معلومة

هل هناك حد عملي أعلى لكمية النيوكليوتيدات أو الجينات في البلازميد المحول؟

هل هناك حد عملي أعلى لكمية النيوكليوتيدات أو الجينات في البلازميد المحول؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أنا أعمل حاليًا في مشروع بيولوجيا تركيبية يتضمن العمل بالعديد من الأجزاء المختلفة. أود في النهاية دمج هذه الجينات عن طريق تحويل بلازميد واحد. لقد سمعت (عرضًا) أن 9-10 جينات أجنبية على البلازميد المحول غالبًا ما يكون الحد الأعلى العملي لهذه الأنواع من التجارب ، دون تفسير حقيقي بخلاف "ما وراء ذلك ، فهو لا يعمل".

هل هناك حد أعلى عمليًا لحجم كمية الجينات في البلازميد المحول ، بافتراض أن جميعها بحاجة إلى أن تكون قابلة للتعبير؟ ما الذي يسبب هذا الحد الأعلى؟


من واقع خبرتي في عالم الثدييات (وهذا قد ينطبق أيضًا على الأنظمة البكتيرية) ، ليس عدد الجينات في البلازميد بقدر حجمه الفعلي. كلما كانت البنية أكبر ، زادت صعوبة إدخالها في الخلايا المستهدفة في قطعة واحدة ، دون تدهور أو قص. نظرًا لأن كفاءة التحويل أقل ، فإنك تحصل على عدد أقل من التركيبات الكاملة لكل خلية ، لذلك اعتمادًا على كيفية إعداد المروجين ، يمكن أن يكون مستوى التعبير العام أقل بكثير. تكمن مشكلة تقسيم جيناتك بين اثنين أو أكثر من البلازميدات في أن كل منها سيكون له كفاءات تحويل مختلفة ، وسيكون هناك عدد معين (ربما كبير) من الخلايا التي لا تحصل على المجموعة الكاملة من الجينات ، مما يتداخل مع تحليل النمط الظاهري. ومرة أخرى ، سيتعين عليك أيضًا التفكير في معدلات التعبير التفاضلي.

ومع ذلك ، بمجرد أن تحصل على المتجه الخاص بك في الخلايا في قطعة واحدة ، من الناحية النظرية ، يجب التعبير عنها جميعًا بمستويات متساوية تقريبًا (بافتراض وجود محفزات متطابقة). من المحتمل حدوث عائق صارم بين مجمعات النسخ المتعددة - لا أعرف ما يكفي عن النسخ البكتيري وتأثيرات البلازميدات الدائرية لأقولها.

تتمثل إحدى طرق التغلب على العديد من هذه العوامل في استخدام الكروموسوم الاصطناعي البكتيري أو BAC. BACs عبارة عن نواقل من 7 إلى 10 كيلو بايت يمكن أن تحتوي على إدخالات تصل إلى 1 مليون نقطة أساس مستنسخة فيها ثم يتم إمدادها بالكهرباء في الخلايا. أحد الأشياء الرائعة (العديدة) المتعلقة بها هو أنها تتحكم في نسخها وتقسيمها عند انقسام الخلية ، لذلك يجب أن يكون للأجيال التالية أساسًا نفس رقم النسخة مثل الأصل. تم استخدامها بكثافة خلال مشروع الجينوم البشري لتضخيم أجزاء كبيرة من الحمض النووي للتسلسل ، ولكنها تستخدم أيضًا في العديد من الدراسات الأخرى ، بما في ذلك البيولوجيا التركيبية. يحتوي OpenWetWare على قائمة ببعض الأنظمة الشائعة ، ويبيع NEB أنظمة pBeloBAC11.


التوليف الجيني الاصطناعي

التوليف الجيني الاصطناعي، أو التوليف الجيني، يشير إلى مجموعة من الأساليب المستخدمة في البيولوجيا التركيبية لبناء وتجميع الجينات من النيوكليوتيدات من جديد. على عكس تخليق الحمض النووي في الخلايا الحية ، لا يتطلب تخليق الجينات الاصطناعية قالبًا للحمض النووي ، مما يسمح فعليًا بتوليف أي تسلسل DNA في المختبر. وهو يتألف من خطوتين رئيسيتين ، أولهما هو تخليق الحمض النووي في المرحلة الصلبة ، والذي يُعرف أحيانًا باسم طباعة الحمض النووي. [1] ينتج عن ذلك شظايا قليلة النوكليوتيد تكون عمومًا أقل من 200 زوج قاعدي. تتضمن الخطوة الثانية بعد ذلك توصيل شظايا قليل النوكليوتيد باستخدام طرق تجميع الحمض النووي المختلفة. نظرًا لأن التوليف الجيني الاصطناعي لا يتطلب نموذجًا للحمض النووي ، فمن الممكن نظريًا صنع جزيئات DNA اصطناعية بالكامل بدون قيود على تسلسل النوكليوتيدات أو حجمها.

تم توضيح توليف أول جين كامل ، وهو عبارة عن خميرة tRNA ، بواسطة Har Gobind Khorana وزملاؤه في عام 1972. [2] تم إجراء توليف أول جينات ترميز الببتيد والبروتين في مختبرات هربرت بوير وألكسندر ماركهام ، على التوالي. [3] [4] في الآونة الأخيرة ، تم تطوير طرق تخليق الجينات الاصطناعية التي ستسمح بتجميع الكروموسومات والجينومات بأكملها. تم تصنيع أول كروموسوم خميرة اصطناعي في عام 2014 ، كما تم تصنيع كروموسومات بكتيرية وظيفية بالكامل. [5] بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للتوليف الجيني الاصطناعي في المستقبل الاستفادة من أزواج القاعدة النووية الجديدة (أزواج القواعد غير الطبيعية). [6] [7] [8]


كوزميد

أ كوزميد، الذي وصفه كولينز وهون لأول مرة في عام 1978 ، هو نوع من البلازميد الهجين (غالبًا ما يستخدم كناقل استنساخ) يحتوي على متواليات كوس، تسلسل الحمض النووي في الأصل من عاثية لامدا. يمكن استخدام الكوسميدات لبناء مكتبات الجينوم.

معرفة إضافية موصى بها

لا تدع الشحنات الثابتة تعطل دقة الوزن لديك

يضمن نطاق الوزن الآمن نتائج دقيقة

ما هي حساسية رصيدي؟

الكوزميدات قادرة على احتواء 37 إلى 52 كيلو بايت من الحمض النووي ، في حين أن البلازميدات العادية قادرة على حمل 1-20 كيلو بايت فقط. يمكنهم التكاثر كبلازميدات إذا كان لديهم أصل مناسب للتكاثر: على سبيل المثال SV40 ori في خلايا الثدييات ، ColE1 ori لتكرار الحمض النووي مزدوج الشريطة أو f1 ori لتكرار الحمض النووي أحادي الجديلة في بدائيات النوى. غالبًا ما تحتوي أيضًا على جين للاختيار مثل مقاومة المضادات الحيوية ، بحيث يمكن التعرف على الخلايا المنقولة عن طريق الطلاء على وسط يحتوي على المضاد الحيوي. تلك الخلايا التي لم تمتص الكون لن تكون قادرة على النمو.

ومع ذلك ، على عكس البلازميدات ، يمكن أيضًا تعبئتها في قفيصة الملتهمة ، مما يسمح بنقل الجينات الأجنبية إلى الخلايا أو بينها عن طريق التنبيغ. تصبح البلازميدات غير مستقرة بعد إدخال كمية معينة من الحمض النووي فيها ، لأن حجمها المتزايد يكون أكثر ملاءمة لإعادة التركيب. للتحايل على هذا ، يتم استخدام نقل الملتهمة بدلاً من ذلك. هذا أصبح ممكنا بواسطة نهايات متماسكة، المعروف أيضًا باسم كوس المواقع. وبهذه الطريقة ، فإنها تشبه استخدام فج لامدا كناقل ، ولكن هذا فقط الكل تم حذف جينات lambda باستثناء كوس تسلسل.

200 زوج قاعدة طويلة وضرورية للتغليف. أنها تحتوي على cosN الموقع الذي يتم فيه قطع الحمض النووي في كل خيط ، على حدة بمقدار 12 نقطة أساس ، بواسطة المحطة النهائية. يتسبب هذا في جعل cosmid خطيًا بنهايتين "متماسكة" أو "نهايتين لزجتين" بمقدار 12 نقطة أساس. يجب أن يكون الحمض النووي خطيًا ليناسب رأس العاثية. ال كوسب الموقع يحمل النهايات أثناء قيامه بخدش وفصل الخيوط. ال كوسك يتم الاحتفاظ بموقع cosmid التالي (حيث يؤدي تكرار الدائرة المتدحرجة غالبًا إلى كونكاتيمر خطية) بواسطة المحطة النهائية بعد تغليف cosmid السابق ، لمنع التدهور بواسطة DNases الخلوية.

نظرًا للحجم الثابت لرأس الملتهمة ، يمكن فقط أن تحزم terminase الكوسميدات التي تتراوح بين 75٪ و 105٪ من طول العاثية العادية. وبالتالي فإن الحد الأعلى العملي لحجم الإدخال هو حوالي 40 كيلو بايت ، حيث ستكون هناك حاجة أيضًا إلى أصول النسخ المتماثل وجينات الاختيار ومواقع الاستنساخ المتعددة. لتعبئة المزيد من الحمض النووي في ناقل ، يمكن استخدام الكروموسومات الاصطناعية البكتيرية أو الكروموسومات الاصطناعية للخميرة.


9.3: الاستنساخ والتعبير المؤتلف

لإنجاز التطبيقات الموضحة أعلاه ، يجب أن يكون علماء الكيمياء الحيوية قادرين على استخراج الأحماض النووية ومعالجتها وتحليلها. لفهم التقنيات الأساسية المستخدمة للعمل مع الأحماض النووية ، تذكر أن الأحماض النووية عبارة عن جزيئات ضخمة مكونة من النيوكليوتيدات (سكر ، فوسفات ، وقاعدة نيتروجينية). كل مجموعات الفوسفات في هذه الجزيئات لها شحنة سالبة صافية. مجموعة كاملة من جزيئات الحمض النووي في نواة الكائنات حقيقية النواة تسمى الجينوم. يحتوي الحمض النووي على خيطين متكاملين مرتبطين بروابط هيدروجينية بين القواعد المزدوجة.

على عكس الحمض النووي في الخلايا حقيقية النواة ، تترك جزيئات الحمض النووي الريبي النواة. يتم تحليل Messenger RNA (mRNA) بشكل متكرر لأنه يمثل جينات ترميز البروتين التي يتم التعبير عنها في الخلية.

تم وصف تقنيات عزل الحمض النووي في القسم 5.1 وهي الخطوة الأولى المستخدمة لدراسة أو معالجة الأحماض النووية. يمكن أيضًا استخراج الحمض النووي الريبي ودراسته لفهم أنماط التعبير الجيني في الخلايا. الحمض النووي الريبي غير مستقر بشكل طبيعي لأن الإنزيمات التي تكسر الحمض النووي الريبي توجد عادة في الطبيعة. يتم إفراز بعضها بواسطة بشرتنا ويصعب جدًا تعطيلها. أثناء استخراج الحمض النووي الريبي ، تُستخدم مثبطات RNase والمعالجة الخاصة للأواني الزجاجية لتقليل خطر إتلاف العينة أثناء العزل

هلام الكهربائي

نظرًا لأن الأحماض النووية عبارة عن أيونات سالبة الشحنة عند درجة حموضة محايدة أو قلوية في بيئة مائية ، فيمكن نقلها بواسطة مجال كهربائي. الرحلان الكهربائي للهلام هو تقنية تستخدم لفصل الجزيئات المشحونة على أساس الحجم والشحنة. يمكن فصل الأحماض النووية ككروموسومات كاملة أو أجزاء. يتم تحميل الأحماض النووية في فتحة في أحد طرفي مصفوفة الهلام ، ويتم تطبيق تيار كهربائي ، ويتم سحب الجزيئات سالبة الشحنة باتجاه الطرف المقابل للجيل (النهاية مع القطب الموجب). تتحرك الجزيئات الأصغر عبر المسام في الهلام أسرع من الجزيئات الأكبر ، وهذا الاختلاف في معدل الهجرة يفصل الأجزاء على أساس الحجم. الأحماض النووية في مصفوفة هلامية غير مرئية حتى يتم تلطيخها بمركب يسمح برؤيتها ، مثل الصبغة. تظهر شظايا مميزة من الأحماض النووية كعصابات على مسافات محددة من الجزء العلوي من الهلام (نهاية القطب السالب) التي تستند إلى حجمها (الشكل 5.15). يظهر خليط من شظايا عديدة بأحجام مختلفة على شكل مسحة طويلة ، في حين أن الحمض النووي الجينومي غير المقطوع عادة ما يكون أكبر من أن يمر عبر الهلام ويشكل نطاقًا كبيرًا واحدًا في الجزء العلوي من الجل.

الشكل 5.15 الرحلان الكهربائي لجيل الحمض النووي. تظهر أجزاء من الحمض النووي من ست عينات تعمل على مادة هلامية ، ملطخة بصبغة فلورية ويتم عرضها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. (الائتمان: تعديل العمل بواسطة جيمس جاكوب ، كلية المجتمع تومبكينز كورتلاند)

تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

تمت مناقشة تفاصيل PCR في القسم 5.1. تستخدم هذه التقنية في استنساخ الحمض النووي إلى زيادة عدد النسخ بسرعة مناطق معينة من الحمض النووي.

استنساخ

بشكل عام ، يعني الاستنساخ إنشاء نسخة متماثلة مثالية. عادةً ما تُستخدم الكلمة لوصف إنشاء نسخة متطابقة وراثيًا. في علم الأحياء ، يُشار إلى إعادة تكوين كائن كامل باسم & ldquoreprative الاستنساخ. & rdquo قبل وقت طويل من محاولات استنساخ كائن حي بأكمله ، تعلم الباحثون كيفية نسخ امتدادات قصيرة من DNA و mdasha التي يشار إليها باسم الاستنساخ الجزيئي.

يسمح الاستنساخ الجزيئي بإنشاء نسخ متعددة من الجينات ، والتعبير عن الجينات ، ودراسة جينات معينة. للحصول على جزء من الحمض النووي في خلية بكتيرية بالشكل الذي سيتم نسخه أو التعبير عنه ، يتم أولاً إدخال الجزء في ناقل الاستنساخ.

أ ناقلات الاستنساخ عبارة عن قطعة صغيرة من الحمض النووي يمكن الحفاظ عليها بثبات في الكائن الحي ، ويمكن فيها إدخال جزء دنا أجنبي لأغراض الاستنساخ. قد يكون ناقل الاستنساخ عبارة عن دنا مأخوذ من فيروس ، أو خلية كائن حي أعلى ، أو قد يكون بلازميد بكتيريا. لذلك ، يحتوي المتجه على ميزات تسمح بإدخال أو إزالة جزء من الحمض النووي بشكل مناسب من الناقل أو منه ، على سبيل المثال عن طريق معالجة المتجه والحمض النووي الغريب بإنزيم التقييد الذي يقطع الحمض النووي. تحتوي أجزاء الحمض النووي المتولدة على نهايات غير حادة أو نتوءات معروفة باسم النهايات اللاصقة ، ويمكن بعد ذلك ضم الحمض النووي المتجه والحمض النووي الغريب ذي النهايات المتوافقة معًا عن طريق الربط الجزيئي. بعد استنساخ جزء من الحمض النووي في ناقل استنساخ ، قد يتم استنساخه بشكل إضافي في ناقل آخر مصمم لاستخدام أكثر تحديدًا.

هناك العديد من أنواع نواقل الاستنساخ ، ولكن أكثرها شيوعًا هي البلازميدات المعدلة وراثيًا. يتم إجراء الاستنساخ أولاً باستخدام الإشريكية القولونية، وناقلات الاستنساخ بتنسيق بكتريا قولونية تشمل البلازميدات والعاثيات (مثل العاثية واللامدا) والكونوزومات والكروموسومات الاصطناعية البكتيرية (BACs). ومع ذلك ، لا يمكن الحفاظ على بعض الحمض النووي بشكل ثابت في بكتريا قولونية، على سبيل المثال شظايا كبيرة جدًا من الحمض النووي. لهذه الدراسات ، يمكن استخدام كائنات أخرى مثل الخميرة. تشمل نواقل الاستنساخ في الخميرة صبغيات الخميرة الاصطناعية (YACs).

الشكل 5.16 مثال لمتجه الاستنساخ المشترك.

جميع نواقل الاستنساخ شائعة الاستخدام في البيولوجيا الجزيئية لها سمات أساسية ضرورية لوظيفتها ، مثل موقع استنساخ مناسب به إنزيمات تقييدية وعلامة اختيار. قد يكون لدى الآخرين ميزات إضافية خاصة باستخدامهم. لأسباب تتعلق بالسهولة والراحة ، غالبًا ما يتم إجراء الاستنساخ باستخدام بكتريا قولونية. وبالتالي ، غالبًا ما تحتوي نواقل الاستنساخ المستخدمة على عناصر ضرورية لتكاثرها وصيانتها في بكتريا قولونية، مثل وظيفية أصل النسخ المتماثل (ORI). تم العثور على أصل ColE1 للنسخ المتماثل في العديد من البلازميدات. تتضمن بعض النواقل أيضًا عناصر تسمح بالحفاظ عليها في كائن حي آخر بالإضافة إلى بكتريا قولونية، وتسمى هذه النواقل ناقلات المكوك.

موقع الاستنساخ

تحتوي جميع نواقل الاستنساخ على ميزات تسمح بإدخال الجين بسهولة في المتجه أو إزالته منه. قد يكون هذا ملف موقع استنساخ متعدد (MCS) أو متعدد الوصلات، والتي تحتوي على العديد من مواقع التقييد الفريدة. يتم أولاً شق مواقع التقييد في MCS بواسطة إنزيمات التقييد ، ثم يتم أيضًا ربط الجين المستهدف الذي تم تضخيمه بواسطة PCR والذي يتم هضمه بنفس الإنزيمات في النواقل باستخدام DNA ligase. يمكن إدخال تسلسل الحمض النووي المستهدف في المتجه في اتجاه معين إذا رغبت في ذلك. يمكن استخدام مواقع التقييد أيضًا للاستنساخ الفرعي إلى ناقل آخر إذا لزم الأمر.

قد تستخدم نواقل الاستنساخ الأخرى توبويزوميراز بدلاً من ligase ويمكن أن يتم الاستنساخ بسرعة أكبر دون الحاجة إلى هضم مقيد للناقل أو الإدخال. في طريقة استنساخ TOPO هذه ، يتم تنشيط ناقل خطي عن طريق ربط topoisomerase I بنهاياته ، وقد يقبل هذا المتجه & quot المنشط من OPO & quot بعد ذلك منتج PCR عن طريق ربط طرفي 5 'من منتج PCR ، وإطلاق الإيزوميراز العلوي وتشكيل ناقل دائري في العمليه. طريقة أخرى للاستنساخ دون استخدام هضم الحمض النووي والليغاز هي عن طريق إعادة تركيب الحمض النووي ، على سبيل المثال كما هو مستخدم في نظام استنساخ البوابة. يمكن إدخال الجين ، بمجرد استنساخه في ناقل الاستنساخ (يسمى استنساخ الدخول في هذه الطريقة) ، بشكل ملائم في مجموعة متنوعة من نواقل التعبير عن طريق إعادة التركيب.

إنزيمات التقييد

أنزيمات التقييد (وتسمى أيضًا نوكليازات التقييد) تتعرف على تسلسلات DNA محددة وتقطعها بطريقة يمكن التنبؤ بها تنتجها البكتيريا بشكل طبيعي كآلية دفاع ضد الحمض النووي الغريب.

كما يوحي الاسم ، فإن نوكليازات التقييد (أو إنزيمات التقييد) هي & ldquoمحدد& rdquo في قدرتها على قطع أو هضم الحمض النووي. القيد الذي يفيد علماء الكيمياء الحيوية عادة ما يكون أ متناوب تسلسل الحمض النووي. المتواليات المتناظرة هي نفس التسلسل للأمام وللخلف. بعض الأمثلة على المتناظرات: RACE CAR ، CIVIC ، A MAN A PLAN A CANAL PANAMA. فيما يتعلق بالحمض النووي ، هناك خيطانان يعملان بشكل مضاد للتوازي مع بعضهما البعض. لذلك ، فإن المكمل العكسي لأحد الخيطين مطابق للآخر.

كما هو الحال مع كلمة متناظرة ، هذا يعني أن تسلسل الحمض النووي المتناظر يقرأ نفس الشيء للأمام والخلف. في معظم الحالات ، يقرأ التسلسل نفس الشيء للأمام على خصلة واحدة وللخلف على الشريط التكميلي. غالبًا ما تقطع العناصر المتفاعلة الحمض النووي إلى نمط متعرج. عندما يتم إجراء قطع متداخلة في تسلسل ، تكون الأجزاء المتدلية مكملة (الشكل 5.17).

الشكل 5.17 تسلسل التعرف على إنزيم التقييد. في هذا (أ) موقع التعرف على إنزيم تقييد ستة نيوكليوتيدات ، لاحظ أن تسلسل ستة نيوكليوتيدات يقرأ نفس الشيء في الاتجاه 5 & Prime إلى 3 & على حبلا واحد كما هو الحال في الاتجاه 5 & Prime إلى 3 & على الشريط التكميلي. هذا هو المعروف باسم المتناظرة. (ب) يجعل إنزيم التقييد فواصل في خيوط الحمض النووي ، و (ج) يؤدي القطع في الحمض النووي إلى نهايات & ldquosticky & rdquo. قطعة أخرى من الحمض النووي مقطوعة على كلا الطرفين بواسطة نفس إنزيم التقييد يمكن أن تلتصق بهذه الأطراف اللاصقة ويتم إدخالها في الفجوة التي يصنعها هذا القطع.

