معلومة

ما هي كمية الرنا المرسال التي تنقلها الإكسوسومات؟

ما هي كمية الرنا المرسال التي تنقلها الإكسوسومات؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أود أن أفهم بشكل أفضل ، إن أمكن ، نوع جزيئات الحمض النووي الريبي التي تنقلها exosomes في الخلايا البشرية.

التجربة وراء هذا السؤال العام هي هدفنا للقيام بمزيج من mRNA-Seq و miRNA-Seq. نود أن نكون قادرين على إعداد مكتبات للتسلسل من نفس العينات لتقليل التحيز المحتمل بقدر ما يحصل. من أجل ذلك ، نود استخراج كل من RNA و miRNA من exosomes ، إن أمكن في جولة واحدة.

هل هناك طريقة لتقريب نسبة جزيئات الحمض النووي الريبي الصغيرة مقارنة بـ MRNA التي يتم نقلها بواسطة exosomes؟

ما مقدار الجزيئات الصغيرة التي تنقلها الحويصلات هي في الحقيقة مجرد مرنا مجزأ وليست رنا صغيرًا حقيقيًا (مثل ميرنا ، رنا ، إلخ)؟

إذا كان أي شخص على علم بورقة / بحث بخصوص هذا الاتجاه ، فأنا أقدر الاستشهاد به.

شكرا آسا


صرخة أميديو أفوجادرو: ما هو 1 ميكروغرام من exosomes؟

تم تحدي الآراء التقليدية حول كيفية انتقال البروتينات والمكونات الخلوية الأخرى بين الخلايا حقيقية النواة في السنوات الأخيرة 1-7. خارج المسار الإفرازي / الإفرازي الكلاسيكي ، جذبت أدوار الحويصلات الدقيقة المفرزة أو المتساقطة (MV) في الإشارات بين الخلايا اهتمامًا كبيرًا. يتم إطلاق MVs بواسطة جميع الخلايا التي تم فحصها حتى الآن وهي موجودة عمليًا في جميع سوائل الجسم. تسمى الحويصلات المتنوعة خارج الخلية مجتمعة حويصلات الغشاء 8. غالبًا ما يشار إلى الحويصلات التي يبلغ قطرها 100 نانومتر إلى 1 مم باسم الجسيمات الدقيقة أو MVs ، ويتم إنشاؤها عن طريق الانسحاب من غشاء البلازما. يشار إلى الحويصلات بحجم 50-100 نانومتر باسم exosomes. يختلف التكوين الحيوي للأكسوزوم عن الحويصلات الغشائية ويحدث في خطوتين: (1) تكوين أجسام متعددة الحويصلات (MVBs) من الجسيمات الداخلية ، عندما تنتشر أجزاء من غشاءها وتتبرعم في تجويف المقصورة لتشكيل حويصلات داخل اللمعان (ILVs) ، و (2) اندماج غشاء البلازما MVB ، الذي يطلق مركبات ILV في الوسط خارج الخلية مثل exosomes 9. ومع ذلك ، لا يمكن إجراء تمييز تجريبي واضح وحاسم بين MVs و exosomes 10. هنا ، أستخدم التصنيف المبني على الحجم أعلاه.

على مدى السنوات القليلة الماضية ، حظيت exosomes باهتمام كبير 8 ، وأنا استخدمها لتوضيح قلقي. تحتوي الإكسوسومات على طيف متغير من الجزيئات المغلقة داخل الحويصلات وعلى غشاءها ، مثل بروتينات الإشارة والمستقبلات ، والبروتينات المستجيبة ، والدهون ، والحمض النووي ، وشحنة الحمض النووي الريبي. نمطهم خاص بالخلية الأبوية المفرزة. غالبًا ما يُنظر إلى الإكسوسومات على أنها "حزم" من المعلومات يمكنها الوصول إلى أهداف مختلفة ، وتمثل شكلاً جديدًا من أشكال الاتصال بين الخلايا. في الاتصال "الكلاسيكي" بين الخلايا ، تفرز الخلايا جزيئات معينة تعمل كإشارات للخلايا المستهدفة. في المقابل ، قد تكون exosomes قادرة على توصيل المزيد من الإشارات والمزيد من المعلومات إلى الخلايا المستقبلة ، مما يسمح باستجابة خلوية أكثر تعقيدًا 11-13. أحد المفاهيم المهمة هو أن exosomes يمكن أن توفر تبادلًا للمعلومات الجينية ، بشكل أساسي في شكل mRNA أو microRNAs 14. من الناحية النظرية ، يمكن نقل هذه المعلومات عبر مسافات طويلة.

ومع ذلك ، كان من الصعب تقييم الأهمية الفسيولوجية للأكسوسومات لأن أصلها وتكوينها الحيوي وآليات إفرازها لا تزال غامضة 8. تعتمد المفاهيم الجديدة بشكل أساسي على البيانات الجزيئية والخلوية في المختبر ، لكن الدليل المباشر لدور الإكسوسومات في الجسم الحي غير موجود حاليًا. لإثبات هذا المفهوم ، يحتاج المرء إلى أدوات خاصة لتثبيط أو زيادة إفراز الجسيمات الخارجية أو امتصاصها ، دون التأثير على إفراز حويصلات الغشاء الأخرى والإفراز العام للبروتينات أو الوسطاء الدهني 1 ، 9 ، 15. حتى الآن لم تنجح هذه المحاولات (انظر المراجعات أعلاه). لذلك ، لا توجد طريقة لتزوير الفرضية حول نقل المعلومات بواسطة exosomes حتى الآن ، وجميع المعلومات ذات الصلة هي مجرد تراكم للبيانات الداعمة. على الرغم من عدم اليقين لدى بعض المؤلفين بشأن الدور الفسيولوجي الحقيقي للإكسوسومات 1 ، 8 ، 9 ، 17 ، فإن الرأي السائد حاليًا هو أن الإكسوسومات قد تحمل "إمكانات معززة" في تدفق المعلومات بين الخلايا وتفتح "حقبة جديدة" في الدراسة الاتصالات بين الخلايا (انظر على سبيل المثال 3 ، 10 ، 11 ، 18-21). بالإضافة إلى ذلك ، تم اقتراح تطبيقات عملية رائعة 14.


الملخص

Exosomes هي جزيئات نانوية شائعة مرتبطة بالغشاء وتحتوي على جزيئات حيوية متنوعة ، مثل الدهون والبروتينات والأحماض النووية. تُشتق الإكسوسومات من الخلايا من خلال الإفراز الخلوي ، وتبتلعها الخلايا المستهدفة ، ويمكنها نقل الإشارات البيولوجية بين الخلايا المحلية أو البعيدة. يعتبر إفراز الجسيمات الخارجية ظاهرة تكوينية تشارك في كل من العمليات الفسيولوجية والمرضية وتحدد كل من جزيئات السطح الخارجي ومحتوياته. ومن ثم ، يمكننا استغلال exosomes كمؤشرات حيوية ولقاحات وناقلات للأدوية وتعديلها بشكل منطقي للتدخلات العلاجية. ومع ذلك ، لا يزال من الصعب تحديد وعزل وتحديد كمية exosomes بدقة وكفاءة وانتقائية. سوف تستكشف المزيد من الدراسات حول exosomes إمكاناتها في الطب الترجمي وتوفر طرقًا جديدة لإنشاء تشخيصات سريرية فعالة واستراتيجيات علاجية ، ويمكن أن يسمى استخدام exosomes في هذه التطبيقات علاجات exosome. تصف هذه المراجعة العمليات الأساسية لتشكيل الجسم الخارجي وامتصاصه. بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضًا توضيح الأدوار الفسيولوجية والمرضية للإكسوسومات في علم الأحياء مع التركيز على كيفية استغلال الإكسوسومات أو هندستها كأدوات قوية في الطب الترجمي.

الكلمات الدالة: الجسيمات الخارجية ، الحويصلة خارج الخلية ، الطب التحويلي ، العلامات الحيوية ، توصيل الأدوية.


نتائج

بروتين مرتبط بالـ RNA موجود على سطح الخلية

لتحديد ما إذا كان ZC3H12D + تعبئة الكريات البيض ناتجًا عن الأورام الأولية ، تم إجراء فحص كيميائي مناعي (IHC) لرئتي الفئران الحاملة للورم. نشأت أورامهم من خلايا سرطان الثدي E0771 أو خلايا سرطان الرئة من لويس (LLC). زاد عدد خلايا ZC3H12D + CD45 + في الرئتين مع نمو الورم الأولي (الشكل التكميلي S1a: بيانات E0771). Zc3h12d تم تحسين التعبير في كريات الدم البيضاء المشتقة من الفئران الحاملة للورم عن طريق الرئتين الحاملة للورم في نظام زراعة في المختبر (الشكل التكميلي S1b). لأن ZC3H12D تم التعرف عليه كجينة مثبطة للورم في سرطان الغدد الليمفاوية الجريبي ومرضى سرطان الرئة 18،19 ، كما تم فحص دور ZC3H12D في ورم خبيث. يتكون الورم الأساسي من غرس E0771 في Zc3h12d- / - أظهرت الفئران 19،20 معدل نمو مشابهًا للفئران البرية (الشكل التكميلي S1c) ، مما يشير إلى أن ZC3H12D في الخلايا المضيفة قد يكون مثبطًا غير كافٍ للورم لنمو الورم الأولي السريع. ومع ذلك ، كان ورم خبيث الرئة أكثر حدة في Zc3h12d- / - مقارنة بالفئران البرية (الشكل التكميلي S1c) ، مما يعني أن ZC3H12D كان بمثابة جزيء مثبط للورم في ورم خبيث.

لتوضيح نمط توطين ZC3H12D في الخلايا المناعية التي يحفزها الورم ، لوحظ بروتين ZC3H12D في خلايا الدم وحيدة النواة (PBMCs) المشتقة من الفئران الخالية من الأورام والفئران الحاملة للورم باستخدام مقياس التدفق الخلوي. تم الكشف عن ZC3H12D على سطح خلية PBMCs من الفئران بدون أورام (الشكل 1 ب ، أعلى). لاحظ أنه تم التحقق من صحة خصوصية هذا الجسم المضاد ZC3H12D باستخدام عينة بالضربة القاضية. في المقابل ، في PBMCs من الفئران الحاملة للورم ، تم اكتشاف ZC3H12D في الكرة داخل الخلايا ولكن ليس على سطح الخلية (الشكل 1 ب ، أسفل). تم تأكيد هذا التغيير بوساطة الورم في نمط التوطين ZC3H12D بشكل أكبر باستخدام اثنين من الأجسام المضادة الأخرى المضادة لـ ZC3H12D (الشكل التكميلي S1d). وسط مكيف للورم (TCM) ، يستخدم كمزرعة للخلايا السرطانية حيث أنه من المتوقع أن يحتوي على عناصر تفرز من الخلايا السرطانية ، يتم تنظيمه ZC3H12D بعد 30 دقيقة من التحفيز على الكريات البيض الطحالية (الشكل 1 ج). بعد ثلاث ساعات ، تحرك بروتين ZC3H12D بالكامل داخل الخلية (الشكل 1 ج). نظرًا لأن ZC3H12D يعتبر بروتينًا مرتبطًا بـ RNA 21،22 ، فقد تم الاشتباه في أن الحمض النووي كان العامل المفسر في هذه الظاهرة. اللافت للنظر ، لم تؤثر المعالجة المسبقة للطب الصيني التقليدي باستخدام RNase (TCM + RNase) على نمط توطين ZC3H12D (الشكل 1 د ، لوحة الوزن). أدت إضافة الحمض النووي الريبي المعزول من الطب الصيني التقليدي إلى نفس الظاهرة (الشكل 1 د ، لوحة الوزن ، عمود RNA-TCM). تشير هذه البيانات إلى أن الحمض النووي الريبي يقود انتقال ZC3H12D. في المقابل ، لم يلاحظ هذا عند وجود الكريات البيض الطحالية من Zc3h12d- / - تم استخدام الفئران (الشكل 1 د).

أ ملخص لنموذج امتصاص الحمض النووي الريبي الذي يلتقط فيه ZC3H12D وينقل nex-mRNA إلى النواة. ب تحليل FACS لبروتين ZC3H12D السطحي وداخل الخلايا في PBMCs المستمدة من الفئران بدون أورام أو الفئران الحاملة للورم. تم استخدام العديد من الأجسام المضادة لـ ZC3H12D (الخط الغامق رقم 1 في الشكل 1 ورقم 2 و 3 في الشكل التكميلي S1d) وجسم مضاد للنمط المتماثل (خط متقطع). ج حركية تعبير ZC3H12D في كريات الدم البيضاء الطحالية بعد التحفيز بواسطة الطب الصيني التقليدي. بار ، 5 ميكرومتر. اعيدت الاختبارات مرتين بنفس النتائج. يظهر التحقق من صحة الجسم المضاد لـ ZC3H12D في الشكل التكميلي S10 (استراتيجية التحقق من الصحة والبوابة). د تحليل التدفق الخلوي لـ ZC3H12D على سطح الكريات البيض الطحالية المشتقة من النوع البري و Zc3h12d- / - الفئران بعد 3 ساعات من تحفيز الطب الصيني التقليدي المعالج بـ DNase أو RNase. NoCM ، التحكم في سم بدون الخلايا السرطانية. لا تسبب إضافة RNase A إلى TCM دخول الخلايا ZC3H12D (TCM + RNase). الحد من سطح ZC3H12D بعد تطبيق الحمض النووي الريبي المنقى من الطب الصيني التقليدي (RNA-TCM). إشارات ZC3H12D بتنسيق Zc3h12d- / - كانت الكريات البيض في الفأر ناتجة عن ارتباط غير محدد بالأجسام المضادة. ه نظام الكشف عن IL1β-مرنا باستخدام اثنين من الاشعال RT ومسبار TaqMan qPCR (أعلى). تحليل PCR في الوقت الحقيقي لـ IL1β-mRNA في CM الرئة المزروع مع TCMs مختلفة ، مثل LLC-TCM ، E0771-TCM ، و B16-TCM ، مقدمة على أنها LTCM ، ETCM ، و BTCM ، على التوالي (ن = 8 و 8 و 7 و 8 عينات مستقلة بيولوجيًا لـ NoCM و LTCM و ETCM و BTCM ، على التوالي). الكشف الخافت عن IL1β-mRNA في سم الكبد المزروع بمختلف أنواع الطب الصيني التقليدي (ن = 9 عينات مستقلة بيولوجيا). F مخطط عزل الحمض النووي الريبي من الطب الصيني التقليدي و CM للرئة المفوضية الأوروبية. كشف qPCR من حIL1β-mRNA في TCMs بعد حضانة خلايا سرطان الثدي البشرية ، بما في ذلك MCF7 و MDAMB231 و T47D و HCC1954 (أسفل اليسار ، ن = 3 و 5 و 3 و 3 و 5 عينات مستقلة بيولوجيًا لـ no و MCF7 و T47D و HCC1954 و MDAMB231 على التوالي). إفراز حIL1β-mRNA من رئة بشرية تحفزها أشكال مختلفة من الطب الصيني التقليدي (أسفل اليمين ، ن = 4 و 3 و 6 و 6 و 8 عينات مستقلة بيولوجيًا لـ لا ، MCF7 ، T47D ، HCC1954 ، و MDAMB231 ، على التوالي). "لا" ، لا توجد خلايا سرطانية. ز تصوير عزل الحمض النووي الريبي خارج الجسد و exosome. ح نسبة الحمض النووي الريبي غير المفصلي (الحمض النووي الريبي خارج الجسد) مقارنة بالحمض النووي الريبي الخارجي في MDAMB231-TCM. أنا نسبة الحمض النووي الريبي خارج الجنس مقارنة مع الحمض النووي الريبي exosome في وسط ثقافة الرئة الماوس مع التحكم CM أو TCM. ي تحليل qPCR بعد الفخ المباشر للـ mRNA غير المفصلي بواسطة حبات البروتين ZC3H12D. يتم عرض البيانات التمثيلية في الرسم البياني. بيانات التجربة المتكررة ذات الصلة د و حي تظهر في الشكل التكميلي S9. في الرسوم البيانية ، المتوسطات ± SEM ونتائج الطالب ريتم عرض -test أو ANOVA أحادية الاتجاه. ال ص تظهر القيم في الشكل. يتم توفير بيانات المصدر كملف بيانات المصدر.

