معلومة

كيفية فصل الببتيد على SDS PAGE؟

كيفية فصل الببتيد على SDS PAGE؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أريد فصل 1600 Da peptide على SDS PAGE ، على 20٪ GEL لم أحصل على أي شريط ، كيف يمكنني الفصل على PAGE؟ هل يمكنني استخدام 25٪ SDS PAGE؟


الصورة عبارة عن جل SDS-polyacrylamide ذو ببتيد صغير من تريس-تريسين بنسبة 18٪ ملطخ بصبغة كوماسي الزرقاء [مصدر].

الببتيد الخاص بك هو 1.6 كيلو دالتون ؛ لن ينفد في 20٪ هلام إذا لم تقم بتشغيله لفترة طويلة. حاول أيضًا منع تسخين الجل (يمكنك تشغيله في غرفة باردة أو أمام فتحة مكيف الهواء). ومع ذلك ، فمن الأفضل استخدام تقنيات أخرى مثل اللوني. يمكنك أيضًا تجربة غسيل الكلى إذا كانت الببتيدات الأخرى غير المرغوب فيها أكبر بكثير.

بروتوكول Tris-Tricine SDS-PAGE.


إذا كان الشريط أسفل واجهة الصبغة ، فقد لا يتلطخ جيدًا. تعتبر المواد الهلامية التريسين هي الأفضل لمثل هذه البروتينات الصغيرة ، وقد تقوم بالركض حتى تصبح مقدمة الصبغة في منتصف الطريق فقط أسفل الجل. من الممكن أيضًا أن البروتين الخاص بك لا يلطخ بالبقع التقليدية القائمة على الكوماسي. ربما جرب بقعة فضية.


فصل البروتين بواسطة SDS-PAGE

يعتبر الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد دوديسيل كبريتات الصوديوم ، أو SDS-PAGE ، تقنية مستخدمة على نطاق واسع لفصل مخاليط البروتينات بناءً على حجمها ولا شيء غير ذلك. يستخدم SDS ، وهو منظف أنيوني ، لإنتاج شحنة متساوية عبر طول البروتينات التي تم تحويلها إلى خطي. عن طريق تحميلها أولاً في هلام مصنوع من بولي أكريلاميد ثم تطبيق مجال كهربائي على الجل ، يتم بعد ذلك فصل البروتينات المغلفة بـ SDS. يعمل المجال الكهربائي كقوة دافعة ، حيث يسحب البروتينات المغلفة بـ SDS نحو القطب الموجب مع بروتينات أكبر تتحرك ببطء أكثر من البروتينات الصغيرة. من أجل تحديد البروتينات حسب الحجم ، يتم تحميل معايير البروتين ذات الحجم المعروف مع العينات وتشغيلها في نفس الظروف.

يقدم هذا الفيديو مقدمة لـ SDS-PAGE من خلال شرح النظرية الكامنة وراءها أولاً ثم توضيح الإجراء التدريجي الخاص بها. تمت مناقشة المعلمات التجريبية المختلفة ، مثل تركيز بولي أكريلاميد والجهد المطبق على الهلام. يتم تقديم طرق تلطيخ المصب مثل Coomassie وبقع الفضة ، ويتم تقديم اختلافات في الطريقة ، مثل 2D الكهربائي للهلام.

إجراء

SDS-PAGE هي تقنية يستخدمها العديد من الباحثين لفصل خلائط البروتينات حسب الحجم. يعد الإكمال الناجح لهذه التقنية خطوة أولى أساسية للعديد من طرق تحليل البروتين ، مثل التجلط المناعي. في حد ذاته ، يعتبر أداة مفيدة في تقييم حجم البروتين ونقاوته.

لفهم تقنية SDS-PAGE ، يجب أولاً فهم مكوناتها الأساسية. SDS-PAGE لتقف على Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis. Sodium-Dodecyl Sulfate ، الجزء الأول من هذا ، أو ldquoSDS & rdquo ، هو منظف أنيوني. هذا يعني أنه يتكون من مجموعة محبة للماء ذات شحنة سالبة صافية وسلسلة طويلة كارهة للماء بشحنة متعادلة.

سلسلة كارهة للماء تغلف البروتينات بما يتناسب مع كتلتها بمعدل 1.4 جرام من SDS لكل جرام من البروتين. يوفر هذا للبروتينات القوة الدافعة اللازمة للفصل المدفوع بالحجم في مجال كهربائي.

يستخدم هلام البولي أكريلاميد الكهربائي هيدروجيل مصنوع من بولي أكريلاميد. بولي أكريلاميد هو بوليمر يشكل مصفوفة منتظمة للغاية يمكن للبروتينات التحرك من خلالها. كلما كان الهلام أكثر تركيزًا ، كلما عبور البروتينات بشكل أبطأ عبره عند تعرضه لمجال كهربائي. تُعرف عملية استخدام مجال كهربائي موحد مكانيًا للتأثير على حركة الأجسام بالرحلان الكهربي.

يتم إجراء SDS-PAGE على بروتينات معزولة من العديد من المصادر المختلفة بما في ذلك الخلايا الموجودة في المزرعة والأنسجة والدم والبول والخميرة.

يجب أولاً فصل البروتينات من هذه المصادر المختلفة عن المكونات الخلوية الأخرى باستخدام تقنيات تشمل التجانس والطرد المركزي ، وغالبًا ما يتبع ذلك استخدام مخازن التحلل.