يميل علماء الأحياء الجزيئية أيضًا إلى استخدام هذه المقصات الجزيئية الخاصة التي تتعرف على متناظرات من 6 أو 8. باستخدام 6 قواطع أو 8 قاطعات ، تحدث التسلسلات عبر امتدادات كبيرة نادرًا ، ولكن غالبًا ما تكون ذات فائدة.

ايكو ارى يولد نهايات لزجة متماسكة SmaI يولد نهايات حادة

الشكل 5.18 أنزيمات التقييد. تعترف إنزيمات التقييد بالتسلسل المتناوب في الحمض النووي وتحلل روابط الفسفودايستر التساهمية للحمض النووي لتترك إما نهايات & ldquosticky / cohesive & rdquo أو نهايات ldquoblunt & rdquo. هذا التمييز في القطع مهم لأن ايكو ارى يمكن استخدام الطرف اللاصق لمطابقة قطعة من الحمض النووي مقطوعة بنفس الإنزيم من أجل لصقها أو ربطها معًا مرة أخرى. بينما تقطع نوكليازات الحمض النووي ، إنزيمات دمج الجزيئات انضم إليهم مرة أخرى معًا. هضم الحمض النووي مع ايكو ارى يمكن ربطها مرة أخرى مع قطعة أخرى من الحمض النووي المهضوم بها ايكو ارى، ولكن ليس للقطعة المهضومة بها SmaI. قاطع غير حاد آخر هو EcoRV مع تسلسل التعرف على GAT | ATC.

علامة اختيار

يتم وضع علامة قابلة للتحديد بواسطة المتجه للسماح باختيار الخلايا المحولة إيجابياً. غالبًا ما تستخدم مقاومة المضادات الحيوية كواسم ، ومثال على ذلك جين بيتا لاكتاماز ، الذي يمنح مقاومة لمجموعة البنسلين من المضادات الحيوية بيتا لاكتام مثل الأمبيسلين. تحتوي بعض النواقل على اثنين من العلامات القابلة للتحديد ، على سبيل المثال ، يحتوي البلازميد pACYC177 على كل من الجين المقاوم للأمبيسيلين والكاناميسين. قد تتطلب أيضًا نواقل المكوك التي تم تصميمها للمحافظة عليها في كائنين مختلفين اثنين من العلامات القابلة للتحديد ، على الرغم من أن بعض الواسمات القابلة للتحديد مثل مقاومة الزيوسين والهيغروميسين ب تكون فعالة في أنواع الخلايا المختلفة. يمكن أيضًا استخدام علامات الانتقاء المساعدة التي تسمح لكائن مساعد التغذية بالنمو في الحد الأدنى من وسط النمو. LEU2 و URA3 التي يتم استخدامها مع سلالات الخميرة المغذية المقابلة لها.

نوع آخر من الواسمات القابلة للتحديد يسمح بالاختيار الإيجابي للبلازميد مع الجين المستنسخ. قد يتضمن ذلك استخدام جينة قاتلة للخلايا المضيفة ، مثل البارناز ، Ccda ، وسموم parD / parE. يعمل هذا عادةً عن طريق تعطيل أو إزالة الجين القاتل أثناء عملية الاستنساخ ، والنسخ غير الناجحة حيث يظل الجين القاتل سليمًا من شأنه أن يقتل الخلايا المضيفة ، لذلك يتم اختيار الحيوانات المستنسخة الناجحة فقط.

جينات المراسل

تُستخدم جينات المراسل في بعض نواقل الاستنساخ لتسهيل فحص الحيوانات المستنسخة الناجحة باستخدام ميزات هذه الجينات التي تسمح بتحديد الاستنساخ الناجح بسهولة. قد تكون هذه الميزات الموجودة في نواقل الاستنساخ هي لاكز& جزء ألفا لتكملة ألفا في الانتقاء الأزرق والأبيض ، و / أو الجين المحدد أو الجينات المراسل في الإطار مع MCS والمحاطة به لتسهيل إنتاج بروتينات الاندماج. من أمثلة شركاء الاندماج التي يمكن استخدامها للفحص البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ولوسيفيراز.

الشكل 5.19 جينات المراسل. في هذا الرسم البياني ، يتم استخدام بروتين التألق الأخضر كجينات مراسلة لدراسة التسلسلات التنظيمية الأولية.

عناصر للتعبير

إذا كان التعبير عن الجين المستهدف مطلوبًا ، فإن ناقل الاستنساخ يحتاج أيضًا إلى احتواء عناصر مناسبة للتعبير عن الجين المستهدف المستنسخ ، بما في ذلك المحفز وموقع الربط الريبوسومي (RBS). يمكن إدخال الحمض النووي المستهدف في موقع يخضع لسيطرة محفز معين ضروري للتعبير عن الجين المستهدف في المضيف المختار. في حالة وجود المحفز ، يفضل التحكم بإحكام في التعبير عن الجين وتحريضه بحيث يتم إنتاج البروتينات فقط عند الحاجة. بعض المروجين الأكثر شيوعًا هي T7 و لاك المروجين. يعد وجود المحفز ضروريًا عند استخدام تقنيات الفرز مثل الاختيار الأزرق والأبيض.

تُستخدم أحيانًا نواقل الاستنساخ بدون محفز و RBS لتسلسل الحمض النووي المستنسخ ، على سبيل المثال عند استنساخ الجينات التي تكون منتجاتها سامة بكتريا قولونية الخلايا. المروج و RBS لتسلسل الحمض النووي المستنسخ غير ضروريين أيضًا عند إنشاء مكتبة الجينوم أو cDNA للمستنسخات لأول مرة لأن الجينات المستنسخة عادةً ما يتم استنساخها في ناقل تعبير أكثر ملاءمة إذا كان تعبيرها مطلوبًا.

أنواع نواقل الاستنساخ

يتوفر عدد كبير من نواقل الاستنساخ ، وقد يعتمد اختيار المتجه الصحيح على عدد من العوامل ، مثل حجم الإدخال ورقم النسخ وطريقة الاستنساخ. قد لا يتم الاحتفاظ بإدخالات الحمض النووي الكبيرة بشكل ثابت في ناقلات الاستنساخ العامة ، خاصة بالنسبة لأولئك الذين لديهم عدد نسخ مرتفع ، وبالتالي قد يتطلب استنساخ أجزاء كبيرة ناقلات استنساخ أكثر تخصصًا.

تقوم البلازميدات بشكل مستقل بتكرار DNA دائري خارج الكروموسومات. هم نواقل الاستنساخ القياسية والأكثر استخدامًا. يمكن استخدام معظم البلازميدات العامة لاستنساخ إدخال DNA يصل حجمه إلى 15 كيلو بايت. العديد من البلازميدات لديها عدد نسخ مرتفع ، على سبيل المثال pUC19 الذي يحتوي على عدد نسخ من 500-700 نسخة لكل خلية ، وعدد النسخ المرتفع مفيد لأنه ينتج عائدًا أكبر من البلازميد المؤتلف من أجل التلاعب اللاحق. ومع ذلك ، يمكن استخدام بلازميدات ذات عدد نسخ منخفض بشكل مفضل في ظروف معينة ، على سبيل المثال ، عندما يكون البروتين من الجين المستنسخ سامًا للخلايا.

الجراثيم

العاثيات الأكثر شيوعًا في الاستنساخ هي ملتهمة لامدا (ولامدا) ولاقمات M13. يوجد حد أعلى لكمية الحمض النووي التي يمكن تعبئتها في فجوة (بحد أقصى 53 كيلو بايت). يبلغ متوسط ​​جينوم العاثيات لامدا 48.5 كيلو بايت تقريبًا (الشكل 5.20). لذلك ، للسماح بإدخال الحمض النووي الغريب في دنا العاثيات ، قد تحتاج نواقل استنساخ العاثيات إلى حذف بعض جيناتها غير الأساسية لإفساح المجال للحمض النووي الغريب.

يوجد أيضًا حد أقل لحجم الحمض النووي الذي يمكن تعبئته في فجوة ، ولا يمكن تغليف الحمض النووي المتجه الصغير جدًا في العاثية بشكل صحيح. يمكن استخدام هذه الخاصية للاختيار - قد يكون المتجه بدون إدراج صغيرًا جدًا ، وبالتالي يمكن تحديد المتجهات التي تحتوي على إدراج فقط للنشر.

الشكل 5.20 Lambda Phage. (أ) تمثيل تخطيطي للجينوم الدائري للعاثية لامدا (ب) رسم تخطيطي لجسيم لامدا فج المعدية و (ج) صورة مجهرية إلكترونية للجراثيم ذات الصلة ، اهتزاز VvAWI. يشير الشريط إلى طول 50 نانومتر.

الكوسميدات عبارة عن بلازميدات تتضمن جزءًا من عاثيات البكتيريا و DNA lambda الذي يحتوي على مواقع نهائية متماسكة (كوس) الذي يحتوي على العناصر المطلوبة لتعبئة الحمض النووي في جزيئات & lambda. يتم استخدامه عادة لاستنساخ أجزاء كبيرة من الحمض النووي بين 28 و 45 كيلو بايت.

الكروموسوم الاصطناعي البكتيري

يمكن استنساخ حجم الإدخال الذي يصل إلى 350 كيلو بايت في الكروموسوم الاصطناعي البكتيري (BAC). يتم الحفاظ على BACs في بكتريا قولونية برقم نسخة واحد فقط لكل خلية. غالبًا ما تم استخدام BACs لتسلسل جينوم الكائنات الحية في مشاريع الجينوم ، بما في ذلك مشروع الجينوم البشري. يتم تضخيم قطعة قصيرة من الحمض النووي للكائن الحي كإدخال في BACs ، ثم تسلسلها. أخيرًا ، يتم إعادة ترتيب الأجزاء المتسلسلة في السيليكو، مما أدى إلى التسلسل الجيني للكائن الحي. تم استبدال BACs إلى حد كبير بهذه السعة بأساليب تسلسل أسرع وأقل شاقة مثل تسلسل الجينوم الكامل للبندقية والآن تسلسل الجيل التالي مؤخرًا.

كروموسوم الخميرة الاصطناعي

يتم استخدام كروموسوم الخميرة الاصطناعي كناقلات لاستنساخ شظايا الحمض النووي لأكثر من 1 ميغا قاعدة (1 ميغا بايت = 1000 كيلو بايت = 1000000 قاعدة) في الحجم. إنها مفيدة في استنساخ أجزاء أكبر من الحمض النووي كما هو مطلوب في رسم خرائط الجينوم كما هو الحال في مشروع الجينوم البشري. يحتوي على تسلسل تيلومير ، تسلسل متماثل بشكل مستقل (ميزات مطلوبة لتكرار الكروموسومات الخطية في خلايا الخميرة). تحتوي هذه النواقل أيضًا على مواقع تقييد مناسبة لاستنساخ الحمض النووي الأجنبي وكذلك الجينات لاستخدامها كعلامات انتقائية.

كروموسوم الإنسان الاصطناعي

قد تكون الكروموسومات الاصطناعية البشرية مفيدة كنواقل لنقل الجينات لتوصيل الجينات إلى الخلايا البشرية ، وأداة لدراسات التعبير وتحديد وظيفة الكروموسوم البشري. يمكن أن يحمل جزءًا كبيرًا جدًا من الحمض النووي (لا يوجد حد أعلى للحجم للأغراض العملية) ، وبالتالي لا يعاني من مشكلة قدرة الاستنساخ المحدودة للناقلات الأخرى ، كما أنه يتجنب حدوث الطفرات الإدراجية المحتملة الناتجة عن الاندماج في الكروموسومات المضيفة بواسطة الفيروس. المتجه.

كما تم التلاعب بالنواقل الفيروسية الحيوانية والنباتية التي تصيب الخلايا النباتية والحيوانية لإدخال جينات غريبة في الخلايا النباتية والحيوانية. إن القدرة الطبيعية للفيروسات على الامتصاص في الخلايا وإدخال الحمض النووي الخاص بها والتكاثر جعلتها مركبات مثالية لنقل الحمض النووي الغريب إلى الخلايا حقيقية النواة في المزرعة. تم استخدام ناقل يعتمد على فيروس Simian 40 (SV40) في أول تجربة استنساخ شملت خلايا الثدييات. تم استخدام عدد من النواقل التي تعتمد على نوع آخر من الفيروسات مثل الفيروسات الغدية وفيروس الورم الحليمي لاستنساخ الجينات في الثدييات. في الوقت الحاضر ، نواقل الفيروسات القهقرية شائعة لاستنساخ الجينات في خلايا الثدييات. في حالة تحول النبات ، تم استخدام الفيروسات بما في ذلك فيروس موزاييك القرنبيط وفيروس موزاييك التبغ وفيروسات الجوزاء بنجاح محدود.

ملخص لاستنساخ الحمض النووي

يقدم الشكل 5.21 ملخصًا لأساليب الاستنساخ الأساسية الأكثر استخدامًا في مختبرات الكيمياء الحيوية. يتم عزل الحمض النووي الأجنبي أو تضخيمه باستخدام PCR للحصول على مادة كافية لإجراء الاستنساخ. يتم تنقية الحمض النووي وتقطيعه باستخدام إنزيمات تقييدية ، ثم يتم مزجه مع ناقل تم قطعه بنفس إنزيمات التقييد. يمكن بعد ذلك خياطة الحمض النووي مرة أخرى مع DNA ligase. يمكن بعد ذلك تحويل الحمض النووي إلى نظام مضيف ، غالبًا البكتيريا ، لتنمية كميات كبيرة من البلازميد الذي يحتوي على الحمض النووي المستنسخ.

يمكن استخدام نقش شظايا التقييد وتسلسل الحمض النووي للتحقق من صحة المواد المستنسخة.

الشكل 5.21 رسم بياني يوضح الخطوات الرئيسية في الاستنساخ.

للحصول على فيديو تعليمي عن استنساخ الحمض النووي ، قم بزيارة: HHMI - BioInteractive

تسمى البلازميدات التي تحتوي على دنا أجنبي داخلها بجزيئات الحمض النووي المؤتلف لأنها تحتوي على توليفات جديدة من المواد الجينية. تسمى البروتينات التي يتم إنتاجها من جزيئات الحمض النووي المؤتلف بالبروتينات المؤتلفة. ليست كل البلازميدات المؤتلفة قادرة على التعبير عن الجينات. يمكن أيضًا تصميم البلازميدات للتعبير عن البروتينات فقط عندما يتم تحفيزها بواسطة عوامل بيئية معينة ، بحيث يمكن للعلماء التحكم في التعبير عن البروتينات المؤتلفة.

الاستنساخ التناسلي

الاستنساخ التناسلي هو طريقة تستخدم في استنساخ أو ملف نسخة متطابقة من كائن متعدد الخلايا كامل. تخضع معظم الكائنات متعددة الخلايا للتكاثر بالوسائل الجنسية ، والتي تتضمن مساهمة الحمض النووي من فردين (الوالدين) ، مما يجعل من المستحيل إنتاج نسخة متطابقة أو استنساخ لأي من الوالدين. جعلت التطورات الحديثة في التكنولوجيا الحيوية من الممكن استنساخ الثدييات التناسلية في المختبر.

يتضمن التكاثر الجنسي الطبيعي اتحاد الحيوانات المنوية والبويضة أثناء الإخصاب. كل من هذه الأمشاج أحادي العدد بمعنى أنها تحتوي على مجموعة واحدة من الكروموسومات في نواتها. ثم تكون الخلية الناتجة ، أو الزيجوت ثنائي الصيغة الصبغية ويحتوي على مجموعتين من الكروموسومات. تنقسم هذه الخلية بشكل انقسامي لإنتاج كائن متعدد الخلايا. ومع ذلك ، فإن اتحاد أي خليتين فقط لا يمكن أن ينتج زيجوتًا قابلاً للحياة ، فهناك مكونات في السيتوبلازم لخلية البويضة ضرورية للتطور المبكر للجنين خلال الانقسامات الخلوية القليلة الأولى. بدون هذه الأحكام ، لن يكون هناك تطور لاحق. لذلك ، لإنتاج فرد جديد ، يلزم وجود مكمل جيني ثنائي الصبغة وسيتوبلازم بيض. تتمثل طريقة إنتاج فرد مستنسخ صناعيًا في أخذ خلية بويضة فرد واحد وإزالة النواة أحادية العدد. ثم يتم وضع نواة ثنائية الصبغيات من خلية جسم الفرد الثاني ، المتبرع ، في خلية البويضة. ثم يتم تحفيز البويضة على الانقسام حتى يستمر التطور. يبدو هذا بسيطًا ، ولكنه في الواقع يتطلب عدة محاولات قبل إكمال كل خطوة بنجاح.

كان أول حيوان زراعي مستنسخ هو دوللي ، وهي شاة ولدت في عام 1996. وكان معدل نجاح الاستنساخ لأغراض التكاثر في ذلك الوقت منخفضًا للغاية. عاشت دوللي لمدة ست سنوات وتوفيت بسبب ورم في الرئة (الشكل 5.22). كانت هناك تكهنات بأنه نظرًا لأن الحمض النووي للخلية الذي أدى إلى ظهور دوللي جاء من فرد أكبر سنًا ، فقد يكون عمر الحمض النووي قد أثر على متوسط ​​عمرها المتوقع. منذ دوللي ، تم استنساخ العديد من أنواع الحيوانات (مثل الخيول والثيران والماعز) بنجاح.

كانت هناك محاولات لإنتاج أجنة بشرية مستنسخة كمصادر للخلايا الجذعية الجنينية. في هذا الإجراء ، يتم إدخال الحمض النووي من إنسان بالغ في خلية بويضة بشرية ، والتي يتم تحفيزها بعد ذلك على الانقسام. تشبه هذه التقنية التقنية التي تم استخدامها لإنتاج دوللي ، ولكن لا يتم زرع الجنين أبدًا في أم بديلة. تسمى الخلايا المنتجة بالخلايا الجذعية الجنينية لأنها تتمتع بالقدرة على التطور إلى أنواع مختلفة من الخلايا ، مثل العضلات أو الخلايا العصبية. يمكن استخدام الخلايا الجذعية للبحث وتقديم تطبيقات علاجية في نهاية المطاف ، مثل استبدال الأنسجة التالفة. وتتمثل فائدة الاستنساخ في هذه الحالة في أن الخلايا المستخدمة لتجديد أنسجة جديدة ستكون مطابقة تمامًا للمتبرع بالحمض النووي الأصلي. على سبيل المثال ، لا يحتاج مريض اللوكيميا إلى شقيق لديه نسيج مطابق لعملية زرع نخاع العظم.

الشكل 5.22 كانت النعجة دوللي أول حيوان زراعي يتم استنساخه. لإنشاء دوللي ، تمت إزالة النواة من خلية بويضة مانحة. تم وضع البويضة المنزوعة النوى بجانب الخلية الأخرى ، ثم صُدموا للانصهار. لقد صُدموا مرة أخرى لبدء الانقسام. تم السماح للخلايا بالانقسام لعدة أيام حتى الوصول إلى مرحلة جنينية مبكرة ، قبل أن يتم زرعها في أم بديلة.

لماذا كانت دوللي فنلندي دورست وليست من الأغنام الاسكتلندية ذات الوجه الأسود؟

لأنه على الرغم من أن الخلية الأصلية جاءت من خروف اسكتلندي ذو وجه أسود وكانت الأم البديلة ذات وجه أسود اسكتلندي ، فإن الحمض النووي جاء من فين دورست.

الهندسة الوراثية

إن استخدام تقنية الحمض النووي المؤتلف لتعديل الحمض النووي للكائن الحي و rsquos لتحقيق الصفات المرغوبة يسمى الهندسة الوراثية. تعد إضافة الحمض النووي الأجنبي في شكل نواقل الحمض النووي المؤتلف الناتجة عن الاستنساخ الجزيئي أكثر الطرق شيوعًا في الهندسة الوراثية. يسمى الكائن الحي الذي يتلقى الحمض النووي المؤتلف أ كائن معدل وراثيا (GMO). إذا كان الحمض النووي الغريب الذي تم إدخاله يأتي من نوع مختلف ، يتم استدعاء الكائن الحي المضيف المعدلة وراثيا. تم تعديل البكتيريا والنباتات والحيوانات وراثيًا منذ أوائل السبعينيات للأغراض الأكاديمية والطبية والزراعية والصناعية.

شاهد هذا الفيديو القصير الذي يشرح كيف يصنع العلماء حيوانًا معدّلًا وراثيًا.

