة ولا يهم حقًا كيف ينجز المرء هذه العملية.

لنفكر في مثال محدد: تكوين روابط H بين جزيئين من N-methylacetamide (NMA) في الماء وفي مذيب غير قطبي. يصف مخطط التفاعل الموضح أدناه مجموعة من التفاعلات (دورة ديناميكية حرارية) تتضمن تكوين ثنائيات مرتبطة بـ H لـ NMA. A و B كلاهما جزيئات NMA ، إما في الماء (w) أو مذيب غير قطبي (n).

N- ميثيل أسيتاميد هو تقليد جيد لمانحي رابطة H ومقبلي رابطة الببتيد لسلسلة بولي ببتيد.

في مخطط التفاعل الموضح أعلاه ،

K 1 هو ثابت التوازن لثنائي NMA في وسط غير قطبي. يمكن تحديد ذلك بسهولة ، وهو & gt1 ، مما يعني أن D G o & lt 0. (تذكر ، D G o = -RTlnKeq) لتقليل NMA في CCl4 ، D G o1 = -2.4 كيلو كالوري / مول.

K 2 هو ثابت التوازن (فكر في الأمر على أنه معامل تقسيم) لنقل جزيئين من NMA من الماء إلى مذيب غير قطبي (يمكن قياسه بسهولة مرة أخرى). لنقل NMA من الماء إلى CCl ، D G o2 = + 6.12 kcal / mol.

K 3 هو ثابت التوازن لثنائي NMA في الماء. يمكن تحديد ذلك بسهولة ، وهو & lt1 ، مما يعني أن D G o & gt 0. لتقليل NMA في الماء ، D G o3 = +3.1 kcal / mol.

K 4 هو ثابت التوازن (فكر في الأمر على أنه معامل تقسيم) لنقل ثنائي مرتبط بالهيدروجين لـ NMA من الماء إلى مذيب غير قطبي. تحاول التفكير في طريقة لقياس ذلك! لا استطيع. هذا هو المكان الذي تأتي فيه الدورات الديناميكية الحرارية بشكل جيد. ليس عليك قياسه. يمكنك حسابها من K1-3 لأن D G o هي دالة حالة!

D G o2 + D G o1 = D G o3 + D G o4 أو -RTlnK2 + -RTlnK1 = -RTlnK3 + -RTlnK4

lnK2 + lnK1 = lnK3 + lnK4 = ln (K2K1) = ln (K3K4) أو (K2K1) = (K3K4)

لنقل NMA من الماء إلى CCl ، D G o4 = + 0.62 kcal / mol.

(ملاحظة: يحب علماء الكيمياء الحيوية التحدث عن الدورات الديناميكية الحرارية التي قد تبدو جديدة بالنسبة لك. ومع ذلك ، صدق أو لا تصدق ، لقد رأيتها من قبل - في الكيمياء العامة - في شكل قانون هيس!)

من K1-4 وقيم D G o المقابلة ، يمكننا الآن حساب D G o5 لتكوين ثنائيات NMA المرتبطة بـ H في مذيب غير قطبي من جزيئين من NMA (aq). هذا التفاعل ، الذي نأمل أن يحاكي تكوين روابط داخل سلسلة H مدفونة في البروتينات على طي البروتين ، هو :،
Dw + Aw & lt ======= & gt (DA) n ، حيث D G o5 = +3.72 (أي غير مفضل).

إذا كان هذا النموذج محاكاة جيدة لدراسة تكوين رابطة H على طي البروتين ، فإنه يشير إلى أن تكوين روابط H المدفونة أثناء طي البروتين لا يؤدي إلى طي البروتين.

ومع ذلك ، إذا كان نقل D و A (من بروتين كبير) من الماء إلى الوسط غير القطبي (على غرار K2) مدفوعًا بقوى أخرى (مثل تأثير كاره للماء) ، فإن القيمة الإيجابية لـ K1 ستفضل بشدة رابطة H المدفونة تشكيل. لذلك ، إذا حدث هذا في البروتينات ، فمن الواضح سبب حدوث الكثير من روابط H داخل السلسلة ، حيث أن K1 مفضل للغاية. قد لا تساعد روابط H في انهيار البروتين ، ولكنها تفضل التنظيم الداخلي داخل بروتين مضغوط. وهذا يعني أن روابط H لا تؤدي إلى طي البروتين في حد ذاته ، ولكنها تتشكل بحيث لا يتم زعزعة استقرار البروتين المطوي بسبب عدد كبير جدًا من روابط H.

هناك مشاكل محتملة مع هذا النموذج البسيط. الجزء الداخلي من البروتين ليس متجانسًا (أي أن العازل الفعال داخل البروتين يختلف). قوة الرابطة H أيضًا حساسة جدًا للهندسة. أيضًا ، هناك العديد من روابط H داخل البروتين ، لذا فإن الأخطاء الطفيفة في تقدير قوة الرابطة H قد تؤدي إلى أخطاء كبيرة في تحديد استقرار البروتين.