بمجرد عزل البروتين ، غالبًا ما يتم قياس تركيزه ، لضمان التحميل المتساوي للعينات ، من خلال مقارنة كمية البروتين في العينة بمعايير الألبومين في اختبار قياس الألوان في حمض Bicinchoninic ، أو BCA.

خطوة مهمة يجب تذكرها هي إضافة مخزن التحميل. يحتوي مخزن التحميل المؤقت على 3 وظائف رئيسية. أولاً ، بفضل SDS وعوامل الاختزال الإضافية ، فإنه يفسد البروتينات ، مما يعني أنه يحول هياكل البروتين المعقدة إلى سلسلة خطية من الأحماض الأمينية. ثانيًا ، يحتوي على الجلسرين ، مما يضمن عدم طفو العينة عند تحميلها في آبار الجل. وأخيرًا ، تشتمل معظم محاليل التحميل التجارية على صبغة ، مثل أزرق بروموفينول ، والتي يمكن تتبعها لقياس تقدم خطوة الرحلان الكهربائي.

بعد إضافة المخزن المؤقت للتحميل ، يجب خلط العينات ثم غليها لمدة 5 دقائق. يسمح ذلك بتكسير روابط ثنائي الكبريتيد القوية في البروتينات بمساعدة عامل الاختزال مثل بيتا مركابتوإيثانول. بمجرد أن يتم كسر جميع روابط ثاني كبريتيد ، يمكن لـ SDS تغطية البروتينات بشكل متساوٍ.

بعد ذلك ، يتم نسج العينات بسرعة وتكون جاهزة بعد ذلك لتحميلها في نظام الهلام من أجل الرحلان الكهربي.

قبل أن يتم تحميل العينات ، يجب أولاً تجميع نظام الهلام. يبدأ هذا بشراء أو تصنيع هلام بولي أكريلاميد. أصبحت المواد الهلامية الجاهزة أكثر شيوعًا لأن مادة الأكريلاميد مادة سامة للأعصاب ويمكن أن تسبب تلفًا في الدماغ. تحتوي علبة الهلام على آبار تستخدم لتحميل العينات.

بمجرد تثبيت المواد الهلامية في مكانها ، تمتلئ الغرف الداخلية والخارجية بمخزن يحتوي على نفس تركيز الأيونات المستخدمة في صنع المواد الهلامية. يؤدي هذا إلى إنشاء دائرة كهربائية تمر بسلاسة من الكاثود ، عبر الهلام إلى القطب الموجب.

بعد ذلك ، يتم عادةً تحميل سلالم الوزن الجزيئي في الهلام ، متبوعة بالعينات. أثناء تشغيل الجل ، ينتشر السلم ويخلق نطاقات بروتينية مرئية بأحجام معروفة. في الخطوات النهائية ، يمكن استخدام هذه النطاقات لحساب كل بروتين وحجم # x2019.

بمجرد تحميل جميع العينات ، يتم توصيل المحطات الموجبة والسالبة في صندوق الهلام بمصدر طاقة قادر على الحفاظ على جهد ثابت لفترة طويلة من الزمن. تبدأ المواد الهلامية عادة في حوالي 60 فولت حتى تدخل العينة بأكملها منطقة الهلام التي تسمى & ldquostacking gel & rdquo. بعد ذلك ، يتم زيادة الجهد إلى حوالي 200 فولت لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة اعتمادًا على حجم وتركيز الهلام وحجم البروتين المطلوب.

عند اكتمال الرحلان الكهربائي ، تتم إزالة الكاسيت وفتحه لكشف الجل. يمكن بعد ذلك تلطيخ الجل ببقعة بروتين نموذجية ، مثل صبغة كوماسي الزرقاء أو الفضية ، لتصور أشرطة البروتين داخل الجل. يمكن لصبغة كوماسي اكتشاف النطاقات التي تحتوي على أقل من 50 نانوجرامًا من البروتين ، بينما يمكن لصبغة الفضة اكتشاف العصابات التي تحتوي على أقل من 1 نانوجرام من البروتين.

في الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد ، يتم فصل العينات بخاصيتين منفصلتين على المواد الهلامية ، بعد واحد في كل مرة. أولاً ، يتم تحميل العينات وترتيبها وفقًا لنقاطها الكهربية على شرائط متدرجة الأس الهيدروجيني الموضعية. يتم بعد ذلك تغيير طبيعة البروتينات الموجودة في الشريط وتوضع فوق هلام بولي أكريلاميد نموذجي حيث يتم تثبيتها في مكانها بمحلول جل جديد. بعد ذلك ، يتم تنفيذ فصل البعد الثاني بواسطة SDS-PAGE.

في حين أن التركيز الكهروضوئي ليس هو الخيار الوحيد للهلام الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد ، فهو الأكثر شيوعًا. يعتبر الفصل الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد أداة لا تقدر بثمن توفر نظرة ثاقبة لمجمعات البروتين وتنظيم العضيات الفرعية.

بعد تشغيل الجل ، فإن الخطوة التالية الشائعة جدًا هي نقل البروتينات من الجل إلى غشاء مصنوع من PVDF أو النايلون لتحليلها. يمكنك بعد ذلك استخدام أجسام مضادة محددة لفحص الغشاء والبحث عن البروتينات المهمة. تظهر هنا نتائج طقطقة مناعية نموذجية حيث استخدم الباحث 3 تقنيات مختلفة لتضخيم الإشارة لتحديد أفضل ما يظهر وجود بروتين Pit-1 خلال عدد من التخفيفات التسلسلية.