على الرغم من أن الطرق الكلاسيكية لدراسة وظيفة الجينات بدأت بنمط ظاهري معين وحددت الأساس الجيني لهذا النمط الظاهري ، فإن التقنيات الحديثة تسمح للباحثين بالبدء على مستوى تسلسل الحمض النووي ويسألون: & ldquo ماذا يفعل هذا الجين أو عنصر الحمض النووي؟ & rdquo هذه التقنية ، مسمى علم الوراثة العكسي، أدى إلى عكس المنهجية الجينية الكلاسيكية. أحد الأمثلة على هذه الطريقة يماثل إتلاف جزء من الجسم لتحديد وظيفته. الحشرة التي تفقد جناحها لا تستطيع الطيران ، مما يعني أن وظيفة الجناح و rsquos هي الطيران. تقارن الطريقة الجينية الكلاسيكية الحشرات التي لا تستطيع الطيران مع الحشرات القادرة على الطيران ، وتلاحظ أن الحشرات غير الطائرة فقدت أجنحة. وبالمثل في نهج علم الوراثة العكسي ، فإن تحور الجينات أو حذفها يوفر للباحثين أدلة حول وظيفة الجينات. بالتناوب ، يمكن استخدام الوراثة العكسية لجعل الجين يفرط في التعبير عن نفسه لتحديد التأثيرات المظهرية التي قد تحدث.

تقنية كريسبر

كريسبر تمثل متكررة متكررة متناظرة قصيرة متباعدة بانتظامويمثل عائلة من سلاسل الحمض النووي الموجودة داخل جينومات الكائنات بدائية النواة مثل البكتيريا والعتائق. يتم اشتقاق هذه التسلسلات من شظايا الحمض النووي للعاثيات التي سبق أن أصابت بدائيات النوى وتستخدم لاكتشاف وتدمير الحمض النووي من العاثيات المماثلة أثناء العدوى اللاحقة. ومن ثم تلعب هذه التسلسلات دورًا رئيسيًا في نظام الدفاع المضاد للفيروسات بدائيات النوى.

5.23 هيكل بلوري لمجمع المراقبة CRISPR RNA الموجه ، Cascade ، المرتبط بهدف ssDNA. وحدات البروتين الفرعية لنظام CRISPR Cascade CasA و CasB و CasC و CasD و CasE (السماوي) المرتبطة بـ CRISPR RNA (الأخضر) والحمض النووي الفيروسي (الأحمر) استنادًا إلى PDB 4QYZ وتم تقديمها باستخدام PyMOL.

Cas9 (أو البروتين المرتبط بـ & quotCRISPR 9 & quot) هو إنزيم يستخدم تسلسلات كريسبر كدليل للتعرف على سلاسل معينة من الحمض النووي وشقها مكملة لتسلسل كريسبر. تشكل إنزيمات Cas9 جنبًا إلى جنب مع تسلسل CRISPR أساس تقنية تُعرف باسم CRISPR-Cas9 والتي يمكن استخدامها لتحرير الجينات داخل الكائنات الحية. عملية التحرير هذه لها مجموعة متنوعة من التطبيقات بما في ذلك البحوث البيولوجية الأساسية ، وتطوير منتجات التكنولوجيا الحيوية ، وعلاج الأمراض.

الشكل 5.24 رسم تخطيطي لآلية دفاع كريسبر بدائية النواة المضادة للفيروسات.

نظام CRISPR-Cas هو نظام مناعي بدائية النواة يمنح مقاومة للعناصر الجينية الأجنبية مثل تلك الموجودة داخل البلازميدات والعاثيات التي توفر شكلاً من أشكال المناعة المكتسبة. يساعد RNA الذي يحتوي على تسلسل المباعد بروتينات Cas (المرتبطة بـ CRISPR) على التعرف على الحمض النووي المسبّب للأمراض وقطعه. تقوم بروتينات Cas الأخرى الموجهة من RNA بقطع الحمض النووي الريبي الأجنبي. تم العثور على كريسبر في حوالي 50٪ من الجينومات البكتيرية المتسلسلة وما يقرب من 90٪ من العتائق المتسلسلة.


4.3 تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

في الأساس ، ينتج عن استنساخ الحمض النووي تنقية جزء واحد من الحمض النووي من خليط معقد من جزيئات الحمض النووي. الاستنساخ تقنية قوية وكان تأثيرها على فهمنا للجينات والجينوم لا يقاس. ومع ذلك ، فإن للاستنساخ عيبًا رئيسيًا واحدًا: فهو عملية تستغرق وقتًا طويلاً ، وفي بعض الأجزاء ، عملية صعبة. يستغرق الأمر عدة أيام لإجراء عمليات التلاعب اللازمة لإدخال شظايا الحمض النووي في ناقل الاستنساخ ثم إدخال الجزيئات المرتبطة في الخلايا المضيفة واختيار المواد المؤتلفة. إذا كانت الاستراتيجية التجريبية تتضمن إنشاء مكتبة استنساخ كبيرة ، متبوعة بفحص المكتبة لتحديد نسخة تحتوي على جين مهم (انظر الملاحظة الفنية 4.3) ، فقد تكون هناك حاجة لعدة أسابيع أو حتى أشهر أخرى لإكمال المشروع.

المربع 4.3

العمل مع مكتبة استنساخ. تستخدم مجموعات الاستنساخ كمصدر للجينات وشرائح الحمض النووي الأخرى. تم استخدام مكتبات النسخ في أبحاث البيولوجيا الجزيئية لسنوات عديدة وتمتد أهميتها إلى ما هو أبعد من دورها كنقطة انطلاق لـ (المزيد).

يُكمل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) استنساخ الحمض النووي من حيث أنه يتيح تحقيق نفس النتيجة - تنقية جزء معين من الحمض النووي - ولكن في وقت أقصر بكثير ، ربما بضع ساعات فقط (Saiki) وآخرون. ، 1988). يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مكملاً للاستنساخ ، وليس بديلاً له ، لأن له حدوده الخاصة ، وأهمها الحاجة إلى معرفة تسلسل جزء على الأقل من الجزء المراد تنقيته. على الرغم من هذا القيد ، اكتسب PCR أهمية مركزية في العديد من مجالات أبحاث البيولوجيا الجزيئية. سوف نفحص التقنية أولاً ثم ندرس تطبيقاتها.

4.3.1. إجراء PCR

ينتج عن PCR النسخ المتكرر لمنطقة محددة من جزيء DNA (انظر الشكل 4.3). على عكس الاستنساخ ، يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل تفاعلًا عبر أنبوب الاختبار ولا يتضمن استخدام الخلايا الحية: لا يتم النسخ بواسطة الإنزيمات الخلوية ولكن بواسطة بوليميراز الحمض النووي المنقى والحرارى لـ T. aquaticus (القسم 4.1.1). سيتضح سبب الحاجة إلى إنزيم قابل للحرارة عندما ننظر بمزيد من التفصيل في الأحداث التي تحدث أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل.

لإجراء تجربة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يتم خلط الحمض النووي المستهدف مع طق بوليميراز الدنا ، زوج من البادئات قليلة النوكليوتيد ، ومصدر للنيوكليوتيدات. يمكن أن تكون كمية الحمض النووي المستهدفة صغيرة جدًا لأن تفاعل البوليميراز المتسلسل حساس للغاية وسيعمل مع جزيء بدء واحد فقط. هناك حاجة إلى البادئات لبدء تفاعلات تخليق الحمض النووي التي سيتم تنفيذها بواسطة طق البوليميراز (انظر الشكل 4.6). يجب أن ترتبط بالحمض النووي المستهدف على جانبي القطعة المراد نسخها ، وبالتالي يجب معرفة تسلسل مواقع الارتباط هذه بحيث يمكن تصنيع بادئات التسلسلات المناسبة.

يبدأ التفاعل بتسخين الخليط إلى 94 & # x000b0C. عند درجة الحرارة هذه ، تنكسر الروابط الهيدروجينية التي تربط بين عديد النوكليوتيدات في اللولب المزدوج ، وبالتالي يتحول الحمض النووي المستهدف إلى جزيئات مفردة الجديلة (الشكل 4.28). تنخفض درجة الحرارة بعد ذلك إلى 50 & # x0201360 & # x000b0C ، مما ينتج عنه بعض إعادة الانضمام للخيوط المفردة للحمض النووي المستهدف ، ولكنه يسمح أيضًا للبادئات بالتعلق بمواقع التلدين. يمكن أن يبدأ تركيب الحمض النووي الآن ، وبالتالي ترتفع درجة الحرارة إلى 72 & # x000b0C ، وهو الأمثل لـ طق بوليميراز. في هذه المرحلة الأولى من PCR ، يتم تصنيع مجموعة من & # x02018long products & # x02019 من كل خيط من الحمض النووي المستهدف. هذه البولينيوكليوتيدات لها نهايات متطابقة 5 & # x02032 لكن نهايات عشوائية 3 & # x02032 ، تمثل الأخيرة المواقف التي ينتهي فيها تخليق الحمض النووي بالصدفة. عندما تتكرر دورة التمسخ - التلدين - التوليف ، تعمل المنتجات الطويلة كقوالب لتخليق الحمض النووي الجديد ، مما يؤدي إلى & # x02018 منتجات قصيرة & # x02019 التي يتم تعيين نهاياتها 5 & # x02032 و 3 & # x02032 بواسطة مواضع التلدين التمهيدي ( الشكل 4.29). في الدورات اللاحقة ، يتراكم عدد المنتجات القصيرة بطريقة أسية (تتضاعف خلال كل دورة) حتى ينضب أحد مكونات التفاعل. هذا يعني أنه بعد 30 دورة ، سيكون هناك أكثر من 250 مليون منتج قصير مشتق من كل جزيء ابتدائي. في الواقع ، هذا يعادل عدة ميكروغرامات من منتج PCR من بضعة نانوجرام أو أقل من الحمض النووي المستهدف.

الشكل 4.28

المرحلة الأولى من PCR. انظر الى النص للحصول على التفاصيل.

الشكل 4.29

توليف & # x02018short & # x02019 من المنتجات في PCR. تظهر منتجات الدورة الأولى من الشكل 4.28 في الأعلى. تؤدي الدورة التالية من التمسخ - التلدين - التوليف إلى أربعة منتجات ، اثنان منها متطابقان مع منتجات الدورة الأولى (المزيد).

يمكن تحديد نتائج PCR بطرق مختلفة.عادةً ، يتم تحليل المنتجات بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام الاغاروز ، والذي سيكشف عن نطاق واحد إذا كان تفاعل البوليميراز المتسلسل قد عمل كما هو متوقع وقام بتضخيم جزء واحد من الحمض النووي المستهدف (الشكل 4.30). بدلاً من ذلك ، يمكن تحديد تسلسل المنتج باستخدام التقنيات الموضحة في القسم 6.1.1.

الشكل 4.30

تحليل نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل بواسطة الاغاروز الكهربائي للهلام. تم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في أنبوب دقيق. يتم تحميل العينة في الممر 2 من هلام الاغاروز. يحتوي المسار 1 على علامات حجم الحمض النووي ، ويحتوي الممر 3 على عينة من تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي قام به زميل. (أكثر. )

4.3.2. تطبيقات PCR

يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل إجراءً مباشرًا بحيث يصعب أحيانًا فهم كيف يمكن أن يصبح مهمًا جدًا في البحث الحديث. أولاً سنتعامل مع حدوده. من أجل توليف البادئات التي ستصلب في المواضع الصحيحة ، يجب معرفة تسلسل المناطق الحدودية للحمض النووي المراد تضخيمه. وهذا يعني أنه لا يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتنقية أجزاء من الجينات أو أجزاء أخرى من الجينوم لم تتم دراستها من قبل. القيد الثاني هو طول الحمض النووي الذي يمكن نسخه. يمكن تضخيم المناطق التي يصل حجمها إلى 5 كيلو بايت دون صعوبة كبيرة ، كما أن التضخمات الأطول - حتى 40 كيلو بايت - ممكنة باستخدام تعديلات التقنية القياسية. ومع ذلك ، فإن أجزاء & # x0003e100 kb اللازمة لمشاريع تسلسل الجينوم لا يمكن الوصول إليها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل.

ما هي نقاط القوة في PCR؟ من أهم هذه العوامل سهولة الحصول على المنتجات التي تمثل جزءًا واحدًا من الجينوم من عدد من عينات الحمض النووي المختلفة. سنواجه أحد الأمثلة المهمة على ذلك في الفصل التالي عندما ننظر في كيفية كتابة واسمات الحمض النووي في مشاريع رسم الخرائط الجينية (القسم 5.2.2). يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل بطريقة مماثلة لفحص عينات الحمض النووي البشري بحثًا عن الطفرات المرتبطة بالأمراض الوراثية مثل الثلاسيميا والتليف الكيسي. كما أنه يشكل أساس التنميط الجيني ، حيث يتم كتابة الاختلافات في طول الساتل الميكروي (انظر الشكل 2.25).

الميزة الثانية المهمة لـ PCR هي قدرته على العمل بكميات ضئيلة من بدء الحمض النووي. وهذا يعني أنه يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل للحصول على تسلسلات من كميات ضئيلة من الحمض النووي الموجودة في الشعر ، وبقع الدم وعينات الطب الشرعي الأخرى ، ومن العظام وغيرها من البقايا المحفوظة في المواقع الأثرية. في التشخيص السريري ، يكون تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) قادرًا على اكتشاف وجود الحمض النووي الفيروسي قبل أن يصل الفيروس إلى المستويات اللازمة لبدء الاستجابة للمرض. هذا مهم بشكل خاص في الكشف المبكر عن السرطانات التي يسببها الفيروس لأنه يعني أنه يمكن البدء في برامج العلاج قبل أن يتشكل السرطان.

ما ورد أعلاه ليس سوى عدد قليل من تطبيقات PCR. تعد هذه التقنية الآن مكونًا رئيسيًا لمجموعة أدوات عالم الأحياء الجزيئية وسوف نكتشف العديد من الأمثلة الأخرى لاستخدامها في دراسة الجينوم بينما نتقدم خلال الفصول المتبقية من هذا الكتاب.


استراتيجيات العلاج الجيني

في هذه المراجعة ، يتم استخدام العلاج الجيني بشكل مترادف مع العلاج الجيني للخلايا الجسدية بدلاً من العلاج الجيني للخط الجرثومي. يكمن التمييز في حقيقة أن العلاج الجيني للخلايا الجسدية يستهدف الخلايا الجسدية. ينتهي نقل الجين وتأثيراته العلاجية (أو الضارة) عندما يموت الكائن الحي. تتضمن جميع بروتوكولات العلاج الجيني السريري المعتمدة حتى الآن العلاج الجيني للخلايا الجسدية. في العلاج الجيني للخط الجرثومي ، ينتقل التلاعب الجيني إلى النسل. خلق حيوانات خالية من جين معين (بمعنى آخر. ، حيوانات الضربة القاضية للجينات) بشكل متزايد في العمل التجريبي للتحقيق في الأهمية الوظيفية لمنتج جيني معين. إن قوة مثل هذا النهج الجيني لفك شفرة الآليات الكامنة وراء الألم المرضي للأغراض التجريبية واضحة ، ومع ذلك ، فإن تطبيق العلاج الجيني للخط الجرثومي لإنشاء كائنات لن تصاب أبدًا بألم مرضي ليس مرغوبًا علاجيًا ولا مقبولًا أخلاقياً. يحاول العلاج الجيني تنظيم التعبير عن البروتين المستهدف بناءً على فهمنا لكيفية تنظيم الخلايا للتعبير الجيني. هناك ستة مستويات عامة من التنظيم الجيني في حقيقيات النوى ، 11 منها من المحتمل أن تكون قابلة للتحكم الاصطناعي ، وبالتالي من المحتمل أن تكون مفيدة للعلاج الجيني. تتضمن هذه المستويات التحكم في النسخ ، والتحكم في معالجة RNA ، والتحكم في نقل RNA ، والتحكم في تدهور mRNA ، والتحكم في الترجمة ، والتحكم في نشاط البروتين. من الناحية النظرية ، يمكن استهداف أي من نقاط التنظيم الجيني هذه ، بمفردها أو مجتمعة ، عن طريق العلاج الجيني. حتى الآن ، اقتصر التطبيق العملي للعلاج الجيني بشكل أساسي على التعبير عن بروتين ناقص أو معيب بواسطة شريط مستقل للتعبير الجيني (بمعنى آخر. ، علاج استبدال الجينات). غالبًا ما يُرى هذا النهج في العلاج الجيني لمرض أحادي الجين (على سبيل المثال ونقص إنزيم الأدينوزين والتليف الكيسي). يمكن أن تستهدف استراتيجية الإفراط في التعبير لإدارة الألم أهدافًا مضادة للألم مثل مستقبلات الأسيتيل كولين والقنب والأفيون والسيروتونين. يتطلب التعبير الناجح لمنتج البروتين الوظيفي نقل الجين والتعبير عنه لترميز البروتين المستهدف الوظيفي بالكامل ، والذي يتم تحقيقه بشكل أفضل عن طريق تقنية ناقلات الفيروس. تشتمل التقنيات البديلة القادرة على نقل دنا كبير على مسدس الجينات للحقن المباشر للبنى البلازميد في الأنسجة المستهدفة 17 وترنسفكأيشن الناقل للدهون لتركيبات البلازميد وامتصاص مركب بروتين-بلازميد فيروسي. 18 تناقش مراجعة حديثة هذه الأنظمة وغيرها من أنظمة توصيل الحمض النووي الاصطناعية. 19

الاستراتيجية الثانية في التجارب السريرية النشطة بالفعل هي الضربة القاضية بوساطة قليل النوكليوتيد المضاد للترتيب لمستويات البروتين المستهدفة على الأرجح من خلال تحلل الرنا المرسال المعزز (بمعنى آخر. ، علاج حذف المنتجات الجينية). تستهدف استراتيجية الضربة القاضية هذه الأهداف المسببة للأمراض أو الأهداف المحتملة للمرض ، مثل ن - مستقبلات ميثيل د أسبارتات ، بروتين كيناز سي ، ومستقبلات نيوروكينين 1. يؤدي إعطاء قليل النوكليوتيد 18-20 ميتر مع تسلسل مكمل للجين الذي يشفر البروتين المستهدف إلى انخفاض في مستويات البروتين. على الرغم من أن الآليات الدقيقة المسؤولة عن الضربة القاضية المضادة للدلالة لا تزال غير معروفة ، فقد تم اقتراح توقيف انتقالي ناتج عن نشاط إنزيم خلوي معين (RNAse H) بوساطة تدهور مرنا هجين مزدوج الشريطة وتوقف النسخ من خلال التداخل مع فك الجين المزدوج تقطعت بهم السبل. هذا النهج محدود في محاولات العلاج بوساطة قليلة النوكليوتيد المضادة المعنى تقليل تنظيم البروتين. لذلك ، فقط أهداف مسبب للتقيؤ هي التي يمكن التدخل العلاجي. بالإضافة إلى نهج oligonucleotide المضاد للمعنى ، يمكن تحقيق ضربة قاضية لهدف البروتين باستخدام ناقل فيروسي مصمم لنسخ mRNA في الاتجاه المضاد أيضًا.

نهج مواز للتعبير عن جزيئات مضادات الذرات القابلة للانتشار من خلال زرع خارج الجسم الحي عودة الخلايا المنقولة إلى الكائن السليم هي طريقة جذابة للعلاج بالمنتج الجيني ولكن لم تتم مناقشتها في هذه المراجعة. من الناحية النظرية ، يمكن جمع خلايا المريض وهندستها لإنتاج جزيئات مسبب للألم ، ثم إعادة زرعها مرة أخرى في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، مما يزيل المشاكل المناعية المرتبطة بالطعوم الغريبة. يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول هذا النهج في مراجعة ممتازة من قبل التشيك و Sagen. 20

أدوات العلاج الجيني

العلاج الجيني ، على عكس العلاج الدوائي التقليدي ، يستهدف الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي لتحقيق هدفه العلاجي. سواء كانت تتضمن نقل جزء قصير من الحمض النووي (طريقة قليل النوكليوتيد المضاد للترميز) أو cDNA كامل الطول يشفر البروتين الوظيفي بالكامل ، فإن الخطوة الأولى من العلاج الجيني تعتمد على النقل الناجح "لعقار استهداف الجينات". في هذا القسم ، تمت مناقشة تقنيتين محددتين لنقل الجينات للخلايا الجسدية ، وهما الناقل الفيروسي وطرق قليل النوكليوتيد المضاد للحساسية ، حيث تمثل هذه الأساليب ، في رأينا ، التقنيات الأقرب إلى التطبيقات السريرية البشرية. تم تلخيص مزايا وعيوب الطريقتين الرئيسيتين في الجدول 1. يحول محدودية المساحة دون مناقشة الأساليب الأخرى لنقل الجينات (المنتج) ، بما في ذلك الريبوزيمات ، ومدفع الجين 21 ، وزرع الخلايا المستهدفة للجينات. 20 نركز مناقشتنا على الأساليب التي تؤثر على أهداف الجهاز العصبي المركزي. يمكن تطبيق نفس المنهجية على الأهداف الطرفية الجديدة المتورطة في الألم ، مثل المحاور والأجسام الخلوية للجهاز العصبي اللاإرادي والمحيطي ، وأهداف الجهاز غير العصبي مثل الخلايا الظهارية المسؤولة عن النقل الميكانيكي في النهايات العصبية الحرة . لا نهدف إلى تقليل الفائدة المحتملة للأهداف المحيطية ، ولكن التركيز على أهداف الجهاز العصبي المركزي ، لا سيما في النخاع الشوكي ، لأن هذه الأهداف يجب أن تكون قابلة للعلاج البؤري من خلال التدخل المباشر داخل القراب. العلاج البؤري مرغوب فيه للغاية لأن خطر الآثار الجانبية غير المرغوب فيها قد يكون له عواقب وخيمة عند التلاعب بالأهداف الجينية.

النواقل الفيروسية

تطوير نواقل المؤتلف.

