معلومة

6: فصل الأحماض الأمينية ، روابط الببتيد ، وتسلسل البروتين - علم الأحياء

6: فصل الأحماض الأمينية ، روابط الببتيد ، وتسلسل البروتين - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

6: فصل الأحماض الأمينية ، روابط الببتيد ، وتسلسل البروتين

الفصل 4 فصل وتنقية الببتيدات

يركز هذا الفصل على فصل وتنقية الببتيدات. ينتج عن انقسام البروتين بالطرق الأنزيمية أو الكيميائية خليط من عدد قليل أو كثير من شظايا الببتيد ، والتي يجب فصلها عن بعضها البعض لتحديد بنيتها. إن تنقية الببتيدات هي المرحلة الأكثر استهلاكا للوقت في تحديد تسلسل الأحماض الأمينية للبروتين ، ولكن الوقت المطلوب الآن أقل بكثير مما كان عليه. تعتمد طرق فصل الببتيدات على واحدة أو أكثر من الخصائص الكيميائية الفيزيائية التالية: الحجم الجزيئي ، والشحنة ، والقطبية ، والذوبان ، والتفاعلات التساهمية أو غير التساهمية المحددة. يمكن تغيير شحنة الببتيد عن طريق تغيير الرقم الهيدروجيني. المناقشة في هذا الفصل للطرق المناسبة للفئات المتخصصة من البروتينات الكروية النموذجية ، مثل الكولاجين ، مع توزيعات غير عادية لبقايا الأحماض الأمينية ، سوف تتطلب نهجًا معدلًا. يمثل فصل الببتيدات عن بروتينات الغشاء المتكامل مشاكل خطيرة ، بسبب الميل الكبير لمثل هذه الببتيدات للتجمع أو أن تكون غير قابلة للذوبان في الوسائط المعتادة لتحليل مخاليط الببتيد.


الملخص

الضغط الهيدروستاتيكي العالي (HHP) والغسيل الكهربائي باستخدام أغشية الترشيح الفائق (EDUF) هما تقنيتان فعالتان تستخدمان على التوالي لتحسين التحلل المائي الإنزيمي للبروتين واستعادة الببتيدات النشطة بيولوجيًا ، ولكن لم يتم اختبارهما معًا مطلقًا. ومن ثم ، في هذه الدراسة ، تم إجراء المعالجة المسبقة لـ HHP على عزل بروتين بذور الكتان منزوع الدهن قبل التحلل المائي الأنزيمي وتم فصل الببتيدات الناتجة بواسطة EDUF. أثرت المعالجة المسبقة لـ HHP على حجم الجسيمات وتشكيل البروتين ودرجة التحلل المائي. بعد فصل EDUF ، تم إثراء أجزاء الببتيد (التي تم إنشاؤها بعد التحلل المائي الإنزيمي للتحكم وعزل البروتين المعالج بالضغط) المستعادة في جزء KCl في الأرجينين وترتبط بانخفاض ضغط الدم الانقباضي (SBP) في الجرذان المصابة بارتفاع ضغط الدم تلقائيًا. بالإضافة إلى ذلك ، ارتبط تحلل EDUF النهائي الناتج من البروتين المعالج مسبقًا وتحلل EDUF الأولي من البروتين الأصلي أيضًا بانخفاض SBP. ومع ذلك ، فقط جزء KCl الضابط الذي تم الحصول عليه من تحلل البروتين الأصلي كان مرتبطًا بالنشاط المضاد لمرض السكري.


3. الاستنتاجات ووجهات النظر

بدءًا من تحديد المكونات المختلفة لمسار إشارات IDA-HSL في نبات الأرابيدوبسيس ، حددنا نحن وآخرون الآن أخصائيو تقويم هذه الجينات في جميع ترتيب النباتات المزهرة وقدموا أمثلة على تعبيرهم في AZs أو الزهور ، وأوراق الشجر والفواكه أظهرت أن IDA يمكن أن يحفز الببتيد عمليات الانفصال في كل من monocots و dicots وفي حالات قليلة تحقق من صحة الوظيفة المحفوظة المفترضة عبر الأعضاء والأنواع من خلال تكملة نبات الأرابيدوبسيس إيدا متحولة. ومع ذلك ، فإن الدليل النهائي على الوظيفة المحفوظة لا يزال يفتقر إلى & # x02014a النقص الكلي في الانفصال عن طريق طفرة في جينات الببتيد أو المستقبلات حتى الآن فقط في Arabidopsis.

بدأ مختبرنا دراسة إيدا متحولة منذ حوالي 20 عامًا نظرًا لانفصالها المميز & # x02014 النمط الظاهري الناقص. على مدار هذه السنوات ، أحدثت الابتكارات التكنولوجية ثورة في العلوم ، بما في ذلك علم النبات ، لذلك ، من حيث المبدأ ، يمكننا الوصول إلى المعلومات الجينية لأي نوع ، وأي فرد وحتى أي خلية. يتيح تسلسل الجينوم الكامل للأنواع من كل رتبة من النباتات المزهرة دراسة التباين في التشكل والتطور والتكيف البيئي من منظور تطوري.

تم اكتشاف الببتيدات كهرمونات جديدة تسهل التواصل من خلية إلى أخرى فيما يتعلق بالعمليات التنموية والدفاع (انظر المراجعات الأخيرة [47،48،49،50]). تعد IDA-HAE / HSL2 من بين أفضل وحدات مستقبلات الببتيد-يجند المفصلة في التاريخ ، مع دليل وراثي وكيميائي حيوي وتركيبي لتفاعل مستقبلات الببتيد ، وتحديد المستقبلات المشتركة ، ومكونات مسار الإشارات النهائية مع كينازات MAP ونسخ KNOX العوامل التي تتحكم في التعبير عن الجينات المشاركة في الخطوة الفعلية لفصل الخلايا [4 ، 5 ، 6 ، 10 ، 13 ، 14 ، 21 ، 23 ، 25 ، 26 ، 34 ، 35]. أحد الأسئلة الأساسية في علم الأحياء التطوري هو ما إذا كان تطور السمات ناتجًا بشكل أساسي عن التغيرات الطفرية في البروتينات أو التغييرات في تنظيم متى وأين يتم التعبير عن الجينات. نحن نفترض أنه فيما يتعلق بعمليات الانفصال ، فإن الحالة الأخيرة هي الحالة التي يتم حفظ الأساس الجزيئي لفصل الخلايا فيها في وحدة إشارات مستقبلات رابطة IDA-HSL بغض النظر عن مكان وزمان حدوث انسحاب العضو.

يعاني المزارعون من خسائر فادحة بسبب الانقطاع المبكر للزهور والفواكه ، كما أن زيادة العائد لكل فدان سيكون موضع ترحيب من منظور بيئي. مع التكيف ، في عدد متزايد باطراد من أنواع النباتات ، لتقنية تحرير الجينات CRISP / Cas التي تعد بطفرات مستهدفة لأي جين ، نتوقع أن يتم اختبار فرضيتنا عن طريق جيل من IDA أو HSL المسوخ في الأنواع ذات الصلة في المستقبل القريب.