لقد شاهدت للتو فيديو JoVE & # x2019s حول فصل البروتين باستخدام SDS-PAGE. يجب أن تفهم الآن الخطوات المتبعة في حل البروتين بالحجم باستخدام هذه التقنية القوية. كما هو الحال دائما، وذلك بفضل لمشاهدة!


جليكوزامينوجليكان

دخان تشانغ ،. روبرت ج.لينهاردت ، في كتيب Glycomics ، 2010

تحليل الوزن الجزيئي لـ GAGs

يمكن تطبيق تحليل الرحلان الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد (PAGE) بشكل ملائم لتحليل الوزن الجزيئي لـ GAGs الكبريتية. يمكن تصور المواد الهلامية التي تم تجزئة GAGs عليها باستخدام Alcian Blue مع أو بدون تلطيخ الفضة ويمكن مسح العصابات ورقمنتها. ثم يتم حساب متوسط ​​MW لـ GAG بناءً على خليط من معايير oligosaccharide المشتقة من HP والتي تم تحضيرها من خلال إزالة البلمرة الإنزيمية الجزئية لـ HP. يظهر تحليل PAGE المنقى من المشيمة البشرية في الشكل 3.2 [30]. لوحظ التشتت المتعدد لـ GAGs كطخة واسعة في PAGE ويمكن حساب القيمة العددية للتشتت.

الشكل 3.2. (أ) تحليل الرحلان الكهربائي للهلام المتدرج بولي أكريلاميد (PAGE) مع تلطيخ Alcian Blue لعينات الجليكوزامينوجليكان قبل وبعد العلاج باستخدام لياز الهيبارين. الممر 1 عبارة عن كبريتات الهيباران المعوية السليمة (HS) الممر 2 عبارة عن حارة خنازير معوية بعد العلاج باستخدام لياز الهيبارين 1 و 2 و 3 حارة 3 عبارة عن معيار رباعي السكاريد سداسي الكبريت مشتق من الهيبارين (HP) المشار إليه بواسطة ممر السهم 4 عبارة عن خليط من معايير oligosaccharide المشتقة من HP المحضرة إنزيميًا من الرئة البقري HP - تشير الأرقام إلى درجة البلمرة (أي 4 عبارة عن رباعي السكاريد) الممر 5 عبارة عن خنازير سليمة. HS lane 8 هو الكبد البشري HS بعد علاج الهيبارين لياز 3. (ب) رسم بياني للوزن الجزيئي اللوغاريتمي لمعايير oligosaccharide المشتقة من الرئة البقريّة كدالة لمسافة الهجرة لكل قليل السكاريد الذي يمكن من خلاله حساب متوسط ​​الوزن الجزيئي لـ HP و HS. (انظر لوحة الألوان 6.)

تم استخدام كروماتوغرافيا نفاذية الهلام (GPC) ، التي تفصل الجزيء فقط على أساس الاختلافات في الحجم الجزيئي لتحليل MW لـ GAGs. يمكن استخدام Dextrans أو كبريتات ديكستران أو GAGs من ميغاواط مختلفة كمعايير في عمود GPC لمعايرة MW من GAGs. يستخدم كشف معامل الانكسار عادةً في هذه الطريقة [52].


SDS PAGE المعروف أيضًا باسم Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis هو تقنية تستخدم لفصل البروتينات على أساس وزنها الجزيئي. إنها تقنية مستخدمة على نطاق واسع في الطب الشرعي وعلم الوراثة والتكنولوجيا الحيوية والبيولوجيا الجزيئية لفصل جزيئات البروتين بناءً على حركتها الكهربي.

مبدأ SDS-PAGE

ينص مبدأ SDS-PAGE على أن الجزيء المشحون يهاجر إلى القطب مع الإشارة المعاكسة عند وضعه في مجال كهربائي. سيتم الفصل على أنه تنقل الأنواع المشحونة. تميل الجزيئات الصغيرة إلى التحرك بشكل أسرع بسبب مقاومتها الأقل في وقت الرحلان الكهربائي. يؤثر معدل الهجرة على هيكل وشحنة البروتين.

تساعد كبريتات دوديسيل الصوديوم والبولي أكريلاميد على القضاء على تأثير بنية البروتينات وشحنها ، ويتم فصل البروتينات بناءً على طول سلسلة البولي ببتيد.

وظيفة SDS في SDS-PAGE

يمكن تعريف SDS على أنه منظف موجود في المخزن المؤقت لعينة SDS-PAGE. تتمثل وظيفة SDS في كسر روابط ثاني كبريتيد البروتينات التي تعطل البنية الثلاثية للبروتينات جنبًا إلى جنب مع بعض عوامل الاختزال.

المواد المطلوبة

مزودات الطاقة: يستخدم لتحويل التيار المتردد إلى تيار مستمر.

المواد الهلامية: يتم تحضيرها ذاتيًا في المختبر أو يتم شراؤها من السوق.

غرف الرحلان الكهربائي: يجب استخدام غرف المواد الهلامية SDS-PAGE الملائمة جيدًا.

عينات البروتين: يذوب البروتين مع محلول SDS-PAGE ويغلى لمدة 10 دقائق. يتم أيضًا إضافة عامل اختزال مثل ديثيوثريتول أو 2-مركابتوإيثانول لتقليل روابط ثاني كبريتيد لمنع أي طي للبروتين العالي.