غير عضوي انترلوكين 1β (IL1β) - تم الكشف عن مرنا في الطب الصيني التقليدي الرئة

تحتوي البيئة المرتبطة بالورم على الحمض النووي الريبي خارج الخلية (exRNA) المرتبط بالحويصلات المجهرية والإكسوسومات والبروتينات الريبية (RNPs). استنادًا إلى البيانات التي تسبب فيها الطب الصيني التقليدي (TCM) في الاستجابة المعتمدة على الحمض النووي الريبي لموقع ZC3H12D (الشكل 1 د) ، تم افتراض أن بعض exRNA 23 المحدد يرتبط بـ ZC3H12D. نظرًا لأنه يجب تعريض exRNA لبروتين ZC3H12D على الكريات البيض ، حاول المؤلفون فحص exRNA غير المفصلي (nex-RNA) الذي زاد في بيئة الرئة المكروية التي حفزها الورم. تم إجراء تحليل ميكروأري على الرئة EC TCM. يتم سرد أفضل 20 جينًا مصنّفًا في الجدول التكميلي S2. ثم بحث المؤلفون عن اختلافات الرنا المرسال في التعبير بين النوع البري و Zc3h12d- / - طحال الفأر. تم اختيار الطحال لأن لديهم أعلى تعبير عن ZC3H12D مقارنة بالأعضاء الأخرى التي تم اختبارها في هذه الدراسة. كان الأساس المنطقي هو أن تأثيرات استنفاد ZC3H12D يمكن رؤيتها من خلال مقارنة النوع البري و Zc3h12d- / - بيانات الطحال. كشفت هذه المقارنة أن غلوبولين مناعي κ متغير (إيغكف), يقاوم مثل γ (ريتنلج), IL1β، و المصفوفة metallopeptidase 8 (ممب 8) تم تنظيمها في Zc3h12d- / - عينة (الجدول التكميلي S3). من بين الجينات المنتظمة ، ركزت هذه الدراسة على IL1β-mRNA لأن هذا الجين أظهر تعبيرًا مرتفعًا نسبيًا عن nex-RNA المشتق من خلايا الرئة المحفزة بـ TCM (الجدول التكميلي S2). أيضا، βactin تم اختياره كعنصر تحكم سلبي في هذه الدراسة لأنه وجد بكثرة في الرئتين المحفزة بالطب الصيني التقليدي (الجدول التكميلي S2) ، ولم تتغير مستويات تعبيره بين النوع البري و Zc3h12d- / - الفئران (الجدول التكميلي S3). أولا ، اختبرت هذه الدراسة ما إذا كان IL1βتم اكتشاف -mRNA في الطب الصيني التقليدي بالرئة المحضرة بواسطة الزراعة المشتركة لعينات الرئة مع مختلف أنواع الطب الصيني التقليدي باستخدام خلايا سرطان الجلد LLC أو E0771 أو B16. لتحديد مستويات التعبير النسبي لـ IL1β-mRNA ، تم استخدام تمهيدي خاص بالجينات (GSP) للتوليف الأول في النسخ العكسي الكمي - تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-qPCR الشكل. 1e ، أعلى). في الشكل 1 هـ ، احتوت نماذج الطب الصيني التقليدي على كميات أكبر من IL1β-mRNA من CM غير المنبه للرئة ، في حين أن الطب الصيني التقليدي للكبد كانت بكميات أقل من الطب الصيني التقليدي للرئة. لتقدير الإنسان خارج الخلية (ح)IL1β-تم جمع mRNA و CMs من خلايا سرطان الثدي البشرية ، بما في ذلك MCF7 و MDAMB231 و T47D و HCC1954 (الشكل 1f ، على اليسار). جنبا إلى جنب مع هذه العينات ، hIL1β-تم تحليل mRNA أيضًا في CM من ECs في الرئة البشرية التي تم تحفيزها بواسطة TCMs المذكورة أعلاه (الشكل 1f ، على اليمين) لأن وسط زراعة رئة الفأر محفز باستخدام الماوس TCM المحتوي على TCM (م)IL1β-مرنا (الشكل 1 هـ). بعد ذلك ، بحثت هذه الدراسة في ما إذا كان هناك غير مفصلي IL1β-mRNA في الطب الصيني التقليدي لسرطان الثدي البشري لأنه تم الإبلاغ عن أن ثقافة الخلايا الجذعية للورم الدبقي البشري تحتوي على mRNA في EVs و RNPs غير المفصلية 24. شروط العزلة للكسور غير المفصلية (تسمى خارج الجسد) والكسور الخارجي (الشكل 1 جم) أنشأناها أولاً ، وتم التحقق من صحة النتائج بواسطة qPCR المستندة إلى مسبار TaqMan و RPLP2 و RPS27 (الشكل 1 ح). وشملت MDAMB231-TCM أكثر من ساعةIL1β-مرنا في جزء خارج الجسد من جزء exosome (الشكل 1 ح). خارج الجسم مIL1β-تمت زيادة mRNA في TCM في رئة الفأر (الشكل 1i) واعتبرت PolyA (+) ، حيث تم نسخها عكسيًا باستخدام التمهيدي oligo (dT) (الشكل التكميلي S1e). أكد GSP-RT-qPCR أيضًا زيادة مIL1β-مرنا في الطب الصيني التقليدي الرئة (الشكل التكميلي S1e). أيضا ، غير حويصلي مIL1β-تم التقاط مرنا في الفئران المحفزة بالطب الصيني التقليدي مباشرة بواسطة حبات البروتين ZC3H12D (الشكل 1 ي). في المقابل ، مرنا من اكتين ، جاب ، ريتينلج, mmp8، و إيغكف لم يتم إثرائها بواسطة حبة المنسدلة (الشكل 1 ي mmp8 و إيغكف لم يتم الكشف عنها).

ZC3H12D يرتبط بـ nex-IL1β-مرنا

تم فحص ما إذا كان nex-mRNA يمكن أن يرتبط بـ ZC3H12D على سطح الخلية بعد ذلك. تم استخدام ZC3H12D لأنه يتم التعبير عنه في الفئران RAW 264.7 خلايا البلاعم 21.25 وخلايا THP1 البشرية 26. لتصور التفاعل بين IL1β-تم إنشاء بروتين mRNA و ZC3H12D ، وهو خط خلية RAW مفرط التعبير mZC3H12D (ZC + RAW) ، وفلوريسين أيزوثيوسيانات (FITC) - المسمى IL1β-تم تطبيق مرنا. بعد ثلاثين دقيقة من تحفيز الطب الصيني التقليدي ، كانت إشارات التلون في خلايا ZC + RAW أكثر بروزًا (Pearson’s ص = 0.47 ± 0.04 ن = 3) من الخلايا التي يتم تحفيزها بواسطة التحكم NOCM (الشكل 2 أ ، السهم والشكل التكميلي S2a). في خلايا ZC3H12D + THP1 المعزولة باستخدام فارز الخلايا والجسم المضاد لـ ZC3H12D ، لوحظت إشارات تكوّن متشابهة بعد التقديم. IL1β-مرنا-FITC (الشكل التكميلي S2b Pearson’s ر = 0.62 ± 0.08 ن = 3). ما إذا كان هناك تفاعل مباشر بين IL1β-تم أيضًا فحص mRNA في الرئة TCM وبروتين ZC3H12D. بعد تطبيق الطب الصيني التقليدي للرئة على خلايا ZC + RAW ، عولجت الخلايا بالإشعاع فوق البنفسجي (UV) لإصلاح الحمض النووي الريبي على البروتينات. بعد ذلك ، تم عزل بروتين ZC3H12D بعلامة FLAG باستخدام خرز مغناطيسي مضاد لـ FLAG ، ومقدار IL1β-تم قياس كمية مرنا المرتبط بحبات ZC3H12D-FLAG بواسطة RT-qPCR. أظهرت البيانات أن البروتين ZC3H12D غني IL1β-مرنا في خلايا ZC + RAW (الشكل 2 ب). في المقابل ، فإن جاب- و βactin- أظهر التحكم في الرنا المرسال القليل من الإثراء في الحالة (الشكل 2 ب). التفاعلات المباشرة بين بروتين ZC3H12D و IL1β-تم فحص mRNA باستخدام التحليل الطيفي للارتباط الفلوري (FCS). تم استخدام هذه التقنية لإثبات وجود تفاعل مباشر بين البروتين والحمض النووي الريبي في المختبر 27. تم إنشاء منحنيات الارتباط الخاصة بـ ZC3H12D المسمى مضان في وجود βactin- أو IL1β-مرنا (الشكل 2 ج). كشف تركيب المنحنى أن بيانات FCS عبارة عن مزيج من ثلاثة عناصر: بروتين ZC3H12D ومركب ZC3H12D-RNA ومكون سريع التحلل. تم تقييم نسبة مركب البروتين- RNA بناءً على نسبة العناصر (الشكل 2 د). تشير بيانات FCS إلى أن ثابت التفكك لـ ZC3H12D- βactin- و IL1β-كانت مرنا في حدود 1 نانومتر. تم التأكيد أيضًا على أن 3′-UTR من IL1β-كان للـ mRNA تفاعل مباشر مع بروتين ZC3H12D (الشكل 2 هـ ، و). لأن 3′-UTR من IL1β-يحتوي mRNA على تسلسل مختلف عن βactin-مرنا ، قد يشتمل الارتباط على تفاعلات غير محددة ومحددة التسلسل في المختبر.

أ صور تمثيلية تظهر كولوكلييشن من IL1β-مرنا-FITC و ZC3H12D في خلايا RAW ZC3H12D-overexpressing (ZC + RAW) 30 دقيقة بعد تحفيز TCM. الصورة بعد التحفيز بواسطة NoCM كما يظهر عنصر التحكم في الشكل التكميلي S2a. تم عرض البيانات المدمجة مع علامة خيوط الأكتين ، و phalloidin ، و DAPI. قضبان ، 5 ميكرومتر.اعيدت الاختبارات مرتين بنفس النتائج. ب تحليل اللطخة الغربية لـ RAW و ZC + RAW. تم الكشف عن الأجسام المضادة لـ ZC3H12D والأجسام المضادة لـ FLAG التي تحمل علامة FLAG (C-term) ZC3H12D ، ويتم عرض ZC3H12D المناعي بعد تطبيق TCM بالإضافة إلى الارتباط المتشابك للأشعة فوق البنفسجية (أعلى). تجليد IL1β-تم الكشف عن mRNA في الرئة TCM (أسفل) إلى ZC3H12D-FLAG بواسطة تحليلات qPCR. تم عرض متوسطات تجربتين مستقلتين في الرسوم البيانية. بيانات التجربة المتكررة ذات الصلة IL1β-RNA تظهر في الشكل التكميلي S9. ج, ه منحنيات الارتباط التلقائي التي تم الحصول عليها بواسطة قياسات FCS لبروتين ZC3H12D المسمى في غياب ووجود الحمض النووي الريبي غير المسمى. تم خلط بروتين ZC3H12D المسمى Alexa Fluor 488 (1 نانومتر ، الخط المنقط) بتركيزات مختلفة من الماوس IL1β-RNA (10 نانومتر ، خط صلب (أحمر)) أو βactin-RNA (10 نانومتر ، خط صلب (أزرق)) (ج)، و IL1β(3′-UTR) -RNA (5 نانومتر ، خط صلب (أرجواني)) أو IL1β(3′-UTR) -RNA (10 نانومتر ، خط صلب (أرجواني)) (ه). د, F كسور معقد ZC3H12D-RNA بالنسبة إلى المحتوى الكلي لـ ZC3H12D التي تم الحصول عليها من خلال تحليل ثلاثي المكونات لبيانات الارتباط التلقائي. يتم توفير بيانات المصدر كملف بيانات المصدر.

ZC3H12D ينقل نيكس-IL1β-مرنا في النواة

لتحديد الخواص الحركية داخل الخلايا IL1β-تم التقاط mRNA بواسطة ZC3H12D ، أجريت تحليلات الخلايا ثلاثية الأبعاد (3D) باستخدام سلسلة من z-كومة صور مجهرية متحد البؤر. 5′-Cap و 3′-Poly (A) هي هياكل مميزة لحقيقية النواة mRNA 28،29 لذلك ، FITC المسمى عارية IL1β-تم اختبار mRNA و 5′-Cap و 3′-Poly (A) في هذا الاختبار. والمثير للدهشة أن كلاهما لوحظ في نواة خلايا ZC + RAW بعد 3 ساعات من التطبيق. IL1β-مرنا-Cap (+) PolyA (+) - لوحظ FITC بشكل أكثر وضوحًا من IL1β-مرنا-FITC في النواة ، في حين أن السيطرة βactin-مرنا-Cap (+) PolyA (+) - لم تعط FITC أي إشارة تقريبًا (الشكل 3 أ على اليسار). لتقييم ما إذا كانت خارجية IL1β-تمت ترجمة mRNA لتعديل الخلية وظيفيًا ، IL1β-مرنا مع طفرات لا معنى لها (IL1β-قف-مرنا). يحتوي هذا الحمض النووي الريبي على ثلاث طفرات توقف في كودون في تسلسل تشفير البروتين (CDS) لعدم توليد بروتين IL1β. ومن المثير للاهتمام، IL1β-قف-يتم نقل mRNA بوضوح إلى النواة (الشكل 3 أ ، على اليمين). يبدو أن ZC3H12D ينتقل إلى البقع استنادًا إلى بيانات المناعة التي أظهر ZC3H12D تكلفة سائدة نسبيًا باستخدام SC35 ، علامة البقعة 30 ، بدلاً من علامات الجسم النووي الأخرى ، مثل سرطان الدم النخاعي (PML) ، fibrillarin ، و SFPQ لجسم PML ، النواة ، والنقشة ، على التوالي (الشكل التكميلي S2c ، d). أيضًا ، أظهر تحليل التدفق الخلوي لخلايا THP1 أن تعبير سطح الخلية ZC3H12D لوحظ في 0.3 ٪ من الخلايا مع تحفيز CM. في المقابل ، انخفض عدد السكان إلى 0.1٪ في وجود تحفيز الطب الصيني التقليدي. يشير هذا الانخفاض إلى أن الطب الصيني التقليدي حفز الاستيعاب داخل الخلايا لـ ZC3H12D من سطح الخلية. تم دمج خلايا ZC3H12D + THP1 IL1β-مرنا و IL1β-قف-mRNA في النواة ، على الرغم من أن الإشارات كانت أضعف من الخلايا القاتلة الطبيعية (الشكل التكميلي S3a). لتحديد كمية الحمض النووي الريبي الخارجي المنقولة إلى النواة ، خيمري IL1β-تم تصنيع mRNA من خلال الجمع بين 5′-hIL1β-مرنا و 3 ميكرومترIL1β-مرنا (الشكل 3 ب). لاحظ أنه تم تصميم مسبار qPCR لتضخيم hIL1β-يقع mRNA في منطقة 5′ ولكن ليس نصوص الماوس الداخلية (أعلى ، الشكل 3 ب ، انظر الشكل التكميلي S3b لمزيد من التفاصيل). تشير هذه البيانات إلى أن الحمض النووي الريبي الخيمري قد تم نقله إلى النواة بغض النظر عن تعديل الغطاء أو بولي (أ) (الشكل 3 ب ، أسفل اليسار) ، على الرغم من اكتشاف كميات صغيرة في السيتوبلازم (الشكل 3 ب ، أسفل اليمين). لتأكيد تورط ZC3H12D في هذه الظاهرة ، تم تكرار هذا الاختبار باستخدام خلايا B220 + CD11c + NK1.1 + 16،31 مشتقة من النوع البري المحفز بواسطة TCM Zc3h12d-/- الفئران. توطين IL1β-مرنا-FITC و IL1β-قف-مرنا-كان FITC في نواة خلايا الفأر البرية بارزة 3 ساعات بعد التطبيق (الشكل 3 ج). في المقابل ، كان هناك حد أدنى من الإشارات في نوى تلك الخلايا من Zc3h12d- / - الفئران (الشكل 3 ج).