هناك حجة أخرى ضد كون روابط H هي العامل المحدد في طي البروتين واستقراره تأتي من دراسات تغيير طبيعة المذيبات. إذا كانت روابط intrachain H مهمة جدًا ، ألا يجب على المذيبات التي يمكن أن ترتبط H بالعمود الفقري أن تفسد البروتين؟ ألا يجب أن يكون الماء (55 م) بمثابة مفسد للطبيعة؟ ومع ذلك ، فهي لا تفعل ذلك. لا يُتوقع أن يفسد الديوكسان (الحلقة الحلقية غير المتجانسة المكونة من 5 أعضاء مع O) الذي يحتوي على مستقبل رابطة H فقط طبيعة البروتينات ، ولكنه يفعل ذلك. تزداد روابط H أيضًا في المذيبات غير القطبية. يمكن تحفيز الببتيدات التي لها هياكل عشوائية في الماء لتكوين حلزونات عند وضعها في محاليل كحولية (ثلاثي فلورو إيثانول ، على سبيل المثال) ، والتي تكون غير قطبية أكثر من الماء ، كما هو موضح أعلاه في دراسات الملف الحلزوني. إذا كانت روابط H هي العامل المهيمن في استقرار البروتين ، فإن الكحوليات ستثبت البروتينات. في التركيزات المنخفضة من الكحول ، تتزعزع البروتينات.

وبالتالي ، بناءً على دراسات الجزيئات الصغيرة ودراسة البروتين في المذيبات المختلفة ، فمن غير المرجح أن تكون روابط H هي المثبتات الكبيرة لبنية البروتين. 11٪ فقط من كل C = O's و 12٪ من كل NH في البروتين ليس لها روابط H (يتم تحديدها من خلال تحليل الهياكل البلورية للأشعة السينية). من بين جميع روابط H بـ C = O ، 43٪ للمياه ، و 11٪ إلى السلاسل الجانبية ، و 46٪ للسلسلة الرئيسية NH's. من بين جميع روابط H بـ NH ، 21٪ منها للمياه ، و 11٪ إلى سلاسل جانبية ، و 68٪ للسلسلة الرئيسية C = O. سنرى لاحقًا ، مع ذلك ، أنه يتم التوصل إلى نتيجة معاكسة من الدراسات التي تستخدم الطفرات الخاصة بالموقع.

/>
الكيمياء الحيوية عبر الإنترنت بواسطة Henry Jakubowski مرخصة بموجب ترخيص Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.


ملخص

الورم الأرومي العصبي هو ورم صلب خارج الجمجمة مرتبط بعدد من التغيرات الجينية. تشتمل هذه التعديلات الجينية على طفرات في مجال كيناز لمستقبلات التيروزين كيناز (ALK) لمستقبلات التيروزين كيناز (RTK) ، والتي تم العثور عليها في كل من الورم الأرومي العصبي الجسدي والعائلي. من أجل علاج المرضى وفقًا لذلك ، يتطلب الأمر توصيف هذه الطفرات من حيث استجابتها لمثبطات ALK التيروزين كيناز (TKIs). هنا ، نُبلغ عن تحديد وتوصيف طفرتين جديدتين في الورم الأرومي العصبي ALK (A1099T و R1464STOP) ، والتي قمنا بالتحقيق فيها مع العديد من طفرات ALK التي تم الإبلاغ عنها سابقًا ولكنها غير مميزة (T1087I و D1091N و T1151M و M1166R و F1174I و A1234T). من أجل فهم الدور المحتمل لطفرات ALK هذه في تطور الورم الأرومي العصبي ، استخدمنا أنظمة قائمة على ثقافة الخلايا جنبًا إلى جنب مع الكائن الحي النموذجي ذبابة الفاكهة كقراءة للنشاط المستقل عن الترابط. ينتج عن تحور ALK في الموضع 1174 (F1174I) مستقبل اكتساب الوظيفة قادر على تنشيط الأهداف داخل الخلايا مثل ERK (كيناز منظم للإشارة خارج الخلية) و STAT3 (محول إشارة ومنشط النسخ 3) بطريقة مستقلة عن الترابط. يشير تحليل طفرات ALK غير المعهودة سابقًا والمقارنة مع طفرات ALK F1174 إلى أن طفرات ALK التي لوحظت في الورم الأرومي العصبي تنقسم إلى ثلاث فئات. هذه الفئات هي: (1) طفرات مستقلة عن الترابط في اكتساب الوظيفة مثل ALK F1174l ، (2) طفرات ALK الميتة كيناز ، على سبيل المثال ALK I1250T (Schönherr et al. ، 2011a) و (iii) طفرات ALK التي تعتمد على الترابط بطبيعتها.بغض النظر عن طبيعة طفرات ALK المرصودة ، في كل حالة يمكن إبطال نشاط مستقبلات ALK المتحولة بواسطة مثبط ALK crizotinib (Xalkori / PF-02341066) ، وإن كان ذلك بمستويات مختلفة من الحساسية.