تشغيل المخزن المؤقت: يتم تشغيل عينات البروتين المملوءة على الجل في المخزن المؤقت للتشغيل SDS-PAGE.

محلول التلوين والوجه: يستخدم محلول البقع Coomassie للتلوين. يتم استخدام محلول تقضي على مادة هلامية. يمكن بعد ذلك ملاحظة عصابات البروتين بالعين المجردة.

سلم البروتين: يتم استخدام سلم البروتين المرجعي لتحديد البروتين محل الاهتمام بناءً على الحجم الجزيئي.

بروتوكول SDS-PAGE

تحضير الجل

يتم الجمع بين جميع الكواشف ، باستثناء TEMED ، لتحضير الجل.

عندما يكون الجل جاهزًا للوضع ، أضف TEMED.

يُسكب الجل المستخدم للفصل في غرفة الصب.

تحتاج إلى وضع البيوتانول قبل البلمرة لإزالة فقاعات الهواء غير المرغوب فيها الموجودة.

بين اللوح الزجاجي ، يتم إدخال المشط.

"الكاسيت الهلامي" عبارة عن جل مبلمر.

اغلي بعض الماء في دورق.

أضف 2-مركابتويثانول إلى المخزن المؤقت للعينة.

ضع محلول العازلة في أنابيب الطرد المركزي الصغيرة وأضف عينات البروتين إليها.

خذ علامات MW في أنابيب منفصلة.

اترك العينات تغلي لمدة أقل من 5 دقائق لتفسد البروتينات تمامًا.

الكهربائي

يتم إخراج علبة الهلام من حامل الصب وتوضع بشكل منفصل في مجموعة القطب الكهربي.

تم تثبيت حامل المشبك على مجموعة القطب.

يضاف عازلة 1X الكهربائي إلى فتحة إطار الصب لملء آبار الهلام.

احتواء 30 مل من العينة المشوهة في البئر.

الخزان مغطى بغطاء والوحدة متصلة بمصدر طاقة.


بولي أكريلاميد جل الكهربائي

بولي أكريلاميد من المحتمل أن يكون الفصل الكهربائي للهلام (PAGE) هو التقنية التحليلية الأكثر شيوعًا المستخدمة لفصل البروتينات وتوصيفها. حل الأكريلاميد و bisacrylamide بلمرة. تشكل مادة الأكريلاميد وحدها بوليمرات خطية. يقدم بيساكرلميد روابط متقاطعة بين سلاسل بولي أكريلاميد. يتم تحديد "حجم المسام" من خلال نسبة مادة الأكريلاميد إلى بيساكريلاميد ، وبتركيز مادة الأكريلاميد. يؤدي وجود نسبة عالية من بيساكريلاميد إلى مادة الأكريلاميد وارتفاع تركيز مادة الأكريلاميد إلى انخفاض الحركة الكهربية. بلمرة الأكريلاميد وبيساكرلميد مونومرات يتم إحداثه بواسطة بيرسلفات الأمونيوم (APS) ، والذي يتحلل تلقائيًا لتشكيل الجذور الحرة. يتم تضمين TEMED ، وهو مثبت الجذور الحرة ، بشكل عام لتعزيز البلمرة.

عادة ما يتم تحضير المواد الهلامية مع الجزء العلوي من الهلام الموجود أسفل آبار العينة التي تكون أقل كثافة من باقي الجل الذي يتم جعله أكثر كثافة عن قصد. يشار إلى الجزء العلوي باسم & ldquostacking gel & rdquo والجزء السفلي يسمى & ldquorunning gel & rdquo أو & ldquoseparating gel & rdquo. الغرض من جل التكديس هو تركيز جميع البروتينات ذات الأحجام المختلفة في منطقة أفقية مضغوطة عن طريق حصرها بين تدرج جزيئات الجلايسين أعلاه وأيونات الكلوريد أدناه. بهذه الطريقة ، ستدخل معظم البروتينات في الهلام الأكثر كثافة في آنٍ واحد قبل أن تبدأ في الانتقال إلى الأسفل بمعدلات مختلفة بناءً على حجمها. بهذه الطريقة ، تكون النطاقات أكثر وضوحًا وأفضل فصلًا عن التصور والتحليل. بدون هلام التكديس ، ستنتج البروتينات مسحة طويلة من خلال الجل المحلول بدلاً من الأشرطة المتميزة المشدودة حتى نتمكن من تحليلها.

الشكل 1. هلام PAGE. يمر البروتين أولاً عبر هلام التراص ، حيث تنتشر العينات. بمجرد وصول البروتين إلى الجل الفاصل ، تتجمع البروتينات معًا في أشرطة ضيقة. أثناء تحركهم خلال هلام الحل ينفصلون حسب الحجم.

SDS-PAGE

كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) عبارة عن برمائي منظف. لديها مجموعة رأس أنيونية و محبة للدهون ذيل. يرتبط بشكل غير تساهمي بالبروتينات ، حيث ينجذب جزيء SDS واحد تقريبًا إلى كل نوعين من الأحماض الأمينية. يتسبب SDS في تفسد البروتينات وفصلها عن بعضها البعض (باستثناء الارتباط التساهمي المتقاطع) وتنحل بشكل أساسي إلى جزيئات خطية. كما أنه يمنح شحنة سالبة. في وجود SDS ، يتم إخفاء الشحنة الذاتية للبروتين. أثناء SDS-PAGE ، تهاجر جميع البروتينات نحو القطب الموجب (القطب الموجب الشحنة). البروتينات المعالجة بـ SDS لها نسب شحنة إلى كتلة متشابهة جدًا ، وأشكال مماثلة. خلال PAGE ، يتم تحديد معدل هجرة البروتينات المعالجة بـ SDS بشكل فعال من خلال طولها غير المطوي ، والذي يرتبط بوزنها الجزيئي.