أ مجهر متحد البؤر مضان لـ ZC + RAW بعد تطبيق 10 نانوغرام / مل غير المسمى IL1β-مرنا ، المسمى FITC βactin-مرنا و IL1β-mRNA مع أو بدون Cap-Poly (A) (CP). يتم عرض الصور ثلاثية الأبعاد (على اليسار). التحليل الكمي لـ RNA-FITC في النواة (يمين). IL1β-قف-يحتوي mRNA على ثلاث طفرات توقف في كودون CDS (أعلى). غير المسمى IL1β-تم استخدام mRNA كعنصر تحكم أساسي لإشارة FITC (ن = 5 و 5 و 5 و 4 و 5 خلايا لغير المسمى IL1β-RNA ، المسمى FITC βactin-RNA ، جاب-RNA ، IL1β-RNA و IL1β-stop-RNA على التوالي). تظهر بيانات التجربة المتكررة في الشكل التكميلي S9. ب نظام كشف خارجي IL1β-مرنا باستخدام الفأر البشري الوهم IL1β-مرنا (IL1β-chimera) متبوعًا بنسخ عكسي باستخدام مسبار 3′-mGSP ومسبار 5′ بشري في تحليل RT-qPCR (أعلى مزيد من التفاصيل في الشكل التكميلي S3b). الكشف عن IL1β- دخول الحمض النووي الريبي الكيميري إلى ZC + RAW. الحمض النووي الريبي النووي والهيولي هواء حار و βactin تطبيع الحمض النووي الريبي النووي والحمض النووي الريبي السيتوبلازمي ، على التوالي (ن = 7 و 8 و 8 و 8 و 8 عينات مستقلة بيولوجيًا لمدة 0 و 30 و 120 دقيقة مع IL1β-الكيميرا ، 30 و 120 دقيقة مع IL1β-chimera-CP ، على التوالي). ج عرض الصور ثلاثية الأبعاد IL1β-مرنا-FITC و IL1β-وقف- مرنا-امتصاص FITC في نواة خلايا B220 + CD11c + NK1.1 + المشتقة من النوع البري المحفز بالطب الصيني التقليدي Zc3h12d- / - الفئران 3 ساعات بعد تطبيق 10 نانوغرام / مل من الحمض النووي الريبي (أعلى). التحليل الكمي لـ RNA-FITC في نواة خلايا B220 + CD11c + NK1.1 + من فئران من النوع البري (أسفل اليسار ، ن = 6 و 4 و 6 و 6 و 6 خلايا لغير المسمى IL1β-RNA ، المسمى FITC βactin-RNA ، جاب-RNA ، IL1β-RNA و IL1β-stop-RNA على التوالي) ومن Zc3h12d- / - الفئران (أسفل اليمين ، ن = 6 و 6 و 6 و 6 و 5 خلايا لغير المسمى IL1β-RNA ، المسمى FITC βactin-RNA ، جاب-RNA ، IL1β-RNA و IL1β-stop-RNA على التوالي). د مجهر متحد البؤر مضان لـ ZC + RAW بعد إضافة FITC المسمى βactin-mRNA ، الطول الكامل ، CDS ، أو 3′-UTR من IL1β-مرنا (أعلى). التحليل الكمي 10 نانوغرام / مل IL1β-نواة مرنا تعتمد على المجال (أسفل ن = 10 و 10 و 11 و 10 و 10 خلايا لغير المسمى IL1β-RNA ، المسمى FITC βactin-RNA ، الطول الكامل ، CDS ، و 3’UTR من IL1β-RNA ، على التوالي). في هذا التحليل ، تم الحصول على 15 صورة ثلاثية الأبعاد مكدسة من أسفل إلى أعلى النواة. بار ، 5 ميكرومتر. في الرسوم البيانية ، يتم عرض المتوسطات ± SEM ونتائج ANOVA أحادية الاتجاه مع تصحيح Bonferroni. ال ص تظهر القيم في الشكل. يتم توفير بيانات المصدر كملف بيانات المصدر.

يتعرف ZC3H12D على 3′-UTR من IL1β-مرنا

تم فحص امتصاص خاص بالتسلسل عبر بروتين ZC3H12D باستخدام IL1β-مرنا. لهذا الغرض ، اثنان جزئي IL1βتم تحضير -mRNA و CDS و 3′-UTR لأول مرة. الأول يتكون من 5′-UTR قصير و CDS لإعطاء 897 nt والأخير بطول 451 nt. تم اختبار هذه الحمض النووي الريبي في اختبار امتصاص الخلية (الشكل ثلاثي الأبعاد). امتصاص المسمى FITC IL1β-(3-UTR) - كان مرنا في ZC + RAW أكبر من IL1β- (CDS) - mRNA (الشكل ثلاثي الأبعاد). علاوة على ذلك ، قبل الحضانة مع IL1β- (3′-UTR) -منعت mRNA امتصاص الطول الكامل المسمى FITC IL1β-mRNA في النواة ، لكن لا IL1β- (CDS) -مرنا ولا βactin-الرنا المرسال كان هذا التأثير (الشكل التكميلي S3c). مجتمعة ، 3′-UTR في IL1βيتم التعرف على -mRNA بواسطة خلايا ZC + RAW بطريقة خاصة بالمنطقة.

تتعرف بعض البروتينات المرتبطة بـ RNA على العناصر الغنية بـ AU (AREs) و / أو هياكل الحلقة الجذعية في 3′-UTR للتحكم في استقرار mRNA الهدف 32. في هذه الدراسة ، كشف اختبار تحول الحركة الكهربي (EMSA) أن ZC3H12D مرتبط بمواقع محددة من الحمض النووي الريبي أحادي الشريطة (ssRNA) مع 50 nt في 3′-UTR من IL1β-مرنا (الشكل 4 أ ، مسبار رقم 5 في الشكل 4 ب والشكل التكميلي S4a). تم تأكيد هذا الارتباط عن طريق مقايسة التثبيط باستخدام أليغنوكليوتيد الحمض النووي الريبي البارد (الشكل 4 أ ، ج). تشير هذه البيانات إلى أن ZC3H12D يتفاعل مع عناصر كبيرة نسبيًا حول المناطق في IL1β-مرنا مع عدم وجود تسلسل حلقة جذعية نموذجية. كشفت فحوصات المنافسة اللاحقة أن موقع ربط ZC3H12D يحتوي على تسلسل نموذجي غني بالاتحاد الأفريقي (UAUUUAU) ولكن شظاياها القصيرة (20 nt) أظهرت ارتباطات أقل بكثير من 50 nt oligonucleotide (الشكل 4 أ ، د والشكل التكميلي S4b) . في النواة ، من المتوقع أن يتم فقد الارتباط في ظل ظروف مع بروتينات أخرى مرتبطة بـ ARE ، مثل HuR 33.

أ مخطط لتحديد موقع ربط ZC3H12D بالمترIL1β-مرنا (NM_008361) 3′-UTR. يشير كل رقم إلى موضع النوكليوتيدات. ب EMSA. مIL1β مجسات (تحقيقات EMSA 1–9 انظر الشكل التكميلي S4a للتسلسل. يتم عرض مواضع النيوكليوتيدات لكل مسبار في الأعلى) مع أو بدون بروتين ZC3H12D. يبلغ طول المجسات من 1 إلى 9 50 nt ، والطرف 3′ موصوف بالبيوتين. يشير السهم إلى تحول النطاق بسبب ارتباط hZC3H12D بالمسبار 5. ج مقايسة مسابقة EMSA. تم خلط بروتين ZC3H12D والمسبار المسمى بالبيوتين 5 (50 نانومتر) بكمية زائدة 100 ضعف من المجسات غير المسمى 1–9 (5 ميكرومتر). د مقايسة مسابقة EMSA. تم خلط بروتين ZC3H12D والمسبار المسمى بالبيوتين 5 (50 نانومتر) بكمية زائدة 100 ضعف من المجسات غير المسمى 5-1-5-7 (5 ميكرومتر). يبلغ طول المنافسين 20 نيوتن وجزء من المسبار 5 (الشكل التكميلي S4b). يشير الرسم البياني إلى الكثافة النسبية للنطاق العلوي [= النطاق العلوي / (النطاق العلوي + النطاق السفلي) × 100]. موضع الشريط العلوي محدد بسهم. اعيدت الاختبارات مرتين بنفس النتائج. يتم توفير بيانات المصدر كملف بيانات المصدر.

قد لا يدعم Regnase-1 امتصاص الحمض النووي الريبي

تشارك العديد من بروتينات ZF في استقلاب الحمض النووي الريبي داخل الخلايا في المناعة الفطرية 32. من بين عائلة ZC3H12 ، تنظم ZC3H12A (المعروف أيضًا باسم Regnase-1) IL6-مرنا مع الارتباط بالحلقة الجذعية في 3 ′-UTR 34،35،36. أيضًا ، من المحتمل أن يتفاعل ZC3H12D مع ZC3H12A 21. ما إذا كان ZC3H12A له وظيفة تعاونية في الامتصاص المعتمد على ZC3H12D لـ IL1β-لذلك تم التحقيق في مرنا. في بيانات ميكروأري (الجدول التكميلي S3) ، Zc3h12a مستويات التعبير في Zc3h12d- / - كان الطحال قريبًا من الطحال من النوع البري. تم فحص ملفات تعريف التعبير الجيني لخلايا B220 + CD11c + NK1.1 + NK في الرئتين والكبد الحاملة للورم. أظهرت البيانات ذلك Zc3h12d تم تنظيمه بشكل ملحوظ أثناء نقل الخلايا من الكبد إلى الرئتين ، بينما Zc3h12a كان التعبير ثابتًا (الجدول التكميلي S1) وهذا يشير إلى عدم وجود علاقة مباشرة بين التعبير عن Zc3h12a و Zc3h12d. كشفت إشارة ZC3H12D عن نمط مماثل في خلايا B220 + CD11c + NK1.1 + NK المشتقة من Zc3h12a –/– (ريجناس -1- / -) الفئران والفئران من النوع البري (الشكل التكميلي S5a). بشكل متناسق ، عرضت الخلايا القاتلة الطبيعية المستمدة من كلا الطرز الوراثية IL1β-امتصاص الرنا المرسال في النواة (الشكل 5 أ ، الشكل التكميلي الأيمن S5b) عند اشتقاق هذه الخلايا من Zc3h12d- / - فقدت الفئران الامتصاص مرة أخرى (الشكل 5 أ ، الشكل التكميلي الأيسر S5b). أشارت هذه البيانات إلى أن ZC3H12A قد لا تشارك في نظام الامتصاص المعتمد على ZC3H12D في خلايا B220 + CD11c + NK1.1 + NK.

أ امتصاص الحمض النووي الريبي في خلايا B220 + CD11c + NK1.1 + مشتقة من النوع البري ، Zc3h12d-/-، و ريجناس -1–/– (Zc3h12a - / -) الفئران 3 ساعات بعد تطبيق 10 نانوغرام / مل βactin-mRNA-CP-FITC و IL1β-مرنا- CP-FITC. تظهر الكميات لإشارة FITC في نواة الخلية B220 + CD11c + NK1.1 + (يسار ، ن = 14 و 17 و 8 و 15 خلية من النوع البري و Zc3h12d- / - فئران βactin-RNA و IL1β-RNA ، على التوالي. حق، ن = 7 و 21 و 7 و 21 خلية من النوع البري و ريجناس -1- / - فئران βactin-RNA و IL1β-RNA ، 15 صورة z-stack على التوالي لكل خلية). الأعمار من ريجناس -1- / - كانت الفئران قريبة من Zc3h12d-/- الفئران. ب المناعة التمثيلية لـ phospho-H2AX في نواة خلايا B220 + CD11c + NK1.1 + 3 ساعات بعد امتصاص IL1β-mRNA-CP (أعلى). التحليل الكمي لـ phospho-H2AX في خلايا B220 + CD11c + NK1.1 + مشتقة من الخلايا البرية و Zc3h12d- / - الفئران 3 ساعات بعد امتصاص βactin-مرنا- CP فجوة-مرنا- CP IL1β-mRNA-CP و IL1β-قف-مرنا- CP (ن = 3 عينات مستقلة بيولوجيا). بار ، 5 ميكرومتر. ج الدورة الزمنية للنخر الثانوي في خلايا B220 + CD11c + NK1.1 + مشتقة من النوع البري المحفز بالطب الصيني التقليدي و Zc3h12d- / - (Homo) الفئران في تطبيق 20 نانوغرام / مل من الحمض النووي الريبي. βactin-مرنا- CP ، IL1β-mRNA-CP و IL1β- توقف-تم تصوير mRNA-CP على أنها actb و IL1b و IL1b-stop على التوالي. يشير التتبع في الوقت الحقيقي لصبغة الحمض النووي الفلوريسين إلى فقدان سلامة الغشاء مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج في المرحلة المتأخرة. د نظام الكشف عنIL1β-مرنا مرتبط بـ Pol II في خلايا ZC + RAW (يسار). تحليل PCR في الوقت الحقيقي لـ IL1β-الوهم-مرنا مرتبط بـ Pol II في النواة. الجسم المضاد لوسيفيراز (لوك) هو عنصر التحكم (ن = 3 عينات مستقلة بيولوجيا). ه الكميات المشتقة من qPCR IL1rn و Dusp1 التعبير في الحمض النووي الريبي النووي لـ ZC + RAW بعد تطبيق IL1β-شيميرا- مرنا (ن = 5 و 6 عينات مستقلة بيولوجيًا في 30 و 120 دقيقة ، و ن = 12 عينة مستقلة بيولوجيًا في 30 و 120 دقيقة لـ IL1rn و Dusp1 ، على التوالي). F الكميات المشتقة من qPCR IL1rn و Dusp1 التعبير في خلايا B220 + CD11c + NK1.1 + بعد تطبيق βactin-مرنا و IL1β-مرنا. يتم عرض البيانات التمثيلية في الرسم البياني. تظهر بيانات التجربة المتكررة في الشكل التكميلي S9. في الرسوم البيانية ، المتوسطات ± SEM ونتائج الطالب ر- يتم عرض الاختبار (على الوجهين) أو أحادي الاتجاه ANOVA مع تصحيح Bonferroni. ال ص تظهر القيم في الشكل. يتم توفير بيانات المصدر كملف بيانات المصدر.