تشير هذه المقالة إلى 32 منشوراً آخر.

تم الاستشهاد بهذه المقالة في 44 مطبوعة.

  1. فرانسيس بيرثياس ، ماثيو أ.بيرد ، ألكسندر أ.شفارتسبورج. الفواصل الأيونية التفاضلية للحركة الأيونية لـ d / l الببتيد Epimers. الكيمياء التحليلية 2021,93 (8) ، 4015-4022. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.0c05023
  2. براتيما باثاك ، أناستازيا ساريشيفا ، ماثيو أ.بيرد ، ألكسندر أ.شفارتسبيرغ. ترسيم الأيزومرات بواسطة تحولات 13C في أطياف التنقل الأيوني. مجلة الجمعية الأمريكية لقياس الطيف الكتلي 2021,32 (1) ، 340-345. https://doi.org/10.1021/jasms.0c00350
  3. K.H Brian Lam، J.C Yves Le Blanc، J. Larry Campbell. فصل الايزومرات والمطابقات ونظائر السيكلوسبورين باستخدام التحليل الطيفي للحركة التفاضلية وقياس الطيف الكتلي وتبادل الهيدروجين والديوتيريوم. الكيمياء التحليلية 2020,92 (16) ، 11053-11061. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.0c00191
  4. براتيما باثاك ، ماثيو أ.بيرد ، ألكسندر أ.شفارتسبورغ. التحولات النظيرية من الناحية الهيكلية في أطياف الحركة الأيونية للأنواع الأثقل. مجلة الجمعية الأمريكية لقياس الطيف الكتلي 2020,31 (1) ، 137-145. https://doi.org/10.1021/jasms.9b00018
  5. الكسندر أ.شفارتسبورغ ، روش أندرزيجوسكي ، أندرو إنتويستل ، روجر جايلز. مطياف التنقل الأيوني للجزيئات الكبيرة مع محاذاة ثنائية القطب قابلة للتحويل عن طريق تغيير ضغط الغاز. الكيمياء التحليلية 2019,91 (13) ، 8176-8183. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.9b00525
  6. ماثيو إيه بيرد ، بافيل ف.شليها ، جوردون أ.أندرسون ، يوجين موسكوفيتس ، فيكتور ليكو ، ألكسندر أ. أجهزة فصل الأيونات التفاضلية عالية الدقة / مطياف الكتلة Orbitrap بدون قيود غازات العازلة. الكيمياء التحليلية 2019,91 (10) ، 6918-6925. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.9b01309
  7. ماثيو أ.بيرد ، براتيما باثاك ، ألكسندر أ.شفارتسبيرغ. الاعتماد الأولي للتحولات النظيرية المحددة هيكليًا في أطياف تنقل الأيونات عالية المجال. الكيمياء التحليلية 2019,91 (5) ، 3687-3693. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.8b05801
  8. براتيما باثاك ، ماثيو أ.بيرد ، ألكسندر أ.شفارتسبورغ. تحديد الايزومرات من خلال التحولات النظيرية متعددة الأبعاد في أطياف تنقل الأيونات عالية المجال. الكيمياء التحليلية 2018,90 (15) ، 9410-9417. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.8b02057
  9. أليسا جارابديان ، وماثيو أ.بيرد ، وجاكوب بورتر ، وكيفن جين ديت فوك ، وبافيل ف.شلياها ، وأولي إن جنسن ، وتود دي ويليامز ، وفرانشيسكو فيرنانديز-ليما ، وألكسندر أ. عمليات الفصل الخطي والتفاضلي للحركة الأيونية للبروتينات المتوسطة السفلية. الكيمياء التحليلية 2018,90 (4) ، 2918-2925. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.7b05224
  10. الكسندر أ. شفارتسبيرغ ، أنيشا هاريس ، روش أندرزيجوسكي ، أندرو إنتويستل ، روجر جايلز. الفصل التفاضلي الأيوني في نظام الضغط المنخفض. الكيمياء التحليلية 2018,90 (1) ، 936-943. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.7b03925
  11. براندون جي سانتياغو ، ماثيو تي كامبل ، غاري إل جيليش. المتغيرات التي تؤثر على الطاقة الداخلية للأيونات الببتيدية أثناء الفصل بواسطة مطياف التنقل الأيوني التفاضلي. مجلة الجمعية الأمريكية لقياس الطيف الكتلي 2017,28 (10) ، 2160-2169. https://doi.org/10.1007/s13361-017-1726-8
  12. ماثيو إيه بيرد ، ألكسندر أ شفارتسبيرج. توطين تعديلات ما بعد الترجمة في مخاليط الببتيد عبر فواصل تنقل الأيونات التفاضلية عالية الدقة متبوعة بتفكك نقل الإلكترون. مجلة الجمعية الأمريكية لقياس الطيف الكتلي 2016,27 (12) ، 2064-2070. https://doi.org/10.1007/s13361-016-1498-6
  13. تشيدان تشين ، ستيفن إل كوي ، إيفان إل بانكوك ، إيفاجيليا سي لايكيس ، آدم بي هول ، ألبرت جيه فورناس جونيور ، بول فوروس. الكشف السريع والعالي الإنتاجية والكمية للعلامات الحيوية للإشعاع في الرئيسيات البشرية وغير البشرية عن طريق قياس الطيف التفاضلي للحركة الطيفية والكتلة. مجلة الجمعية الأمريكية لقياس الطيف الكتلي 2016,27 (10) ، 1626-1636. https://doi.org/10.1007/s13361-016-1438-5
  14. هيلين ج كوبر. ما مدى فائدة FAIMS في تحليل البروتينات ؟. مجلة الجمعية الأمريكية لقياس الطيف الكتلي 2016,27 (4) ، 566-577. https://doi.org/10.1007/s13361-015-1326-4
  15. هونغ هي لي ، أريوم هونغ ، يونجو تشو ، سنغوان كيم ، وون جونغ كيم ، هيو آي كيم. التوصيف الهيكلي لعقار باكليتاكسيل المضاد للسرطان ومستقلباته باستخدام مطياف الكتلة الأيونية الحركية وقياس الطيف الكتلي الترادفي. مجلة الجمعية الأمريكية لقياس الطيف الكتلي 2016,27 (2) ، 329-338. https://doi.org/10.1007/s13361-015-1280-1
  16. سانتياغو براندون ، راشيل إيه هاريس ، سامانثا إل إيزنبرغ ، مارك إي ريدجواي ، أليس إل بيلو ، ديزموند إيه كابلان ، غاري إل جيليش. تحسين الفصل بين التنقل الأيوني التفاضلي باستخدام عمليات المسح المرتبطة لتكوين الغاز الحامل وحقل التعويض. مجلة الجمعية الأمريكية لقياس الطيف الكتلي 2015,26 (10) ، 1746-1753. https://doi.org/10.1007/s13361-015-1208-9
  17. جوسسيلين سارسبي ، وريان إل.جريفثس ، وآلان إم. رايس ، وجوزفين بانش ، وإليزابيث سي راندال ، وأندرو جيه كريس ، وهيلين جيه كوبر. التحليل السطحي لاستخلاص السائل مطياف الكتلة مقترنًا بمقياس طيف الحركة الأيوني غير المتماثل الميداني لتحليل البروتينات السليمة من الركائز البيولوجية. الكيمياء التحليلية 2015,87 (13) ، 6794-6800. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5b01151
  18. فلاديمير كوبيسوف ، وألكسندر ماكاروف ، وأوليج ف. بوياركين. ألوان الكتل الجزيئية: اندماج التحليل الطيفي وقياس الطيف الكتلي لتحديد الجزيئات الحيوية. الكيمياء التحليلية 2015,87 (9) ، 4607-4611. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5b00822
  19. نيكولاس إي مانيك ، مايكل بلفورد. فصل أيزومرات الأفيون باستخدام التأين بالرش الكهربائي ورذاذ الورق المقترن بمقياس الطيف الأيوني للتنقل الموجي غير المتماثل عالي المجال. مجلة الجمعية الأمريكية لقياس الطيف الكتلي 2015,26 (5) ، 701-705. https://doi.org/10.1007/s13361-015-1096-z
  20. ديفيد أورباخ ، جوليا أسبنليتر ، ديتريش إيه فولمر. وصف تفاعلات الطور الأيوني / المحايد للغاز في مطياف التنقل الأيوني التفاضلي: التنبؤ بالسيرة الذاتية باستخدام تشغيل المعايرة. مجلة الجمعية الأمريكية لقياس الطيف الكتلي 2014,25 (9) ، 1610-1621. https://doi.org/10.1007/s13361-014-0934-8
  21. سامانثا إل إيزنبرغ ، بول إم أرميستيد ، غاري إل جيليش. تعظيم الاستفادة من فصل الببتيد عن طريق قياس الطيف التفاضلي للتنقل الأيوني. مجلة الجمعية الأمريكية لقياس الطيف الكتلي 2014,25 (9) ، 1592-1599. https://doi.org/10.1007/s13361-014-0941-9