الشكل 2: بروتين محاط بجزيئات SDS.


عندما يتم فصل البروتينات عن طريق الرحلان الكهربي من خلال مصفوفة هلامية ، فإن البروتينات الأصغر تهاجر بشكل أسرع بسبب مقاومة أقل من مصفوفة الهلام. تشمل التأثيرات الأخرى على معدل الهجرة عبر مصفوفة الهلام بنية البروتينات وشحنها.

في SDS-PAGE ، يزيل استخدام كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS ، المعروف أيضًا باسم كبريتات لوريل الصوديوم) وهلام بولي أكريلاميد إلى حد كبير تأثير الهيكل والشحنة ، ويتم فصل البروتينات فقط بناءً على طول سلسلة البولي ببتيد.

SDS هو منظف له تأثير قوي على تغيير طبيعة البروتين ويرتبط بالعمود الفقري للبروتين بنسبة مولارية ثابتة. في وجود SDS وعامل الاختزال الذي يشق روابط ثاني كبريتيد ضرورية للطي المناسب ، تتكشف البروتينات في سلاسل خطية ذات شحنة سالبة تتناسب مع طول سلسلة البولي ببتيد.

تشكل مادة الأكريلاميد المبلمرة (بولي أكريلاميد) مصفوفة تشبه الشبكة مناسبة لفصل البروتينات ذات الحجم النموذجي. قوة الجل تسمح بسهولة التعامل. يسمح الرحلان الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد للبروتينات المعالجة بـ SDS للباحثين بفصل البروتينات بناءً على طولها بطريقة سهلة وغير مكلفة ودقيقة نسبيًا.


كيفية فصل الببتيد على SDS PAGE؟ - مادة الاحياء

طرق تعتمد على الحجم لفصل الجزيئات الكبيرة

عندما تضع جسيمًا في مجال طرد مركزي ، فإنه يتأثر بقوة الطرد المركزي ، والتي تتناسب مع الوزن الجزيئي (M) ، مع مربع السرعة (السرعة الزاوية ، rpm) للعضو الدوار (w 2) و على مسافة المحلول من مركز الدوران (ص): سنت. القوة

ميغا 2 ص. العمل في الاتجاه المعاكس لحركة الجسيمات هو الاحتكاك. تتناسب قوة الاحتكاك هذه مع سرعة الجسيم (V) ومعامل الاحتكاك (f) الذي يعتمد على شكل الجسيم: قوة الاحتكاك

fV. سوف يتسارع الجسيم حتى تتحقق السرعة بحيث تتساوى هاتان القوتان المتعارضتان ، وبعد ذلك سيستمر الجسيم في الترسيب ، ولكن بسرعة ثابتة. وضع القوتين متساويتين لدينا: Mw 2 r = fV ، وهكذا:

(لاحظ أن هذه المعادلة تمت طباعتها بشكل غير صحيح مع w 2 r في المقام على النسخة المطبوعة من هذه النشرة).

بشكل عام ، هذا يعني أن السرعة تزداد مع زيادة الكتلة (الوزن الجزيئي) ، وتقل السرعة مع زيادة حجم المقطع العرضي (القطر) (تزداد f مع حجم المقطع العرضي).

يعتمد V على آلة معينة وعلى سرعة الدوران. لذا يمكنك مقارنة النتائج بغض النظر عن الماكينة والسرعة ، يمكنك حساب ثابت Svedberg أو قيمة S بدلاً من V. S = V / w 2 r. تحتوي الجزيئات الكبيرة عادةً على قيم S بين 1 و 100 X 10-13 ثانية. تسمى القيمة 1 × 10-13 ثانية وحدة Svedberg واحدة أو S. تُعرف العديد من الجزيئات بقيمها S ، على سبيل المثال 23 S ribosomal RNA. كانت قيمة S معروفة قبل وظيفتها أو وزنها الجزيئي ، وبالتالي أصبح اسمها.

عادةً ما يتم فصل الجزيئات ذات قيم S المختلفة عن طريق وضعها فوق محلول كثيف (مثل السكروز) ثم تشغيل جهاز الطرد المركزي لإجبار الجزيئات من خلال المحلول. تذهب الجزيئات ذات القيمة S الأكبر إلى مسافة أبعد بسبب الوزن الجزيئي الأكبر أو انخفاض الاحتكاك أو كليهما. تقوم بإيقاف جهاز الطرد المركزي عندما تنتقل الجزيئات المختلفة لمسافات مختلفة أسفل الأنبوب ثم تزيل المحلول عن طريق ثقب الجزء السفلي من الأنبوب أو ضخ المحلول من الأعلى. كان اختراع Svedberg للطرد المركزي الفائق السرعة هو ما جعل تنقية الجزيئات الضخمة ممكنة في الأصل. اليوم ، هناك العديد من الطرق الأخرى المستخدمة أيضًا ، كما هو موضح أدناه.

