معلومة

مشاكل تفسير شريحة صبغة الجرام

مشاكل تفسير شريحة صبغة الجرام


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

سؤالي الرئيسي هو هذا: عند تفسير نتائج صبغة الجرام ، هل يحدد لون الأغلبية ما إذا كان موجبًا أم سلبيًا؟

لقد حصلنا على معلومات مجهولة وعلينا الآن تحديد ماهية الكائن الحي. أواجه مشكلة في تفسير نتائج تلطيخ الجرام. بقدر ما يتعلق الأمر بالمورفولوجيا ، فجميعهم من نوع cocci و (نوعًا ما) في مجموعات ، لكن (هذا هو الجزء المربك) كلاهما أرجواني ووردي. أفهم أن اللون الأرجواني يشير إلى غرام + والوردي هو غرام ، ولكن يجب أن يكون هناك جنس واحد من الكائن الحي وليس اثنين. إذن ألا يجب أن يكون هناك لون أرجواني فقط أو وردي فقط ، ولكن ليس كلاهما؟ هل يجب أن أبحث عن لون "الأغلبية" وأستخدم ذلك لتحديد ما إذا كنت أمتلك نقاط البيع أو السلبية؟ هذا يعني ، إذا كان لونه أرجوانيًا في الغالب ، فهل يعني ذلك نقاط البيع ، ولكن إذا كان الأمر كذلك ، فلماذا لا يزال هناك مكوّن وردي على الشريحة؟

أفهم أيضًا سبب ظهور نقاط الجرام باللون الأرجواني ، - أنه يتم الاحتفاظ بمركب اليود البنفسجي البلوري بسبب جدران الخلايا السميكة في نقاط الجرام ... وجدران الخلايا الأرق في الجرام النيجي ، بحيث يتم إزالة لونها وتظهر بلون مضاد.

كما أنني بالتأكيد لم أر أي قضبان في شريحتي ، فقط cocci.


السبب الوحيد لإظهار كلا اللونين هو التلاعب غير الكامل أثناء التلوين. لا يمكنك الاعتماد على الأغلبية لتحديد نتيجة البقعة.

في حالتك الخاصة ، ربما لم يتم الشطف أو إزالة اللون باستخدام EtoH بشكل كافٍ ولم يتم التخلص من safrainin تمامًا.

أفضل طريقة للتأكد من النتيجة هي إعادة التلوين.

نصيحة جيدة أثناء التلوين هي أن يكون لديك نسخ مكررة أو ثلاث نسخ.

ثانياً للإجابة على ما قلته هنا:

أفهم أيضًا سبب ظهور نقاط الجرام باللون الأرجواني ، حيث يتم الاحتفاظ بمركب اليود البنفسجي البلوري بسبب جدران الخلايا السميكة في نقاط الجرام ... وجدران الخلايا الأرق في الجرام النيجي ، بحيث يتم إزالة لونها وتظهر بلون مضاد.

في الواقع ، ليس فقط سمك جدار الخلية هو الذي يتسبب في احتفاظ البكتيريا أو عدم احتفاظها باللون البنفسجي البلوري. تحتوي البكتيريا الموجبة للجرام على غشاء بلازما ثم الببتيدوغليكان في الأعلى بينما تحتوي البكتيريا سالبة الجرام على غشاء بلازما ، ثم الببتيدوغليكان وغشاء خارجي آخر في الأعلى. الكريستال البنفسجي "يلتصق" بشكل أساسي بالببتيدوغليكان.

سيزيل Decoloring البقع على الغشاء الخارجي للبكتيريا سالبة الجرام. لقد كنت محقًا في حقيقة أن البكتيريا موجبة الجرام سيكون لها ببتيدوغليكان أكثر سمكًا.

غرام + مقابل غرام - جدران الخلايا http://www.diffen.com/difference/Gram-negative_Bacteria_vs_Gram-positive_Bacteria


تفسير بقع الجرام ومستحضرات الشرائح الميكروبيولوجية الشائعة الأخرى

تمت كتابة هذا الأطلس لمساعدة الأطباء وعلماء الأحياء الدقيقة وموظفي المختبرات على تحديد الكائنات الحية في المواد المصابة الملطخة بتقنيات شائعة الاستخدام في معظم المختبرات السريرية. نظرًا لقيمته العريقة كأداة تعليمية للمختبرات والأطباء السريريين ، فقد تم الاحتفاظ بأكبر قدر ممكن من تنسيق الطباعة الأصلي لـ Atlas & apos لهذه النسخة الإلكترونية ، مع بعض التنقيح في تسميات الكائنات الحية.