لا تعمل الطرق التقليدية لنقل الجينات ، مثل ترسيب فوسفات الكالسيوم ، أو التثقيب الكهربائي ، أو تقنيات مختلفة بوساطة حاملات الدهون ، بكفاءة عالية في الخلايا التالية للتضخم ، وغالبًا ما تكون غير عملية لتطبيقات الجهاز العصبي المركزي. توفر النواقل الفيروسية المطورة حديثًا وسيلة قوية لنقل الجينات بشكل فعال في الجهاز العصبي المركزي. 22،23 من خلال التطور ، اكتسبت الفيروسات القدرة على إصابة وتحويل جينومها إلى الخلايا المضيفة. يشير مصطلح التنبيغ إلى العملية التي يصيب بها الفيروس خلية مضيفة ويدخل محتوياتها الجينية. تستفيد المعالجة الجينية القائمة على الناقلات الفيروسية من البيولوجيا الطبيعية للفيروس لتحويل الجينات الخارجية إلى الخلايا المضيفة. يتمثل المبدأ العام لتكوين ناقل فيروسي في حذف الجينات غير الأساسية من الفيروس ، مما يؤدي إلى إعاقة تكاثره وبالتالي جعله غير مُمْرِض مع الاحتفاظ بالقدرة على الارتباط ونقل جينومه إلى المضيف. ومع ذلك ، فإن تقديم نقص في النسخ المتماثل للفيروس لا يضمن القضاء على السمية الخلوية المباشرة أو إلغاء الاستجابة المناعية للمضيف الناجم عن التعبير عن بروتينات فيروسية أخرى غير ضرورية للتكاثر. 24 يجب أن يحقق ناقل مثالي للعلاج الجيني تعبيرًا جينيًا منظمًا ومستقرًا خاصًا بالأنسجة دون إثارة الاستجابة المناعية للمضيف. 25 يعتمد اختيار الناقل الفيروسي الذي سيتم استخدامه أيضًا على الاعتبارات العملية التالية الخاصة بالجينات المحورة: (1) ما هو حجم الجين الخارجي الذي يريد المرء نقله؟ (2) هل الخلية المستهدفة نشطة من الناحية الانقسامية (على سبيل المثال ، الخلايا الدبقية) أو ما بعد التقلص (على سبيل المثال والخلايا العصبية)؟ (3) ما هو الطريق المطلوب للتسليم؟ و (4) ما هي المدة المطلوبة للتدخل العلاجي؟

يحدد حجم الجين المراد نقله سعة "الحمولة" المطلوبة للناقل الفيروسي. بشكل عام ، الفيروس الذي يحتوي على جينوم أصلي أكبر قادر على حمل جين خارجي أكبر. تسمح آلية تكرار الحمض النووي ، مثل نظام النسخ المتداول الذي يستخدمه فيروس الهربس البسيط (HSV) المتضخم (amplicon) ، بالتضخيم المتأصل للجين الخارجي ، مما يؤدي في الواقع إلى زيادة جرعة الجين. يحدد الهدف المنشود لنقل الجينات ما إذا كان يجب على الناقل الفيروسي نقل الخلايا غير المنقسمة. بالنسبة للعلاج الجيني للجهاز العصبي المركزي ، حيث يكون الهدف المرغوب في أغلب الأحيان هو الخلايا العصبية التالية للتضخم ، يُمنع استخدام ناقلات مثل فيروس سرطان الدم في الفئران Maloney (MMLV) والفيروس المرتبط بالغدية (AAV) ، والتي لها قدرة محدودة على إصابة الخلايا الصامتة الانقسامية. . أخيرًا ، تحدد المدة المطلوبة للتعبير الجيني الخارجي ما إذا كانت هناك حاجة إلى ناقل فيروسي متكامل أو غير متكامل. التنبيغ مع دمج الفيروس (على سبيل المثال ، فيروس نقص المناعة البشرية [HIV]) يؤدي إلى تكامل الجين الخارجي في جينوم العائل ، وبالتالي ضمان التواجد الدائم للجين الخارجي في الأجيال القادمة من الخلايا الناتجة عن الانقسام الفتيلي. فيروس غير متكامل (على سبيل المثال ، Adenovirus و HSV) يسمح فقط بوجود خارج الكروموسومات للجين الخارجي ، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى فقدان الجين المحور مع انقسام الخلية حتى في الظروف المثالية.

تم استخدام كل من فيروس DNA وفيروس RNA والفيروسات القهقرية كناقلات تجريبية لنقل الجينات (الجدول 2). تستند النواقل الفيروسية الأربعة الأكثر شيوعًا إلى MMLV و AAV و Adenovirus و HSV. كان MMLV ، وهو فيروس ارتجاعي ، أول من أدخل تجربة إكلينيكية بشرية ، ومع ذلك ، نظرًا لضعف كفاءة نقله وعدم قدرته على إصابة الخلايا التالية للتضخم ، فإن فائدة MMLV في العلاج الجيني للجهاز العصبي المركزي محدودة باستثناء استخدامه في تحويل الخلايا النشطة الانقسامية خارج الجسم الحي للزرع اللاحق في الجهاز العصبي المركزي. 22،29 الفيروس القهقري الذي يتم إدخاله في الكائن الحي كناقل للعلاج الجيني يحمل أيضًا المخاطر النظرية للطفرات التدميرية. من الممكن أيضًا إعادة التركيب مع سلاسل الفيروسات القهقرية المتكاملة بشكل ثابت الموجودة في الجينوم البشري ، مما يؤدي إلى إنشاء فيروس ارتجاعي كفء للتكرار. على الرغم من هذه القيود النظرية ، فقد أظهر العلاج الجيني المستند إلى MMLV فعالية إكلينيكية للمرضى الذين يعانون من مرض أحادي الجين. قد يؤدي ظهور ناقل قائم على فيروس نقص المناعة البشرية لديه القدرة على تحويل الخلايا العصبية إلى تمهيد الطريق لمزيد من استخدام الفيروسات القهقرية (الفيروسة البطيئة) في العلاج الجيني للجهاز العصبي المركزي أيضًا. 31

الجدول 2. النواقل الفيروسية للعلاج الجيني للجهاز العصبي المركزي *

* من المحتمل أن تكون النواقل الفيروسية خطرة وتتطلب موافقة مؤسسية على السلامة الأحيائية قبل بدء العمل. يمكن إنشاء نواقل غير كفؤة النسخ المتماثل بأمان مع احتياطات المستوى الثاني من السلامة الأحيائية التي لا تختلف عن العمل الروتيني على الخلايا من أصل بشري. يمكن العثور على معلومات عامة حول مستوى السلامة الحيوية الموصى به لعمل الحمض النووي المؤتلف على http://www4.od.nih.gov/oba/ (المعاهد الوطنية للصحة ، تم الوصول إليه في 12 أبريل / نيسان 2001).

† يتم تكرار الحمض النووي المُدخَل في ناقل أمبليكون لفيروس الهربس البسيط (HSV) على شكل كونكاتيمر من الرأس إلى الذيل يبلغ حوالي 150 كيلو بايت ، وهو ما يقارب حجم جينوم فيروس الهربس البسيط من النوع البري. من الناحية النظرية ، يجب أن يكون الجين المحور بحجم 150 كيلو بايت قابلاً للتحويل. في الممارسة العملية ، يحد تقييد استقرار amplicon القائم على البلازميد من الحمولة إلى 15 كيلو بايت. يجب أن يؤدي استخدام مركبات الاستنساخ ذات السعة الكبيرة ، مثل الكوسميدات أو الكروموسومات الاصطناعية للخميرة ، إلى تحسين قدرة الحمولة بشكل كبير.

‡ E1- ، E3 المحذوفة من ناقلات الفيروسات الغدانية (المكوك والبلازميدات الأم) متاحة من Microbix Inc. (http://www.microbix.com ، تم الوصول إليه في 12 أبريل 2001) وشركة Quantum Biotechnologies Inc. (http: // www. Quantumbiotech.com ، بالرجوع إليه في 12 أبريل 2001). يتطلب إنشاء فيروس غدي مأشوب باستخدام الكواشف التجارية استنساخًا فرعيًا متبوعًا بإعادة التركيب المتماثل في خلايا HEK293. مطلوب مزيد من الطرد المركزي المتدرج لكلوريد السيزيوم متبوعًا بغسيل الكلى للحصول على فيروس غدي نظيف. على الرغم من تسويقه على أنه "مجموعة" ، إلا أن إنشاء ناقل غدي - يؤوي الجين المهم يتطلب تقنيًا ، ويتطلب خبرة كبيرة في البيولوجيا الجزيئية وثقافة الخلية. تتوفر الخدمات المخصصة لإنشاء فيروسات غدية مؤتلفة محددة E1- ، E3 محذوفة تجارياً ولكنها مكلفة للغاية. يمكن العثور على دليل معمل ممتاز لإنشاء الجيل الأول من الفيروسات الغدية في Ehrenbruber وآخرون. 124 أو في غراهام وبريفك. 125 يمكن العثور على مرجع تقني إضافي لإنشاء فيروسات غدية مأشوبة على موقع ويب شركة Microbix Inc.

§ بالنسبة للفيروسات الغدية المعوية ، الحمض النووي الكلي (بمعنى آخر. ، حجم الجينوم) بين 28 و 36 كيلو بايت للتعبئة الفعالة في جزيئات فيروسية. بالنسبة للجينات المحورة الصغيرة ، بما في ذلك المحفز وإشارات تعدد الأدينيل ، تمتلئ المساحة المتبقية بالحمض النووي غير المرتبط (غالبًا λ-phage DNA) لتلبية متطلبات الحجم الأدنى. من الناحية النظرية ، يمكن استخدام أشرطة متعددة التعبيرات التي تستخدم مروجات فردية أو متسلسلة بواسطة تسلسل موقع دخول الريبوسوم الداخلي بدلاً من الحمض النووي للعاثية لإنشاء ناقل يعبر عن جينات علاجية متعددة في وقت واحد. لذلك ، يمكن أن تقترب سعة الإدراج النظرية من 36 كيلو بايت.

∥ لا تتوفر الكواشف الخاصة بتكوين الفيروسات المرتبطة بالغدة كمجموعة. ومع ذلك ، فإن البلازميدات التي تؤوي الفيروس المرتبط بالغدة (كتالوج رقم 37216 ، 68065) ​​اللازمة لإنشاء تركيبات فيروسات مرتبطة بالفيروسات الغدية المؤتلفة متاحة من American Type Culture Collection Inc. (http://atcc.org ، تمت الزيارة في 12 أبريل / نيسان 2001) . يمكن العثور على بروتوكول جيد في Skulimowski و Simulski. 126

# سلسلة من النواقل المشتقة من فيروس Moleny leukemia وخطوط خلايا التغليف متوفرة كمجموعة من Clontech Inc. (http://www.clontech.com ، تمت الزيارة في 12 أبريل / نيسان 2001). يتطلب إنشاء فيروس قهقري قائم على فيروس ابيضاض الدم الموليني الفئران استنساخًا فرعيًا للجين المعني في الناقل المتوفر تجاريًا وترنسفكأيشن العابر في خط خلية تعبئة. يمكن حصاد الفيروسات القهقرية المعدية ولكنها غير كفؤة من طاف ثقافة الخلية. البروتوكول موثق جيدًا وسهل تقنيًا. لم نتمكن من تحديد موقع مرجع محدد يوضح الحد الأعلى لحجم الإدخال. ومع ذلك ، نظرًا لأن نواقل فيروس سرطان الدم الموليني في الفئران تفتقر أساسًا إلى الجينوم الفيروسي بأكمله ، فإن الإدخال الذي يقترب من حجم الجينوم الفيروسي من النوع البري يجب أن يكون قابلاً للتعبئة. تم الحصول على حد الحمولة البالغ 5 كيلو بايت المدرج في الجدول من Clontech Technical Support.

** يمكن شراء ناقل مشتق من فيروس Sindbis والحمض النووي للفيروس المساعد من Invitrogen Inc. (http://www.invitrogen.com ، تمت الزيارة في 12 أبريل / نيسان 2001). يتطلب إنشاء فيروس السندبيس استنساخًا فرعيًا للجين المعني في نواقل pSIN و في المختبر نسخ الحمض النووي الريبي من كل من نواقل pSIN والناقل المساعد ، متبوعًا بترنسفكأيشن إلى خط الخلية المتسامح للكلى الهامستر. في المختبر النسخ أمر صعب بالنسبة لأولئك الذين لم يعتادوا العمل مع الحمض النووي الريبي. خلاف ذلك ، يكون الإجراء كما هو موضح في النشرة الداخلية للحزمة واضحًا ومباشرًا. لاحظنا أن غسيل الكلى من طاف ثقافة الخلية قبل الاستخدام يقلل من السمية الخلوية المباشرة لفيروس السندبيس. يمكن للفيروس أن يحزم إدخالات خارجية من 3 كيلو بايت ، ومع ذلك ، فإن الحمولة محدودة بسبب عدم استقرار الإدخال ، مع إدخالات أقل من 2 كيلو بايت تظهر أكبر قدر من الاستقرار (انظر Huang 127). يمكن العثور على مصدر معلومات لا غنى عنه لناقلات فيروسات ألفا في http://www.microbiology.wustl.edu/sindbis/sinVectors (كلية الطب بجامعة واشنطن ، قسم علم الأحياء الدقيقة ، تم الوصول إليه في 12 أبريل / نيسان 2001).

JuPNOtgBzXKqflJIhzGuRBy5GEVshFZ7IQXvw __ & ampKey-Pair-Id = APKAIE5G5CRDK6RD3PGA "/>

يسمح التقدم الأخير في طرق إنتاج AAV بإنشاء نواقل عالية العيار مع عدم وجود تلوث بالفيروس الغدي المساعد. أكدت العديد من المختبرات الآن نجاح التعبير الجيني المستمر بوساطة AAV في الدماغ والحبل الشوكي دون آثار اعتلال خلوي ، ودحض الفكرة التقليدية القائلة بأن AAVs غير قادرة على تحويل الخلايا بعد التقلص ، ومع ذلك ، فإن قدرة الإدخال المحدودة لهذا الفيروس تقيد استخدامه لنقل الجينات الصغيرة .22A الهجين الفيروسي الهجين - MMLV أو الفيروس الغدي - AAV الذي يحجب تسلسل الفيروسات القهقرية أو AAV داخل الفيروس الغدي ، مما يؤدي إلى فيروس متكامل بشكل ثابت مع نطاق مضيف واسع ، 33 قد يكون ناقلًا جذابًا بشكل خاص للتدخل الجيني طويل الأجل المطلوب لإدارة ألم مزمن.

كان HSV أول من قدم قدرة استنساخ كبيرة تمكن من التعبير عن جينات كبيرة محورة. خصائصه العصبية الطبيعية تجعل هذا الناقل جذابًا بشكل خاص لتوصيل الجينات CNS. العيب الرئيسي هو عدم فهم البيولوجيا الفيروسية المعقدة التي تنظم الدخول إلى المرحلة الكامنة حيث يتوقف التعبير الجيني الفيروسي (ويفترض الجين المحور الذي يريد المرء أن يعبر عنه). كما هو الحال مع AAV ، فإن المطلب الحالي للفيروس المساعد للانتشار والتحضير على نطاق واسع لـ HSV المؤتلف يفرض بعض القيود أيضًا. قد يتغلب على هذا القيد عبوة حديثة خالية من الفيروسات المساعدة على أساس مكتبة كونية من فيروس الهربس البسيط المعيب. 26 يسمح استخدام cosmid ، وهو بناء خاص للحمض النووي يسمح بانتشار قطع كبيرة من الحمض النووي في البكتيريا ، بتمثيل جينوم HSV بأكمله في أجزاء متداخلة ، وبالتالي توفير جميع الوظائف الضرورية للفيروس المساعد ولكن دون التعرض لخطر "إعادة التكوين" فيروس مساعد ملوث.

الجين المبكر 1 (ه 1 ) - تم حذف الفيروس الغدي ، وهو فيروس آخر للحمض النووي يتمتع بقدرة استنساخ محترمة (8 كيلو بايت [kb]) ، وكان ناقلًا فيروسيًا مبكرًا تم تطويره للعلاج الجيني. حذف الفيروس ه 1 جعل الجين تكاثر الفيروس ناقصا وخلق مساحة لدمج الجين المحور. الفيروس غير متكامل ، وبيولوجيته الطبيعية مفهومة جيدًا ، وأدوات تكوين فيروس مؤتلف متاحة بسهولة. الشكل 34 ، الشكل 1 يوضح العملية المتضمنة في تكوين فيروس غدي من الجيل الأول المؤتلف وعمله في الخلية المستهدفة. كان العلاج الجيني للتليف الكيسي باستخدام الفيروس الغدي الذي يعبر عن بروتين منظم نقل التليف الكيسي أحد أولى تجارب العلاج الجيني الإكلينيكي البشري التي تمت تجربتها. يستمر استخدام 35،36 من ناقلات الفيروسات الغدية في العديد من البروتوكولات السريرية البشرية للسرطان والتليف الكيسي 38 ومرض الكبد أحادي المنشأ. 39 في وقت مبكر في الجسم الحي كشفت التجربة مع نواقل الفيروس الغدي في الحيوانات والبشر عن وجود قيود أساسية في الجيل المبكر من ناقلات الفيروسات الغدية للتطبيقات طويلة المدى: العدوى الفيروسية تثير الخلية المضيفة والمناعة الخلطية ، مما يؤدي إلى القضاء على الخلايا المنقولة. في الجهاز العصبي المركزي ذي الامتيازات المناعية ، يمكن اكتشاف التعبير الجيني المتحور بوساطة الفيروس الغدي لمدة شهرين بعد الإصابة ، ومدة محترمة 40 أ ولكن لا يزال مقيدًا للعلاج الجيني طويل المدى. أظهر الفيروس الغدي اللاحق الذي يشتمل على طفرة حساسة لدرجة الحرارة في البروتين المرتبط بالحمض النووي أحادي السلسلة 41 أو الذي يعبر بشكل أساسي عن بروتين gp19K 42 الفيروسي أنه ينتج عنه بقاء أطول للخلية المضيفة بعد انتقال الفيروس. هذه القيود على نواقل الفيروس الغدي ، ولا سيما نواقل الجيل الأول ، على الرغم من خطورة في الجسم الحي تطبيقات العلاج الجيني ، ليست ذات أهمية كبيرة في التجارب في المختبر التطبيقات ، حيث لا يوجد وسطاء مناعيون. القضاء اللاحق على الفيروس ه 3 و ه 4 أدت الجينات إلى نواقل فيروسات الغد من الجيل الثالث والرابع مع استمناع أقل بشكل ملحوظ وزيادة سعة الحمولة. 43- حذف أي من المضاعفات ه 3 و ه 4 تؤدي المنتجات الجينية إلى فيروس يتصرف بشكل أفضل لا يزال مجهولًا ، ولكن السؤال يحل محله إلى حد كبير الجيل الجديد من الفيروس "غير المعوي".

التين. 1. تكوين الفيروس الغدي المؤتلف وعمله في الخلايا العصبية المستهدفة. (أ ينتج عن إعادة التركيب المتماثل بين البلازميد الأم والبلازميد المكوكي (تبديل خيوط الحمض النووي بين قطع منفصلة من الحمض النووي ، والمنطقة المظللة) فيروس غدي معدي ولكن معيب في النسخ المتماثل (سداسي مع بروتينات ألياف شبيهة بالأنتانا في القمة). تشير الخطوط المتعرجة إلى DNA البلازميد غير الفيروسي. ITR = تكرار المحطة المقلوبة ψ = تسلسل التغليف ΔE1 و ΔE3 = حذف الجين المبكر 1 أو 3. (ب ) يتصل الجسيم الفيروسي بمستقبل CAR على سطح الغشاء ويتم دمجه في الخلية المستهدفة. يتم إلقاء طبقة البروتين الفيروسية ونقل الجينات المعدلة إلى النواة. يتم نسخ الحمض النووي الريبي (mRNA) المرسال للاستشعار الجيني (mRNA) ويتم تصنيع بروتين جديد مضاد للألم ، أو يمكن نسخ mRNA المضاد لتحفيز البروتين المستقبلي الداخلي المنشأ. كلتا الاستراتيجيتين تؤدي إلى انخفاض الألم.

التين. 1. تكوين الفيروس الغدي المؤتلف وعمله في الخلايا العصبية المستهدفة. (أ ينتج عن إعادة التركيب المتماثل بين البلازميد الأم والبلازميد المكوكي (تبديل خيوط الحمض النووي بين قطع منفصلة من الحمض النووي ، والمنطقة المظللة) فيروس غدي معدي ولكن معيب في النسخ المتماثل (سداسي مع بروتينات ألياف شبيهة بالأنتانا في القمة). تشير الخطوط المتعرجة إلى DNA البلازميد غير الفيروسي. ITR = تكرار المحطة المقلوبة ψ = تسلسل التغليف ΔE1 و ΔE3 = حذف الجين المبكر 1 أو 3. (ب ) يتصل الجسيم الفيروسي بمستقبل CAR على سطح الغشاء ويتم دمجه في الخلية المستهدفة. يتم إلقاء طبقة البروتين الفيروسية ونقل الجينات المعدلة إلى النواة. يتم نسخ الحمض النووي الريبي (mRNA) المرسال للاستشعار الجيني (mRNA) ويمكن نسخ بروتين جديد مضاد للأذى ، أو يمكن نسخ mRNA المضاد لتحفيز البروتين المستقبلي الداخلي المنشأ. كلتا الاستراتيجيتين تؤدي إلى انخفاض الألم.