2. الرحلان الكهربائي للهلام بالإضافة إلى SDS

عندما يتم معالجة البروتينات والجزيئات الكبيرة الأخرى بـ SDS ، وهو منظف قوي ، يتم تغيير طبيعتها. تصبح أيضًا سالبة الشحنة بسبب الشحن الموجود على المنظف ، كما أن كمية المنظف المرتبط بها كبيرة جدًا بحيث يتم غمر أي اختلافات في الشحنات النشطة. كلما زاد حجم الجزيء الكبير ، زاد ارتباط SDS ، بحيث يكون لجميع الجزيئات الكبيرة المعالجة بـ SDS نفس نسبة الشحنة إلى الكتلة. (الكمية المقيدة تتناسب مع الكتلة.) لذلك بالنسبة للجزيئات المعالجة بـ SDS ، تكون قوة السحب لكل كتلة في المجال الكهربائي هي نفسها ، ويجب أن يكون لجميع الجزيئات نفس السرعة إذا لم يكن هناك مقاومة احتكاكية. لكن الرحلان الكهربي باستخدام SDS يتم دائمًا في مادة هلامية ، بحيث يجب سحب الجزيئات عبر المسام. وتعتمد سهولة الحركة عبر المسام على قطر الجزيئات. الجزيئات الأكبر تتأخر أو تتعثر ولا تتحرك بسرعة. نظرًا لأنه يتم تغيير طبيعة الجزيئات إلى ملفات عشوائية ، فإن القطر يعتمد بشكل صارم على الطول أو الجزيئية ث ثمانية. كلما زاد الوزن الجزيئي ، زاد طول الملف وكان الجزيء أبطأ. لذلك ، يفصل الرحلان الكهربائي + SDS على أساس الوزن الجزيئي ، وليس على أساس الشحنة الأصلية. ملاحظة مهمة: لا يمكن عادةً فصل البروتينات التي لها نفس الطول عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام + SDS. الاختلافات في الوزن الجزيئي الناتجة عن الاختلافات في مجموعات R ليست كافية للسماح بالفصل. إذا قام بروتينان بترحيل نفس SDS + ، فمن المفترض أن يكون لهما نفس الوزن الجزيئي تقريبًا لأنهما بنفس الطول تقريبًا (يحتويان على نفس عدد الأحماض الأمينية).

3. الترشيح الهلامي أو كروماتوغرافيا المنخل الجزيئي

يمكنك عمل عمود مليء بالخرز الذي يحتوي على ثقوب فيها. الخرزات مصنوعة من مادة هلامية ، ويمكن أن تكون الثقوب بأي حجم تريده ، في حدود. هناك العديد من أنواع الخرز المتاحة تجارياً ، لكن أشهرها يسمى Sephadex. تملأ عمودًا بالخرز ، ثم تملأ الفراغات حول الخرز بمخزن مؤقت. ثم تضع مزيج الجزيئات في الأعلى وتغسله من خلال العمود. تستغرق الجزيئات الأصغر التي يمكن أن تدخل في الثقوب الموجودة في الخرزات وقتًا أطول لتتتبع طول العمود. الجزيئات الأكبر التي لا تستطيع دخول الخرزات على الإطلاق تتحرك فقط عبر الفراغات بين الخرزات وتخرج بسرعة من الطرف الآخر. لذا فإن الجزيئات الأصغر تستغرق وقتًا أطول لتخرج من الجزيئات الأكبر. لاحظ أن هذا هو العنصر المعاكس للهلام الكهربائي. النتائج مختلفة هنا لأن لديك نظام مرحلتين - الجزيئات الكبيرة مستبعدة تمامًا من الثقوب الصغيرة في الحبيبات ، وليست مضطرة للسفر عبر مساحات ضيقة كما هو الحال في الرحلان الكهربائي للهلام. تنشأ هذه الطريقة على أساس الحجم أو القطر. إذا كان القطر متناسبًا مع الوزن الجزيئي ، كما هو الحال غالبًا ، فيمكن استخدام هذه الطريقة لتقدير الأوزان الجزيئية أو الفصل على أساس الوزن الجزيئي. يمكن أن يكون المخزن المؤقت المستخدم هنا عبارة عن خيمة مع الحفاظ على الهيكل الثالث والرباعي ، لذا فإن هذه الطريقة مفيدة لتحديد MW للبروتينات الأصلية.


صفحة SDS

تفصل SDS PAGE الجزيئات حسب الحجم لأن وجود SDS (كبريتات دوديسيل الصوديوم) يفسد البروتين الذي يزيل الهياكل 2 & # 730 و 3 & # 730 و 4 & # 730 (يفترضون سلسلة خطية) ويغطي SDS الجزيئات مما يمنحها شحنة موحدة /نسبة الجماعية. غالبًا ما يتم معالجة عينات البروتين أيضًا بـ & # 223-مركابتوإيثانول (& # 223-ME) لكسر أي روابط ثاني كبريتيد موجودة ومنحها سلسلة خطية (هيكل 1 & # 730).

إن وجود معايير ذات حجم معروف دائمًا منحنى معايرة يمكن إنشاؤه والذي يمكن استخدامه لتحديد MW التقريبي لبروتين غير معروف (نطاق).


طقم جل SDS-PAGE

مهلة:اطلب الآن ، اشحن خلال 3 أيام مرحبًا بكم في الطلب من الموزعين المحليين.

مجموعة الفحص الجل SDS-PAGE Elabscience ® هي مجموعة تحضير هلام SDS-PAGE الكلاسيكية التي تحتوي على جميع أنواع الكواشف اللازمة لتحضير هلام SDS-PAGE. يحتاج المستخدمون فقط إلى جهاز و ddH 2 O لاستكمال تحضير الجل.