  22. Chenxi Jia و Christopher B. Lietz و Qing Yu و Lingjun Li. التوصيف الخاص بالموقع للحمض الأميني d الذي يحتوي على الببتيد Epimers بواسطة Ion Mobility Spectrometry. الكيمياء التحليلية 2014,86 (6) ، 2972-2981. https://doi.org/10.1021/ac4033824
  23. أندرو جيه كريس ، وجيد سمارت ، وهيلين جيه كوبر. تحليل واسع النطاق لمتغيرات تسلسل الببتيد: حالة مطياف الحركة الأيونية عالي المجال غير المتماثل. الكيمياء التحليلية 2013,85 (10) ، 4836-4843. https://doi.org/10.1021/ac400646m
  24. Yaoyang Zhang ، و Bryan R. Fonslow ، و Bing Shan ، و Moon-Chang Baek ، و John R. Yates ، III. تحليل البروتين بواسطة Shotgun / Bottom-up Proteomics. مراجعات كيميائية 2013,113 (4) ، 2343-2394. https://doi.org/10.1021/cr3003533
  25. أندرو جيه كريس ، نيل جيه شيمويل ، كاثرين بي بي لاركينز ، جون ك. هيث ، هيلين جيه كوبر. التحقيق في تكامل FAIMS والكروماتوجرافيا القوية للتبادل الكاتيوني في بروتينات البندقية. مجلة الجمعية الأمريكية لقياس الطيف الكتلي 2013,24 (3) ، 431-443. https://doi.org/10.1007/s13361-012-0544-2
  26. الكسندر أ.شفارتسبيرغ وريتشارد د. مطياف أيون التنقل التفاضلي عالي الدقة للبروتين. الكيمياء التحليلية 2013,85 (1) ، 10-13. https://doi.org/10.1021/ac3029129
  27. ألكسندر أ. شفارتسبيرج ، ويوبينج زينج ، وريتشارد د. سميث ، ونيل إل كيلير. فصل الحركة الأيونية لذيول هيستون المتغيرة الممتدة إلى النطاق "الأوسط للأسفل". الكيمياء التحليلية 2012,84 (10) ، 4271-4276. https://doi.org/10.1021/ac300612y
  28. أندرو جيه كريس وهيلين جيه كوبر. الفصل والتعرف على الببتيدات السكرية المتساوية عن طريق قياس الطيف الطيفي للتنقل الأيوني غير المتماثل عالي المجال. الكيمياء التحليلية 2012,84 (5) ، 2597-2601. https://doi.org/10.1021/ac203321y
  29. الكسندر أ.شفارتسبيرغ وريتشارد د. عمليات فصل الأيونات التفاضلية عالية الدقة المتسارعة باستخدام الهيدروجين. الكيمياء التحليلية 2011,83 (23) ، 9159-9166. https://doi.org/10.1021/ac202386w
  30. يانغ لي ، داندان جيانغ ، كون تشاو ، إينو لي ، ييبينغ ليو ، تشوانغ تشن ، ويغو وانغ ، هاييانغ لي. قياس مستمر في الوقت الحقيقي لأثر البروبوفول الزفير أثناء العملية بواسطة مطياف الحركة التفاضلية المستوية. الطرق التحليلية 2021,13 (23) ، 2624-2630. https://doi.org/10.1039/D1AY00179E
  31. فويسلاف بلاجوفيتش ، أماندا دي فيليبس ، ديثارد ك.بوهم. المثيلة كإستراتيجية لتعزيز الحساسية والانتقائية في تحليل الببتيد باستخدام مطياف التنقل التفاضلي (DMS). المجلة الدولية لقياس الطيف الكتلي 2020,450 116310. https://doi.org/10.1016/j.ijms.2020.116310
  32. جونغيو لي ، دانيال جي ديلافيلد ، لينجون لي. توضيح هيكلي محسّن لأيزومرات الببتيد ومستقبلاتها باستخدام مطياف الكتلة الحركية الأيونية المتقدمة. اتجاهات TrAC في الكيمياء التحليلية 2020,124 115546. https://doi.org/10.1016/j.trac.2019.05.048
  33. أوليج في بوياركين. التحليل الطيفي للأيونات الباردة للتعرف الهيكلي للجزيئات الحيوية. المراجعات الدولية في الكيمياء الفيزيائية 2018,37 (3-4) ، 559-606. https://doi.org/10.1080/0144235X.2018.1547453
  34. Xueyun Zheng ، Liulin Deng ، Erin S. Baker ، Yehia M. Ibrahim ، Vladislav A. Petyuk ، Richard D. Smith. التمييز بين الأحماض d - و l -aspartic و isoaspartic في ببتيدات amyloid مع مطياف الحركة الأيونية فائقة الدقة. الاتصالات الكيميائية 2017,53 (56) ، 7913-7916. https://doi.org/10.1039/C7CC03321D
  35. برادلي ب. شنايدر ، إركينجون ج.نزاروف ، فرانك لوندري ، بول فوروس ، توماس آر كوفي. مطياف الحركة التفاضلية / تاريخ قياس الطيف الكتلي ، والنظرية ، وتحسين التصميم ، والمحاكاة ، والتطبيقات. مراجعات الكتلة الطيفية 2016,35 (6) ، 687-737. https://doi.org/10.1002/mas.21453
  36. نافين شيكوري ، ريتشارد دي أونوين ، جون آر غريفيث. تطبيق الاستراتيجيات المستهدفة القائمة على قياس الطيف الكتلي لاكتشاف وتوطين التعديلات اللاحقة للترجمة. مراجعات الكتلة الطيفية 2015,34 (6) ، 595-626. https://doi.org/10.1002/mas.21421
  37. جوران ميتولوفيتش. تقنيات HPLC الجديدة لتحليل البروتينات: نظرة عامة موجزة على أحدث التطورات. مجلة الكروماتوغرافيا السائلة والتقنيات ذات الصلة 2015,38 (3) ، 390-403. https://doi.org/10.1080/10826076.2014.941266
  38. جولي إيه راي ، مارك إم كوشنير ، ريتشارد إيه يوست ، آلان إل.روكوود ، إيه واين ميكلي. تحسين الأداء في قياس 5 منشطات داخلية بواسطة LC-MS / MS جنبًا إلى جنب مع مطياف تنقل الأيونات التفاضلية. كلينيكا شيميكا أكتا 2015,438 ، 330-336. https://doi.org/10.1016/j.cca.2014.07.036
  39. سانتياغو براندون ، راشيل إيه هاريس ، سامانثا إل إيزنبرغ ، غاري إل جيليش. حل صلاحيات & gt7900 باستخدام عمليات المسح المرتبطة: إلى أي مدى تصف قوة التحليل قدرة الفصل لمطياف تنقل الأيونات التفاضلية. المحلل 2015,140 (20) ، 6871-6878. https://doi.org/10.1039/C5AN00845J
  40. نانان بانغ ، كونيو يان. دراسة الاعتماد على الحركات الميدانية والفصل المباشر للهرمونات النباتية الحمضية عن طريق مطياف الحركة التفاضلية - مطياف الكتلة. المجلة الدولية لقياس الطيف الكتلي 2014,362 ، 48-55. https://doi.org/10.1016/j.ijms.2013.12.025
  41. كورينا فلانجيا ، كاتالين شيوبو ، فلورينا كابيتان ، كريستينا موسواركا ، ماريلينا مانيا ، يوجين سيسو ، ألينا زامفير. رشاش النانو الكهربائي المؤتمت بالكامل مع تفكك نقل الإلكترون من أجل البروتينات عالية الإنتاجية من أعلى إلى أسفل. الكيمياء المفتوحة 2013,11 (1) ، 25-34. https://doi.org/10.2478/s11532-012-0130-2
  42. مايرا فاسكيوتي ، جوستافو ب.سانفيدو ، فانيسا ج.سانتوس ، بريسيلا إم لالي ، مايكل ماكولاغ ، جيلبرتو إف دي سا ، روميو ج.دارودا ، مارتن جي بيتر ، ماركوس إن إيبرلين. فصل السكاريد الأيزومري عن طريق انتقال مقياس الطيف الكتلي لحركة أيون الموجة باستخدام ثاني أكسيد الكربون كغاز انجراف. مجلة قياس الطيف الكتلي 2012,47 (12) ، 1643-1647. https://doi.org/10.1002/jms.3089
  43. كريستيان إي سويرينجن ، روبرت إل موريتز. مطياف تنقل أيون الموجي غير المتماثل عالي المجال للبروتيوميات القائمة على قياس الطيف الكتلي. مراجعة الخبراء للبروتيوميات 2012,9 (5) ، 505-517. https://doi.org/10.1586/epr.12.50
  44. كارولين إيفانز ، جوسلين نويرل ، سو ين أو ، ماليندا سالم ، آنا جي بيريرا-ميدرانو ، نارسيسو كوتو ، جاغروب باندال ، دنكان سميث ، ترونج كوا فام ، إستير كاروناكاران ، شين زو ، كاثرين إيه بيغز ، فيليب سي رايت. نظرة ثاقبة على نظام iTRAQ: أين نقف الآن؟ الكيمياء التحليلية والتحليلية الحيوية 2012,404 (4) ، 1011-1027. https://doi.org/10.1007/s00216-012-5918-6