تم وصف فيروسات غدية عديمة الأمعاء وصفت مؤخرًا وخالية أساسًا من جميع الجينوم الفيروسي غير المرغوب فيه ، مما يضعنا على بعد خطوة واحدة من الناقل الفيروسي المثالي. يتم إنشاء الفيروس الغدي غير المعوي عن طريق حذف كل الجينوم الفيروسي باستثناء التكرار الطرفي المقلوب والتسلسل الضروري للتعبئة الفيروسية. تسلسل الحمض النووي الفيروسي المتبقي في ناقل الأمعاء ضئيل ويشبه الفيروس القهقري أو AAV. يوسع الفضاء الناتج عن هذا الحذف أيضًا سعة الحمولة النافعة للفيروس ، نظريًا ، إلى أكثر من 30 كيلو قاعدة من الحمض النووي. إنشاء فيروس عديم الأمعاء معيب ولكنه معدي للنسخ المتماثل مع الحد الأدنى من التلوث بالفيروس المساعد يعتمد على استخدام خط الخلية المساعد - ريكومبيناز - معبرًا عن Cre. 45،46 تعتمد التقنية على خاصية إنزيم Cre-recombinase لاستئصال جزء انتقائي من الحمض النووي محاطًا بنوكليوتيد محدد مكون من 30 قاعدة يسمى تسلسل lox P. عندما يتم استخدام فيروس مساعد مصمم خصيصًا بتسلسل الخاص به المحاط بـ lox P لإنشاء الفيروس الغدي المعوي المعتمد على المساعد في خط خلوي يعبر بشكل أساسي عن إعادة التركيب المترابط لـ Cre ، فإن استئصال التسلسل ψ يعطي عيبًا انتقائيًا. والنتيجة هي تكوين الفيروس الغدي المعوي المعتمد على المساعد مع الحد الأدنى من التلوث بالفيروس المساعد.

أظهرت دراسة أجريت على الفئران والبابون التفوق في الجسم الحي طول عمر الفيروس عديم الأمعاء مقارنة بالجيل الأول من الفيروسات الغدية. لم يُلاحظ أي استجابة مناعية للمضيف الناجم عن النواقل يمكن إثباتها. على الرغم من أنه لا يزال خطوة بعيدة عن نظام توصيل الجينات المثالي بسبب إنشاء كمية صغيرة من تلوث الفيروس الغدي المساعد أثناء التحضير على نطاق واسع (& lt 0.1٪) ، فإن هذا التقدم الكبير في تصميم ناقل الفيروس الغدي يجلب بوضوح التطبيق السريري للناقل الفيروسي - العلاج الجيني أقرب إلى الواقع.

عقبات في الأساليب الفيروسية.

يتطلب التدخل العلاجي للألم توصيل الجينات إلى الجهاز العصبي المركزي. على الرغم من أن النواقل الفيروسية تقدم نهجًا واعدًا لتحقيق هذا الهدف ، إلا أن هناك العديد من العقبات العملية التي تحول دون تحقيقه. يتم إعاقة توصيل معظم الأدوية إلى الجهاز العصبي المركزي بسبب الحاجز الدموي الدماغي (BBB). قيود حركية دوائية مماثلة تتعلق بالعلاج الجيني. يتكون BBB من تقاطعات ضيقة بين الخلايا البطانية الشعرية ويستبعد الجزيئات التي يزيد حجمها عن 600 Da تقريبًا. من الواضح أن النواقل الفيروسية المحقونة بشكل منهجي وكذلك قليل النوكليوتيد العاري مستبعدة من الدخول الفعال إلى الجهاز العصبي المركزي. هناك ثلاث طرق متاحة للتحايل على هذا القيد: (1) الحقن المباشر داخل المتني أو تحت العنكبوتية للمركبات ، (2) التعطيل العابر لـ BBB للسماح بالتخلل بعد الحقن الجهازي ، أو (3) الدخول إلى الجهاز العصبي المركزي من خلال النقل عبر تجاوز الحاجز الدماغي.

يتخطى الترسيب المباشر للجسيمات الفيروسية في الفضاء تحت العنكبوتية القيود التشريحية التي يفرضها التقاطع الضيق البطاني BBB. ومع ذلك ، تشير دراسة حديثة للتصوير بالرنين المغناطيسي لأدمغة الفئران ، حيث تم تعطيل BBB تناضحيًا ، إلى وجود حاجز أمام الوصول الخلوي يفرضه الغشاء القاعدي 51 حتى في غياب BBB. قد يمنع حاجز مماثل الجسيمات الفيروسية التي تم ترسيبها مباشرة في الفضاء تحت العنكبوتية من الوصول إلى الحبل الشوكي المناسب وبالتالي يحد من فائدة الفيروس الغدي بقطر 90 نانومتر تقريبًا. على النقيض من ذلك ، أدى الحقن داخل القراب للفيروس الغدي إلى زيادة كبيرة في تعبير مراسل β-galactosidase في الخلايا المحيطة بالفضاء تحت العنكبوتية. لا يُعرف ما إذا كان فيروس أصغر مثل AAV بقطر 20 نانومتر يمكنه اجتياز حاجز الغشاء القاعدي هذا. ينتج عن الحقن المباشر داخل المتني للفيروس الغدي تعبير قوي وموثوق عن الجينات المحورة في النخاع الشوكي المناسب. 52،54

يسمح الاضطراب العابر لـ BBB للعوامل المحقونة بشكل منهجي ، بما في ذلك النواقل الفيروسية للعلاج الجيني ، بدخول حمة الدماغ. تم إثبات أن اضطراب مانيتول مفرط التكاثر في BBB ، والذي تم استخدامه سريريًا لتعزيز دخول عوامل العلاج الكيميائي إلى الدماغ ، يعزز دخول نواقل الفيروس في الجهاز العصبي المركزي أيضًا. 55-57 بدلاً من ذلك ، يمكن نقل الجسيمات الفيروسية إلى الجهاز العصبي المركزي بعد التسليم المحيطي عن طريق نظام النقل المحوري الداخلي ، وبالتالي تجاوز BBB. الدخول الطبيعي للـ HSV في الجهاز العصبي المركزي عبر الألياف العصبية الحسية معروفة بعد الإصابة المحيطية. تم إثبات النقل التجريبي لـ HSV المؤتلف المحقون طرفيًا والفيروس الغدي ، 58،59 وأظهرت دراسة حديثة تأثيرًا مسكنًا طويل الأمد للحقن المحيطي والمنقول مركزيًا HSV المصمم للتعبير عن proenkephalin. في الواقع ، قد يكون النقل الانتقائي وتحويل فيروس الهربس البسيط إلى العقد الحسية المحيطية وخلايا الحبل الشوكي باستخدام آليات النقل المحوري مثاليًا للعلاج الجيني المستهدف والمقيّد تشريحًا للألم.

تبين أن الحقن الفيروسي المباشر في الفضاء تحت العنكبوتية والتعبير عن الببتيد الأفيوني القابل للانتشار يوفران التسكين. على الرغم من أن إنتاج الفيروس والببتيد يقتصر على الفضاء تحت العنكبوتية واستبعاده من الحبل الشوكي السليم ، إلا أن ببتيدات إندورفين التي يتم إنتاجها بسهولة دون عوائق بواسطة الحاجز التشريحي للخلية الدبقية الهامشية وأظهرت انخفاض متوقع لعكس النالوكسون في حساسية الألم. يمكن أن يمتد المفهوم نفسه إلى أهداف مستقبلات غير أفيونية أخرى حيث توجد ناهضات الببتيد أو مضاداته ويوسع من إمكانية العلاج الجيني بوساطة الناقلات الفيروسية للألم من خلال التعبير المباشر تحت العنكبوتية للببتيدات القابلة للانتشار. يلخص الشكل 2 السبل المختلفة لإيصال الفيروس العلاجي.

التين. 2. الطرق المحتملة لإعطاء الفيروس المؤتلف. (1) الحقن المباشر للفيروس (السداسيات) في الفضاء تحت العنكبوتية ، ومع ذلك ، هناك دخول محدود إلى النخاع الشوكي المناسب بسبب حاجز انتشار الخلايا الدبقية الهامشية. (2) الحقن في المحيط وإعادة النقل إلى الجهاز العصبي المركزي (الجهاز العصبي المركزي فعال بشكل خاص لفيروس الهربس البسيط). (3) الحقن في الدماغ مع الرجوع إلى الوراء (أسفل المسار الصاعد) أو الانتقال المتقدم (أسفل المسار الهابط) إلى الحبل الشوكي. (4) الحقن المباشر في النخاع الشوكي. (5) الإعطاء داخل الأوعية الدموية مع اضطراب عابر للحاجز الدموي الدماغي. (6) انتقال الخلايا تحت العنكبوتية مع الانتشار اللاحق للبروتينات الصغيرة (الدوائر الصلبة) في النخاع الشوكي المناسب.

التين. 2. الطرق المحتملة لإعطاء الفيروس المؤتلف. (1) الحقن المباشر للفيروس (السداسيات) في الفضاء تحت العنكبوتية ، ومع ذلك ، هناك دخول محدود إلى الحبل الشوكي المناسب بسبب حاجز انتشار الخلايا الدبقية الهامشية. (2) الحقن في المحيط وإعادة النقل إلى الجهاز العصبي المركزي (الجهاز العصبي المركزي فعال بشكل خاص لفيروس الهربس البسيط). (3) الحقن في الدماغ مع الرجوع إلى الوراء (أسفل المسار الصاعد) أو الانتقال المتقدم (أسفل المسار الهابط) إلى الحبل الشوكي. (4) الحقن المباشر في النخاع الشوكي. (5) الإعطاء داخل الأوعية الدموية مع اضطراب عابر للحاجز الدموي الدماغي. (6) انتقال الخلايا تحت العنكبوتية مع الانتشار اللاحق للبروتينات الصغيرة (الدوائر الصلبة) في النخاع الشوكي المناسب.

هناك مسألتان أخريان تحدان من الفائدة العملية لجميع النواقل الفيروسية المتاحة حاليًا. الأول هو عدم القدرة على استهداف الفيروس لمجموعة فرعية معينة من الخلايا ، والثاني هو الاستجابة المناعية للمضيف. حاليًا ، لا يمكن تحقيق انتقال عدد محدود من الخلايا المستهدفة إلا من خلال توصيل محدد تشريحيًا لناقلات فيروسية. جميع النواقل الفيروسية المتاحة مختلطة ، ويتم نقل جميع الخلايا التي تعبر عن المستقبلات الفيروسية التي تتلامس مع الفيروس. يمكن تحقيق مستوى واحد من الخصوصية من خلال دمج محفز خاص بنوع الخلية في شريط التعبير. يقيد المروجون نسخ الجينات المحورة فقط في الخلايا المختارة التي تنشط المروج. لذلك ، على الرغم من الانتقال الفيروسي السائد للعديد من الخلايا ، يمكن تقييد التعبير عن الجين المحول. تتضمن أمثلة المحفزات الخاصة بالخلايا العصبية المستخدمة بشكل متكرر محفز enolase الخاص بالخلايا العصبية بسعة 1.8 كيلو بايت والذي يوجه التعبير في جميع الخلايا العصبية. 61A 1.1-kb 5′-untranslated area of ​​dopamine β-hydroxylase يوجه التعبير عن الجين المصب في الخلايا العصبية الأدرينالية والنورادرينالية. قد يكون هذا المروج مفيدًا للتعبير المحدد تشريحًا عن مستقبلات α 2 الأدرينالية لتعزيز تثبيط إطلاق الناقل العصبي المشبكي. تم وصف التعبير المنتبذ ولكن الخاص بالخلايا العصبية بواسطة زوج من 500-قاعدي ، مستقبلات من النوع A من حمض أمينوبوتيريك ، محفز α 6-الوحيدات. 63 يمكن أن يقتصر التعبير عن الجينات المحورة على الخلايا العصبية المثبطة باستخدام مثل هذا المحفز. بشكل عام ، يبدو أن 0.5-1 كيلو بايت من التسلسل غير المترجم 5 للعديد من المحفزات كافية لمنح التعبير عن الجينات المحورة ، ولكن التسلسل التنظيمي الأطول 3-4 كيلو بايت ضروري لمنح تعبير خاص بالخلايا العصبية في مناطق محددة تشريحيًا من مخ. يمكن العثور على جدول شامل لمحفزات الجينات العصبية والجينية الدبقية في تقرير هينسون. 64- ومع ذلك ، في المختبر خصوصية المروجين لا تضمن مماثلة في الجسم الحي الخصوصية ، والحذر يجب أن يمارس. يحول الحجم المطلوب للمحفز دون الدمج في معظم النواقل الفيروسية ، لكن تقييد حجم الحمولة النافعة لا يعد قيدًا على الفيروسات الغدية التي لا تحتوي على أمعاء أو أمبليكونات HSV المستندة إلى cosmid. يعد الاختيار المناسب للمحفز أمرًا ضروريًا ليس فقط للتعبير الخاص بالأنسجة عن الجينات المحورة ولكن أيضًا للتعبير طويل المدى عن منتج الجين. يتم تقليل تنظيم المحفزات الفيروسية التأسيسية المستخدمة بشكل متكرر في الجسم الحي ، مما أدى إلى مدة محدودة من التعبير الجيني. 65-67 تنظيم مزيد من التعبير بواسطة يجند خارجي (على سبيل المثال ، المنشطات ، التتراسيكلين ، والراباميسين) ، بالاشتراك مع محفز خاص بالأنسجة سيسمح بالتنظيم الزمني للتعبير الجيني بالإضافة إلى خصوصية الأنسجة. يُعد مثل هذا التنظيم الزمني للتعبير عن منتج الجين المضاد للألم أمرًا مرغوبًا فيه بشكل خاص بسبب الطبيعة العرضية للألم.

هناك طريقة بديلة لتحقيق الخصوصية المستهدفة وهي اقتران الجسيم الفيروسي بببتيد محدد الهدف. تم التعرف على الببتيد القصير الأمثل ذو التقارب العالي للأنسجة المستهدفة (ظهارة مجرى الهواء في هذه الدراسة) عن طريق الغسل الحيوي المتمايز ظهارة مجرى الهواء مقابل مكتبة عرض الملتهمة. تم إقران الببتيد عالي التقارب المختار بيولوجيًا بالجسيم الفيروسي باستخدام جزيء بولي إيثلين جليكول ثنائي الوظيفة. أظهر الفيروس الغدي المقترن بالببتيد الناتج مع القفيصة الفيروسية المعدلة نقلًا فعالًا للخلايا المستهدفة المطلوبة في المختبر . خصوصية الهدف من مثل هذا الفيروس المعدل القفيصة في الجسم الحي غير معروف في هذا الوقت ، ولكن نهج اقتران البولي إيثلين جليكول جذاب من حيث أن الفيروس الذكي يمكن أن يستهدف أي نسيج من خلال تحديد الببتيد المستهدف المحدد.

في وقت مبكر من تطور النواقل الفيروسية ، تم تحديد الاستجابة المناعية للمضيف لإدارة النواقل على أنها قيد أساسي لمزيد من استكشاف النواقل الفيروسية من أجل في الجسم الحي العلاج الجيني. 70 يؤدي تناول النواقل الفيروسية إلى استجابة مناعية للمضيف ، والتي تشمل كلا من المناعة الخلطية والخلطية. 24،70 الاستجابة المناعية للمضيف تحد من صلاحية الخلايا المستهدفة المنقولة فيروسيًا وتحول أيضًا دون الإعطاء المتكرر لنفس الناقل. على الرغم من أن الاستجابة المناعية للمضيف تتطور لمعظم النواقل الفيروسية ، إلا أنها مشكلة بشكل خاص وبالتالي تمت دراستها بدقة أكبر للفيروس الغدي. قد تؤدي إزالة الجينات الفيروسية في عملية تكوين نواقل فيروسية إلى إعاقة آليات المناعة الذاتية التي تبرز مشكلة الاستمناع الفيروسي. 72 يحدث التفاعل الالتهابي الأولي عن طريق دخول الفيروس إلى الخلية. على الرغم من أن الخطوة المحددة في تسلسل الأحداث التي تؤدي إلى استجابة المضيف غير واضحة ، بدءًا من ارتباط الجسيم الفيروسي بمستقبلات coxachie adenoreceptor على سطح الخلية وانتهاءً بالتحلل التحلل للبروتين للجسيم الفيروسي الداخلي ، يبدو أنه يتم التوسط من خلال تنشيط مسار RafM-APK ، مما أدى إلى إطلاق inlterleukin 8. 74 المسببة للالتهابات ، كما أن إنترلوكين 1 متورط في الاستجابة الالتهابية المبكرة بعد حقن الفيروس الغدي في الدماغ. 75

تحدث المرحلة الثانية من الاستجابة المناعية عن طريق التعبير عن البروتينات الفيروسية. على الرغم من نقص النسخ المتماثل ه 1 - تم تصميم الفيروسات الغدية المحذوفة للحد من التعبير عن البروتينات الفيروسية ، والتعبير المنخفض المستوى لهكسون الفيروسي والبنتون (البروتينات التي تشكل القفيصة الفيروسية) ، وبروتينات الألياف (البروتين الذي يشكل نتوءات تشبه الهوائيات من القفيصة) ، وجين متأخر آخر المنتجات تنشط الخلايا اللمفاوية التائية السامة للخلايا. 76 تحد الاستجابة المناعية الخلوية إلى حد كبير من قابلية الخلايا المنقولة بالفيروسات خلال الإدارة الأولية للفيروس. التصميم الأساسي لنواقل MMLV و AAV ، ومؤخرًا ، الفيروس الغدي المعوي ، الخالي أساسًا من جميع الجينات الفيروسية ، يتحايل على المشكلات المرتبطة بالتعبير الأساسي للبروتينات الفيروسية. ينتج عن الاستجابة الخلطية في المرحلة الثالثة للجزيئات الفيروسية التي تم تطهيرها إنتاج الأجسام المضادة المضادة للفيروسات. الاستجابة الخلطية تحد من فعالية إدارة الفيروسات الغدية اللاحقة. تعتبر كل من الاستجابات السامة للخلايا والخلطية للفيروس الغدي تقليدية في طلب تفاعلات مع جزيئات التوافق النسيجي الرئيسية من الصنف الأول والثاني. تم إثبات أن التثبيط المناعي العابر للمضيف مع التناول المتزامن للأجسام المضادة لـ CD4 أو السيكلوفاسفاميد أو FK506 يطيل مدة التعبير الجيني.79-81 الإدارة المتسلسلة للفيروس الغدي للأنماط المصلية المختلفة تتحايل على التثبيط بوساطة المناعة ، مما يشير إلى إمكانية حقيقية لتحقيق تعبير طويل الأمد عن الجينات المحورة. 48

على الرغم من العجز إلى حد ما ، إلا أنه لا يمكن اعتبار النواقل الفيروسية المتاحة حاليًا خالية من المخاطر. بينما نكتسب مزيدًا من التبصر في طبيعة الاستجابة المناعية للمضيف للناقلات الفيروسية ومع تطوير نواقل أفضل ، يجب أن يصبح الإعطاء طويل الأمد والمتكرر للناقلات الفيروسية العلاجية حقيقة واقعة. النواقل الفيروسية المتاحة حاليًا ليست جاهزة للاستخدام في التدخل العلاجي ، ولكن التكنولوجيا جاهزة للدراسات التجريبية والتجارب السريرية البشرية المحدودة. تقدم الفيروسات الغدية غير المعوية وناقلات HSV amplicon القائمة على الكون أكبر وعد نحو تحقيق ناقل فيروسي مثالي للعلاج الجيني البشري.

قليل النوكليوتيدات المضادة للحساسية

مزايا العلاج قليل النوكليوتيد.

الوعد بالعلاج المضاد للحساسية هو القدرة على تثبيط التعبير عن جين معين. تحقق العوامل الدوائية التقليدية مفعولها من خلال البروتينات ، وهي ليست انتقائية تمامًا ، وقد تظهر العديد من الآثار الجانبية ، بما في ذلك تنظيم المستقبلات. 82- لا يمكن للأدوية التقليدية الحالية أن تعمل على بروتينات معينة داخل الخلايا. بسبب خصوصية العلاج المضاد للحساسية ، قد يكون تخليق عقار قليل النوكليوتيد العقلاني وتصميمه أسهل بكثير من العوامل الحالية. يلخص الشكل 3 كيف يمكن أن يتداخل قليل النوكليوتيد مع نشاط الجين الطبيعي ، مما يؤدي إلى انخفاض في تعبير البروتين المستهدف ، وهو ما يسمى ضربة قاضية للبروتين. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الأدوية المضادة للحساسية لمجموعة متنوعة من الاضطرابات. 83 ومع ذلك ، فإن الميزة الأكبر هي المقدار الكبير من الخبرة السريرية مع الأدوية القائمة على قليل النوكليوتيد.

التين. 3. أليغنوكليوتيد مضاد المعنى ومواقع التأثير المحتملة. (أ ) ينتج عن النشاط الجيني الطبيعي (DNA to messenger RNA [mRNA] إلى البروتين) إنتاج بروتين مسبب للنضج يتوسط الألم (اليسار ). يدخل قليل النوكليوتيد الخلية ويهجن إلى هدف mRNA التكميلي. هذا يمنع إنتاج البروتين ، مما يؤدي إلى ضربة قاضية انتقائية للبروتين (حق ). (ب ) قد يعمل قليل النوكليوتيد (قضبان متقطعة أو صلبة قصيرة) في مواقع متعددة بين نسخ الجينات واستهداف البروتين النهائي.