نظرًا لأن الميكروبات التي تنمو على وسائط الاستنبات قد تبدو مختلفة عن تلك الموجودة في العينات السريرية الأصلية ، يتم تضمين بقع العينات السريرية فقط. تجد أدناه وصفًا موجزًا ​​للبقع المستخدمة والتقنيات المجهرية ، متبوعًا بروابط لأقسام الصور وأوصاف مسببات الأمراض المستردة من مصادر الجسم التالية: البلغم والبول المهبلي وعنق الرحم والإحليل إفرازات الجلد خراجات داخل البطن والسائل الشوكي والأنسجة المتنوعة.

ينشأ الشك في إصابة المريض بالعدوى من تفسير الطبيب والتاريخ ، والفحص البدني ، وبعض نتائج الاختبارات المعملية ، وأحيانًا إجراءات التصوير الشعاعي. يعتمد التشخيص النهائي عادة على عزل مسببات الأمراض على وسط زراعة مناسب. ومع ذلك ، يحتاج العديد من المرضى إلى علاج سريع قبل أن تتوفر نتائج المزرعة. في كثير من الأحيان ، يمكن تحديد مسببات الأمراض من خلال الفحص المجهري للمواد المصابة (مثل البلغم والقيح والبول والسائل النخاعي) ، ويمكن اختيار العلاج بثقة وعقلانية. نظرًا لأن البكتيريا تسبب الكثير من الإصابات الخطيرة التي يمكن علاجها ، تركز هذه المجموعة على صبغة جرام ، وهي أهم تقنية تلطيخ لتحديد البكتيريا باستخدام الفحص المجهري الضوئي. ومع ذلك ، تمت أيضًا مناقشة وتوضيح العديد من مستحضرات الشرائح الميكروبيولوجية الأخرى.

ما لم يُذكر خلاف ذلك ، تم التقاط كل صورة مجهرية من خلال عدسة مغمورة بالزيت (100x) (تكبير إجمالي 1000x).

  • وجود نوع واحد أو عدة أنواع من الكائنات الحية
  • النوع السائد من الكائن الحي في حالة وجود أكثر من كائن
  • خصائص التلوين (الجرام موجبة أو سلبية الجرام)
  • شكل الكائنات الحية ، قضبان (عصيات) أو دائرية (cocci)
  • حجم الكائنات الحية: صغير ، كبير ، رفيع ، ممتلئ الجسم
  • التكوين: كائنات مفردة ، أزواج ، سلاسل ، كتل ، عناقيد ، متفرعة
  • العلاقة بالخلايا الالتهابية لأن بعض الكائنات الحية تكون مميزة داخل الخلايا الالتهابية (داخل الخلايا) أو ملتصقة بها

فحص بقع الجرام من البلغم

فحص بقع الجرام في البول (6 صور)

فحص بقع الجرام من الإفرازات المهبلية (6 صور)

فحص بقع غرام لإفرازات عنق الرحم والإحليل (3 صور)


الهيماتوكسيلين والأيوزين (H & amp E): صبغة روتينية

هذه هي الصبغة النسيجية الأكثر شيوعًا ، وتستخدم للتمييز بين تراكيب الأنسجة المختلفة. كما أنه يلعب دورًا مهمًا في تشخيص الأمراض المختلفة. الهيماتوكسيلين، هي صبغة طبيعية توجد في خشب شجرة Longwood في أمريكا الوسطى. في وصمة عار H & amp ؛ خليط من الهيماتوكسيلين المؤكسد المعروف باسم الهيماتين يستخدم. نظرًا لضعف تقارب الهيماتين مع الأنسجة ، يتم دمج مادة حادة في بقعة H & ampE. الموردات الأكثر شيوعًا هي أملاح الألمنيوم والحديد والتنغستن. تُعرف هذه المادة باسم الهيمالوم. عند تطبيقه على قسم الأنسجة ، يصبغ الهملوم النوى باللون الأزرق. يتم بعد ذلك عكس العينة باستخدام محلول يوزين (إما كحول أو ماء) ، الذي يلطخ البروتينات والسيتوبلازم بدرجات متفاوتة من اللون الوردي. الأيوزين هي أصباغ زانثين ولها أنواع مختلفة ، ولكن بشكل عام يستخدم Eosin Y بشكل شائع.