فصل شظايا الببتيد من ركيزة بروتين كيناز C مدمجة في دبوس الشعر عن طريق الرحلان الكهربائي الشعري

تمتلك الببتيدات الاصطناعية التي تشتمل على ببتيدات دبوس الشعر المطوية جيدًا مزايا في مجموعة متنوعة من تطبيقات بيولوجيا الخلية بفضل المقاومة المتزايدة للتدهور التحلل البروتيني. في هذه الدراسة ، تم تصنيع الببتيد WKpG β-hairpin المندمج في ركيزة بروتين كيناز C (PKC) ، وتم تطوير ظروف الفصل الشعري الكهربائي لهذا الببتيد وشظايا التحلل البروتيني. تم إنشاء شظايا WKpG-PKC عن طريق المعالجة الأنزيمية باستخدام التربسين و Pronase E لإنتاج معايير لتحديد شظايا التدهور في محللة خلوية. نظام عازلة بسيط بسعة 250 ملي مولار ساعة3ص4، مكّن الأس الهيدروجيني 1.5 فصل WKpG-PKC وشظاياها بواسطة الرحلان الكهربائي الشعري في أقل من 16 دقيقة. باستخدام محللة خلوية يتم إنتاجها من خلايا Ba / F3 ، يمكن اكتشاف الركيزة المرتبطة بدبابيس الشعر ومنتجها PKCα-phosphorylated وفصلهما عن الأجزاء الناتجة عن الببتيداز المنتجة في محللة الخلية. هذه الطريقة لها تطبيق محتمل لتحديد وتقدير WKpG-PKC وشظاياها في أنظمة بيولوجية معقدة عند استخدام الببتيد كمراسل لفحص نشاط PKC.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