مجرور IL1β- قد يكون للـ mRNA في النواة وظائف

متي IL1βتم تطبيق -mRNA مع أو بدون غطاء (+) PolyA (+) على خلايا B220 + CD11c + NK1.1 + ، IL1β-مرنا-Cap (+) PolyA (+) - تم اكتشاف FITC بشكل أكثر وضوحًا من IL1β-مرنا-FITC في نواة خلايا B220 + CD11c + NK1.1 + من فئران من النوع البري. فى المقابل، IL1β-تم تجميع mRNA-FITC خارج نوى Zc3h12d-/- الفئران. ومن المثير للاهتمام ، أن بعض الخلايا البرية أظهرت نواة غير منتظمة 6 ساعات بعد تطبيق غطاء 20-100 نانوغرام / مل (+) بولي أ (+) (الشكل التكميلي S5c ، 100 نانوغرام / مل). لإزالة احتمال أن يكون شكل النواة غير المنتظم هذا ناتجًا عن إضافة مواد معدلة من FITC ، لوحظت نفس الظاهرة باستخدام غير مسمى IL1β-مرنا. في هذه الحالة ، لوحظت زيادة في فسفرة هيستون H2AX ، وهي علامة لإجهاد / تلف الحمض النووي 37 ، في نواة خلايا B220 + CD11c + NK1.1 + من فئران من النوع البري ولكن لم يتم ملاحظتها في Zc3h12d- / - الفئران (الشكل 5 ب). خلايا B220 + CD11c + NK1.1 + مشتقة من ريجناس -1- / - أظهر الفأر فسفرة H2AX عند التأسيس مع IL1β-mRNA- Cap (+) PolyA (+) (الشكل التكميلي S5d). لاحظ أن H2AX يؤدي كلاً من الأدوار الهيكلية والوظيفية في تنظيم الكروماتين إلى ما وراء علامة كسر الحمض النووي المزدوجة المحددة 37. بعد ذلك ، حاولت هذه الدراسة تحديد ما إذا كان يجب أن يكون IL1β-يؤدي mRNA الموجود في النواة إلى موت الخلايا بسبب زيادة الإجهاد الخلوي (الشكل 5 ج). الدورة الزمنية لموت الخلايا بعد العلاج ب βactin-مرنا ، IL1β-مرنا و IL1β-قف-تم تقييم مرنا. في هذا الاختبار ، خلايا B220 + CD11c + NK1.1 + NK مشتقة من النوع البري المحفّز بـ TCM و Zc3h12d- / - أظهرت الفئران زيادة طفيفة في إشارات النخر (الشكل 5 ج). عندما 20 نانوغرام / مل IL1β-مرنا و IL1β-قف-تم تطبيق mRNA على خلايا B220 + CD11c + NK1.1 + NK من النوع البري ، وتم قمع شدة الإشارة مقارنةً بتلك التي تحتوي على βactin-مرنا (الشكل 5 ج). خلايا B220 + CD11c + NK1.1 + NK من Zc3h12d- / - لم تظهر الفئران أي استجابة تقريبًا لأي RNA (الشكل 5 ج). هذا يشير إلى أن دمج IL1β-قد يساهم الرنا المرسال في النواة في بقاء الخلية القاتلة الطبيعية.

سواء كان التضمين IL1β-يؤثر mRNA في النواة على الأنشطة داخل النواة ، مثل النسخ ، ثم تم فحصها. فحصت هذه الدراسة أولاً ما إذا كان يتم نقلها نوويًا IL1β-ارتبط mRNA بـ RNA polymerase II (Pol II) ، الذي ينظم بدء واستطالة نسخ mRNA 38. لتمييز المطبق IL1β-مرنا من الذاتية IL1β-تم تصميم mRNA ، وهو مسبار qPCR الذي يصلب المتواليات الخاصة بالإنسان فقط. بعد تطبيق الوهم IL1β-مرنا إلى ZC + RAW ، الوهم المنقولة IL1β-تم إصلاح الرنا المرسال بالإشعاع فوق البنفسجي و الترسيب المناعي المشترك بواسطة الجسم المضاد للبول II (الشكل 5 د). ثم بحثت هذه الدراسة عن تغيرات التعبير الجيني المتأثرة بها IL1β-mRNA في نفس بيانات ميكروأري (الجدول التكميلي S3). تم اختيار سبعة جينات بناءً على المعايير التالية التي تشير إلى أن سلوكهم مشابه لسلوك IL1β: تم تصنيفها على أنها مرتبطة بالنواة بواسطة Gene Ontology وأظهرت مستوى تعبير أعلى نسبيًا في Zc3h12d- / - مقارنة بالفئران البرية في مجموعة بيانات المصفوفات الدقيقة (الجدول التكميلي S4). تمت مقارنة مستويات التعبير الجيني لهذه الجينات السبعة بين خلايا RAW و ZC + RAW بعد العلاج IL1β-مرنا. كشف qPCR ذلك Dusp1 39 و 40 و IL1rn تم التعبير عنها بمستويات أعلى في ZC + RAW مقارنةً بالتحكم في RAW (الشكل التكميلي S6) ، وزاد محتوى هذه النصوص في الحمض النووي الريبي النووي بالتزامن مع امتصاص IL1β-مرنا (الشكل 5 هـ). بالإضافة إلى، Dusp1 و IL1rn تم تنظيم التعبير في خلايا B220 + CD11c + NK1.1 + NK بعد تطبيق IL1β-مرنا (الشكل 5f).

فخ ZC3H12D من IL1β-mRNA يستحث نشاط مضاد الكسر

سواء IL1β-يثير mRNA نشاط الهجرة في خلايا ZC3H12D + NK لأن هذه الخلايا هاجرت من الكبد إلى الرئتين في الفئران الحاملة للورم. أظهرت خلايا B220 + CD11c + NK1.1 + NK المشتقة من الفئران من النوع البري نشاط هجرة باستخدام IL1β-مرنا ، ولكن ليس βactin-مرنا ، وكان نشاط الترحيل هذا غائبًا في Zc3h12d- / - خلايا الفأر (الشكل 6 أ). لإثبات أن بروتين ZC3H12D يمكنه التقاط المنتج بشكل طبيعي IL1β-مرنا ، أجريت فحوصات الهجرة باستخدام nex-RNA المعزول من الطب الصيني التقليدي. لتأكيد تأثير بروتين ZC3H12D ، تم تكرار فحوصات الترحيل باستخدام TCM التي تم تمريرها عبر علامة ZC3H12D-FLAG المرتبطة بخرز مضاد لـ FLAG. في هذه التجربة ، تم تحضير TCM عبر حبات مرتبطة بالبروتين ZC3H12D [تم تحديدها على أنها عمود ZC3H12D (+)] وتم تمريرها عبر خرزات مضادة لـ FLAG [تم تحديدها على أنها عمود ZC3H12D (-) ، تستخدم كعنصر تحكم]. تم عزل nex-RNA من كل من الطب الصيني التقليدي واستخدمت لفحص الهجرة. كشف اختبار الترحيل هذا أن nex-RNA الذي تمت معالجته بعمود ZC3H12D (+) قد قلل من النشاط الكيميائي مقارنةً بالنشاط الكيميائي لـ nex-RNA المعالج بعمود ZC3H12D (-) في خلايا B220 + CD11c + NK1.1 + NK (الشكل التكميلي S1). S7a) ، مما يوحي بذلك IL1β-تلعب تفاعلات mRNA-ZC3H12D دورًا حيويًا في نشاط ترحيل الخلايا.

أ ترحيل خلايا B220 + CD11c + NK1.1 + مشتقة من النوع البري و Zc3h12d- / - الفئران حتى 10 نانوغرام / مل βactin-مرنا ، فجوة-مرنا ، IL1β-مرنا و IL1β-قف-مرنا (ن = 3 آبار لكل مجموعة). ب تحريض IFN-في خلايا B220 + CD11c + NK1.1 + من النوع البري المحفز بواسطة TCM و Zc3h12d- / - الفئران بعد الحضانة مع IL1β-مرنا و IL1β-قف-مرنا. النسبة الكمية IHC للخلايا الإيجابية IFN-(ن = 3 آبار لكل مجموعة). ج مقايسة مبيد الأورام في المختبر بعد احتضان الخلايا السرطانية مع خلايا B220 + CD11c + NK1.1 + معدة 10 نانوغرام / مل. نسبة خلايا E0771 المسمى رودامين والتي أصبحت Zombie + خلايا ميتة في الفحص. زادت خلايا E0771 الميتة بعد الزراعة باستخدام IL1β-مرنا- و IL1β- توقف-خلايا B220 + CD11c + NK1.1 + معدة بمرنا mRNA من الفئران من النوع البري التي تحفز TCM بدلاً من الخلايا من Zc3h12d-/- الفئران (ن = 3 آبار لكل مجموعة). د نظام مقايسة مبيد الأورام. مقايسة مبيد الأورام في المختبر بعد احتضان الخلايا السرطانية مع خلايا B220 + CD11c + NK1.1 + بعد الاستزراع باستخدام BMDMs مع IL1β-مرنا (أعلى). لاستبعاد الآثار المباشرة لـ IL1β-مرنا على الخلايا القاتلة الطبيعية ، تم غسل BMDM مع وسط القاعدية بعد فتيلة. نسبة خلايا E0771 المسمى رودامين والتي أصبحت Zombie + خلايا ميتة في الفحص (أسفل ، ن = 4 آبار لكل مجموعة). ه نظام مقايسة Antimetastatic في الجسم الحي. IL1β-خلايا B220 + CD11c + NK1.1 + التي تم تحضيرها بمرنا mRNA من طحال الفأر الذي يحفزه TCM ثم يتم تطبيقها على فأر آخر محفز بالطب الصيني التقليدي. تم حقن الخلايا السرطانية المسمى رودامين لتقييم ورم خبيث. F أرقام خلايا LLC النقيلية في الرئتين مع أو بدون معالجة مسبقة IL1β-مرنا-تستعد خلايا B220 + CD11c + NK1.1 + من النوع البري و Zc3h12d- / - تظهر الفئران (ن = 12 فأر لكل مجموعة). يظهر B220 + CD11c + NK1.1 + بالشكل Tri NK. في الرسوم البيانية ، المتوسطات ± SEM ونتائج الطالب ر- يتم عرض الاختبار (على الوجهين) أو أحادي الاتجاه ANOVA مع تصحيح Bonferroni. ال ص تظهر القيم في الشكل. يتم توفير بيانات المصدر كملف بيانات المصدر.

حاولت هذه الدراسة تقييم تأثير IL1β-مرنا على إنتاج IFN-في خلايا B220 + CD11c + NK1.1 + NK. تم تحفيز الخلايا المشتقة من الفئران البرية بوضوح بواسطة IL1β-مرنا ، ولكن لوحظ تحريض خافت فقط في الخلايا من Zc3h12d- / - الفئران (الشكل 6 ب). علاوة على ذلك ، لتحديد التأثيرات القاتلة للأورام لخلايا B220 + CD11c + NK1.1 + NK ، تمت زراعة خلايا E0771 التي تحمل علامة رودامين باستخدام IL1β-تستعد الخلايا القاتلة الطبيعية mRNA لعد الخلايا السرطانية الميتة الملطخة بـ Zombie ، وهي صبغة فلورية خضراء. في نظام الفحص هذا ، لحساب تأثيرات تحضير الحمض النووي الريبي على الخلايا السرطانية ، تم غسل الخلايا القاتلة الطبيعية قبل تطبيقها على الخلايا السرطانية. كشفت هذه البيانات أن IL1β-زاد تحضير mRNA من نشاط مبيدات الأورام في الخلايا القاتلة الطبيعية التي تنشأ من الفئران من النوع البري ولكن ليس من Zc3h12d- / - الفئران (الشكل 6 ج). مرة أخرى ، خلايا B220 + CD11c + NK1.1 + NK من Zc3h12d+/– كان لدى الفئران نشاط مبيد للأورام مماثل (الشكل التكميلي S7b). للتحقق مما إذا كان IL1β-تعزز الخلايا الضامة المستمدة من الرنا المرسال هذا النشاط ، وقد تم احتضان الخلايا القاتلة الطبيعية مع الضامة المشتقة من نخاع العظم (BMDMs) التي تم تحفيزها بواسطة IL1β-مرنا (الشكل 6 د ، أعلى). على حد سواء IL1β-تستمد BMDMs mRNA من النوع البري و Zc3h12d- / - الفئران لم يكن لها تأثيرات مضافة على نشاط مبيد الأورام في المختبر (الشكل 6 د ، أقل).

كما تعرف ZC3H12D على 3 ′-UTR من IL1β-مرنا ، المنطقة الوظيفية في 3 ′-تم فحص UTR كذلك. لتحديد العنصر الوظيفي في 3′-UTR من IL1β-مرنا ، تم تقسيمه أيضًا إلى أربع أجزاء تحتوي على 150 نانومتر ، حيث كان لكل جزء على الأقل 50 نانومتر متداخلة مع الأجزاء المجاورة لها. أظهر الجزء الثالث نشاطًا أعلى من الأجزاء الأخرى في اختبار الترحيل لخلايا B220 + CD11c + NK1.1 + NK المستمدة من الفئران من النوع البري ولكنها ظلت دون أن يلاحظها أحد من قبل. Zc3h12d- / - الفئران (الشكل التكميلي S7c). بعد ذلك ، تم فحص تنشيط NK عبر ZC3H12A 32،34،35 ، وهي عائلة فرعية من بروتينات ZC3H12. في فحص الهجرة ، كامل الطول و 3′-UTR IL1β-الرنا المرسال الناجم عن النشاط الكيميائي في الخلايا القاتلة الطبيعية من الفئران من النوع البري و Zc3h12a –/– (ريجناس -1- / -) الفئران 34 ، بينما CDS IL1βأنتج -mRNA نفس مستويات النشاط تقريبًا مثل تلك الموجودة في التحكم RNA (الشكل التكميلي S7d). بالإضافة إلى ذلك ، استقراء IFN-γ بواسطة IL1βكان -mRNA متشابهًا في الخلايا المشتقة من كلا الطرازين الجيني (الشكل التكميلي S5e). وهكذا ، أشارت هذه البيانات إلى أن منطقة مركزية من 3′-UTR في IL1β- يتم التعرف على -mRNA بطريقة تعتمد على البروتين ZC3H12D.

في السرطان ، ينتشر بروتين IL1β في تعزيز الورم بالاقتران مع الخلايا المناعية المسببة للالتهابات 41. سواء IL1β-تم فحص خلايا B220 + CD11c + NK1.1 + NK المعدة بمرنا mRNA-primed mRNA-primed at vivo. في نظام الفحص هذا ، تم الحصول على خلايا NK من طحال الفأر المحفز بالطب الصيني التقليدي وتم تحضيره باستخدام مادة اصطناعية IL1β-مرنا. تم بعد ذلك تطبيق هذه الخلايا القاتلة الطبيعية على فأر آخر محفز بالطب الصيني التقليدي قبل حقن الخلايا السرطانية المسمى رودامين عبر الوريد الذيل. لتقييم ورم خبيث في الرئة ، تم عزل الرئتين بعد الحقن ، وتم حساب عدد الخلايا في الرئتين (الشكل 6 هـ ، النموذج). IL1β-مرنا-قللت الخلايا البرية B220 + CD11c + NK1.1 + من النوع البري من عدد الخلايا السرطانية المنتشرة التي تتجه إلى الرئتين (الشكل 6f). فى المقابل، IL1β-الخلايا القاتلة الطبيعية التي تستعد مرنا من Zc3h12d- / - الفئران لها تأثير مضاد بسيط للورم (الشكل 6f ، الرسم البياني).