جل ميكس في هذه المجموعة هو خليط من محلول جل مثل SDS و Tris-HCl وما إلى ذلك ، مما يبسط إجراءات تحضير الهلام. يوجد Tris-HCl pH 8.8 و SDS في مزيج الجل المنفصل و Tris-HCl pH 6.8 و SDS في Stacking Gel Mix.

وفقًا للوزن الجزيئي المختلف للبروتين المستهدف ، يجب تحضير تركيز مختلف من هلام الفصل.

1. يتم عرض مقارنة بين النطاق الخطي لفصل البروتين في الدليل.

2. يظهر حجم العينة لكل مكون يتوافق مع أحجام هلام التراص المختلفة في الدليل.

3. يظهر حجم العينة لكل مكون يتوافق مع أحجام هلام الفصل المختلفة في الدليل.

1. اختر قالب الهلام النظيف وأكمل التجميع.

2. الرجوع إلى الدليل ، تحضير هلام الفصل للتركيز والحجم المطلوب. أضف كمية مناسبة من ddH 2 O ، 30٪ Acr-Bis (29: 1) [E-IR-R305A] ومزيج الجل المنفصل [E-IR-R305B] في دورق نظيف ، اخلطه.

3. أضف كمية مناسبة من 10٪ APS و TEMED ، امزج بلطف وتجنب الفقاعات.

4. أضف هلام الخليط إلى قالب الهلام المجمع على الفور. ثم أضف 1-2 مل ddH 2 O أو الكحول المطلق على الجل الفاصل لتسطيح مستوى الهلام الفاصل.

5. احتفظ في RT لمدة 30-60 دقيقة حتى تصلب الجل المنفصل تمامًا.

6. صب خارج ddH 2 O أو الإيثانول المطلق ، تمتص السائل المتبقي بورق ماص.

7. الرجوع إلى الدليل ، تحضير هلام التراص بالحجم المطلوب. أضف كمية مناسبة من ddH 2 O ، 30٪ Acr-Bis (29: 1) [E-IR-R305A] وتكديس خليط الجل [E-IR-R305C] في دورق نظيف ، اخلطه.

8. أضف كمية مناسبة من 10٪ APS و TEMED ، امزج بلطف وتجنب الفقاعات.

9. أضف هلام الخليط إلى الجل الفاصل على الفور. أدخل أسنان المشط بعناية ، وتجنب الفقاعات.

10. حافظ على درجة حرارة الغرفة لمدة 30-40 دقيقة حتى تصلب هلام التراص تمامًا.

11. اسحب مشط الأسنان بعناية. اتبع تجربة SDS-PAGE.

يجب تخزين 30٪ Acr-Bis (29: 1) [E-IR-R305A] و TEMED [E-IR-R305E] في 2

يجب تخزين 10٪ APS [E-IR-R305D] في درجة حرارة -20 درجة مئوية.

يجب تخزين الكواشف الأخرى في RT.

1. للحصول على أقصى أداء للمقايسة ، يجب استخدام هذا الكاشف في غضون 6 أشهر. تجنب دورات التجميد / الذوبان.

2. يرجى فصل 10٪ APS [E-IR-R305D] في أنابيب مختلفة وتخزينها في -20 درجة مئوية ، مدة صلاحية الكاشف هي 6 أشهر. إذا تم تخزينه في 4 درجات مئوية ، يرجى عدم استخدامه بعد أسبوع واحد.

3. TEMED متقلب. يرجى شد الغطاء بعد الاستخدام. بسبب درجات الحرارة المختلفة ، سيكون معدل تصلب الهلام مختلفًا. يمكن تعديل كمية TEMED بشكل مناسب لضبط معدل التكوّن عند درجات حرارة مختلفة.

4. تجنب الفقاعات لتجنب التأثير على نتائج التجربة.

5. أضف ddH2O أو الكحول المطلق على الجل الفاصل برفق لتجنب الضغط غير المستوي على الخط.

6. هذه المجموعة للاستخدام البحثي فقط. من أجل سلامتك وصحتك ، يرجى ارتداء ملابس المختبر والقفازات. يجب اتباع التعليمات بدقة ، قد تؤدي التغييرات في العملية إلى نتائج غير موثوقة.


كيفية فصل الببتيد على SDS PAGE؟ - مادة الاحياء

الرحلان الكهربائي للهلام هو طريقة تفصل الجزيئات الكبيرة - سواء الأحماض النووية أو البروتينات - على أساس الحجم والشحنة الكهربائية والخصائص الفيزيائية الأخرى. يشير الرحلان الكهربائي للهلام إلى التقنية التي يتم فيها دفع الجزيئات عبر مدى من الهلام ، يتحرك بواسطة تيار كهربائي. توفر الأقطاب الكهربائية في أي من طرفي الجل القوة الدافعة. تحدد خصائص الجزيء مدى السرعة التي يستطيع بها المجال الكهربائي تحريك الجزيء عبر الوسط. مثالان على ذلك هما الاغاروز وبولي أكريلاميد. المواد الهلامية Agarose لها حجم كبير جدًا & quot؛ & quot؛ وتستخدم بشكل أساسي لفصل الجزيئات الكبيرة جدًا ذات الكتلة الجزيئية التي تزيد عن 200 كيلو دالتون. SDS-PAGE هو نوع آخر من البولي أكريلاميد الكهربائي. قد يتنوع حجم مسام الهلام لإنتاج تأثيرات جزيئية منفصلة مختلفة لفصل البروتينات ذات الأحجام المختلفة. توفر المواد الهلامية بولي أكريلاميد مرونة أكبر ونطاقات محددة بشكل أكثر حدة من المواد الهلامية agarose.