الملخص

تجزئة كروماتوغرافي للمستخلصات الخام (مستخلصات C8) من الدقيق المخصب بالبروتين من البازلاء الحقلية التجارية (بيسوم ساتيفوم L.) هنا لإنتاج مخاليط الببتيد المتعلقة بعائلة البازلاء الزلال 1 ب (PA1b) من الببتيدات النباتية الغنية بالسيستين. تم الحصول على المخاليط في البداية عن طريق كروماتوجرافيا الوميض مع هلام السيليكا. بعد شطف soyasaponins و lysolecithins ، أظهرت الكسور النهائية التي تم الحصول عليها باستخدام نظامي مذيب كروماتوجرافي فلاش نشاطًا في اختبار حيوي مضاد للتغذية باستخدام سوسة الأرز [Sitophilus oryzae (لام)]. تمت مقارنة الخواص الكيميائية لهذه المخاليط عن طريق تحليل كروماتوجرافيا الطبقة الرقيقة ، كروماتوجراف سائل عالي الأداء (HPLC) ، الأشعة تحت الحمراء ، MS ، وتحليلات الأحماض الأمينية. تم عزل الببتيدات الرئيسية لمستخلصات C8 ، بمتوسط ​​كتل 3752 و 3757 و 3805 دا ، بواسطة كروماتوجرافيا تبادل الأنيون. تم عزل العينات المخصبة في الببتيد للكتلة 3752 بواسطة كروماتوجرافيا التبادل الكاتيوني. أظهرت تجارب الاختزال بالإضافة إلى الألكلة بالاشتراك مع مقياس الطيف الكتلي للتأين بالرش الكهربائي أن مستخلصات C8 تحتوي على حوالي 10 ببتيدات ، ومثل PA1b ، يمتلك كل ببتيد ستة بقايا سيستين (ثلاثة روابط ثنائي كبريتيد). أدى تقليل رابطة ثاني كبريتيد مع مركبتويثانول 2 إلى تدمير النشاط المضاد للتغذية. تم العثور على الببتيدات الأصلية لمستخلصات C8 ليتم حلها في تسع قمم باستخدام أعمدة XTerra HPLC تعمل عند درجة الحموضة القلوية. تم استخدام هذه الأعمدة لتقييم توزيع ببتيدات البازلاء في الكسور المعزولة ، مع مجموعة الثنائي الضوئي وكشف الرش الكهربائي.

الكلمات الدالة: بيسوم ساتيفوم البازلاء الزلال PA1b المبيدات الحشرية الحيوية كروماتوغرافيا الوميض اللوني للتبادل الأيوني XTerra HPLC

لمن ينبغي أن تعالج المراسلات. هاتف: 306-956-7651. الفاكس: 306-956-7247. البريد الإلكتروني: [email & # 160protected]


شجرة متجذرة تم إنتاجها من مصفوفات المسافات الموضحة في النصف الأيسر السفلي من الجدول 1 بواسطة برنامج الجار تحت خيار UPGMA لحزمة PHYLIP (Felsenstein ، 1993). أطوال الفروع تتناسب مع مسافات البروتين في قاع الشجرة. يظهر أيضًا على الشجرة أطوال الفروع الفردية من تحليل ربط الجار (Felsenstein ، 1993) الذي أنتج نفس البنية المتفرعة مثل تحليل UPGMA. ميا ، منذ مليون سنة. تتوافق اختصارات الأنواع مع تلك المستخدمة في الشكل 5.

تم إجراء العديد من المحاولات لفصل وتنقية السلاسل الفردية للهيموجلوبين الحلقي: الترشيح الهلامي (Shlom and Vinogradov، 1973 Suzuki وآخرون.، 1983 ب) ، كروماتوغرافيا عمود التبادل DEAEion (سوزوكي وآخرون.، 1983 أ) ، التحضير للهلام الكهربائي (Ochiai and Enoki ، 1979) ، والتركيز اللوني (Gotoh ، 1982 Shishikura وآخرون.، 1986) ، كروماتوغرافيا العمود ذي الطور العكسي (Fushitani وآخرون.سوزوكي 1988 وآخرون.، 1990a أونبي وآخرون.، 1993) وآخرون (بونافينتورا وبونافينتورا ، 1981). كان لطريقة الفصل الموصوفة هنا كفاءة مماثلة كما تم الحصول عليها مسبقًا في فصل قطني الهيموغلوبين بواسطة Ownby وآخرون. (1993) و لاميليبراشيا الهيموغلوبين من سوزوكي وآخرون. (1990b) ، الذي استخدم أعمدة المرحلة العكسية ، Synchropak RP-P C18 و Cosmosil 5C18-300 على التوالي. ومع ذلك ، لا تزال هناك العديد من المزايا: يمتلك المورد RPC كمية كبيرة من سعة العينة مع ثبات كيميائي عالٍ ، ويوفر دقة ممتازة في الفصل بمعدلات تدفق عالية مع ضغط خلفي منخفض (عكس معدلات التدفق) ، ويمكن تشغيلها في درجة حموضة تتراوح من 1-12. في هذه الدراسة ، كميات كبيرة تصل إلى 520 ميكروغرام (20.8٪) و 480 ميكروغرام (19.2٪) للوحدات الفرعية للمونومر و 1.16 مجم (46.4٪) و 1.56 مجم (62.4٪) للوحدات الجزئية من Pontodrilus matsushimensis و Pheretima communissima ، على التوالي ، تم الحصول عليها من 2.5 ملغ من كل عينة هيموجلوبين كاملة.

وفقًا لتحليلات SDS-PAGE في ظل ظروف مخفضة وغير مخفضة ، كانت الوحدة الفرعية monomer Pontodrilus التي انتقلت أبطأ من أي من سلاسل البولي ببتيد المكونة للوحدة الفرعية للقطع (الشكل 2 ب ، الممر 5) كانت ميزة فريدة لأن الوحدات الفرعية المقابلة للهيموجلوبين الحلقي الآخر ، بشكل عام ، هاجروا أسرع من السلاسل الثلاث للوحدة الفرعية Trimer (Vinogradov ، 1985). علاوة على ذلك ، فإن الوزن الجزيئي الظاهر لـ بونتودريلوس تم تقدير الوحدة الفرعية للمونومر بحوالي 18400 Da على SDS-PAGE. بعد التسلسل ، تم تحديد الكتلة الجزيئية لوحدة المونومر لتكون 16366 دا. كانت هذه القيمة متوافقة جيدًا مع تلك التي تم الإبلاغ عنها في سلاسل مونومر لـ Megascolecidae (سوزوكي ، 1989 Shishikura ، 1996) ، بما في ذلك قيمة Pheretima communissima. وبالتالي ، فإن القيمة التي تم الحصول عليها من خلال تحليل SDS-PAGE هي سوء فهم وربما يرجع ذلك إلى الاختلاف في الشكل الجزيئي والشحنة الصافية الظاهرة للمعالجة بـ SDS بونتودريلوس الوحدة الفرعية مونومر. تشير الأشكال 1 و 2 و 3 أيضًا إلى وجود تباين في الوحدات الفرعية للجلوبين المونومر في كل من Pontodrilus matsushimensis و Pheretima hilgendorfi hemoglobin كما هو موضح سابقًا في Lumbricus terrestris hemoglobin (Shishikura وآخرون.، 1987 أونبي وآخرون.، 1993) وكذلك نيانثس مختلفة الألوان الهيموغلوبين (سوزوكي وآخرون.، 1994). في هذه التجربة ، تم تنقية وتسلسل الأجزاء الرئيسية فقط من كل من مونومرات الهيموجلوبين.