تحتوي خلية NK البشرية على ZC3H12D-IL1β-محور مرنا

تم التحقيق فيما إذا كان hZC3H12D يلعب دورًا مهمًا في نظام امتصاص الرنا المرسال. يحتوي hZC3H12D على منتجين جيني مقسم بشكل بديل 26: أحدهما شكل طويل (58 كيلو دالتون: hZC58) ، هيكله الأساسي مشابه جدًا لبروتين الفأر ، والآخر عبارة عن شكل قصير (36 كيلو دالتون: hZC36) ، والذي يفتقر إلى مجال C- المحطة. يشترك هذان الشكلان الإسفنديان في مجالات ربط RNA و ZF ، لكن المجال الغني بالبرولين ، والذي يعتبر موقع تفاعل لبروتين ZC3H12A ، فريد بالنسبة لـ hZC58 (الشكل 7 أ ، أعلى). لمقايسة امتصاص الرنا المرسال ، تم إنشاء 786 خلية ، خلايا سرطان الكلى البشرية التي تعبر بثبات عن hZC58 أو hZC36. كشفت تحليلات IHC هذه أن ZC3H12D تم توزيعه على نطاق واسع في غشاء الخلية والسيتوبلازم لخلايا hZC58 ، بينما تم العثور عليه في منطقة محدودة نسبيًا في خلايا hZC36 (الشكل 7 أ ، أسفل). تم تحضين هذه الخلايا باستخدام h المسمى FITCIL1βIL1β-mRNA) ، وتشير الصور الناتجة إلى أن hIL1β-تم اكتشاف mRNA-FITC في نواة خلايا hZC58 أكثر من خلايا hZC36 (الشكل 7 ب) ، مما يشير إلى أن المجال الطرفي C لـ hZC58 الذي يحتوي على المجال الغني بالبرولين يلعب دورًا حيويًا في نقل mRNA إلى النواة . امتصاص hIL1β-تم فحص مرنا في CD56 + CD3 - خلايا NK 42،43 المعزولة من PBMCs البشرية (hPBMCs) بعد ذلك. في تحليل التدفق الخلوي ، تم اكتشاف ZC3H12D على سطح الخلية بنسبة 46 ٪ من خلايا CD56 + CD3 - NK. حIL1β-مرنا ، ولكن ليس السيطرة على hβactin-mRNA ، في نواة خلايا CD56 + CD3 - NK (الشكل 7 ج). تم إجراء ضربة قاضية صغيرة بوساطة الحمض النووي الريبي (سيرنا) لـ ZC3H12D في خلايا CD56 + CD3 - NK لتوضيح ما إذا كان بروتين ZC3H12D متورطًا في عملية امتصاص الخلايا القاتلة الطبيعية. قمع مستويات البروتين ZC3H12D بواسطة electroporation سيرنا (الشكل التكميلي S8a) قلل بوضوح من hIL1β-امتصاص الرنا المرسال (الشكل 7 د) بالمقارنة مع السيطرة على سيرنا- أو ZC3H12A- الخلايا المصابة بالعدوى بالسيرنا. تنشيط NK بعد امتصاص hIL1β-تم فحص مرنا. كشف التلقيح المناعي IFN-أن خلايا CD56 + CD3 - NK زادت في إيجابية IFN-بعد hIL1β-كان تحفيز mRNA (الشكل 7 هـ) ، ومستويات تعبير IFN-عالية مثل تلك التي يسببها المؤتلف IL12 44 كمحفز IFN-γ لخلايا NK 45. تنقسم الخلايا البشرية القاتلة الطبيعية إلى مجموعتين فرعيتين متميزتين ، CD56 مشرق و CD56 خافت 46 ، وتتأثر البيئة الدقيقة المرتبطة بالورم بشكل مختلف في تلك الخلايا القاتلة الطبيعية على وظائفها القاتلة للأورام والتكاثر. نظرًا لأنه تم التعبير عن ZC3H12D في كلتا المجموعتين الفرعيتين (الشكل التكميلي S8b) ، تمت تنقية كسور خلايا CD56 الساطعة و CD56 القاتمة NK من hPBMCs ، وحIL1β-تم اختبار امتصاص الرنا المرسال بشكل منفصل لتجد أنه كان في 38٪ من CD56 الساطع و 50٪ من خلايا CD56 القاتمة NK. لتقليد البيئة المكروية للورم ، تم تحفيز الخلايا القاتلة الطبيعية أولاً باستخدام TCM المشتق من خلايا سرطان الثدي البشري MDAMB231 ، ثم لوحظ استجابة إنتاج IFN-عند تطبيق بروتين IL-2 و / أو hIL1β-مرنا (الشكل 7f ، أعلى). بعد ثلاثة أيام من تحفيز الطب الصيني التقليدي ، حIL1β-زاد mRNA وليس بروتين IL2 من إنتاج IFN-في خلايا CD56 القاتمة NK (الشكل 7f ، أسفل اليسار). التحفيز الثاني بواسطة hIL1β-تسبب mRNA في إنتاج IFN-بنفس مستوى التحفيز الأول (الشكل 7f ، أسفل اليمين الشكل التكميلي S8c). على العكس من ذلك ، لم تظهر خلايا CD56 الساطعة NK تحريضًا (الشكل التكميلي S8d). تم زيادة علامة تنشيط الخلية NK ، NKG2D ، في خلايا CD56 الساطعة NK بشكل طفيف بعد تطبيق hIL1β-مرنا (الشكل التكميلي S8e).

أ مخطط اثنين من الأشكال الإسوية للربط من hZC3H12D. يشفر النموذجان الطويل والقصير 58 و 36 كيلو دالتون بروتينات على التوالي. يحتوي كلاهما على تسلسل N-terminal مشترك ، بما في ذلك مجال ZF (أخضر) ، ويحتوي الشكل الطويل على مجال غني بالبرولين (قمة برتقالية). تحليل IHC لـ ZC3H12D في الشكل الطويل (hZC58) - والشكل القصير (hZC36) - يعبر عن خلايا 786-O (أسفل). اعيدت الاختبارات مرتين بنفس النتائج. ب الصور المجهرية التمثيلية من حIL1β-مرنا-امتصاص FITC في نواة الخلية hZC58 أو hZC36 (أعلى). الإشارات الكمية لـ hIL1β-مرنا-FITC في نواة الخلية hZC58 أو hZC36 (الصور الثلاثية الأبعاد السفلية لكل مجموعة: ن = 38 لـ hZC58 و ن = 50 لـ hZC36). ج امتصاص hIL1β-mRNA-FITC إلى CD56 + CD3 - نواة الخلية NK 3 ساعات بعد تطبيق 50 نانوغرام / مل من الحمض النووي الريبي مع 200 وحدة / مل من بروتين IL-2. التصوير المجهري متحد البؤر يظهر النواة الملطخة بـ DAPI في صور مفردة (أعلى) ومكدسات ثلاثية الأبعاد تجمع بين 15 صورة من أعلى إلى أسفل (وسط). تُظهر صور المكدس ثلاثية الأبعاد مقارنة الامتصاص النووي بين hIL1β-مرنا وحβactin-مرنا (أسفل). د الإشارات النووية لـ hIL1β-mRNA-FITC في خلايا CD56 + CD3 - NK المعالجة بـ siRNA. Control (con) هو سيرنا غير مستهدف (ن = 13 و 10 و 11 خلية للتحكم ، ZC3H12D-سيرنا و ZC3H12A-سيرنا ، على التوالي. تتكون كل صورة خلية من 15 صورة ثلاثية الأبعاد مكدسة). ه تحليل IHC لتحريض IFN-بعد 48 ساعة من تطبيق RNA مع 200 U / mL IL2 إلى CD56 + CD3 - NK cells. تم تحضين التحكم الإيجابي بـ 20 نانوغرام / مل من بروتين IL12 في وسط مزرعة IL2 (إشارات IFN-γ من ن = 16 و 21 و 20 ZC3H12D + خلية بدون ، IL1β-RNA و IL2 بروتين على التوالي). F تحليل IHC لتحريض IFN-3 و 6 أيام بعد تحفيز hIL1β-بروتين mRNA و IL2 لخلايا CD56 خافتة CD3 - NK المعالجة بـ MDAMB231-TCM. يظهر نظام الفحص (أعلى). تم استخدام خليتين من خلايا NK المانحة بشكل مستقل. لا ، التحكم في وسط الثقافة القاعدية (أسفل اليسار ، ن = 42 و 45 و 51 و 51 خلية في حالة عدم وجود ، IL1β-RNA و IL2 بروتين و IL1β-RNA بالإضافة إلى بروتين IL2 على التوالي. أسفل اليمين ، ن = 34 و 44 و 37 و 60 خلية بدون ، IL1β-RNA و IL2 بروتين و IL1β-RNA بالإضافة إلى بروتين IL2 ، على التوالي). قضبان ، 5 ميكرومتر. في الرسوم البيانية ، والمتوسطات ± SEM ونتائج الطالب ر- يتم عرض الاختبارات (على الوجهين) أو ANOVA أحادي الاتجاه مع تصحيح Bonferroni. ال ص تظهر القيم في الشكل. يتم توفير بيانات المصدر كملف بيانات المصدر.

باختصار ، يلتقط ZC3H12D في الخلايا القاتلة الطبيعية بشكل انتقائي nex-IL1β-المخصب mRNA في بيئة الرئة المحفزة للورم وينقلها إلى النواة. لتوطين بروتين ZC3H12D على سطح الخلية ، فإن المجال الطرفي C الغني بالبرولين ضروري ، على الرغم من أنه بعيد عن موقع ربط الحمض النووي الريبي. IL1β-أثار نقل mRNA إلى النواة ثلاث وظائف: (1) تعزيز نشاط مبيدات الأورام مع قدرة هجرة الخلايا وإنتاج IFN-، (2) تنظيم التعبير الجيني المضاد للخلايا من خلال الارتباط بـ RNA Pol II ، و (3) التحكم في بقاء الخلية NK و إنتاج IFN-لفترات طويلة في بيئة مكروية للورم (الشكل 8).

العلاقة المرتبطة بالورم-IL1β-مرنا 3 ′-تم حصر UTR بواسطة بروتين ZC3H12D على سطح خلية NK وتم إدخاله إلى النواة عبر محطة C الخاصة بها التي تحتوي على مجال غني بالبرولين. بعد ذلك ، قد ينظم هذا التعبير الجيني المضاد للخلايا المرتبط بـ RNA Pol II والتحكم في هجرة الخلايا القاتلة الطبيعية والبقاء على قيد الحياة واستدامة إنتاج IFN-.


2 إكسوسومات

تم اكتشافها لأول مرة في الخلايا الشبكية للثدييات (خلايا الدم الحمراء غير الناضجة) ، وهي exosomes

40 إلى 100 نانومتر حويصلات تفرزها مجموعة واسعة من أنواع خلايا الثدييات [24]. مصطلح exosome (في ذلك الوقت مشتق من الحويصلات الدقيقة) صاغه ترامز وآخرون لأول مرة في أوائل الثمانينيات [25]. تتكون الإكسوسومات من غشاء ثنائي الطبقة يحيط بعصارة خلوية صغيرة وخالية من العضيات الخلوية. تحتوي الإكسوسومات على مكونات جزيئية مختلفة لخليتها الأصلية ، بما في ذلك البروتينات ومواد الحمض النووي (جميع أنواع الحمض النووي الريبي) [26]. على الرغم من أن تكوين البروتين الخارجي يختلف باختلاف الخلية والأنسجة الأصلية ، فإن معظم exosomes تحتوي على مجموعة مشتركة من جزيئات البروتين محفوظة تطوريًا [27]. تشتمل جزيئات RNA في exosomes على mRNAs ، و miRNAs التي تم التعرف عليها مؤخرًا. على مر السنين ، تمكن الباحثون من التقاط عملية التكوُّن الحيوي للخلايا الخارجية في أنواع مختلفة من الخلايا وعزلوا بنجاح هذه الأجسام الغشائية من مصادر متنوعة تتراوح من بلازما الدم [28] والمصل [29] والبول [30].

التولد الحيوي لل exosomes (تلخيصها في الشكل 1) هي عملية منظمة بإحكام شديد تحكمها جزيئات إشارات متعددة وتبدأ بتنشيط المستقبلات الفريدة لكل نوع من الخلايا [31]. على سبيل المثال ، في الخلايا الوحيدة والعدلات ، يكون تنشيط مستقبل البورينات P2X بواسطة ATP ، وفي الصفائح الدموية يكون تنشيط مستقبل الثرومبين ، وبالنسبة لعديد السكاريد الدهني البكتيري ، تم التعرف على المستقبل الشبيه بالحصيلة -4 (TLR-4) على الخلايا التغصنية [3233) ]. تشير الدراسات المورفولوجية إلى أن exosomes مشتق من مسار فرز جسم الحويصلة الدقيقة (MVB) [3435]. تندمج MVBs أولاً مع غشاء البلازما وتحرر الحويصلات في الوسط خارج الخلية على شكل exosomes. باختصار ، تقوم آلية الانقباض للخلية أولاً بسحب الأغشية المتقابلة بمساعدة مركب مستقبلات البروتين المرفق القابل للذوبان (أو ببساطة مركب SNARE) معًا قبل قطع اتصال الغشاء وإطلاق الحويصلة في الفضاء خارج الخلية [36-40] .

رسم تخطيطي يصور النموذج المقبول جيدًا للتكوين الحيوي للخارج وإطلاقه. في المقام الأول ، يتم اشتقاق exosomes من الأجسام متعددة الحويصلات (MVBs) والتي تُعرف باسم الجسيمات الداخلية المتأخرة (مشتقة في الأصل من الجسيمات الحالة). يمكن أن يتم تحفيز توليد الإكسوزوم من خلال العديد من العوامل بما في ذلك المنبهات خارج الخلية (على سبيل المثال ، الهجوم الجرثومي) والضغوط الأخرى. يمكن إطلاق الإكسوسومات في البيئة خارج الخلية عن طريق اندماج MVBs مع سطح الخلية الذي يدعمه عدد من البروتينات المتخصصة تسمى SNAREs.

تمت دراسة آليات إطلاق exosomes بعمق أيضًا. أظهرت الدراسات التي أجراها Thery وزملاؤه أن عددًا من بروتينات عائلة Rab ، بما في ذلك Rab27a و Rab27b ، تعمل كمنظمين رئيسيين لمسار إفراز الجسيمات الخارجية [41]. لقد ثبت أن Rab27 يشارك في تطور السرطان وتعزيز الورم ، مما قدم مؤشرات مبكرة على أن مكونات مسار إفراز الجسيمات الخارجية قد يكون لها دور في بيولوجيا الورم [42]. بصرف النظر عن Rab27a و b ، وهو بروتين آخر عضو في عائلة Rab ، فقد ثبت أن Rab35 ينظم إفراز الجسيمات الخارجية من خلال التفاعل مع عائلة مجال TBC1 للبروتين المنشط لـ GTPase ، العضو 10A-C (TBC1D10A-C) [43].وقد ثبت أن إطلاق الجسيمات الخارجية يتم تحفيزه بواسطة محفزات أخرى مختلفة بما في ذلك السيراميد [44] والتغيرات في درجة حموضة الغشاء [45]. أظهرت الدراسات أيضًا أنه يمكن إطلاق exosomes في mileu خارج الخلية عن طريق مسار التبرعم الخارجي والحويصلة الدقيقة (EMV) الذي يحدث فيه تبرعم / انشطار غشاء البلازما [46]. تنظيم مسار EMV متعدد العوامل وحساس لمستويات الكالسيوم داخل الخلايا ويعتمد على السقالات الهيكلية للخلية و # x02019. الرسم البياني الموجز للنموذج الأكثر قبولًا لتشكيل exosome وإطلاق exosomes موجود في الشكل 1.