الاستنتاجات ووجهات النظر

تهتم التطورات الحديثة في دراسة بولي (ADP-ribosyl) بشكل أساسي بالدور البيولوجي وطريقة تشغيل البروتينات التي تنتمي إلى عائلة PARP بالإضافة إلى الوظائف المختلفة لبولي (ADP-ribosyl) في الخلايا. حفز الدور الرئيسي لهذه العملية في خلايا الثدييات على نشر المراجعات الممتازة (111-113) وإصدارات المجلات [Mol Aspects Med. 2013 34 (6)] مخصص لـ PARP و poly (ADP-ribosyl) وكذلك لمثبطات PARP. في الوقت نفسه ، تظل الآلية الجزيئية لهذه العملية ، والتي تعتبر مهمة لفهم الدور الذي يلعبه النظام الأحادي والبولي (ADP-ribosyl) في تنظيم النسخ المتماثل ، والنسخ ، وإصلاح الحمض النووي ، واستقرار / تدهور البروتين غير واضحة إلى حد كبير. مدى. يجب تنظيم كل هذه الأحداث من خلال تفاعلات البروتين والحمض النووي والبروتين والبروتين بالإضافة إلى تفاعلات البروتينات مع بولي (ADP-ribose). من المعروف أن وظيفة البروتينات المرتبطة بـ RNA تعتمد أيضًا على PARP و poly (ADP-ribosyl) ation (27 ، 114).

يبدو أن العمل المشترك لـ PARP1 و PARP2 مهم في تنظيم بولي (ADP-ribosyl) من البروتينات (43 ، 115) واكتشاف بولي (ADP-ribosyl) مؤخرًا من الحمض النووي التالف (32 ، 33 ، 116 ، 117). قد يساهم PARP3 جنبًا إلى جنب مع أعضاء آخرين من عائلة PARP التي تحفز أحادية (ADP-ribosyl) في بدء تخليق PAR في ظل ظروف محددة (117). من المحتمل جدًا أن يؤدي تخليق بوليمرات PAR القصيرة أو الطويلة والمتفرعة وظائف مختلفة أثناء تنظيم العمليات الخلوية. يمكن أن يعمل تخليق سلاسل PAR المتفرعة بشكل أساسي على إنشاء مقصورات خلوية غير غشائية عن طريق أحداث إزالة المزج السائل التي يسببها PAR (84) اللازمة لتنظيم إعادة تشكيل الكروماتين والعمليات متعددة الإنزيمات اللاحقة لإصلاح الحمض النووي والنسخ. في هذا الصدد ، قد يضمن العمل المشترك للناقلات الأحادية والقليلة والبولي (ADP-ribosyl) في الخلية تنظيمًا متعدد المستويات لاستقلاب الحمض النووي الريبي والحمض النووي الريبي.

نظرًا لأن الحمض النووي التالف ليس المنشط الوحيد لـ PARP1 (85) ، يمكن افتراض أن الآليات الأكثر تعقيدًا ضرورية للتنشيط المضبوط جيدًا ودقة عملية الارتباط بالريبوزيل ADP. في الواقع ، كشفت الدراسات الحديثة عن عدد من البروتينات التي لا يمكنها فقط تحفيز أو تثبيط النشاط التحفيزي لـ PARP1 ، ولكن يبدو أيضًا أنها تنظم الهدف وطول PAR. نظرًا لأن تثبيط PARP يحمل وعدًا كبيرًا في علاج السرطان ، فإن توضيح الفروق الدقيقة في آلية PARylation وكذلك الآليات الجزيئية لتنشيط وتنظيم تخليق PAR في الخلايا قد يوفر أساسًا للتطوير العقلاني لاستراتيجيات العلاج الجديدة.

كان الهدف من هذه المراجعة هو تلخيص المعرفة الحالية حول الآلية الجزيئية لبولي (ADP-ribosyl) المحفز بـ PARP1 وتنظيمه للمضي قدمًا في دراستنا لهذه العملية الرئيسية في خلايا الثدييات.


شاهد الفيديو: دورة الأحياء 2020 المحاضرة 6 (قد 2022).


تعليقات:

  1. Vizshura

    أعتذر ، لكن في رأيي أنت لست على حق. دعونا نناقشها. اكتب لي في PM ، سنتحدث.

  2. Phelps

    إنها قطعة رائعة ، إنها قطعة قيمة

  3. Derwyn

    ها !!! بارد !!!!

  4. Maralyn

    من الأفضل أن أبقى هادئًا

  5. Heikkinen

    يمكن قول هذا الاستثناء: ط) من القواعد

  6. Dibei

    انا أنضم. يحدث ذلك. يمكننا التواصل حول هذا الموضوع. هنا أو في PM.

  7. Bittan

    أوافق ، عبارة مفيدة للغاية.



اكتب رسالة