واحدة من أكثر السمات اللافتة للنظر للمونومرات المتسلسلة هي أن بونتودريلوس تم إثبات أن مونومر غلوبين يحتوي على ثلاث بقايا من السيستين في المواضع 2 و 73 و 131. يبدو أن بقايا السيستين في كلا النوعين تشكل سلسلة interchain مرتبطة بثاني كبريتيد كما تم الإبلاغ عنه بالفعل في التسلسلات المعروفة للوحدات الفرعية مونومر من الهيموجلوبين الحلقي. لذلك ، قد تكون بقايا السيستين الثالثة في الموضع 73 حرة وهي خاصية بارزة لمونومر غلوبين Pontodrilus matsushimensis. هذه هي الملاحظة الأولى لوجود بقايا السيستين الثالثة في الوحدات الفرعية المونومر للهيموجلوبين الحلقي. مؤخرا سوزوكي وآخرون. (1990b) أظهر وجود ثلاث بقايا من السيستين في سلسلة مكونة متعدد الببتيد (AIII) لدودة أنبوبية أعماق البحار لاميليبراشيا (phylum Vestimentifera) الهيموجلوبين. أظهروا أن بقايا السيستين الثالثة في الموضع 74 بوصة لاميليبراشيا الهيموغلوبين مسؤول عن القدرة على الارتباط بالكبريتيد لأن الهيموغلوبين قد يكون قد اكتسب تكيفًا جزيئيًا عاليًا لنقل ما يكفي من الكبريتيد إلى المتعايشات البكتيرية المؤكسدة للكبريتيد الداخلية (Childress وآخرون.، 1987). ومع ذلك ، من الصعب تعديل مناقشتهم مباشرة لشرح وظيفة بقايا السيستين الثالثة في بونتودريلوس الهيموغلوبين لأن Pontodrilus matsushimensis لا يوجد إلا في بيئات شواطئ البحر حيث تعيش الحيوانات وتقضي وقتها على عمق 50 سم تحت الأرض في الشتاء (دكتور ن. تاكيوتشي ، اتصال شخصي). في هذا الصدد من تكيفاتهم مع ظروف نقص الأكسجين ، يمكن القول أنهم طوروا آليات معينة للحفاظ على 0 كاف.2 توريد الأنسجة. على الرغم من وجود نقص في البيانات حول هياكل الغلوبين ، ولا سيما عن oligochaetes المائية أو البحرية التي تتحمل نطاقًا واسعًا من الملوحة ، فمن الجدير بالذكر أن بونتودريلوس الهيموغلوبين له تشابه واضح في تسلسل الأحماض الأمينية مقارنة بدودة أنبوب أعماق البحار لاميليبراشيا. وبالتالي ، سيكون من المثير للاهتمام التحقيق في المعاني الكيميائية الحيوية لبقايا السيستين الثالثة في بونتودريلوس الهيموجلوبين للتطور الجزيئي للهيموجلوبين وكذلك فيزيولوجيا الهيموجلوبين اللافقاري.

الأعمال السابقة (جوتو وآخرون.، 1987 Shishikura ، 1996) أن الوحدات الفرعية المتماثلة التي تشترك في علاقة تقويمية في جزيئات الهيموجلوبين هي أدلة مفيدة لتحليل العلاقة الجينية لديدان الأرض. يسرد الجدول 1 الفروق المئوية ومسافات البروتين بين متواليات الأحماض الأمينية الكاملة فيريتيما و بونتودريلوس مقارنة مع المتواليات المعروفة من oligochaetes و polychaetes. درجات متطابقة (81.6٪ -87.9٪) بين ثلاثة أنواع من فيريتيما أظهرت درجات عالية جدًا من التشابه وقد تقدم دليلاً على دعم كيميائي حيوي للدراسة المورفولوجية السابقة لإيستون (1984) الذي جمع عدة أنواع من فيريتيما، بما في ذلك ثلاثة أنواع أعلاه في مجمع الأنواع Amynthas hilgendorfi. في الآونة الأخيرة ، قام بور وبراون (1995) بتسلسل الحمض النووي الكامل للميتوكوندريا لديدان الأرض (من Lumbricus terrestris). ومن المؤمل أيضًا أنه يمكن استخدامه لتحليل العلاقات الوراثية بين هذه الأنواع وكذلك الحلقات.

أنتج تحليل UPGMA (Felsenstein ، 1993) لمصفوفات المسافة الموضحة في النصف الأيسر السفلي من الجدول 1 شجرة متجذرة بافتراض ساعة تطورية (الشكل 6). تم الحصول على نفس طوبولوجيا الشجرة من خلال تحليل الانضمام إلى الجار (Felsenstein ، 1993). كانت هذه الشجرة المتجذرة متزامنة مع السلالات التقليدية للأقنيات. علاوة على ذلك ، تم أيضًا حساب المعدلات التطورية للوحدات الفرعية المونومرية للهيموجلوبين الحلقي بافتراض أن الاختلاف بين Oligochaeta و Polychaeta حدث منذ حوالي 450 مليون سنة (Fushitani وآخرون.، 1988). أعطى هذا وقت تباعد مقدر لـ Pheretima communissima و Pheretima hilgendorfi قبل 62.5 مليون سنة ، و Pheretima sieboldi والنوعين الآخرين من فيريتيما منذ 83.3 مليون سنة ، وتلك الخاصة بـ بونتودريلوس وثلاثة أنواع من فيريتيما قبل 208.8 مليون سنة. على الرغم من أن الأنواع قريبة جدًا من فيريتيما تم تحليلها ، وتبين بوضوح أنه يمكن دراسة أنماط الاختلاف التطوري باستخدام بيانات تسلسل الأحماض الأمينية من الوحدات الفرعية المونومر للهيموجلوبين الحلقي.