من عزل Exosome إلى اكتشاف العلامات الحيوية


Exosomes هي حويصلات صغيرة (30-150 نانومتر) تفرزها خلايا الثدييات والتي أصبحت ، جنبًا إلى جنب مع حمولتها الفريدة من البروتين والبروتين ، محور الكثير من الأبحاث. من الأهمية بمكان تعزيز فهمنا لوظيفة exosomes وتطبيقاتها في التشخيص والعلاج هو توافر الكواشف والبروتوكولات لعزلها وتوصيفها ، وكذلك لتحليل محتوى الحمض النووي الريبي والبروتين. لقد طورنا مجموعة جديدة من الكواشف التي تتيح سير عمل خارجي كامل - من الاستخراج السريع والفعال للإكسوسومات من وسط أو مصل مزرعة الخلية إلى عزل وتوصيف محتوى الحمض النووي الريبي الخارجي باستخدام تسلسل الجيل التالي.

حويصلات صغيرة ذات إمكانيات هائلة

Exosomes هي حويصلات صغيرة يُعتقد أنها تتكون من جزيئات الحمض النووي الريبي والبروتينات التي تفرزها جميع أنواع خلايا الثدييات في المزرعة ، وتوجد أيضًا بشكل طبيعي في سوائل الجسم بما في ذلك الدم واللعاب والبول وحليب الثدي. بدأت الآلية الجزيئية الدقيقة لإفرازها وامتصاصها ، بالإضافة إلى تكوينها وحمولتها ووظائفها ، في الانهيار [1]. كان يُعتقد في الأصل على أنها "أكياس قمامة" تستخدمها الخلايا للتخلص من الجزيئات الكبيرة غير الضرورية ، ويُنظر الآن إلى الإكسوسومات على أنها حويصلات مُفرزة على وجه التحديد تتيح التواصل بين الخلايا [2]. أظهرت الدراسات أن exosomes يمكنها نقل mRNA و miRNA بين الخلايا ، وأن الحمض النووي الريبي المنقول يعمل في موقعه الجديد [3].

مجموع كواشف عزل exosome

يعتبر عزل exosomes من وسط زراعة الخلايا وسوائل الجسم في الوقت الحالي عملية شاقة وصعبة وغير محددة تتطلب تنبذًا فائقًا [4]. لتبسيط عملية عزل exosome وتقصيرها ، قمنا بتطوير نوعين مختلفين من كواشف عزل Exosome الكلي التي تتيح تركيزًا مباشرًا وموثوقًا للإكسوسومات السليمة من وسط زراعة الخلية أو مصل الدم. من خلال ربط جزيئات الماء ، تقوم الكواشف بإخراج المكونات الأقل قابلية للذوبان (أي exosomes) من المحلول ، مما يسمح بجمعها بعد خطوة قصيرة بطرد مركزي منخفض السرعة. يتيح الإجراء استعادة عدد كبير من الحويصلات الدقيقة في نطاق حجم خارجي نموذجي يتراوح من 30 إلى 150 نانومتر ، مع توزيع حجم مماثل لتوزيع exosomes المعزول باستخدام تنبذ فائق (شكل 1).


الشكل 1. تحليل exosomes المسترجعة من مصل دم الإنسان باستخدام كاشف عزل Exosome الكلي أو بروتوكول تنبيذ فائق.
تم استخراج Exosomes من مصل الدم البشري باستخدام (أ) إجمالي كاشف عزل Exosome أو (ب) إجراء تنبيذ فائق "homebrew" [4] ، وتحليله باستخدام أداة NanoSight® LM10. ينتج كلا البروتوكولين exosomes بتوزيع حجم مماثل: جميع الجسيمات النانوية أصغر من 300 نانومتر ، مع وجود غالبية

مجموع الحمض النووي الريبي (Exosome RNA) ومجموعة عزل البروتين

تم تصميم Total Exosome RNA و Protein Isolation Kit لعزل RNA والبروتين من مستحضر exosome المخصب. ينقسم تحضير exosome المعلق إلى عينتين ، أحدهما يستخدم لطرق تحليل البروتين الشائعة مثل النشاف الغربي ، والآخر يستخدم للاستخراج العضوي متبوعًا بتنقية مرشح الألياف الزجاجية للحمض النووي الريبي الكلي. يمكن تحضير الغلة القصوى من الحمض النووي الريبي عالي النقاء في حوالي 30 دقيقة وهي مناسبة لدراسات تعبير الحمض النووي الريبي (بما في ذلك ميرنا) أو المعالجة أو الوظيفة. يمكن أيضًا استخدام RNA في مجموعة متنوعة من تطبيقات المصب بما في ذلك RT-PCR والتسلسل (على سبيل المثال ، باستخدام Ion Personal Genome Machine® (PGM ™) أو Ion Proton ™ أو SOLiD® System) وتضخيم RNA وتحليلات ميكروأري و تهجين محلول وصمة عار.

تسلسل وتحليل الحمض النووي الريبي exosomal

يمكن تحليل الحمض النووي الريبي exosomal المستخرج باستخدام بروتوكول كاشف عزل Exosome الكلي عن طريق التسلسل ثم مقارنته بـ RNA من العينات "الأبوية" (الخلايا أو المصل الذي نشأت منه exosomes). يمكن إعداد مكتبات RNA الصغيرة باستخدام Ion Total RNA-Seq Kit v2 ، مع بعض تعديلات البروتوكول لمعالجة الكميات المنخفضة نسبيًا والأحجام الصغيرة (& lt200 nt) من الحمض النووي الريبي الخارجي. بمجرد إنشاء المكتبات ، يمكن تسلسلها باستخدام Ion PGM ™ Sequencer والبروتوكولات القياسية.

بعد التسلسل ، قمنا بمقارنة محتوى الحمض النووي الريبي من exosomes المستخرجة من وسط زراعة خلايا هيلا ومن المصل إلى عينات الوالدين الخاصة بهم (خلايا هيلا والمصل الكامل). تم العثور على exosomes تحتوي على مجموعة متنوعة من الحمض النووي الريبي ، بما في ذلك ميرنا ، مرنا ، الرنا الريباسي ، وغيرها من الحمض النووي الريبي الصغير (snoRNA و ncRNA الأخرى). بشكل عام ، تعكس الحمولة الخارجية لكلا نوعي العينات محتوى الحمض النووي الريبي للخلايا الأبوية - من حيث التسلسلات ومستويات التعبير - للعديد من الأهداف (الشكل 2) ، مما يشير إلى أن الحمض النووي الريبي الخارجي يمكن أن يكون بمثابة أداة تشخيصية مهمة. ومع ذلك ، تظهر بعض ميرنا ، و tRNA ، و ncRNA ، و mRNA اختلافات كبيرة في المستويات بين العينات الخارجية والعينات الأبوية (الشكل 3) ، مما قد يؤدي إلى تحديد العلامات الخاصة بالجسيمات الخارجية.


خيارات الوصول

احصل على الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

جميع الأسعار أسعار صافي.
سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

جميع الأسعار أسعار صافي.


مراجع

Ratajczak، J.، Wysoczynski، M.، Hayek، F.، Janowska-Wieczorek، A.، & amp Ratajczak، M. Z. (2006). الحويصلات المجهرية المشتقة من الغشاء: وسطاء مهمون لا يحظون بالتقدير الكافي للتواصل بين خلية وخلية. سرطان الدم، 20, 1487–1495

Ratajczak، J.، Miekus، K.، Kucia، M.، Zhang، J.، Reca، R.، Dvorak، P.، & amp Ratajczak، M. Z. (2006). إعادة برمجة الحويصلات المجهرية المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية: أسلاف المكونة للدم: دليل على النقل الأفقي للرنا المرسال وإيصال البروتين. سرطان الدم، 20(5), 847–856

Deregibus ، M. C. ، Cantaluppi ، V. ، Calogero ، R. ، Lo Iacono ، M. ، Tetta ، C. ، Biancone ، L. ، et al. (2007). تعمل الحويصلات المجهرية المشتقة من الخلايا البطانية السلفية على تنشيط برنامج الأوعية الدموية في الخلايا البطانية عن طريق النقل الأفقي للـ mRNA. دم، 110, 2440–8. 22

Valadi ، H. ، Ekström ، K. ، Bossios ، A. ، Sjöstrand ، M. ، Lee ، J. J. ، & amp Lötvall ، J. O. (2007). النقل الجيني بوساطة mRNAs و microRNAs هو آلية جديدة للتبادل الجيني بين الخلايا. نات سيل بيول ، 9, 654–9. 26

Skog ، J. ، Würdinger ، T. ، van Rijn ، S. ، Meijer ، D. H. ، Gainche ، L. ، SenaEsteves ، M. ، et al. (2008). تنقل الحويصلات الدقيقة للورم الأرومي الدبقي الحمض النووي الريبي والبروتينات التي تعزز نمو الورم وتوفر المؤشرات الحيوية التشخيصية. بيولوجيا خلية الطبيعة ، 10, 1470–1476

Quesenberry، P. J.، Aliotta، J.، Deregibus، M.C، & amp Camussi، G. (2015). دور الحويصلات الحاملة للـ RNA خارج الخلية في تمايز الخلايا وإعادة برمجتها. أبحاث الخلايا الجذعية وعلاجها ، 6, 153

Bruno، S.، Chiabotto، G.، Favaro، E.، Deregibus، M.C، & amp Camussi، G. (2019). دور الحويصلات خارج الخلية في بيولوجيا الخلايا الجذعية. المجلة الأمريكية لعلم وظائف الأعضاء. فسيولوجيا الخلية 317 ، C303-C313


من عزل Exosome إلى اكتشاف العلامات الحيوية


Exosomes هي حويصلات صغيرة (30-150 نانومتر) تفرزها خلايا الثدييات والتي أصبحت ، جنبًا إلى جنب مع حمولتها الفريدة من البروتين والبروتين ، محور الكثير من الأبحاث. من الأهمية بمكان تعزيز فهمنا لوظيفة exosomes وتطبيقاتها في التشخيص والعلاج هو توافر الكواشف والبروتوكولات لعزلها وتوصيفها ، وكذلك لتحليل محتوى الحمض النووي الريبي والبروتين. لقد طورنا مجموعة جديدة من الكواشف التي تتيح سير عمل خارجي كامل - من الاستخراج السريع والفعال للإكسوسومات من وسط أو مصل مزرعة الخلية إلى عزل وتوصيف محتوى الحمض النووي الريبي الخارجي باستخدام تسلسل الجيل التالي.

حويصلات صغيرة ذات إمكانيات هائلة

Exosomes هي حويصلات صغيرة يُعتقد أنها تتكون من جزيئات الحمض النووي الريبي والبروتينات التي تفرزها جميع أنواع خلايا الثدييات في المزرعة ، وتوجد أيضًا بشكل طبيعي في سوائل الجسم بما في ذلك الدم واللعاب والبول وحليب الثدي. الآلية الجزيئية الدقيقة لإفرازها وامتصاصها ، بالإضافة إلى تكوينها وحمولتها ووظائفها ، بدأت للتو في الانهيار [1]. كان يُعتقد في الأصل على أنها "أكياس قمامة" تستخدمها الخلايا للتخلص من الجزيئات الكبيرة غير الضرورية ، ويُنظر الآن إلى الإكسوسومات على أنها حويصلات مُفرزة على وجه التحديد تتيح التواصل بين الخلايا [2]. أظهرت الدراسات أن exosomes يمكنها نقل mRNA و miRNA بين الخلايا ، وأن الحمض النووي الريبي المنقول يعمل في موقعه الجديد [3].

مجموع كواشف عزل exosome

يعد عزل exosomes من وسط زراعة الخلايا وسوائل الجسم في الوقت الحالي عملية شاقة وصعبة وغير محددة تتطلب تنبذًا فائقًا [4]. لتبسيط عملية عزل exosome وتقصيرها ، قمنا بتطوير نوعين مختلفين من كواشف عزل Exosome الكلي التي تتيح تركيزًا مباشرًا وموثوقًا للإكسوسومات السليمة من وسط زراعة الخلية أو مصل الدم. من خلال ربط جزيئات الماء ، تقوم الكواشف بإخراج المكونات الأقل قابلية للذوبان (أي exosomes) من المحلول ، مما يسمح بجمعها بعد خطوة قصيرة بطرد مركزي منخفض السرعة. يتيح الإجراء استعادة عدد كبير من الحويصلات الدقيقة في نطاق حجم خارجي نموذجي يتراوح من 30 إلى 150 نانومتر ، مع توزيع حجم مماثل لتوزيع exosomes المعزول باستخدام تنبذ فائق (شكل 1).


الشكل 1. تحليل exosomes المسترجعة من مصل دم الإنسان باستخدام كاشف عزل Exosome الكلي أو بروتوكول تنبيذ فائق.
تم استخراج Exosomes من مصل الدم البشري باستخدام (أ) إجمالي كاشف عزل Exosome أو (ب) إجراء تنبيذ فائق "homebrew" [4] ، وتحليله باستخدام أداة NanoSight® LM10. ينتج كلا البروتوكولين exosomes بتوزيع حجم مماثل: جميع الجسيمات النانوية أصغر من 300 نانومتر ، مع وجود غالبية

مجموع الحمض النووي الريبي (Exosome RNA) ومجموعة عزل البروتين

تم تصميم Total Exosome RNA و Protein Isolation Kit لعزل RNA والبروتين من مستحضر exosome المخصب. ينقسم تحضير exosome المعلق إلى عينتين ، أحدهما يستخدم لطرق تحليل البروتين الشائعة مثل النشاف الغربي ، والآخر يستخدم للاستخراج العضوي متبوعًا بتنقية مرشح الألياف الزجاجية للحمض النووي الريبي الكلي. يمكن تحضير الغلة القصوى من الحمض النووي الريبي عالي النقاوة في حوالي 30 دقيقة وهي مناسبة لدراسات تعبير الحمض النووي الريبي (بما في ذلك ميرنا) أو المعالجة أو الوظيفة. يمكن أيضًا استخدام RNA في مجموعة متنوعة من تطبيقات المصب بما في ذلك RT-PCR والتسلسل (على سبيل المثال ، باستخدام Ion Personal Genome Machine® (PGM ™) أو Ion Proton ™ أو SOLiD® System) وتضخيم RNA وتحليلات ميكروأري و تهجين محلول وصمة عار.

تسلسل وتحليل الحمض النووي الريبي exosomal

يمكن تحليل الحمض النووي الريبي exosomal المستخرج باستخدام بروتوكول كاشف عزل Exosome الكلي عن طريق التسلسل ثم مقارنته بـ RNA من العينات "الأبوية" (الخلايا أو المصل الذي نشأت منه exosomes). يمكن إعداد مكتبات RNA الصغيرة باستخدام Ion Total RNA-Seq Kit v2 ، مع بعض تعديلات البروتوكول لمعالجة الكميات المنخفضة نسبيًا والأحجام الصغيرة (& lt200 nt) من الحمض النووي الريبي الخارجي. بمجرد إنشاء المكتبات ، يمكن تسلسلها باستخدام Ion PGM ™ Sequencer والبروتوكولات القياسية.