بقعة الهيماتوكسيلين وأمبير يوزين للنسيج الضام الرخو (الشريحة النسيجية)

الإجراء العام لصبغة H & amp E هو كما يلي:

  • يتم ترطيب القسم ثم مسحه باستخدام زيلين
  • ثم يتم غمرها في الماء الهيماتوكسيلين، يختلف وقت البقعة حسب نوع البقعة وعمرها وتفضيلاتك الشخصية.
  • يوجد هنا خياران محتملان - تقدمي أو تنازلي. رجعي يتضمن تلطيخ القسم ، ثم شطف الفائض. تدريجي يتضمن استخدام صبغة أقل تركيزًا ، والتحقق منها على فترات حتى يتلطخ القسم بدرجة كافية
  • يتم شطف القسم في صنبور ماء ثم غمرها في محلول حمض كحول
  • إنه مغمور في الصنبور ماء
  • القسم مغمور في يوزين وصمة
  • يتم شطف البقعة الزائدة بالصنبور ماء
  • القسم مجفّف بـ الإيثانول، ومثبتة باستخدام ملف صمغيواسطة

إجراء تلوين غرام

غالبًا ما يرغب الأطباء في تحديد نوع البكتيريا الموجودة في المريض المصاب بعدوى. لذلك ، يجب على المحترفين إجراء عدة اختبارات ، وأحد هذه الاختبارات هو إجراء صبغ الجرام. يستخدم الخبراء إجراء تلطيخ الجرام كأحد الأساليب للتمييز بين مجموعتين من البكتيريا وفقًا لخصائص جدار الخلية. يتضمن استخدام صبغة لمعرفة البكتيريا التي تحتفظ باللون و mdashviolet أو الأحمر في جدران خلاياها.

متى يتم تطبيق صبغ غرام

  • يستخدم إجراء تلطيخ الجرام لتحديد ما إذا كانت البكتيريا موجبة الجرام أو سالبة الجرام. عادة ما تكون هذه هي الخطوة الأولى في عملية التعرف على البكتيريا الموجودة في الثقافات.
  • هذا الإجراء مهم في إعطاء فكرة عن تشخيص الأشخاص المصابين بالأمراض المعدية. كما أنه يساعد في تقدير العدد الإجمالي للبكتيريا.
  • يمكن للأطباء اتخاذ قرار تجريبي على نوع المضادات الحيوية التي قد يصفونها للمريض ، بناءً على نتائج إجراء صبغ الجرام.
  • يمكن أيضًا اختيار وسيلة الثقافة التي سيتم استخدامها للتلقيح بشكل تجريبي بناءً على تقرير صبغة الجرام.

كيف يتم إجراء صبغة غرام؟

1. تحضير الشريحة الزجاجية المجهرية

للتأكد من أن الشرائح الخاصة بك خالية من الشحوم / الزيوت ، عليك أولاً غسلها بالماء والصابون ثم مسح الشرائح بالكحول. سيؤدي ذلك إلى إزالة أي بصمات أصابع أو أوساخ منها. جفف الشرائح وضعها على مناشف المختبر حتى تصبح جاهزة للاستخدام.

2. تسمية الشرائح

ارسم دائرة أسفل الشرائح باستخدام قلم تعليم مصمم للأواني الزجاجية. سيساعد هذا في تحديد المنطقة التي يجب تحضير اللطاخة بها في الخطوة التالية. يمكنك أيضًا تسميتها بالأحرف الأولى من اسم الكائن على حافة كل شريحة. احرص على ألا تتلامس الملصقات مع الكواشف المستخدمة للتلوين.