التين. 3. أليغنوكليوتيد مضاد المعنى ومواقع التأثير المحتملة. (أ ) ينتج عن النشاط الجيني الطبيعي (DNA to messenger RNA [mRNA] إلى البروتين) إنتاج بروتين مسبب للنضج يتوسط الألم (اليسار ). يدخل قليل النوكليوتيد الخلية ويهجن إلى هدف mRNA التكميلي. هذا يمنع إنتاج البروتين ، مما يؤدي إلى ضربة قاضية انتقائية للبروتين (حق ). (ب ) قد يعمل قليل النوكليوتيد (قضبان متقطعة أو صلبة قصيرة) في مواقع متعددة بين نسخ الجينات واستهداف البروتين النهائي.

الخبرة التراكمية مع في الجسم الحي حددت دراسات قليل النوكليوتيد على مدى العقد الماضي التوافر البيولوجي الأساسي وخصائص حركية قليل النوكليوتيدات بالإضافة إلى مشاكل السمية غير المتوقعة غير المقنعة. تتم إزالة قليل النوكليوتيدات بكفاءة بواسطة الجهاز الشبكي البطاني عند حقنها في الوريد أو تحت الجلد أو داخل الصفاق. 84 بعد الإعطاء في الوريد ، يُظهر قليل النوكليوتيدات القصيرة الموسومة بالنشاط الإشعاعي نصف عمر توزيع نموذجي (T 1 / 2α) بترتيب 1 ساعة ونصف عمر للتخلص (T 1/2) 40-50 ساعة مستقلة عن التسلسل الفعلي . الطريق الرئيسي للتخلص هو من خلال البول ، على الرغم من أن بعض النكليوتيدات تفرز في البراز. تشير البيانات الحديثة إلى أن قليل النوكليوتيد يُمتص بشكل منهجي بعد تناوله عن طريق الفم ، مما يؤدي إلى إمكانية تناول عقاقير قليلة النوكليوتيد عن طريق الفم. 85- تشمل السمية طويلة المدى للقليل النوكليوتيدات ، ولا سيما مع تعديل الفوسفوروثيوات ، فرط التنسج اللمفاوي المعتمد على الجرعة ولكن القابل للانعكاس ، وتضخم الطحال ، وتسلل أحادي الخلية متعدد الأعضاء. بالإضافة إلى هذه السميات الناتجة عن التحفيز المفترض للجهاز المناعي ، تم الإبلاغ عن إطالة ملف التخثر على الأرجح بسبب تفاعلات محددة بين قليل النوكليوتيد والثرومبين. بشكل عام ، تعد تقارير السمية الجهازية قليلة حتى بعد إعطاء قليل النوكليوتيد لفترات طويلة ، وهناك العديد من المسارات السريرية البشرية التي تحتوي على قليل النوكليوتيد المضاد للحساسية قيد التقدم. 88-90 نجح واحد على الأقل من قليل النوكليوتيد المضاد للدلالة المصمم لعلاج التهاب الشبكية الناجم عن الفيروس المضخم للخلايا (ISIS 2922) في إكمال المرحلة الثالثة من التجارب السريرية بنجاح وتم طرحه للتسويق. خضع قليل النوكليوتيد الآخر المضاد للحساسية الذي يستهدف جين هفوة HIV (GEM 91) لتجارب سريرية بشرية واسعة النطاق من المرحلة الأولى إلى الثانية وتقترب من تجربة المرحلة الثالثة كاملة النطاق (http://www.hybridon.com). يقلل قليل النوكليوتيد المضاد للحساسية من إنتاج البروتين p24 في الخلايا الليمفاوية المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية إلى درجة مماثلة لعقار زيدوفدين المضاد للفيروسات ، وهو المعيار المقبول حاليًا للعلاج بالعقاقير المضادة للفيروسات. 91 ليس هناك شك في أن الإعطاء الجهازي للأوليغنوكليوتيد جيد التحمل لدى البشر عند تناوله بالجرعة المناسبة ، وستدخل هذه الفئة من الأدوية المستهدفة للجينات إلى مستودع الأسلحة السريرية قبل فترة طويلة.

على عكس التجارب السريرية البشرية العديدة لإعطاء قليل النوكليوتيد النظامي ، لا توجد تقارير عن الإدارة المباشرة للجهاز العصبي المركزي من قليل النوكليوتيدات في البشر حتى الآن. لقد تم الاعتراف لبعض الوقت أنه بسبب BBB ، فإن الجهاز العصبي المركزي غير متاح نسبيًا لأوليغنوكليوتيدات بعد طرق الإدارة النظامية. يمكن التحايل على مشكلة الحرائك الدوائية عن طريق الحقن المباشر لأوليغنوكليوتيد داخل الجهاز العصبي المركزي. تم الإبلاغ عن مسارات داخل البطين ، داخل المخ ، وداخل القراب إما عن طريق حقنة واحدة أو عن طريق زرع قسطرة داخل القراب للإعطاء على المدى الطويل في الحيوانات. على عكس الجزيئات الفيروسية ، لا تحد الخلايا الدبقية الهامشية من انتشار قليل النوكليوتيد من الفضاء داخل القراب إلى النخاع الشوكي المناسب. تم استهداف الجينات بنجاح بدليل كيميائي حيوي ووظيفي على ضربة قاضية للبروتين بعد الحقن داخل البطين داخل النسيج أو الحقن البطيني وتشمل مستقبلات الببتيد العصبي Y ، 92brain calcineurin ، 93 ،ن -وحدة فرعية لمستقبل ميثيل- د- أسبارتات NR1 ، 94-97 الدماغ c-fos ، 98،99 و سينثاز أكسيد النيتريك البطاني للدماغ. العديد من أهداف الجهاز العصبي المركزي التي ثبت بالفعل أنها حساسة للعلاج المضاد للحساسية تلعب أيضًا دورًا مهمًا في الألم. لم يلاحظ أي شذوذات سلوكية توحي بسمية جهازية أو غير محددة لإعطاء قليل النوكليوتيد. تم استخدام الطريق داخل القراب لإعطاء قليل النوكليوتيد لاستهداف مستقبلات c-fos و 101μ-opioid و 102δ-opioid receptor و 103 neurokinin-1 receptor و 104 و gene 2 / IP-10 في نموذج تجريبي لالتهاب الدماغ والنخاع التحسسي. 105 في هذه الدراسة Wojcik وآخرون. أبلغت عن شلل في الأطراف الخلفية ونخر في أنسجة الحبل الشوكي بعد التسريب داخل القراب لمادة الفوسفوروثيوات ولكن ليس الفوسفوديستر قليل النوكليوتيدات ، مما يزيد من احتمالية التأثيرات السامة للنيوكليوتيدات المعدلة في العظام الخلفية. ومع ذلك ، لا يمكن استبعاد تفاعل محدد بين الإعطاء الجهازي لبروتين المايلين الأساسي الذي يؤدي إلى التهاب الدماغ التحسسي التجريبي وأوليغنوكليوتيد الفوسفوروثيوات داخل القراب. لم يُظهر العمل في مختبرنا أي سمية علنية في الفئران التي عولجت بأوليغنوكليوتيد الثيولاتيد الذي يستهدف ن -ميثيل- د- وحدة فرعية لمستقبل الأسبارتات NR1. 97

تشير دراسة حديثة عن الحرائك الدوائية للتسريب داخل النسيج المتني للدماغ من أوليغنوكليوتيد 18 مير المسمى بـ 18 مير إلى انتشار واسع للقليل النوكليوتيد في جميع أنحاء الدماغ والسائل الدماغي النخاعي. 106 تلاشى النشاط الإشعاعي بعد التسريب خلال الـ 12 ساعة التالية بدورة زمنية أحادية التكافؤ ، مع ثابت زمني قدره 3 ساعات (تقريبًا من الشكل 5 في تقرير Broaddus وآخرون. 106). لا توجد بيانات قابلة للمقارنة للإعطاء داخل القراب ، ولكن يمكن توقع خواص حركية دوائية مماثلة أو توزيع أسرع وانتشار أكبر بعد إيداع مباشر من قليل النيوكليوتيدات داخل السائل الدماغي النخاعي. الملاحظات التي توثق التغيير الوظيفي الناجح للعديد من المنتجات الجينية المختلفة والخصائص الحركية الدوائية المرغوبة في الجهاز العصبي المركزي مشجعة بشكل خاص عند النظر إلى قليل النوكليوتيد المضاد للحساسية كدواء علاجي محتمل عند البشر. يعتبر الطريق داخل القراب للتسليم كحقنة واحدة أو من خلال قسطرة التسريب في الممارسة السريرية النشطة اليوم لإدارة الجهاز العصبي المركزي لمجموعة متنوعة من الأدوية. الطبيعة غير الباضعة النسبية ، والقدرة على ترسيب قليل النوكليوتيدات مباشرة بالقرب من موقع معالجة مسبب للألم في الحبل الشوكي ، والخبرة السريرية الواسعة مع مسار الإعطاء داخل القراب ، تجعل هذه طريقة جذابة للغاية لتوصيل قليل النوكليوتيد المضاد للحساسية.

على عكس النواقل الفيروسية ، تمتلك أليغنوكليوتيدات مضادات المعنى الحد الأدنى من الخصائص المناعية ، ولا تنتج بروتينات فيروسية سامة ، وهي فعالة في الخلايا غير المنقسمة. 82 بالإضافة إلى ذلك ، لم يتم دمج أليغنوكليوتيدات مضادة المعنى في الحمض النووي الجيني ، وبالتالي القضاء فعليًا على إمكانية حدوث تعديلات جينية. قد تكون المعايرة إلى تأثير بيولوجي حاد ، مثل الشعور بالألم ، أسهل مع قليل النوكليوتيد المضاد للحساسية بسبب مدة تأثيره الأقصر.

معوقات في العلاج المضاد للحساسية.

على الرغم من أن مفهوم تثبيط قليل النوكليوتيد المضاد للحساسية من الحمض النووي الريبي المستهدف يبدو بسيطًا ، إلا أن واقع عزل قليل النوكليوتيد وتطبيقه كان أكثر صعوبة مما كان متوقعًا في الأصل. واجه المحققون العديد من الصعوبات ، بما في ذلك إنتاج الأوليغومرات النشطة ، وخصوصية قليل النوكليوتيدات المضادة للحساسية ، والوصول إلى أليغنوكليوتيدات مضادة المعنى لاستهداف الحمض النووي الريبي ، وحدوث تأثيرات غير متوقعة غير مضادة للحساسية. على الرغم من الوعد بأن القليل من النيوكليوتيدات المضادة للدلالة يمكن أن تستهدف بشكل حصري جينًا واحدًا محددًا لمنع التعبير عن البروتين ذي الصلة ، لم يثبت أحد بالفعل أن أليغنوكليوتيدات مضادة المعنى يمكن أن تقضي على التعبير عن جين واحد. 107

عزل أوليغومر مناسب.

في الوقت الحاضر ، لا توجد مخططات لتوجيه المحقق في توليد أوليغومرات نشطة. العملية الحالية هي في الأساس اختيار عشوائي للأوليغومرات التكميلية (كل منها يتوافق مع مواقع مختلفة) إلى (كدنا) أو مرنا موضع الاهتمام. لكل أوليغومر نشط يتم الحصول عليه ، يجب فحص ما يقرب من سبعة أو ثمانية أوليغومرات. 108 يجب إجراء اختبار فردي لكل أوليغومر نشط لتحديد أوليغومر بأكبر قدر من الخصوصية وأقل تركيز مثبط. 109 على الرغم من عدم معرفة عدد الأوليغومرات النشطة التي يجب فحصها للعثور على واحد نشط للغاية ، اقترح أحد الخبراء أنه سيكون من الأمثل (على الرغم من التكلفة) فحص ما يقرب من 30-40 أوليغومرات نشطة. 108 قد تكون نسبة 3٪ فقط من أليغنوكليوتيدات مضادات الحس فعالة للغاية. 110 ومن ثم ، فإن الطرق الحالية لاختيار قليل القسيمات النشط إلى أقصى حد من مجموعة كبيرة من المرشحين هي عملية تستغرق وقتًا طويلاً للغاية. قد يقلل التصميم العقلاني لأوليغنوكليوتيد فعال مضاد للحساسية من عدد الأوليغومرات التي تحتاج إلى اختبار في المختبر و في الجسم الحي . تتضمن الطرق المحتملة رسم خرائط RNAse H للـ mRNA المستهدف (لتحديد المواقع التي يمكن الوصول إليها للأوليغنوكليوتيدات المضادة للتحسس) ومسح صفيف oligonucleotide التوافقي (لتحديد كل أليغنوكليوتيدات متداخلة محتملة من كل طول حتى طول معين). 111

خصوصية وتمييز قليل النوكليوتيد.

يعد طول قليل القسيمات عاملاً مهمًا في تحديد التعرف على الموقع المستهدف لأوليغنوكليوتيد مضاد المعنى. 108 على الرغم من أنه قد يبدو أن اختيار قليل القسيمات بتسلسل أطول من النيوكليوتيدات من شأنه أن يمنح خصوصية متزايدة لاستهداف الرنا المرسال والتمييز من مواقع أخرى ذات تسلسلات نيوكليوتيد مماثلة ، فإن زيادة طول قليل القسيمات إلى ما بعد 10 نيوكليوتيدات تقريبًا قد يكون له تأثير معاكس لتثبيت ارتباط قليل النوكليوتيد بمضاد التماثل. لتسلسلات غير متطابقة. 107 على سبيل المثال ، قليل القسيمات مع تسلسل من 13-17 نيوكليوتيدات ، والذي من المرجح أن يكون فريدًا ، قد يرتبط ليس فقط باستهداف الحمض النووي الريبي ، ولكن أيضًا الحمض النووي الريبي المتفرج الذي يمتلك واحدًا أو اثنين من عدم تطابق النيوكليوتيدات. بعبارة أخرى ، من المحتمل أن يكون هناك 209 و 12 تطابق بديل لـ 13 نيوكليوتيد مضاد للنيوكليوتيد إذا حدث 2 و 1 ، على التوالي ، عدم تطابق القاعدة. 112 بالإضافة إلى ذلك ، قد لا تؤدي زيادة طول قليل النوكليوتيد المضاد للاندماج إلى زيادة الخصوصية لأن RNAse يتطلب على الأرجح تسلسلًا قصيرًا (7-10 نيوكليوتيدات) لشق خيط RNA لمركب أليغنوكليوتيد مرنا - مضاد المعنى. 112 لسوء الحظ ، فإن استخدام تسلسل أقصر للنيوكليوتيدات سيزيد من احتمالية أن يكون للحمض النووي الريبي غير المستهدف تسلسل أساسي مماثل ويكون مرتبطًا بأوليغنوكليوتيد مضاد المعنى مع الانقسام اللاحق بواسطة RNAse. على الرغم من الحدود النظرية لخصوصية مضادات المعنى والتمييز ، يبدو أن هناك إجماعًا عامًا على أن الطول الأمثل لأوليجومير مضاد المعنى يتراوح بين 18 و 20 قاعدة. 108

الوصول داخل الخلايا وربط قليل النوكليوتيد.

التأثيرات الناتجة عن قليل النوكليوتيد المضاد للحساسية في المختبر قد لا تترجم إلى تأثيرات مماثلة في الجسم الحي ، ناتج جزئيًا عن الحواجز التي تحول دون الوصول داخل الخلايا وربط الحمض النووي الريبي. على عكس الوضع الاصطناعي داخل الخلايا حيث يرتبط قليل النوكليوتيدات المضادة للدلالة بالحمض النووي الريبي المجرد ، يجب أن تنتقل الأوليغنوكليوتيدات المضادة المعنى المستخدمة في المواقف السريرية سليمة إلى الخلية المستهدفة ، والحصول على وصول داخل الخلايا إلى السيتوبلازم والنواة ، وتتوافق مع الحمض النووي الريبي المستهدف وترتبط به بشكل آمن للسماح بالانقسام بواسطة RNAse. يتم امتصاص قليل النوكليوتيدات بسرعة وتوزيعها على نطاق واسع بعد الحقن (على سبيل المثال ، في الوريد ، داخل الأدمة) ومع ذلك ، لم تكن هناك بيانات تشير إلى حدوث اختراق كبير لـ BBB بعد إعطاء قليل النوكليوتيد النظامي. 80 عند إعطائها داخل البطينات أو داخل القراب ، لا يبدو أن قليلات النكليوتيدات المضادة للحساسية ، على عكس النواقل الفيروسية ، تواجه صعوبة في عبور الأغشية القلبية والانتشار في الخلايا العصبية. 113،114 لقد ثبت أن الحقن داخل البطينات لأوليغنوكليوتيد مضاد للحساسية يقلل من تعبير الرنا المرسال داخل الخلايا العصبية وتعبير البروتين. 94115

العوامل التي تحدد الامتصاص الخلوي لأوليغنوكليوتيدات غير واضحة ، ومع ذلك ، يتم توزيع قليل النوكليوتيدات على نطاق واسع داخل الخلايا بمجرد حدوث الامتصاص الخلوي. 83 إذا لم ترتبط أليغنوكليوتيدات ببروتينات غير مستهدفة أو أصبحت محاصرة في الإندوسومات داخل الخلايا أو الجسيمات الحالة ، عندها يكون لديها إمكانية الارتباط بالـ RNA المستهدف ، وهو اقتراح صعب في حد ذاته. 116 ،في الجسم الحي الحمض النووي الريبي عبارة عن بنية معقدة ثلاثية الأبعاد ، وقد لا يمكن الوصول إلى المناطق المستهدفة أو حمايتها بواسطة البروتينات الخلوية أو مجمعات البروتين النووي التي تمنع ارتباط قليل النوكليوتيد المضاد أو الانقسام بوساطة الريبوزيم. وبالتالي ، فإن بنية الحمض النووي الريبي (RNA) هي أحد المحددات الرئيسية للوصول إلى قليل النوكليوتيد المضاد للحساسية والربط النهائي في الجسم الحي . 118,119

تأثيرات غير مضادة للحساسية.

واحدة من أهم المشاكل في استخدام أليغنوكليوتيدات مضادات المعنى هي المجموعة الواسعة من التأثيرات غير المتوقعة غير المضادة للحساسية التي قد تحدث. بسبب طبيعة خصوصية قليل النوكليوتيد (انظر خصوصية وتمييز قليل النوكليوتيد) ، من المرجح أيضًا أن يرتبط قليل النوكليوتيدات المضادة للحساسية بالحمض النووي الريبي غير المستهدف ، مما قد يتسبب في العديد من الآثار الجانبية غير المتوقعة سريريًا ، والتي قد يكون بعضها مفيدًا جدًا في الواقع. 120 بالإضافة إلى ذلك ، مجموعات معينة من النيوكليوتيدات (على سبيل المثال ، أربعة بقايا غوانوزين مستمرة) تمنع تعبير البروتين بطريقة مستقلة عن التسلسل. 121 قد لا يكون المحقق متأكدًا مما إذا كان التأثير المطلوب (في حالة حدوثه) ناتجًا عن تفاعل قليل النوكليوتيد مع الهدف المقصود أو بروتين غير مستهدف. قد تحدث التأثيرات غير المضادة للدلالة من خلال آليات غير متوقعة تمامًا مع توضيح آليات العمل الدقيقة ، وقد يستغرق تحديدها سنوات. 103

تسمم.

قليل النوكليوتيدات قد تظهر سمية مستقلة عن التسلسل ومعتمدة. التأثيرات المستقلة عن التسلسل ، بما في ذلك التحفيز المناعي ، قلة الصفيحات الدموية ، ارتفاع ناقلة أمين الكبد ، تنشيط المكمل ، والإطالة في أوقات التخثر ، قد تكون ناجمة عن الطابع متعدد الأيونات لأوليغنوكليوتيدات الفسفوروثيوات. 122 قد تتفاعل جزيئات الفوسفوروثيوات بشكل غير محدد مع الأهداف الخلوية ، مما يؤدي إلى سمية خلوية واسعة النطاق.

يقال إن السمية المعتمدة على التسلسل تحدث عندما ينتج عن إعطاء أليغنوكليوتيد الفوسفوروثيوات بأطوال مختلفة ملامح سمية متشابهة متفاوتة الشدة. 122 قد تكون سمية الأوليغنوكليوتيدات عاملاً مقيدًا في الاستخدام العلاجي لأوليغنوكليوتيدات المضادة للحساسية كمنحنيات شديدة الانحدار للجرعة والاستجابة ونوافذ علاجية ضيقة (قد يفرق عامل 10 فقط التركيز الذي لا ينتج عنه أي تأثير عن ذلك الذي ينتج عنه تأثير كامل). في الجسم الحي . 107

تفسير البيانات من دراسات قليل النوكليوتيد المضاد للحساسية.