بعد التسلسل ، قمنا بمقارنة محتوى الحمض النووي الريبي من exosomes المستخرجة من وسط زراعة خلايا هيلا ومن المصل إلى عينات الوالدين الخاصة بهم (خلايا هيلا والمصل الكامل). تم العثور على exosomes لاحتواء مجموعة متنوعة من الحمض النووي الريبي ، بما في ذلك ميرنا ، مرنا ، الرنا الريباسي ، وغيرها من الحمض النووي الريبي الصغير (snoRNA و ncRNA الأخرى). بشكل عام ، تعكس الحمولة الخارجية لكلا نوعي العينات محتوى الحمض النووي الريبي للخلايا الأبوية - من حيث التسلسلات ومستويات التعبير - للعديد من الأهداف (الشكل 2) ، مما يشير إلى أن الحمض النووي الريبي الخارجي يمكن أن يكون بمثابة أداة تشخيصية مهمة. ومع ذلك ، تظهر بعض ميرنا ، و tRNA ، و ncRNA ، و mRNA اختلافات كبيرة في المستويات بين العينات الخارجية والعينات الأبوية (الشكل 3) ، مما قد يؤدي إلى تحديد العلامات الخاصة بالجسيمات الخارجية.


مناقشة

لقد تم إثبات أن مجموعة فرعية انتقائية من RNAs تخرج من الخلايا ، إلى البيئة خارج الخلية ، عن طريق إفراز حويصلات مثل exosomes [17 ، 19 ، 28]. على هذا النحو ، هناك اختلافات كبيرة بين محتوى الحمض النووي الريبي للإكسوسومات والخلايا الأم ، على سبيل المثال ، تفتقر exosomes إلى 18S و 28S rRNA [17 ، 28-31] ، في حين أن 80 ٪ من الحمض النووي الريبي في الخلايا حقيقية النواة هو الرنا الريباسي [53]. ومع ذلك ، لم يتم تقديم أي آلية نهائية حتى الآن للكشف عن اللاعبين الرئيسيين المشاركين في التحميل الانتقائي للرناوات السيتوبلازمية في exosomes أو الطريقة التي يتم بها تنظيم هذه العملية. يجب أن توجد آلية نقل في الخلايا لتحميل شحنة الحمض النووي الريبي في الإكسوسومات. لهذا ، نفترض أن عملية نقل RNA إلى exosomes تحدث على الأرجح من خلال عمل RBPs معينة.

باستخدام تحديد وتوصيف البروتين عالي الإنتاجية ، حدد باحثون آخرون البروتينات النووية في exosomes المدرجة في Vesiclepedia [54]. استنادًا إلى تحليلات REMSA و LC-MS / MS ، حددنا RBPs في مقتطفات exosome التي كانت قادرة على التفاعل مع الخلايا RNA و cell-miRNA و esRNA (الشكل 1 ب و الصورة 2). نظرًا لأن المحتوى الخلوي السائد ، أي الرنا الريباسي (80-85٪) [53] ، غائب تمامًا تقريبًا في exosomes [17] ، استخدمنا بشكل انتقائي فقط جزء mRNA الخلوي والخلايا الخلوية من الخلايا الأبوية للمقارنة. تم تحضين إجمالي مستخلصات البروتين الخارجي مع كل من RNA الخلوي و exosomal-RNAs. لوحظت تفاعلاتهم وتم تحديد RBPs. يمكن أن يكون للبروتينات الخارجية المرتبطة بـ RNA الخلوي ، أي exosomal-RBPs ، غرض مزدوج: (1) يمكن الحفاظ على خصائص ربط RNA لبروتينات معينة بمجرد نقلها إلى exosomes ، على الرغم من التعديلات اللاحقة للنسخ التي من المحتمل أن تحدد توطينها دون الخلوي [ 55] و (2) بمجرد نقل الـ RBPs الخارجية إلى خلايا أخرى عبر exosomes وإطلاقها في الخلية المتلقية ، قد تكون هذه البروتينات قادرة على التفاعل مع RNAs المستهدفة في الخلايا المتلقية. تشير النتائج المقدمة هنا إلى أن العديد من البروتينات الخارجية يمكن أن تتفاعل مع الحمض النووي الريبي من الخلايا (أي خلية ميرنا وخلية مرنا) ومع الحمض النووي الريبي في الإكسوسومات (إسرنا).

التورط المحتمل لـ RBPs الخارجية في تعديلات ما بعد النسخ ونقل الحمض النووي الريبي

في هذه الدراسة ، حددنا 30 RBPs في exosomes التي كانت قادرة على الارتباط بأنواع RNA الخلوية و esRNA. من بين هذه الـ 30 RBPs ، كان هناك عشرين من RBPs exosomal مرتبطة بـ esRNA (12 انتقائية لـ esRNA ، و 8 مشتركة) 14 إلى خلية مرنا ، و 9 إلى خلية ميرنا ، بينما كانت أربعة RBPs شائعة بين المجموعات الثلاث (الشكل 2 ج و الجدول 2). ومع ذلك ، لا توجد صورة واضحة عن عدد الـ RBPs التي قد توجد في exosomes ، وربما فاتنا تحديد جميع RBPs في هذه المركبات الكهربائية ، وخاصة RBPs التي يتم التعبير عنها قليلاً في exosomes أو أنها ترتبط بعدد قليل من جزيئات RNA. من بين الـ exosomal-RBPs المحددة التي حددناها ، تم بالفعل الإبلاغ عن 90٪ تقريبًا في الدراسات البروتينية لأنواع مختلفة من الجسيمات الخارجية [56-62]. ثلاثون من الـ RNA exosomal هي مكونات لمجمعات RNP المعروفة بأداء وظائف خلوية مرتبطة بمراحل عديدة من استقلاب الحمض النووي الريبي ، مثل النضج والنقل والترجمة. تتميز معظم RBPs المعروفة بتحديد مواقع متعددة في المقصورات الخلوية والوظائف متعددة الأوجه. بشكل ملحوظ ، حددنا عددًا من exosomal-RBPs التي هي أعضاء في عائلة hnRNP المعبر عنها في كل مكان وهي hnRNPA2B1 و hnRNPD و hnRNPH1 و hnRNPK و hnRNPE1 و hnRNPM و hnRNPU و hnRNPUL1. تشارك هذه البروتينات في استقلاب الحمض النووي الريبي (RNA) وتدفع ما قبل الرنا المرسال من خلال خطوات النضج من النواة إلى حجرة السيتوبلازم ، بما في ذلك التنظيم اللاحق للنسخ ، والربط البديل ، والنقل ، والتوطين [63]. بينما يتم ترجمة جميع أعضاء عائلة hnRNP إلى النواة ، يوجد رقم (ه.ز. ، hnRNPA2 ، hnRNPH1 ، hnRNPK ، hnRNPE1 ، و hnRNPUL1) قد تلعب دورًا في نقل الحمض النووي الريبي (RNA) تحت ظروف معينة [64-67]. علاوة على ذلك ، فإن hnRNPH1 قادر على ربط جزيئات pri-miRNA مباشرة وتعزيز معالجة pri-miRNA ، وبالتالي فهو يشارك بشكل مباشر في نضج miRNA [67]. عوامل مثل معالجة الحمض النووي الريبي بوساطة hnRNPH1 ، مهمة لضمان أن النسبة بين ما قبل ميرنا وميرنا الناضجة صحيحة [67].

بالإضافة إلى ذلك ، حددنا عددًا من RBPs في exosomes التي تشارك في نضج الحمض النووي الريبي الحمض النووي الريبي ونضوج الحمض النووي الريبي النووي الصغير (snoRNA). اكتشفنا ELAC2 ، الذي يحفز إزالة المقطورة 3 'من السلائف tRNAs ، مما يؤدي إلى إنتاج tRF-1001 [68] ، وكذلك MOCS3 ، الذي يشارك في ثيول الحمض الريبي النووي النقال ، و RUVBL1 ، الذي يلعب دورًا مهمًا في تجميع واستقرار snoRNAs [69]. علاوة على ذلك ، تم تحديد أربعة أعضاء من عائلة synthetase aminoacyl-tRNA (IARS و DARS و EPRS و RARS) في exosomes. الوظيفة الرئيسية لهذه البروتينات هي تحفيز تفاعل aminoacylation أثناء الترجمة [70]. حددنا أيضًا بروتينات TUFM (عامل استطالة الترجمة Tu ، الميتوكوندريا) و EEF1A1 (عامل استطالة الترجمة حقيقية النواة 1) في exosomes ، وكلاهما يلعب دورًا رئيسيًا في الترجمة TUFM هو عامل استطالة الميتوكوندريا ، بينما EEF1A1 مسؤول عن التسليم الأنزيمي لـ aminoacyl tRNAs إلى الريبوسومات. التفاعل بين هذين البروتينين يمنع إطلاق EEF1A1 ويؤدي إلى إسكات الترجمة [71]. لم يكن وجود البروتينات داخل exosomes التي تشارك في نضج الحمض النووي الريبي (tRNA) و snoRNA مفاجئًا لأن الإكسوسومات تحتوي على وفرة من ncRNAs القادرة على الارتباط ببروتينات الأرجونوت لتكوين مجمعات إسكات يسببها الحمض النووي الريبي (RISCs) [18 ، 72 ، 73]. حددنا أيضًا GNB2L1 ، وهو مكون أساسي للريبوسوم ، في exosomes. يعمل هذا البروتين كمحول جزيئي قادر على تجنيد مجموعة متنوعة من المنظمين لترجمة الرنا المرسال ، مثل مجمعات الإسكات المستحثة بالـ miRNA ، ويسهل تفاعلات هذه المنظمات مع آلية الترجمة أثناء خطوات الترجمة المتنوعة [74]. علاوة على ذلك ، ينتمي عدد من RBPs المكتشفة في exosomes (HSP90AB1 و HSP1A و HSPD و HSPA8) إلى عائلة بروتين الصدمة الحرارية. على الرغم من أن هذه الفئة من البروتينات لا تحتوي على مجالات محددة مرتبطة بالـ RNA ، إلا أنها تلعب دورًا في إسكات الجينات بوساطة miRNA. في الواقع ، توجد العديد من بروتينات الصدمة الحرارية في مجمعات تحتوي على بروتينات الأرجونوت [75].يعتبر مجمع Hsc70 (HSPA8) -HSP90 ضروريًا لتجميع RISC ويلعب دورًا مباشرًا في تحميل miRNAs إلى RISCs [76].

في سياق الشبكات وتعديلات ما بعد النسخ (تين. 3) ، تُظهر الأدلة الحديثة أن التعديلات اللاحقة للنسخ على الحمض النووي الريبي يمكن أن تكون ذات صلة بفرز الحمض النووي الريبي في إكسوسومات [44 ، 77]. ارتبط 3 ′ adenylation من miRNAs بالاحتفاظ داخل الخلايا بينما يتم إثراء الأشكال الإسوية uridylated في كسور exosome [77]. قد يشير هذا إلى أن التوطين الخلوي المحدد للبروتينات المعدلة للحمض النووي الريبي قد يكون له تأثير على فرز الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تساهم تعديلات ما بعد النسخ في فرز مجموعات miRNA المحددة في exosomes مثل miR-2909 ، في حين أن طبيعة التعديل اللاحق للنسخ لـ miR-2909 يمكن أن تساهم في التقسيم الانتقائي لأدينوزين كيناز بين الخلايا السرطانية وإكسوسوماتها المفرزة [ 78].

الشبكات ووجود RBPs المعدّل بعد النسخ المحدد في exosomes لدينا (تين. 3) يمكن أن تتعاون (يمكن أن تعمل بشكل تعاوني) لتحديد الأدوار المذكورة أعلاه في فرز الحمض النووي الريبي إلى exosomes. فيما يتعلق بالتعديل اللاحق للنسخ والتخليق الجيني في سياق الجسيمات الخارجية ، هناك بالفعل بعض الأدلة على أن البروتينات الخارجية تكون غنية بالبروتينات المشاركة في مثل هذه العمليات [79]. على سبيل المثال ، ظهر مؤخرًا أن exosomes تحتوي على بروتينات مرتبطة بتخليق الحمض النووي الريبي (RNA) والترجمة وتعديل البروتين ، مما يشير إلى أنه يمكن ترجمة هذه البروتينات من mRNAs بعد تعبئتها في exosomes. نظرًا لأن آلية معالجة الحمض النووي الريبي (RNA) يمكن أن توجد في exosomes [9 ، 80] ، فإن وجود العديد من البروتينات الخارجية يُظهر علاقتها بآلات تصنيع ومعالجة البروتينات RNA ، مما يشير إلى أن الإكسوسومات لا تحتوي فقط على آليات بروتين جاهزة للاستخدام ولكن أيضًا mRNAs التي يمكن ترجمتها إذا لزم الأمر [79]. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن أن تعمل mRNAs فقط في الخلايا المستهدفة ولكن أيضًا يتم التعبير عنها في exosomes بعد الإفراز [79]. نظرًا لأنه تم الإبلاغ على نطاق واسع في السنوات الأخيرة عن أن exosomes تنقل البروتينات والأحماض النووية بين الخلايا وقد تكون قادرة بعد ذلك على تنظيم التعبير الجيني في الخلايا المتلقية. قد يساعد وجود معدِّلات ما بعد النسخ في exosomes على استقرار تنقل الحمض النووي الريبي (النقل) بين الخلايا والأنشطة اللاجينية في الخلايا المتلقية.

كان البروتين الرئيسي الذي تم اكتشافه من فحوصاتنا هو MVP ، وهو مكون رئيسي في مجمع vault ، وهو بروتين يتيم ينتمي إلى فئة منتشرة في كل مكان من RNPs ذات وظيفة غير محددة (أقبية). هذا البروتين هو متعدد الوحدات الفرعية RNP التي تشكل مع البروتينات الأخرى معقدًا جزيئيًا كبيرًا ، وهو شكل مميز يشبه البرميل المجوف [81]. نظرًا لشكلها المميز ووظيفتها المفترضة (النقل النووي للـ RNA) [81] ، فإننا نفترض أن MVP قد لا ينقل الحمض النووي الريبي إلى exosomes فحسب ، بل يمكن أيضًا أن يشارك في نقل esRNA إلى خلايا أخرى عبر exosomes. تم العثور أيضًا على العديد من RBPs الأخرى ذات المواقع المتعددة في exosomes ، بما في ذلك NCL و SNW / SKIP. يشارك NCL في نضج الرنا الريباسي ومعالجته ، ولديه القدرة على الارتباط بـ mRNAs السيتوبلازمي ، مما يؤدي إلى تنظيم ما بعد النسخ ، وتعزيز استقرار الحمض النووي الريبي ، وتنظيم الترجمة في العصارة الخلوية [82-85]. NW / SKIP هو عامل الربط الذي يشارك في تنظيم توليف mRNA [86].

الدور المحتمل لـ RBPs التي تم تحديدها في نقل RNAs إلى exosomes: MVP هو بروتين مهم

تشير الاختلافات بين العرض الخلوي و esRNAs إلى أن الرنا لا يتم تعبئتها بشكل عشوائي في exosomes بدلاً من ذلك يجب أن تكون هناك آلية فرز منظمة بدقة تزود هذه الحويصلات بمجموعة فرعية من الحمض النووي الريبي ، أثناء تركيبها الحيوي. لقد ثبت أن جميع RNAs داخل الخلايا ليست عارية ، بل هي مقترنة بـ RBPs ، وكذلك البروتينات المرتبطة بها (شركاء الربط) ، والتي تؤثر على عملية التمثيل الغذائي الخاصة بها وكذلك عمليات النقل داخل المقصورة. يشير هذا إلى أنه يجب أن تقترن esRNA بالبروتينات (أي يجب أن تكون موجودة كمجمعات RNP).