نقاش

4.1 تحديد CaM Allostery

للوصول إلى السلوك الخيفي لـ CaM عند ربط Ca 2+ ، نأخذ نظرة مجمعة للسلوك المعتمد على Ca 2+ للببتيدات التي تغطي أربعة أيادي EF. عند التفاعل مع Ca 2+ ، يستجيب EF-4 أولاً عن طريق تناول Ca 2+ كما يتضح من زيادة الحماية من الببتيد التربتي 127-148 (الشكل S4b) والببتيد chymotryptic 125-138 (الشكل 4 ج). ثم تنخفض الحماية عند [Ca 2+]: [CaM] من

1.5 ، عندما يصبح الرابطان المرنان اللذان يمثلهما الببتيدات 76-90 (الشكل S3a) و107-126 (الشكل S3b) أكثر تعرضًا. علاوة على ذلك ، يستمر تعديل المنطقة 38-74 في الزيادة حتى [Ca 2+]: [CaM]

1.7 (الشكل 5 أ) ، حيث تنتهي EF-4 من ربط Ca 2+ (الشكل 4c والشكل S4b) ولا يزال الربط في EF-3 قيد التنفيذ (الشكل 4 أ و S4a). الأهم من ذلك ، يحدث فقدان الحماية للببتيدات 38-74 و 76-90 و107-126 أثناء ربط Ca 2+ لـ EF-4 و EF-3. يغطي الببتيد 38-74 EF-2 (الشكل 1) ، ويكشف سلوكه عن خفة CaM عند ربط Ca. تشير نتائج LITPOMS إلى أن ارتباط Ca 2+ في EF-3 و EF-4 يؤدي إلى تغيير توافقي لـ EF-2 (وأجزاء أخرى من البروتين) ، وإعداده للربط التالي Ca 2+.

مع تقدم المعايرة إلى [Ca 2+]: [CaM]

5.0 ، تم فتح غالبية CaM كما تم التقاطها بواسطة LITPOMS للببتيدات 38-74 ، 76-90 ، 91-106 ، 107-126 ، 127-148. في هذه الأثناء ، بدأت EF-1 (مغطاة بالببتيد التجريبي 14-30) بربط Ca 2+ (الشكل 3 أ). تكشف المنحنيات أيضًا عن الطبيعة التعاونية لأربعة أيدي EF في CaM المرتبطة بـ Ca 2+. في مراحل المعايرة اللاحقة عندما يكون [Ca 2+]: [CaM] هو & # x0003e 15 ، تصبح جميع استجابات LITPOMS ثابتة تقريبًا ، مما يشير إلى التشبع باستخدام Ca 2+. يُعلمنا تتبع استجابات LITPOMS كدالة لـ [Ca 2+] بديناميكيات ربط Ca 2+ في الببتيد وحتى عند مستويات الأحماض الأمينية (M51 في الشكل 5 ب) ، والتي لا يمكن تحقيقها باستخدام طرق الدقة المنخفضة إلى المتوسطة (على سبيل المثال ، البصمة المحللة للبروتين 40 والفلورة 15).

4.2 تحديد ترتيب ملزمة الكالسيوم

كان هناك نقاش طويل الأمد حول ترتيب Ca 2+ الملزم لـ CaM. توجد عقارب EF الأربعة في فصين ، EF-1 و EF-2 في الفص الطرفي N و EF-3 و EF-4 في الفص الطرفي C. اقترحت دراسات مضان التيروزين المبكرة ودراسات إنارة التيربيوم ارتباطًا أولاً في الفص الطرفي N ثم في الفص الطرفي C. 41 في وقت لاحق ، يعطي اختبار الربط مع chelophoric chelator أربعة تقاربات ملزمة أعلى ستة أضعاف من تقارب الكالسيوم في الطرف C مقارنة بالفص N- الطرفي يوحي بأن الفص C- الطرفي يربط أولاً. 10 بعد ذلك ، سمحت نتائج الدراسات الطفرية وفلورة التربتوفان بتعديل ترتيب الربط كـ EF-3 & # x0003e EF-4 & # x0003e EF-1 & # x0003e EF-2. 42 باستخدام نفس المسوخات ذات الأربعة مواقع ، أكد قياس المسعر الحراري المتساوي أن الارتباط يحدث أولاً في الفص C الطرفي. 17 حتى الآن ، هذا هو الأمر الملزم المقبول ، على الرغم من أن الطفرات الأخرى قد تسبب تعديلات. ومع ذلك ، فإن التألق منخفض الدقة يحد من ثقة هذه الاستنتاجات. يي وآخرون. 18 تم تطعيم أربع حلقات كالسيوم بشكل فردي على بروتين سقالة وخلص إلى أن تقارب الربط الجوهري لأربع حلقات مرتبة كـ EF-1 & # x0003e EF-3 & # x0003e EF-2 & # x0003e EF-4. ومع ذلك ، فمن الخطورة تعيين أوامر ربط الكالسيوم من خلال مقارنة تقاربات الربط الجوهرية لأن أيدي EF الأربعة غالبًا ما تعمل بشكل تعاوني في ربط Ca 2+. وبالتالي ، فإن ترتيب ربط الكالسيوم لا يزال غير مستقر.

تقدم LITPOMS نهجًا جديدًا لمعالجة هذا السؤال المهم. Ca 2+ binding increases protection (decreases reactivity) at a binding site owing to spatial hinderance. Thus, comparing the onset point of the LITPOMS decay as a function of [Ca 2+ ] affords the binding order. Although previously we suggested a binding order of EF-4 > EF-3 > EF-2 > EF-1 by ranking four tryptic peptides, 33 the order for EF-3 and EF-2 is competitive and thus ambiguous owing to entanglement of LITPOMS decay curves for regions 91-106 and 38-74. The entanglement is due to broad coverages of these peptides, where part of a region opens and part tightens. The order was eventually assigned by the early onset of EF-3.

Elevated spatial resolution for each EF-hand can give more accuracy. We chose peptides 125-138, 90-99 and 14-30 that cover primarily calcium loops of EF-4, EF-3 and EF-1, respectively (no peptides or resolved residues for calcium loop of EF-2 were captured). Fortunately, residue M51 is close to the calcium loop of EF-2 and exhibits binding-induced protection, and we chose it for comparison.

To illustrate better calcium binding orders for each EF-hand, plots of the decay region for four candidates were normalized to 1 and plotted together ( Figure 6 ). Clearly, the first binding occurs at EF-4 (peptide 125-138) whereas EF-1 binds last (peptide 14-30). Curves for EF-3 and EF-2 are now well separated at the early stage of the titration, clearly indicating that EF-3 binds prior to EF-2. With improvement of LITPOMS, the overall binding order can be confidently assigned as EF-4 > EF-3 > EF-2 > EF-1.

Normalized (to 1) peptide-level LITPOMS responses for selected peptides and residue showing increases in protection (decreases in modification) for peptides 125-138, peptide 90-99, residue M51 and peptide 14-30 representing EF hands 4 – 1 of CaM, respectively. The insert shows expanded decreases in modification for peptide 90-99, residue M51 and peptide 14-30. Data are averages of two independent runs, and error bars are standard deviations and are normalized accordingly. The relatively large standard deviations for EF-3 (90-99) are discussed in SI.

4.3 Measuring Site-specific Binding Affinity

In addition to assessing binding orders, another LITPOMS advance is the determination of site-specific binding affinities. This is particularly important for signaling proteins whose binding stoichiometry is usually greater than 1, and the affinities for different binding sites may differ significantly owing to allostery. 1 Current approaches are mainly based on optical methods, requiring specific fluorophores for signal enhancement but giving limited spatial resolution. 10 LITPOMS, however, delivers site-specific binding affinities with mid-to-high structural resolution. We previously communicated that affinities for EF-2 and 3 agree with literature values within a factor of 1.6, and EF-1 and 4 are within a factor of 20. 10, 33 Binding within each lobe (N-terminal lobe of EF-1 and EF-2, C-terminal lobe of EF-3 and EF-4) is positively cooperative, consistent with previous conclusions.