تتمثل إحدى أصعب المشكلات في تفسير البيانات من دراسات قليل النوكليوتيد المضاد للدلالة في تحديد ما إذا كان التأثير المرصود ناتجًا عن التفاعل المضاد الهدف أو الآليات الأخرى غير المستهدفة. كما هو موضح سابقًا ، قد تحدث العديد من التأثيرات غير المضادة للدلالة وتتداخل مع البيانات التي تم الحصول عليها في الجسم الحي . دليل على وجود آلية مضادة للحساسية في المختبر و في الجسم الحي سيتطلب عددًا مناسبًا من الضوابط ، وقياسًا مباشرًا للبروتين المستهدف أو الحمض النووي الريبي ، ومنحنيات الاستجابة للجرعة الكاملة مع فاعلية ترتيب الترتيب من النظائر وعدم التطابق ، ونقص التأثير على المنتجات الجينية وجينات التدبير المنزلي وثيقة الصلة ، وشرح التأثيرات غير المتوقعة الناتجة عن التحكم قليل النوكليوتيدات. لا يزال مجال تطوير العقاقير المضادة للدلالة في مهده ، وستزيد الإرشادات التجريبية المقترحة من معرفة الحرائك الدوائية والصيدلانية والسمية لاستخدام أليغنوكليوتيدات مضادات المعنى في نهاية المطاف للأغراض العلاجية. 108،121،123


تطبيق المصادقة

يجب أن يكون لدى المختبر الذي يطبق اختبارًا محددًا أدلة موثقة على أن الطريقة قد تم التحقق منها بشكل مناسب. تظل المسؤولية على عاتق المستخدم للتأكد من توثيق المصادقة لتلبية متطلبات الطريقة المحددة. إذا تم استخدام الطرق القياسية (الجمعية الأمريكية للاختبار والمواد ، المنظمة الدولية للتوحيد القياسي ، دستور الأدوية الأوروبي والأمريكي) ، فيجب التحقق من أن نطاق الطريقة وبيانات التحقق من الصحة ، على سبيل المثال مصفوفة العينة والخطية والمدى وحدود الكشف ، يتوافق مع متطلبات التحليل المختبري. خلاف ذلك ، يجب إعادة التحقق من صحة الطريقة القياسية باستخدام معايير المختبر الخاصة. يجب أن يثبت المختبر صحة الطريقة في بيئة المختبر. يوصى بالتحقق الكامل من الطريقة القياسية حيث لا يمكن العثور على معلومات عن نوع ونتائج التحقق في وثائق الطريقة القياسية. لا توجد إرشادات رسمية بشأن تسلسل تجارب التحقق من الصحة ويمكن أن يعتمد التسلسل الأمثل على الطريقة نفسها.

في هذا الفصل ، نقدم لمحة عامة عن المعلمات الحرجة الموصى بتضمينها كجزء من حزمة التحقق من اختبارات PCR و ELISPOT و Microarray و LAL ، والتي تم اختيارها باعتبارها أمثلة تمثيلية للمقايسات البيولوجية الجزيئية والمناعية والميكروبيولوجية المستخدمة في تحليل وتطوير منتجات العلاج الجيني واللقاحات.

فحوصات PCR

يجب دراسة الأنسجة المستهدفة والمثابرة والتطهير (التوزيع الحيوي) للمنتج قيد البحث كجزء من دراسات السلامة قبل السريرية. بالنسبة لمنتجات العلاج الجيني ، يمكن دراسة التوزيع الحيوي عن طريق فحص الأنسجة لتسلسل الحمض النووي العلاجي باستخدام منهجية تفاعل البوليميراز المتسلسل.

تقنية PCR 7 ، 8 تمكن محدد في المختبر تضخيم مقاطع DNA و RNA (RT-PCR). يتم تغيير طبيعة قالب DNA مزدوج الشريطة إلى DNA أحادي السلسلة ، وبعد ذلك يتم ربط اثنين من البادئات قليلة النوكليوتيد الاصطناعية ذات التوجهات المختلفة بالتسلسلات التكميلية في قالب DNA. يتم تضخيم المناطق القصيرة المزدوجة التي تقطعت بها السبل ، والمحدودة بواسطة الاشعال ، بواسطة بوليميراز الحمض النووي المستقر للحرارة. من خلال تكرار خطوات التمسخ - التلدين - الاستطالة هذه حتى 30-40 مرة ، يمكن تضخيم ملايين النسخ من التسلسل المحدد في أقل من نسخة واحدة من التسلسل المستهدف.

نظرًا لحساسيته العالية ، يكون اختبار PCR عرضة للتلوث المتبادل والنتائج الإيجابية الخاطئة ما لم يتم أخذ الاحتياطات المناسبة في الاعتبار مثل تقسيم العمل في مناطق منفصلة اعتمادًا على خطوة التحليل ، واستخدام الملابس الواقية ، والماصات المنفصلة وأطراف التصفية بالإضافة إلى استخدام اليوراسيل-نأمبليكونات حساسة للجليكوزيلاز لمنع التلوث المرحل. 9 يجب استخدام الضوابط السلبية وما يسمى بالضوابط الخافرة ، والتي تحاكي العينة ، للتحكم في التلوث. قد تساعد الإجراءات الموحدة الموضوعة لمنع التلوث في إثبات خصوصية الفحص وموثوقيته.

أخذ العينات هو أول قضية حاسمة لتحليل PCR. على سبيل المثال ، قد تكون بيئة جمع العينات وترتيب جمع العينات أمرًا بالغ الأهمية ، على سبيل المثال ، في دراسات التوزيع الحيوي ، حيث يتم حقن الحيوانات بمنتج DNA البلازميد ، يكون خطر التلوث المتبادل مرتفعًا. كما أن بعض مضادات التخثر ، مثل الهيبارين ، المستخدمة لتجميع الدم قد تثبط تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل. تتطلب العينات البيولوجية المدرجة في تحليل PCR أن نموذج PCR يحتاج إلى استخراج وتنقية قبل التحليل. يجب إثبات كفاءة واستنساخ إجراءات الاستخراج والتنقية في دراسات التصاعد حيث يتم شد العينات قبل الاستخراج وبعده.

نظرًا لأن خصوصية طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل تعتمد على اختيار وجودة البادئات والتحقيقات ، وكذلك على ظروف التفاعل والكشف ، يجب تبرير الأساس المنطقي لاختيار التمهيدي وتسلسل المسبار بعناية. من المهم أن تكون على دراية بالمواد المتداخلة ومثبطات PCR ، مثل تلك الموجودة في مصفوفة العينة أو غيرها من منتجات DNA البلازميد ، والتي يتم التعامل معها في نفس المختبر وقد تسبب خطر التلوث المتبادل. طريقة القياس الكمي والكيمياء (على سبيل المثال SYBR Green عكس يجب اختيار مجسات الفلورسنت) بالإضافة إلى معايير القياس بعناية للحصول على تقدير كمي محدد ودقيق. يجب أن تتمتع هذه المعايير بنفس كفاءة التضخيم مثل عينات الدراسة. يجب تنفيذ الضوابط الإيجابية في كل تشغيل PCR لمتابعة أداء الفحص.

يمكن إثبات خصوصية اختبار PCR من خلال تقييم منتج PCR الناتج عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام ، وبالتالي التأكد من أن amplicon بالحجم المتوقع أو عن طريق تحليلات منحنى الذوبان ، وكذلك من خلال تحليل القوالب المختلفة ، والتي يمكن أن تكون موجودة في تفاعل PCR كملوث أو مصفوفة عينة ، مثل الحمض النووي الصبغي. يجب إثبات خطية الفحص في جميع أنحاء النطاق المقصود ويجب تمثيل نقطة العبور (أو تركيز العينة) كدالة لنسبة التألق / التألق التي تم الحصول عليها. يمكن استنتاج الدقة بمجرد إثبات الخطية والدقة من التشغيل إلى التشغيل وبين العديد من المشغلين.

عادةً ما يتم اختبار LOD (أو القطع الإيجابي) و LOQ لمقايسة PCR بشكل تجريبي من خلال تحليل العديد من التخفيفات المكررة للقالب المستهدف ويتم تمثيلها بعدد من التسلسلات المستهدفة لكل كمية عينة. يمكن تحديد LOD على أنه التركيز ، والذي يمكن اكتشافه في 95٪ من الأشواط ، و LOQ ، على التوالي ، الحد الأدنى لعدد التسلسلات المستهدفة التي يمكن اكتشافها وتحديدها كميًا في جميع عمليات التشغيل. تشمل المعلمات ، التي تؤثر على LOD و LOQ لمقايسة PCR ، توزيع التسلسل المستهدف في العينة وأداء الاختبار ، على سبيل المثال ، التكرار ، وأخطاء الماصات ، وجودة الكواشف ، وتجانس شروط التفاعل والتوزيع من خليط التفاعل في أنبوب PCR (البقع).

فحص ELISPOT

غالبًا ما تُستخدم مقايسات ELISPOT 10 و 11 لقياس استجابات الخلايا التائية في دراسات مناعة وفعالية لقاح مختلفة. يتم تحفيز الخلايا التائية المعزولة من الدم باستخدام مستضدات مختلفة من أجل تحفيز تخليق و / أو إفراز السيتوكين ، مثل IFN-، والذي يستخدم بشكل خاص في مراقبة CTL الخاص بـ CD8 أو CD4 الخاص بالـ CD4.1 استجابات. 12 ، 13 ، 14 يتم بعد ذلك ربط IFN-الناتج بغشاء صلب ، مغطى بجسم مضاد أحادي النسيلة محدد. ثم يتم الكشف عن IFN-المرتبط باستخدام تقنية مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). 15 تم الكشف عن خلايا إفراز IFN-γ كبقع ملونة على الغشاء ، كل بقعة تمثل خلية واحدة تنتج IFN-، وعدد البقع يتناسب مع قوة الاستجابة المناعية. فحوصات ELISPOT الأخرى لـ IL-2 (Th1 الاستجابة) ، IL-4 (Th2 الاستجابة) أو Perforin (استجابة سامة للخلايا مباشرة) متاحة أيضًا وقيد الاستخدام.

على الرغم من أن طريقة ELISPOT توفر قياسًا كميًا للبقع والاستجابة المناعية ، فإن القياس الكمي يختلف تمامًا عن المنحنى القياسي التقليدي باستخدام المقايسات. ELISPOT هو اختبار بيولوجي نموذجي يقيس استجابات الخلايا الحية في المختبر. لذلك ، تحدد العينة بالفعل متطلبات محددة ، والتي يجب تحسينها وفقًا لذلك.

يتم تحليل العينات المأخوذة من أفراد مختلفين لديهم نقاط قوة مختلفة في الاستجابة المناعية. في فترات زمنية مختلفة من حصاد الدم ، يمكن للفرد نفسه أن يستجيب بشكل مختلف. يجب توخي الحذر بشكل خاص في تقييم نتائج الأفراد الذين يعانون من اضطرابات مناعية مختلفة مثل المرضى المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية الذين قد يختلف تكوين الخلايا التائية بسبب العلاج وتقدم العدوى. على سبيل المثال ، سميث وآخرون أظهر الشكل 13 أن استنفاد خلايا CD4 أدى إلى فقدان الإشارة مع بعض الميثوجينات في مقايسة IFN-γ ELISPOT. يتطلب التعامل مع عينات الدم والخلايا الحية عناية خاصة فيما يتعلق بوقت التخزين وظروفه ، والتي تعتبر حاسمة لأداء الفحص. الفاصل الزمني من حصاد الدم حتى فصل PBMC له تأثير كبير على حيوية الخلية وأداء الفحص. يجب توحيد إجراءات زراعة الخلايا وتحسينها فيما يتعلق بكمية البداية للخلايا القابلة للحياة والكواشف وأوقات الحضانة بالإضافة إلى معايرة وتكوين المستضدات والببتيدات المستخدمة لتحفيز الخلايا. لتحقيق أفضل نسبة إشارة إلى ضوضاء ، يجب تحسين خطوات التقاط الجسم المضاد واكتشافه بما في ذلك جميع خطوات الغسيل (كفاءة الغسيل اليدوي عكس غسالة أوتوماتيكية) ، وكمية الطلاء والكشف عن الأجسام المضادة ، وكذلك أوقات وظروف الحضانة. يجب أن يحتوي كل اختبار على عناصر تحكم سلبية وإيجابية (مثل PHA ، ذوفان الكزاز ، FEC) لإثبات صلاحية الفحص. يجب أن توجد ضوابط إيجابية للتحفيز وكذلك لالتقاط / الكشف عن الأجسام المضادة (ELISA).

يجب إثبات متانة معالجة العينة وتخزينها ، حيث إنها المعلمة الأولى والأكثر أهمية التي تؤثر على أداء الفحص وموثوقية النتائج. يجب تقييم تأثير ظروف التخزين (بما في ذلك حاوية العينة) ودورة التجميد والذوبان وأوقات التخزين المختلفة. يجب إثبات الخطية للمقايسة من خلال دراسة الاستجابة كدالة للخلايا القابلة للحياة المستخدمة في التحفيز. التباين في كل خطوة من خطوات الإجراء التحليلي ، وفصل PBMC ، وثقافة الخلية ، و ELISA وخطوات عد البقعة (أيضًا الإنسان عكس يجب تقييم عدد أجهزة الكمبيوتر عند استخدامها) بشكل منفصل. يمكن أن يوفر تقييم التباين في الاستجابة التي تم الحصول عليها من عينات الدم التي تم جمعها من نفس الفرد في نقاط زمنية مختلفة معلومات قيمة حول التباين المحتمل الذي تسببه العينة. يتم تحديد حد القياس الكمي من خلال تحديد أقل استجابة ، والتي يمكن تحديدها كميا بشكل موثوق كخلايا تشكيل البقعة (SPC). يجب على المرء أيضًا وضع حدود للاستجابة ، والتي يتم تفسيرها على أنها نتيجة "إيجابية" أو نتيجة مهمة عند تقييم فاعلية أو كفاءة "منتج صيدلاني".

تحليل التعبير الجيني

تعتمد وظيفة منتجات العلاج الجيني على التعبير عن الجين العلاجي واستهدافه. توجد عدة طرق لتحليل التعبير الجيني في الجسم الحي و في المختبر مثل ELISA و 15 Northern 16 و Western blot و 17 RT-PCR 8 و DNA Microarrays. 18 غالبًا ما يتم دراسة كفاءة التعبير والأنسجة المستهدفة إما مع نواقل تحتوي على جين يشفر بروتينًا فلوريًا ، مثل لوسيفيراز 19 و / أو بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ، 20 ، 21 مع الجين العلاجي أو استبداله.

في مقايسات ELISA و Western blot ، عادةً ما يتم تحليل البروتين المعبر مباشرةً من عينات المصل أو الأنسجة ، بينما في اللطخة الشمالية و RT-PCR و Microarrays يسبق التحليل استخراج mRNA (أو الحمض النووي الريبي الكلي) من الأنسجة الحيوانية. في فحوصات البروتين الفلوري ، يتم الكشف عن الإشارة عادة من الفورمالين الثابت ، والأنسجة المضمنة بالبارافين أو مقتطفات الأنسجة. يجب أن تؤخذ في الاعتبار المبادئ المتعلقة بمناولة وتخزين العينات البيولوجية. أصبحت المصفوفات الدقيقة ، كطريقة قوية لفحص التعبير الجيني ، مؤخرًا أداة شائعة جدًا بين الباحثين.

يمكن اعتبار المصفوفة الدقيقة بمثابة اختبار لطخة جنوبية مكررة ، والتي تتضمن خطوة PCR ، حيث يتم الحصول على مسبار cDNA إما عن طريق استنساخ التسلسل المطلوب في الخلايا البكتيرية ، وبعد ذلك يتم تضخيم الجين المعني وتنقيته في PCR أو عن طريق التوليد من cDNA تجاري مكتبة ومقترنة على المرحلة الصلبة. يتم أيضًا تضخيم العينة المستخرجة من الرنا المرسال باستخدام RT-PCR للجين المعني ويتم تمييزها بعلامة الفلورسنت ، والتي يتم تهجينها بعد ذلك باستخدام مسبار (كدنا) الثابت واكتشافها باستخدام قارئ ليزر. من خلال مقارنة شدة إشارات العينة التجريبية والعينة الضابطة أو باستخدام تسميات مختلفة للعينة والمجموعة الضابطة ، يمكن ملاحظة ما إذا كان الجين المعني قد تم تنظيمه أو تغييره أو عدم تغييره أو غيابه. بدلاً من استخدام مجسات (كدنا) كمصائد ، فإن المنصات التي تطبق إما قصيرة (25 نقطة أساس) أو طويلة (∼ 40-80 نقطة أساس) تحقيقات قليلة النوكليوتيد المركبة تكون أكثر ملاءمة للاستخدام. 22

سواء تم اختيار النظام الأساسي ، فإن الاختلاف البيولوجي بين الأفراد ومجموعات الجينات المستهدفة المختلفة قد يتسبب في تباين في نتائج المصفوفة وبالتالي قد يعيق تفسيرهم خاصة في الحالات التي يصعب فيها تحديد سبب الاختلاف على أنه إما بسبب أسباب تقنية أو تباين بيولوجي طبيعي أو نتيجة حقيقية. لذلك ، يجب إثبات التكرار من مجموعة إلى مجموعة في كل من الاختلاف البيولوجي والتقني ويجب تأكيد دقة النتائج من خلال مقارنتها بمنهجيات أخرى مثل اللطخة الشمالية أو RT-PCR. كما هو الحال في فحوصات التهجين التقليدية ، فإن الخطوات الحاسمة التي تسبب الاختلاف التقني هي التهجين (على سبيل المثال نسبة المجسات ونسبة العينة / التحكم ونقاء عينة الحمض النووي الريبي) ، وكفاءة تضخيم (كدنا) ووضع العلامات والغسيل والقراءة. يجب استخدام الضوابط الإيجابية والسلبية للتحكم في جودة العينة والأداء الفني للمصفوفة. يجب إيلاء اهتمام خاص لاختيار الجينات أو البرامج المستخدمة لتطبيع البيانات الخام وكذلك على الطريقة الإحصائية المستخدمة لتقييم البيانات. تم إنشاء جمعية دولية ، Microarray Gene Expression Data (MGED) ، لمساعدة جميع علماء المصفوفات الدقيقة في الحصول على بيانات موثوقة ومقارنتها من خلال استهداف وضع معايير لتعليقات البيانات بالإضافة إلى قاعدة بيانات مشتركة ، والتي تتيح مشاركة البيانات في مجال الجينوميات الوظيفية والبروتيوميات. نتيجة لذلك ، تم تعيين متطلبات الحد الأدنى من المعلومات حول تجربة المصفوفة الدقيقة (MIAME) لتسهيل تفسير نتائج ميكروأري 23 ويوصى باتباعها عند تصميم مصفوفة جديدة.

اختبر LAL طريقة Gel-Clot

كمثال للاختبار الميكروبيولوجي ، نناقش اختبار Limulus Amebocyte Lysate (LAL) ، والذي يستخدم لتحديد الذيفان الداخلي البكتيري. من بين الاختبارات الميكروبيولوجية الأخرى ، على سبيل المثال اختبار العقم ، والميكوبلازما ، والفيروسات العرضية ، والاختبارات ذات الصلة بتكرار الفيروسات ، فإن تحديد مستوى الذيفان الداخلي البكتيري داخل منتج ما ينتمي إلى تحليلات السلامة الهامة التي تتطلبها السلطات التنظيمية ليتم تضمينها كجزء من مجموعة الاختبارات المستخدمة لإصدار المنتج النهائي. مقارنةً باختبار البيروجين التقليدي ، الذي يستخدم الأرانب كنموذج حيواني ، 24 ، 25 فإن LAL أكثر ملاءمة أيضًا للأداء من وجهة النظر الأخلاقية.

يستخدم الاختبار LAL يمثل الدم ، والذي يتم استخراجه من سلطعون حدوة الحصان (ليمولوس بوليفيموسور, Tachypleus tridentatus). عندما يتم تحضينها بالمحلول ، فإن الذيفان الداخلي الموجود في العينة يؤدي إلى مسار تفاعل إنزيمي ، مما يؤدي إلى تنشيط تجلط الدم lysate ، وفي النهاية تكوين هلام أبيض ثابت. إذا لم يتم تشكيل الجل ، فإن العينة تحتوي على كمية أقل من الذيفان الداخلي كما تم تحديده لحساسية المحللة. عندما يتم الحصول على نتائج إيجابية ، يتم تحديد الكمية الفعلية من الذيفان الداخلي الموجود في العينة عن طريق تحليل التخفيفات التسلسلية للعينة. 26 ، 27

تمت الموافقة على LAL في دستور الأدوية الأوروبي 27 والأمريكي 26 كطريقة قياسية ، والتي تصف أيضًا جزء التحقق من الصحة. الأجزاء الأكثر أهمية التي يجب التحقق من صحتها لمقايسة LAL هي العوامل المتداخلة ، والتي يوصى بتقييمها لكل نوع جديد من مواد العينة المستخدمة في الاختبار ، والحد الأقصى للتخفيف الصالح (MVD) الذي يجب استخدامه لكل عينة معينة . يجب إزالة العوامل المسببة للتداخل على سبيل المثال عن طريق التخفيف أو الترشيح أو التحييد أو التسخين. على سبيل المثال ، من المعروف أن الحمض النووي بتركيزات عالية يعزز التفاعل في طريقة Gel-Clot وبالتالي يتسبب في نتائج إيجابية خاطئة. لذلك ، يجب اختبار التركيز الذي لا يحدث عنده التحسين بشكل تجريبي عن طريق اختبار التخفيفات المختلفة للعينة.


مراجع

مكدول ، ك وآخرون. في التصوير وإعادة بناء تطور الفأر بعد الزرع على مستوى الخلية المفردة. زنزانة 175, 859–876 (2018).

ماكينا ، إيه وآخرون. تتبع سلالة الكائن الحي بالكامل عن طريق تحرير الجينوم التوافقي والتراكمي. علم 353، aaf7907 (2016).