حددنا RBPs في exosomes التي كانت قادرة على التفاعل مع أنواع مختلفة من الحمض النووي الريبي. تقييمنا هو: (أ) نظرًا لوجود RBPs مرتبطة بـ RNAs ذات الصلة ، فإن RBPs هذه لا تنتهي في exosomes وحدها ، ولكن جنبًا إلى جنب مع جزيئات RNA كمركب من RNA و ribonucleoproteins ، و (ب) وجود RBPs في يمكن أن تكون exosomes لغرض مثل الحفاظ على RNAs داخل exosomes ونقل هذا RNA إلى خلايا أخرى - ما يسمى exosome المكوك RNA (esRNA) [17].

على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن RBPs لتنظيم التولد الحيوي للخارج ، إلا أن دورها في فرز الحمض النووي الريبي إلى exosomes لم يبدأ إلا مؤخرًا في استكشافه [27 ، 33 ، 44 ، 45]. على الرغم من ذلك ، تظل الآليات التي يتم من خلالها التعرف على مجمعات RBP-RNA الخلوية بواسطة MVBs وتحميلها في exosomes غير معروفة. في دراستنا ، يشير وجود RBPs في exosomes إلى أنه ، على غرار الخلايا ، تحتوي exosomes على RNAs مرتبطة ببروتيناتها المشابهة. قد تكون هذه RBPs مهمة لمصير ووظيفة esRNAs ، بما في ذلك عبواتها في exosomes ، واستقرارها وصيانتها لتسليمها إلى الخلايا المتلقية. لتقييم الأدوار المحتملة لـ RBPs في تغليف RNA في exosomes ، تم إسكات ستة نسخ جينية ، ترميز RBPs المحددة في exosomes (HSP90AB1 و XPO5 و hnRNPH1 و hnRNPM و hnRNPA2B1 و MVP) ، تم إسكاتها في الخلايا الأم (تم تحديد XPO5 فقط في واحدة من التكرارات ولكن لا يزال يتم تضمينها بين الجينات التي تم إسكاتها ، ومع ذلك لم يتم تضمينها في الجدول 2). أربعة من ستة RBPs المحددة تحتوي على مجال ربط RNA وظيفي معروف (الجدول 2) ومن المعروف أنها تشارك في مراحل مختلفة من استقلاب الحمض النووي الريبي ، بما في ذلك النقل والربط والنضج. بشكل ملحوظ ، كشفت نتائجنا أن الإسكات الانتقائي لـ MVP السيتوبلازمي قلل بشكل كبير من كمية إجمالي الحمض النووي الريبي في exosomes (الشكل 4) ، مما يشير إلى الدور المحتمل لـ MVP في نقل الحمض النووي الريبي من الخلايا إلى exosomes. علاوة على ذلك ، بعد اختبار السحب لأسفل ، أظهر القياس الكمي للحمض النووي الريبي الذي تم التصفية منه مع MVP أن كمية الحمض النووي الريبي الموجودة في MVP-elute كانت أعلى بكثير من esRNA من الخلايا غير المنقولة. ومن المثير للاهتمام ، أن هذا يشير إلى أن MVP معقد بمستوى أعلى من الحمض النووي الريبي الخارجي من exosomes من الخلايا غير المنقولة (الشكل 5 ب و 5 ج). في السيناريو الحالي ، تشير نتائجنا إلى أن MVP مهم في نقل RNA إلى exosomes ، ومع ذلك ، ما زالت أنواع الحمض النووي الريبي تتفاعل مع MVP في هذه الإكسوسومات بحاجة إلى إجابة. أظهرت الدراسات أن أكثر أنواع الحمض النووي الريبي وفرة في exosomes هو vault RNA (vRNA) وأن هذا الحمض النووي الريبي يرتبط بـ MVP [87]. تمشيا مع هذه الملاحظة ، نتوقع أن إسكات MVP يمكن أن يمنع تغليف الحمض النووي الريبي وبالتالي تقليل إجمالي الحمض النووي الريبي في exosomes (الشكل 4 د). ومع ذلك ، بالإضافة إلى RNA المدفن الموجود في exosomes ، تم الإبلاغ عن وجود العديد من الأنواع الأخرى المشفرة و ncRNA في exosomes [3 ، 88]. قد يتعامل MVP مع العديد منهم. على سبيل المثال ، مؤخرًا ، ثبت أن MVP يتفاعل مع miR-193a ، بينما يؤدي خروج MVP إلى تراكم miR-193a في خلايا المتبرع الخارجي بدلاً من exosomes [89]. كما تم اقتراح أن أنواع الخلايا المختلفة قد تستخدم RBPs مع تفضيلات ربط مميزة لإفراز مجموعات فرعية معينة من miRNA ، وربما فئات أخرى من RNA ، في exosomes [33]. بالنظر معًا ، يمكن أن يكون MVP لاعبًا مهمًا في نقل RNA إلى exosomes ، ومع ذلك ، قد تبرر المزيد من الدراسات الآليات الأساسية.

بشكل مفاجئ ، بعد إسكات hnRNPH1 ، زادت كمية الحمض النووي الريبي في exosomes مقارنةً بالتحكم السلبي (الشكل 4 ب). يمكن افتراض هذا الارتباط العكسي بين hnRNPH1 وكمية esRNA بطريقة تجعل هذا البروتين مهمًا في حلقة التغذية الراجعة للحفاظ على مستويات الحمض النووي الريبي السيتوبلازمي (الاحتفاظ داخل الخلايا لـ RNA) عن طريق منع نقل RNA إلى exosomes. ومع ذلك ، يتم الحصول على البيانات الحالية المتعلقة بـ hnRNPH1 من مكررين بيولوجيين وما إذا كان هذا البروتين له دور محتمل في احتباس الحمض النووي الريبي السيتوبلازمي سيحتاج إلى مزيد من التحقق من الصحة.

بالإضافة إلى تقليل إجمالي الحمض النووي الريبي الخارجي بعد إسكات MVP ، تسبب إسكات hnRNPA2B1 أيضًا في انخفاض طفيف في إجمالي الحمض النووي الريبي الموجود في exosomes ، ولكن عند مستوى غير مهم ≈13 ٪ (الشكل 4 ب). في الآونة الأخيرة ، حددت دراسة دور hnRNPA2B1 الساموي في نقل مجموعة فرعية معينة من miRNAs إلى exosomes من خلايا Jurkat [44]. ومع ذلك ، في تجاربنا ، حددنا hnRNPA2B1 في فحوصات الربط من البروتينات الخارجية و mRNA الخلوية أو الحمض النووي الريبي الخارجي ، بالإضافة إلى فحوصات الربط التي تحتوي على بروتينات خلوية و miRNAs / mRNA الخلوية ، لكننا لم نتمكن من تحديدها في فحوصات تحتوي على بروتينات خارجية وخلوية. - ميرناس (الشكل 2 ج). يمكن أن يكون هذا التناقض في hnRNPA2B1 في نقل مجموعة فرعية معينة من miRNAs إلى exosomes ناتجًا عن عائق ستيري ناتج عن البقايا المتراكمة في hnRNPA2B1 التي تمنع تفاعل البروتين / الحمض النووي الريبي على سطح Dynabeads. إذا تم نقل miRNAs إلى exosomes بواسطة هذا الشكل المعدل من البروتين ، والذي يكون سائدًا ولكن ليس حصريًا في exosomes ، فربما نكون قد حددنا التفاعلات التي تحدث بين RNAs والشكل العادي للبروتين (غير السومويليتيد). بدلاً من ذلك ، قد يكون التفاعل بين hnRNPA2B1 و RNAs المستهدفة محددًا ومستهدفًا لجزيئات miRNA معينة لا يمكن اكتشافها بالطريقة المستخدمة هنا. ومع ذلك ، قد تستبعد دراسات أخرى هذه التناقضات.

آلية النقل الممكنة للحمض النووي الريبي الخارجي

بعد إظهار تفاعلات exosomal-RBPs مع أنواع مختلفة من الحمض النووي الريبي ، فإنه يشير إلى أن الحمض النووي الريبي الموجود في الإكسوسومات يقترن بـ RBPs (أي أنها موجودة كمجمعات RNP) التي اكتشفناها في دراستنا (الشكل 1 ب)، وحدد الممارسات التجارية التقييدية من هذا التفاعل (الصورة 2). ومع ذلك ، في أي مرحلة يتم إدخال معقدات RNP-RNA في exosomes - أثناء التخليق الحيوي للحويصلات وما هي الآليات الأساسية لا تزال غير واضحة.

هنا ، نفترض مسارين معقولين لنقل RNAs إلى exosomes أثناء التخليق الحيوي لهذه الحويصلات من أجسام multivesiclur (MVBs) (الشكل 6). في النموذج الأول ، يمكن لمجمعات بروتين الحمض النووي الريبي (RNPs) استخدام آلية تبرعم من الغلاف النووي (NE) ليتم تعبئتها في حويصلات تسمى حبيبات "إسرنا - بروتين". يمكن أن تندمج حبيبات بروتين esRNA وتدخل في MVBs مكونة حويصلات وسيطة ، والتي تنضج لاحقًا إلى حويصلات داخل اللمعة من MVBs. تم وصف عملية مماثلة في ذبابة الفاكهة لوجود حبيبات RNP من النواة عند التقاطع العصبي العضلي. على وجه التحديد ، تندمج حبيبات RNP مع الغشاء النووي الداخلي وتبرعم في الغلاف النووي. في وقت لاحق ، يمكن للبراعم المحتوية على RNP أن تهاجر إلى السيتوبلازم عن طريق الاندماج مع الغشاء النووي الخارجي [90]. وبالمثل ، فإننا نقترح أنه في الخطوة الأولى لتعبئة esRNA ، قد تشكل حبيبات RNP (أي مركب بروتين إسرنا) حويصلة وسيطة داخل MVBs ، عن طريق التبرعم الداخلي - على غرار تبرعم الغشاء النووي. تنضج الحويصلات الوسيطة وتتحول إلى حويصلات داخل اللمعة داخل MVB. عند اندماج MVB مع غشاء البلازما ، سيتم إطلاق الحويصلات داخل اللمعة (exosomes) في الخارج التي تحتوي على مجمعات RNA-RNPs في البيئة خارج الخلية. في النموذج الثاني (الشكل 6 الجانب الأيمن) ، RNA- مجمعات البروتين (RNPs) - يتم نقلها عبر مجمع المسام النووي (NPC) - تنجذب إلى موقع الاستيعاب / بروتينات المستقبل التي يمكن أن تتوسط في التبرعم الداخلي لـ MVBs ، لتشكيل حويصلات داخل اللمعة. عند الاندماج مع غشاء البلازما ، تطلق MVBs الحويصلات داخل اللمعة كإكسوسومات تحتوي على مجمعات RNA-RNPs في البيئة خارج الخلية.

مساران افتراضيان (أ و ب) لتعبئة معقدات RNA - البروتينات (RNPs) في exosomes أثناء التخليق الحيوي لهذه الحويصلات من الأجسام متعددة الخلايا (MVBs): (أ) تستخدم حبيبات RNP ، أي مجمعات بروتين RNA التي يتم تضمينها في exosomes (ما يسمى بمركب بروتين esRNA) آلية تبرعم للدخول في الحويصلات داخل اللمعة من MVBs كحبيبات بروتين RNA. عند القيام بذلك ، فإنها تشكل أولاً حويصلة وسيطة داخل MVBs ، عن طريق التبرعم الداخلي - وهي آلية مشابهة لتبرعم الغلاف النووي (NE) كما هو موضح في [90-92]. تنضج الحويصلات الوسيطة وتتحول إلى حويصلات داخل اللمعة داخل MVB. عند اندماج MVB مع غشاء البلازما ، سيتم إطلاق الحويصلات داخل اللمعة (exosomes) في الخارج التي تحتوي على مجمعات RNA-RNPs في البيئة خارج الخلية. في النموذج الثاني (ب) RNA- مجمعات البروتين (RNPs) - التي يتم نقلها عبر مجمع المسام النووي (NPC) - تنجذب إلى موقع الاستيعاب الذي يحتوي على بروتينات مستقبلات مختلفة يمكنها التوسط في التبرعم الداخلي لـ MVBs ، لتشكيل حويصلات داخل اللمعة. عند الاندماج مع غشاء البلازما ، تطلق MVBs الحويصلات داخل اللمعة (exosomes) التي تحتوي على مجمعات RNA-RNPs في البيئة خارج الخلية.

أظهرت الدراسات الحديثة تورط كل من تبرعم NE و NPC في نقل RNPs من النواة إلى السيتوبلازم [91 ، 92]. نحن نفترض أن RNPs بعد تبرعم NE يمكن أن تتبع المزيد من البراعم المماثل في MVBs. ومع ذلك ، للتحقق من صحة هذه المسارات ، ستكون هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات.

باختصار ، بالنظر إلى دور RBPs في نقل RNA والتمثيل الغذائي والدور الذي تم الإبلاغ عنه مؤخرًا في فرز RNA إلى exosomes ، من الأهمية بمكان فهم أي RBPs ضروري لتعبئة RNA في exosome. يثير هذا أيضًا إمكانية مشاركة RBPs في الحفاظ على RNA في exosomes لفترات كافية قد تسهل نقل الحمض النووي الريبي الخارجي السليم إلى الخلايا المتلقية لضمان النقل الوظيفي لـ RNA. تحقيقًا لهذه الغاية ، تُبلغ بياناتنا عن العديد من RBPs (على وجه الخصوص MVP) في exosomes وتفتح طرقًا أخرى لاستكشاف الآليات الأساسية. ومع ذلك ، لا تُظهر بياناتنا الأشكال التسلسلية المحددة لأنواع MVP و esRNA. منذ أن تم التحقق من صحة تكوين مجمعات MVP-RNA وكذلك إسكاتها والتحقق منها في جميع المقايسات المستقلة ، وعلى الأقل في سطرين من الخلايا (HTB-177 و HEK293F) ، فإن غياب تسلسل الحمض النووي الريبي للعثور على فكرة ملزمة لا يتغير استنتاجنا أن MVP يلعب دورًا مهمًا في نقل RNA إلى exosomes. اقترح Shurtleff وزملاؤه أن أنواعًا مختلفة من الخلايا قد تستخدم RBPs مع تفضيلات ربط مميزة لإفراز miRNAs ، وربما فئات أخرى من RNA ، في exosomes. اقترح المؤلفون أيضًا أن بعض أنواع الخلايا قد تنشر RBPs متعددة لفرز RNAs إلى exosomes [33]. تتفق بياناتنا التي تُظهر تحديد العديد من RBPs ، مع هذه الحجة ، ولكن من غير الواضح ما إذا كانت هذه البروتينات تعمل معًا أم بمفردها. بالإضافة إلى ذلك ، جادل مؤلفو هذه الدراسة بأنه في هذه الحالة سيكون اكتشاف الحافز أمرًا صعبًا ، حتى في الحويصلات شديدة النقاء ، بسبب تفضيلات الأشكال المتنوعة من البروتينات المتميزة [33].


شاهد الفيديو: علم Exosomes (قد 2022).