In this work, the binding affinities obtained from fitting the eight original tryptic peptides were adopted to reconstruct simulation curves for the newly obtained LITPOMS curves of chymotryptic peptides ( Figure 4a , ​ ,4c 4c and ​ and4d) 4d ) and residues ( Figures 2a – b , ​ ,3b 3b – d , ​ ,4b, 4b , ​ ,5b 5b – d , S4c𠄿). The current fitting algorithm cannot fit all available LITPOMS responses thus, the newly obtained LITPOMS responses were not part of the fitting. The reconstructed simulations for these newly obtained LITPOMS responses agree well with the data, indicating confidence in the binding affinities and the LITPOMS approach. It is possible that the values determined here are more accurate than those in the literature.

4.4 Dissecting the Composite Behavior

In general, spatial resolution can be elevated by tracking smaller peptides, obtainable by either a combination of multiple enzymes to cleave differently the protein or by fragmentation in MS 2 accompanied by improved LC separation.

Class IV tryptic peptides 38-74, 91-106 and 127-148 behave compositely because the peptides are long and represent regions undergoing multiple conformational changes (e.g., peptide 127-148 covers the calcium loop and F-helix of EF-4). These two structural motifs behave differently in the Ca 2+ titration, resulting in a composite curve. By digesting with a different protease, however, the two motifs can be cleaved into two peptides that cover each region and reveal single behavior.

Furthermore, given the irreversible labeling by FPOP, the resolution can be enhanced by tracking at the amino-acid residue level. 35� The response of peptide 38-74 can be dissected by three residue-level LITPOMS curves, each showing simpler behavior. Residue M51, however, is either involved with or near an allosteric site, as seen from its “up and down” modification behavior. The promise of increased spatial resolution motivates the development of new FPOP reagents that provide complementary labeling to OH radicals, 43� even of residues directly involved in binding.

4.5 Probing Local Conformational Changes in Calcium Loop

The elevated spatial resolution allows differentiating direct binding sites from those not directly involved in binding, even in a calcium loop. Residue Y138 sits in the calcium loop of EF-4. Binding of Ca 2+ tightens the loop by chelating with negatively charged residues and protecting them. Tyrosine, however, is not involved in Ca 2+ chelation and becomes less protected upon binding owing to a structural transition of the calcium loop whereby the SASA of the unbound at 23 Å 2 becomes 50 Å 2 in the bound form. Residue-level LITPOMS successfully captures these transitions, as demonstrated in Figure S4d.

4.6 Advancing LITPOMS over Other Approaches

Another hydroxyl radical-based protein footprinting approach utilizing synchrotron radiation was previously applied to a Ca 2+ binding protein. With an X-ray exposure time of 80 ms, Chance and coworkers followed structural transitions of gelsolin upon Ca 2+ titration and successfully identified a three-state activation process. 22� Moreover, three classes of residues/peptides were identified, which become more and less protected while titrating with Ca 2+ . Although conceptually similar, the synchrotron footprinting does not reveal composite behavior or the relative timing of change from one region to another. This may be because the timescale for footprinting by LITPOMS is shorter by two orders of magnitude.

Quantitative measurements of protein ligand interactions by HDX were pioneered in the SUPREX 21 and PLIMSTEX 19 methods, both of which were brought to regional-level spatial resolution by protease digestion. 46 HDX detects changes of SASA by probing the changes in hydrogen bonding. Protein conformational changes, however, do not necessarily associate with re-organization of its hydrogen bonding pattern. In an HDX study that compares Ca 2+ -free and Ca 2+ -bound CaM, kinetic curves successfully reveal the binding regions of Ca 2+ in CaM, whose deuterium uptake decreases upon Ca 2+ binding. HDX fails to probe regions that open-up, whose SASA increases upon Ca 2+ binding. 47 Ca 2+ -binding tightens the calcium loop in an EF-hand, which strengthens the hydrogen bonds in the backbone. Structural opening of E and F helices, however, is due to changes in their interhelical angles that is not easily captured by HDX. FPOP is more sensitive to subtle changes in the SASA of amino acid side chains, making it suitable to probe such structural transitions.

In addition to HDX and free radicals, slower reacting reagents such as GEE 24 and BHD 25 also shed light on this field. Negative-charged side chains of D and E in the calcium loop of EF-hands are the actual binding motifs that chelate with the positive-charged Ca 2+ . GEE 48 and BHD 25 footprinting of CaM reveal decreases in modification extents for D and E that located in the calcium loop upon Ca 2+ binding, but these changes have not yet been followed in a titration format and composite behavior not seen.

A binding site that has a fast off-rate can show noticeable convergence in footprinting if the labeling time is slow. The result is a reduction in the difference in labeling between bound and unbound states. Calcium off-rate constants for interacting with CaM range from 10 to 4000 s 𢄡 , 15, 49� making the off-rate timescale for Ca 2+ binding fast, in the range of 200 μs to 100 ms. For HDX, which labels the protein over exchange times of minutes to hours, problems in convergence occur. 19 Similar slow timescales apply to GEE labeling, where the reaction times for protein and reagent can be up to an hour. 24 Other spectroscopic methods such as fluorescence and circular dichroism, even though their detection timescales are often shorter than the ligand off-rates, cannot afford the detailed structural information afforded by LITPOMS. 10 LITPOMS, for the first time, combines high resolution with an ultra-short timescale for footprinting. The labeling time of hydroxyl radical-based FPOP is in the sub-millisecond range, which is comparable or even shorter than the calcium off-rates, 34� allowing structural details to be revealed at high spatial resolution without diminishing the footprint between bound and unbound states.


الملخص

Many proteins and proteolytic peptides incorporate the same post-translational modification (PTM) at different sites, creating multiple localization variants with different functions or activities that may coexist in cells. Current analytical methods based on liquid chromatography (LC) followed by tandem mass spectrometry (MS/MS) are challenged by such isomers that often coelute in LC and/or produce nonunique fragment ions. The application of ion mobility spectrometry (IMS) was explored, but success has been limited by insufficient resolution. We show that high-resolution differential ion mobility spectrometry (FAIMS) employing helium-rich gases can readily separate phosphopeptides with variant modification sites. Use of He/N2 mixtures containing up to 74% He has allowed separating to >95% three monophosphorylated peptides of identical sequence. Similar separation was achieved at 50% He, using an elevated electric field. Bisphosphorylated isomers that differ in only one modification site were separated to the same extent. We anticipate FAIMS capabilities for such separations to extend to other PTMs.


شاهد الفيديو: محاضرة الاحماض الامينية والببتيدات الجزء الثانى (قد 2022).