Perli، S. D.، Cui، C.H & amp Lu، T.K. التسجيل الجيني المستمر باستخدام تقنية CRISPR-Cas ذاتية الاستهداف في الخلايا البشرية. علم 353، aag0511 (2016).

Kalhor، R.، Mali، P. & amp Church، G.M. نات. أساليب 14, 195–200 (2017).

فريدا ، ك.ل وآخرون. تسجيل اصطناعي وقراءات في الموقع لمعلومات النسب في خلايا مفردة. طبيعة سجية 541, 107–111 (2017).

شميت ، S. T. ، Zimmerman ، S.M ، Wang ، J. ، Kim ، S.K & amp Quake ، S. R. موالفة ACS. بيول. 6, 936–942 (2017).

Sheth، R. U.، Yim، S. S.، Wu، F.L & amp Wang، H.H. تسجيل متعدد للأحداث الخلوية بمرور الوقت على شريط CRISPR البيولوجي. علم 358, 1457–1461 (2017).

Tang، W. & amp Liu، D. R. التسجيل التناظري متعدد الأحداث القابل لإعادة الكتابة في الخلايا البكتيرية والثديية. علم 360، eaap8992 (2018).

Shipman ، S. L. ، Nivala ، J. ، Macklis ، J.D & amp Church ، G.M CRISPR-Cas ترميز فيلم رقمي في جينومات مجموعة من البكتيريا الحية. طبيعة سجية 547, 345–349 (2017).

Shipman ، S.L ، Nivala ، J. ، Macklis ، J.D & amp Church ، G.M Molecular التسجيلات عن طريق الحصول على مباعد CRISPR الموجه. علم 353، aaf1175 (2016).

كالهور ، آر وآخرون. الترميز التنموي للماوس كله عبر توجيه CRISPR. علم 361، eaat9804 (2018).

راج ، ب. وآخرون. التنميط المتزامن للخلية الواحدة للأنساب وأنواع الخلايا في دماغ الفقاريات. نات. التكنولوجيا الحيوية. 36, 442–450 (2018).

سبانجارد ، ب. وآخرون. تتبع النسب المتزامن وتحديد نوع الخلية باستخدام الندبات الجينية التي يسببها كريسبر-كاس 9. نات. التكنولوجيا الحيوية. 36, 469–473 (2018).

Sheth ، R. U. & amp Wang ، H. H. أجهزة الذاكرة القائمة على الحمض النووي لتسجيل الأحداث الخلوية. نات. القس جينيه. 19, 718–732 (2018).

هوانج ، ب. وآخرون. تتبع النسب باستخدام نظام التشفير الشريطي Cas9-deaminase الذي يستهدف عناصر L1 الذاتية. نات. كومون. 10, 1234 (2019).

تشان ، إم إم وآخرون. التسجيل الجزيئي للتكوين الجنيني للثدييات. طبيعة سجية 570, 77–82 (2019).

Bowling، S. et al. خط فأرة CRISPR-Cas9 مصمم هندسيًا لقراءة متزامنة لتواريخ النسب ومظاهر التعبير الجيني في الخلايا المفردة. زنزانة 181, 1410–1422 (2020).

Alemany، A.، Florescu، M.، Baron، C. S.، Peterson-Maduro، J. & amp van Oudenaarden، A. تتبع استنساخ الكائن الحي بالكامل باستخدام التسلسل أحادي الخلية. طبيعة سجية 556, 108–112 (2018).

Landau ، N.R ، Schatz ، D.G ، Rosa ، M. & amp Baltimore ، D. مول. خلية بيول. 7, 3237–3243 (1987).

بريور ، ج.م وآخرون. يتيح دمج الريبونوكليوتيدات إصلاح تكسر الكروموسومات عن طريق الانضمام إلى طرف غير متماثل. علم 361, 1126–1129 (2018).

Wang، T.، Wei، J. J.، Sabatini، D. M. & amp Lander، E. S. شاشات وراثية في الخلايا البشرية باستخدام نظام CRISPR-Cas9. علم 343, 80–84 (2013).

جينك ، م وآخرون. نوكلياز DNA داخلي قابل للبرمجة مزدوج RNA موجه في المناعة البكتيرية التكيفية. علم 337, 816–821 (2012).

Zuo، Z. & amp Liu، J. Cas9-catalyzed DNA انشقاق يولد نهايات متداخلة: دليل من محاكاة الديناميات الجزيئية. علوم. اعادة عد. 6, 37584 (2016).

جيزلر ، إس وآخرون. يكشف استهداف Cas9 المتعدد عن تأثيرات الموقع الجينومي وفواصل متداخلة قائمة على gRNA تؤثر على كفاءة الطفرات. نات. كومون. 10, 1598 (2019).

شانون ، سي إي. نظرية رياضية للاتصال. بيل سيست. تقنية. ج. 27, 379–423 (1948).

Motea ، E.A & amp Berdis ، A. J. Terminal deoxynucleotidyl transferase: قصة بوليميريز DNA مضلل. بيوكيم. بيوفيز. اكتا 1804, 1151–1166 (2010).

ليو ، إم وآخرون. الاكتشاف الجيني لعوازل الكروماتين القوية للعلاج الجيني البشري. نات. التكنولوجيا الحيوية. 33, 198–203 (2015).

العوامل المحفزة بنقص الأكسجة في علم وظائف الأعضاء والطب. زنزانة 148, 399–408 (2012).

رانكين ، إي ب.& amp Giaccia ، A. J. السيطرة على نقص الأكسجة في ورم خبيث. علم 352, 175–180 (2016).

Ede ، C. ، Chen ، X. ، Lin ، M.-Y. & amp Chen، Y. Y. تتيح التحليلات الكمية للمروجين الأساسيين هندسة دقيقة للتعبير الجيني المنظم في خلايا الثدييات. موالفة ACS. بيول. 5, 395–404 (2016).

McKenna، A. & amp Gagnon، J. A. تطوير التسجيل باستخدام تتبع ديناميكي للخلية الواحدة. تطوير 146، dev169730 (2019).

Fu، Y.، Sander، J.D، Reyon، D.، Cascio، V.M & amp Joung، J.K. نات. التكنولوجيا الحيوية. 32, 279–284 (2014).

بالوك ، إس وآخرون. تخليق الحمض النووي De novo باستخدام اتحادات البلمرة والنيوكليوتيدات. نات. التكنولوجيا الحيوية. 36, 645–650 (2018).

Barthel، S.، Palluk، S.، Hillson، N.J، Keasling، J.D & amp Arlow، D.H. الجينات 11, 102 (2020).

Lee ، H. H. ، Kalhor ، R. ، Goela ، N. ، Bolot ، J. & amp Church ، G. M. نات. كومون. 10, 2383 (2019).

زامفت ، ب.م وآخرون. قياس المناظر الطبيعية التي تعتمد على الكاتيونات بوليميريز الحمض النووي عن طريق التسلسل العميق. بلوس واحد 7، e43876 (2012).

ماربيلستون ، إيه إتش وآخرون. المبادئ الفيزيائية للتسجيل العصبي القابل للتطوير. أمام. حاسوب. نيوروسسي. 7, 137 (2013).

جلاسر ، ج. آي وآخرون. التحليل الإحصائي لتسجيل الإشارات الجزيئية. PLoS Comput. بيول. 9، e1003145 (2013).

بهان ، إن جيه وآخرون. تسجيل البيانات الزمنية على الحمض النووي بدقة دقيقة. ما قبل الطباعة في bioRxiv https://doi.org/10.1101/634790 (2019).

مالي ، ب وآخرون. هندسة الجينوم البشري الموجهة RNA عبر Cas9. علم 339, 823–826 (2013).

كومور ، إيه سي ، كيم ، واي بي ، باكر ، إم إس ، زوريس ، جيه إيه ، أمبير ليو ، دي آر تحرير قابل للبرمجة لقاعدة مستهدفة في الحمض النووي الجيني دون انقسام الحمض النووي المزدوج الشريطة. طبيعة سجية 533, 420–424 (2016).

يتعاون كل من Yan، Q.، Bartz، S.، Mao، M.، Li، L. & amp Kaelin، W.G. مول. خلية بيول. 27, 2092–2102 (2007).

كامبو ، إي وآخرون. نظام فيروسي متعدد الاستخدامات للتعبير عن البروتينات واستنفادها في خلايا الثدييات. بلوس واحد 4، e6529 (2009).

تساي ، س. كيو وآخرون. نوكليازات FokI الموجه بواسطة كريسبر كريسبر ديميريك لتحرير الجينوم عالي التحديد. نات. التكنولوجيا الحيوية. 32, 569–576 (2014).

والدو ، جي إس ، ستانديش ، بي إم ، بيرندزن ، جيه ، وأمبير تيرويليجر ، تي سي المقايسة السريعة لطي البروتين باستخدام بروتين الفلوريسنت الأخضر. نات. التكنولوجيا الحيوية. 17, 691–695 (1999).

Yang ، B. ، Gathy ، K.N & amp Coleman ، M.S. J. بيول. تشيم. 269, 11859–11868 (1994).

Repasky ، J.A E. ، Corbett ، E. ، Boboila ، C. & amp Schatz ، D.G. J. إمونول. 172, 5478–5488 (2004).

Lee ، M. E. ، DeLoache ، W. C. ، Cervantes ، B. & amp Dueber ، J.E مجموعة أدوات خميرة عالية الجودة للتجميع المعياري متعدد الأجزاء. موالفة ACS. بيول. 4, 975–986 (2015).

Chen، S. et al. شاشة CRISPR على مستوى الجينوم في نموذج فأر لنمو الورم ورم خبيث. زنزانة 160, 1246–1260 (2015).

Tanida-Miyake، E.، Koike، M.، Uchiyama، Y.، Tanida، I. & amp Sato، M. يزيد تحسين mNeonGreen لـ Homo sapiens من شدة الفلورسنت في خلايا الثدييات. بلوس واحد 13، e0191108 (2018).

كلاينستيفر ، ب. وآخرون. نوكلياز CRISPR – Cas9 المصمم هندسيًا مع تغيير خصائص PAM. طبيعة سجية 523, 481–485 (2015).

Zhang، J.، Kobert، K.، Flouri، T. & amp Stamatakis، A. PEAR: دمج إعادة دمج Illumina Paired-End سريع ودقيق. المعلوماتية الحيوية 30, 614–620 (2013).


البوليمرات في علم الأحياء والطب

9.02.1 مقدمة

الأحماض النووية هي واحدة من أربع فئات رئيسية من الجزيئات الكبيرة الموجودة في الكائنات الحية ، والبروتينات ، والجليكوزيدات ، والدهون. في حين أن أكواد الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA) للمعلومات الجينية (والتخلقية اللاجينية) توفر في النهاية الخصائص الفيزيائية للكائن الحي ، RNA ، الذي كان يُعتقد في البداية أنه يعمل ببساطة كوسيط في نقل المعلومات الجينية الموجودة في DNA إلى الريبوسوم لتخليق البروتين ، يبدو أنه يلعب أدوارًا أكثر ديناميكية تتضمن جوانب التحفيز والتنظيم. بينما يبدو أن الطبيعة قد احتفظت بتخزين المعلومات ونقلها كدور أساسي للأحماض النووية في الخلية ، خارج الخلية ، فإنها تلعب أدوارًا متنوعة ومتعددة الوظائف بشكل متزايد. هذه الوظائف هي نتاج للعديد من الاكتشافات الأساسية التي ترتبط بالخصائص البوليمرية الفريدة للأحماض النووية ، وظهور طرق البيولوجيا الكيميائية والجزيئية التي مكنت الباحثين من توليف واشتقاق ، وفي النهاية إنشاء كيانات جديدة تمامًا ذات كيانات غير عادية وغير طبيعية الخواص الكيميائية.

تلبي كيانات الأحماض النووية الجديدة هذه الاحتياجات العملية والتحديات الفكرية التي لا يمكن تلبيتها بسهولة عن طريق الأحماض النووية أو البروتينات التي تحدث بشكل طبيعي ، وبالتالي قد تكون محفزات أو أجهزة استشعار أو حتى أدوية. في حين أنها تحتفظ على مستوى العالم بالعمود الفقري للحمض النووي البوليمري وبالتالي لا تزال تشبه الأحماض النووية ، فقد تم تزويدها بوظائف إضافية مميزة للتركيبات الأخرى الموجودة في البروتينات و / أو المحفزات العضوية و / أو الدهون. تقاوم هذه البوليمرات الاصطناعية ، البشرية المنشأ التعريف لأنها في حين أنها غير طبيعية في العديد من الجوانب ، فإن أنشطتها تلتقط الكفاءة والتعقيد وحتى جمال الأنظمة الكيميائية الحيوية. وبالتالي ، فإن الاندماج المثير للسمات البوليمرية الفريدة للأحماض النووية ، جنبًا إلى جنب مع التطورات في اختيار الكيمياء التوافقية ، وكيمياء الأحماض النووية الاصطناعية التي تشكل أساس هذا الفصل.


مقدمة

الفيروس هو طفيلي مجهري إلكتروني ، غير قادر على التكاثر من تلقاء نفسه ، يعيش عن طريق توجيه آلية الخلية المضيفة لإنتاج المزيد من الفيروسات ، التي تنبثق من الخلية المضيفة الخاصة بها من خلال التحلل. تحتوي معظم هذه الكائنات الفيروسية إما على دنا مزدوج الشريطة أو مفردة الجديلة وكذلك الحمض النووي الريبي في جينوماتها ، والتي قد تكون إما مفردة أو مزدوجة الجديلة. بعد التنقية والتبلور الجزئي لفيروس التبغ الموسيقي في عام 1935 بواسطة Wendell Stanley ، ألهمت دراسة الفيروسات العديد من العلماء ، مما أدى إلى تحديد وتوصيف فيروسات النبات والبكتيريا والعتائق والحيوان. نظرًا لأن الفيروسات قادرة على إصابة عدد كبير من أنواع الخلايا المختلفة ، يتم النظر في الفيروسات المعدلة وراثيًا في العلاج الجيني. كل هذه العوامل والتطبيقات تجعل الفيروس كائنًا حيويًا مهمًا لقدرته على إصابة أي كائن حي على هذا الكوكب.

الفيروسات صغيرة تحت المجهر ، تلزم طفيليات داخل الخلايا ، والتي تحتوي إما على DNA أو RNA كجينوم محمي بطبقة بروتينية مشفرة بالفيروس تسمى قفيصة. الفيروسات عبارة عن عناصر وراثية متحركة ، وتعتمد على آلية التمثيل الغذائي والتخليق الحيوي للخلايا المضيفة لتكاثرها. لا تستطيع الفيروسات القيام بوظائف الحفاظ على حياتها خارج الخلية المضيفة. لا يمكنهم تصنيع البروتينات لأنهم يفتقرون إلى الريبوسومات ويستخدمون آلية ريبوسوم الخلية المضيفة لترجمة mRNA إلى بروتينات. لا يمكن للفيروسات أن تولد أو تخزن ATP ولكنها تستمد الطاقة اللازمة ووظائف التمثيل الغذائي الأخرى عن طريق تطفل الخلية المضيفة للمواد الأساسية مثل الأحماض الأمينية والنيوكليوتيدات والدهون. على الرغم من التكهن بالفيروسات كشكل من أشكال الحياة الأولية ، فإن عدم قدرتها على البقاء على قيد الحياة خارج الكائنات الحية لا يجعلها كائنات حية بالمعنى الدقيق للكلمة ومن غير المرجح أن تكون قد سبقت الحياة الخلوية أثناء تطور الأرض. حتى أن بعض العلماء يتكهنون بأن الفيروسات قد بدأت كقطع شريرة من الشفرة الجينية والتي تكيفت مع شكل طفيلي من الوجود. Virions هي جزيئات الفيروس الكاملة التي يتم إنتاجها من خلال تجميع المكونات الفيروسية مسبقة التكوين ، وتتمثل وظيفتها الرئيسية في توصيل جينومها إلى الخلية المضيفة للتعبير عنها (النسخ والترجمة). virion عشري الوجوه التي تنتمي إلى ذوات الوجوه تتكون أو فئة هيكلية من الفيروسات من 20 وجهًا مثلثيًا متطابقًا ، كل وجه مكون من ثلاث وحدات بروتين قفيصة متطابقة مكونة 60 وحدة فرعية لكل قفيصة ، مع خمس وحدات فرعية تتلامس بشكل متماثل مع كل من القمم الاثني عشر ، مما يجعل جميع البروتينات في تفاعل مكافئ مع بعضها البعض . يتم تعبئة الجينوم الفيروسي داخل قفيصة بروتين متماثلة ، تتكون من بروتين واحد أو عدة بروتينات ، كل منها يشفر جينًا فيروسيًا واحدًا. بسبب هذا الهيكل المتماثل ، يمكن للفيروسات ترميز جميع المعلومات الضرورية لبناء قفيصة كبيرة باستخدام مجموعة صغيرة من الجينات. تسمى القفيصة مع الحمض النووي المغلق بـ nucleocapsid. في الفيروسات المغلفة ، يحيط nucleocapsid بطبقة ثنائية من الدهون ومرصعة بطبقة من البروتينات السكرية. في كثير من الأحيان ، يرتبط الحمض النووي ببروتين يسمى البروتين النووي. تمتلك الفيروسات تنوعًا كبيرًا فيما يتعلق بحجمها. هو أكبر فيروس تم الإبلاغ عنه بقطر 400 & # x000a0nm ، أكبر من البكتيريا ، وهو

200 إلى 300 & # x000a0nm طويلة. كما أنها تعرض تنوعًا واسعًا في الأشكال والأشكال ، مثل كروية ، وشبيهة بالقضيب ، وما إلى ذلك.

هناك عدد قليل من الكيانات الفرعية الفيروسية المتشابهة للغاية والممرضة ولها خصائص مشابهة لخصائص الفيروسات. هذه الكيانات هي أشباه الفيروسات ، الفيروسات ، والبريونات. أشباه الفيروسات هي امتداد قصير من جزيئات الحمض النووي الريبي (200 & # x02013400 نيوكليوتيدات) ، وهي جزيئات RNA دائرية لها بنية ثانوية شبيهة بالقضيب بدون أي قفيصة أو غلاف. ترتبط هذه الفيروسات بأمراض النبات والإنسان مثل التهاب الكبد D. وهي تلزم طفيليات داخل الخلايا ، مع استراتيجيات تكاثر مشابهة للفيروسات. الفيروسات عبارة عن رنا ساتلي ، دائري أحادي السلسلة (1000 نيوكليوتيد) يعتمد على فيروسات نباتية لتكرارها وتغليفها. يتم تعبئتها في كبسولات الفيروس كركاب. الجينوم الخاص بهم يشفر البروتينات الهيكلية فقط. البريونات هي عوامل معدية شاذة تسبب أمراضًا تنكسية عصبية قاتلة بوساطة آليات معاصرة. تتكون البريونات من نوع واحد من جزيء البروتين بدون أي مكون للحمض النووي. البروتين هو شكل إسوي معدل من بروتين بريون (PrP) المعين PrPSc. يتم تحويل PrPC الخلوي العادي إلى PrPSc عن طريق الانتقال الهيكلي لهيكل & # x003b1-helical ويتم إعادة تشكيل هيكل الملف إلى & # x003b2-sheet. غالبًا ما يوجد بروتين البريون وجين الترميز الخاص به في الخلايا الطبيعية غير المصابة ويرتبطان بأمراض فيروسية مثل مرض كروتزفيلد & # x02013 جاكوب في البشر ، سكرابي في الأغنام والاعتلال الدماغي الإسفنجي البقري (جنون البقر) في الماشية.


استنتاج

وصفت هذه المقالة أحد المناهج الدراسية ، Designer Bacteria ، التي طبقت بنجاح DBL للتعبير الجيني. يعد التعبير الجيني مناسبًا لـ DBL لأنه أساسي في مجال علم الأحياء ، ويصعب تعلمه ، ولبنة بناء لمنهج علم الأحياء الأكبر ، ومهم لمنهج المدرسة الثانوية الإلزامي على المستوى الوطني ومستوى الولاية. استخدمت وحدة Designer Bacteria أنشطة تصميم منظمة استراتيجيًا حيث قام الطلاب بتعديل البكتيريا وراثيًا للتعبير عن سمات جديدة باستخدام ممارسات علمية أصيلة. تضمنت الوحدة ميزات إضافية لزيادة التنفيذ على نطاق واسع. تضمنت هذه الميزات صلة الطالب ، والتكاليف الخاضعة للرقابة ، والمواد الطلابية المختارة استراتيجيًا ، والنتائج العلمية المحسّنة.

يقدم هذا العمل دليلاً على أن DBL يمكن أن يكون أداة فعالة لتعلم المفاهيم الأساسية الصعبة في علم الأحياء. ستكون هذه الوحدة ومكاسبها التعليمية مفيدة للمعلمين والباحثين الذين يسعون إلى تطوير طرق أكثر فاعلية لتدريس المعلومات المعقدة في دورات علم الأحياء. سيتم تطوير مزيد من العمل مع هذه الوحدة لاستكشاف أنماط تفكير الطلاب في جميع أنحاء الوحدة والتحقيق في مكونات هذه الوحدة التي تعمل على تحسين التعلم بشكل أكثر فاعلية. DBL لديه القدرة على أن يكون نهجًا ناجحًا للإصلاح في تعليم الأحياء ، خاصةً من أجل تحسين فهم الموضوعات المعقدة مثل التعبير الجيني.


شاهد الفيديو: الهندسة الوراثية - استنساخ الحمض النووى DNA (قد 2022).