كان الجل المستخدم في هذه التجربة هو SDS-PAGE. SDS هو المنظف المستخدم في الجل لكسر التفاعلات غير التساهمية بين مجموعات R من الأحماض الأمينية والميركابتويثانول سوف يكسر الروابط التساهمية. SDS هو منظف يرتبط بإحكام بالبروتين وهو سالب الشحنة. لذلك ، عندما يرتبط بجميع البروتينات في الخليط ، فإنه يمنحها شحنة تتناسب تقريبًا مع وزنها الجزيئي.

PAGE لتقف على PolyAcrylamide Gel Electrophoresis. هناك جزأان أساسيان لكل هلام SDS-PAGE: هلام التراص وجل حل. النصف العلوي من الجل هو هلام التراص. يحتوي هذا الجزء على درجة حموضة 6.9 ويحتوي فقط على 2-3٪ أكريلاميد ، مما يضمن & quot؛ بدء & quot؛ لجميع العينات التي يتم تحميلها في الجل. توجد مسام أكبر في هذا الجزء من أجل تركيز شريط ثقيل من جميع العينات ، قبل أن تنتقل إلى هلام التراص. يكون الجل المذاب أصغر مسامًا ، مما يسهل فصل الجزيئات. يوجد الجل المذيب في النصف السفلي من الجل ، ويستخدم لتحريك الجزيئات عبر الهلام. يحتوي على درجة حموضة 8-9 وهو أكبر من 7٪ أكريلاميد.

يتم تحميل العينات والعديد من المعايير والسلالم في مادة هلامية وتشغيلها عموديًا مع مرور بعض الجهد من خلالها. كانت المعايير المختارة هي الكحول ديهيدروجينيز ، الليزوزيم ، والألبومين البقري. تم عمل تركيزين من كل معيار ثم خلطهما ببعض صبغة التحميل. كما تمت إضافة صبغة إلى العينات والسلالم ، مما يجعلها مرئية بالعين المجردة. تم غلي العينة ثم تشغيلها في الهلام لمدة ساعة تقريبًا مع مرور 135 فولت من خلالها. بعد اكتمال الجل ، تم وضع الجل في Brillant Blue Stain لإحداث تحول في امتصاص الطول الموجي إلى 595 نانومتر ، والذي يرتبط ارتباطًا مباشرًا بتركيز البروتين.

فيما يلي صورة نموذجية لما يبدو عليه جل SDS-PAGE:

إليكم صورة الهلام الذي يتم تشغيله في هذه التجربة:

الممرات 3 و 4: الألبومين (بقري)

في المسارين الأولين ، توجد معايير. تستخدم هذه لتحديد حجم البروتينات في الهلام. في الحارة الأولى ، يوجد سلم بعلامات تتراوح من 199.6 كيلو دالتون إلى 6.7 كيلو دالتون. في المسار الثاني ، تم استخدام سلم أصغر يتراوح من 36.5 كيلو دالتون إلى 3.9 كيلو دالتون. لمشاهدة الأوزان الدقيقة لكل فرقة ، انقر هنا. كل فرقة في السلم وزن جزيئي معروف. يمكن تحديد العينات من هذه الأوزان المعروفة.

الممرات الثالثة والرابعة عبارة عن تركيزين مختلفين للألبومين (بقري). لا يمكن رؤية عينة لين 3 على هذا الهلام. يمكن رؤية الخط رقم 4 وشريطه بوزن أعلى بكثير مما ينبغي توقعه. يجب أن يكون موجودًا عند 65 كيلو دالتون تقريبًا ، ولكنه موجود في نطاق 160 كيلو دالتون. على الرغم من أنه لا يمكن تحديد السبب الدقيق لحدوث ذلك ، فقد تكون هناك مشكلة في التركيزات. تظهر الصبغة أن البروتين لم يتحرك معًا ، مما أدى إلى افتراض وجود بروتينات أخرى هناك أيضًا.

الممران التاليان بهما الليزوزيم. تم العثور على العصابات حوالي 15 كيلو دالتون. إنهم بجوار بعضهم البعض ، مما يدل على أنه لا يوجد سوى الليزوزيم الموجود في هذين المسارين. يحتوي الممران الأخيران على نازعة هيدروجين الكحول ، ويتواجد عند 140 كيلو دالتون تقريبًا. مرة أخرى ، هم قريبون تقريبًا من بعضهم البعض. إذا تم تشغيل GFP على هذا الجل ، فسيوجد عند 40 كيلو دالتون. هذا أقل من نازعة هيدروجين الكحول وفوق الليزوزيم ، في منتصف الهلام تقريبًا.

من الجل أعلاه ، تم تحديد أن الكحول ديهيدروجينيز والليزوزيم بروتينات نقية نسبيًا ، مما يعني أن هناك القليل من التداخلات مع البروتينات أو الجزيئات الأخرى. وجد أيضًا أن البروتين سيكون له نفس الوزن الجزيئي ، بغض النظر عن التركيز.


شاهد الفيديو: تشكل الرابطة البيبتيدية (قد 2022).