3. تحضير المسحة

لعمل معلق بكتيري في مرق، استخدم حلقة معقمة مبردة لوضع كمية صغيرة من ثقافة المرق على الشريحة الخاصة بك. باستخدام حركة دائرية ، افرد المرق بحلقة التلقيح حتى يبلغ قطرها حوالي 1 سم. لا تنتشر بشكل مفرط لمنع تعطيل الترتيب الخلوي. تسمح اللطاخة المناسبة بفحص الخلايا المعزولة وترتيبها الخلوي المميز.

لعمل مزرعة البكتيرية، استخدم حلقة معقمة مبردة وضع قطرة من محلول ملحي أو ماء معقم على شريحة. بعد إعادة تعقيم الحلقة وتبريدها ، التقط عينة صغيرة من المستعمرة البكتيرية. حرك المستعمرة برفق في الماء أو المحلول الملحي على الشريحة واصنع مستحلبًا.

بالنسبة لعينات المسحة ، قم بلف ممسحة فوق شريحة زجاجية نظيفة

ملحوظة: تجنب تحضير مسحة كثيفة مع عينة بكتيرية زائدة. سيمنع هذا الضوء من المرور ويجعل من الصعب رؤية شكل الخلية. عادة ما تتطلب المسحات كميات صغيرة من الثقافة البكتيرية فقط. تتكون اللطاخة المثالية من طبقة رقيقة بيضاء بعد عملية التثبيت الحراري.

4. تحديد الحرارة

تقتل هذه الخطوة البكتيريا الموجودة على اللطاخة ، وتجعلها تلتصق بشدة بالشريحة ، مما يسمح للعينة بأخذ البقع بسهولة أكبر. قم بتجفيف اللطاخة بالهواء. أثناء إمساك الشريحة الخاصة بك من أحد طرفيها (جانب اللطاخة لأعلى) ، مرر الشريحة من خلال اللهب من موقد بنسن ، 2-3 مرات. تجنب الإفراط في التسخين لمنع التخثر وتشويه البروتينات في العينة. أنت الآن جاهز لإجراء تلطيخ الجرام.

5. تلوين غرام

  • ضع اللطاخة المثبتة بالحرارة على صينية التلوين.
  • اغمر المسحة برفق باستخدام الكريستال البنفسجي. دعها تقف لمدة دقيقة واحدة.
  • قم بإمالة الشريحة قليلاً وشطفها برفق بماء الصنبور أو الماء المقطر باستخدام زجاجة غسيل.
  • الآن اغمر المسحة برفق بيودين غرام. دعها تقف لمدة دقيقة واحدة.
  • قم بإمالة الشريحة قليلاً وشطفها برفق بماء الصنبور أو الماء المقطر من زجاجة غسيل. الآن ستظهر مسحتك باللون الأرجواني على الشريحة.
  • باستخدام الأسيتون أو 95٪ كحول الإيثيل ، قم بإزالة لون اللطاخة. قم بإمالة الشريحة قليلاً وضعي الكحول بقطرات لمدة 5-10 ثوانٍ حتى يصبح السائل صافيًا. لا تفرط في إزالة اللون.
  • اشطفه فورًا باستخدام الماء.
  • قم بالتصدي عن طريق غمر اللطاخة بلطف بالسافرانين. دعه يقف لمدة 45 ثانية.
  • قم بإمالة الشريحة قليلاً وشطفها برفق بماء الصنبور أو الماء المقطر من زجاجة غسيل.
  • جففه بورق ماص.
  • افحص المسحة تحت المجهر الضوئي (الغمر بالزيت).

إليك مقطع فيديو يوضح كيفية إجراء عملية تلوين الجرام بالتفصيل:

ما هي النتائج التي يخبرنا بها إجراء تلطيخ الجرام؟

يساعد إجراء تلطيخ الجرام في تمييز البكتيريا ذات الجدران الخلوية السميكة عن تلك التي تحتوي على جدران خلوية أرق ، نظرًا لكمية الببتيدوغليكان في جدرانها. تحتوي الخلايا ذات الجدران الرقيقة على طبقة عديدات السكاريد الدهنية أكثر من الببتيدوغليكان في جدرانها.

يدخل البنفسج البلوري واليود كلا النوعين من جدران الخلايا البكتيرية ويتحدان ليصبحا جزيئات أكبر داخل هذه الجدران. ومع ذلك ، عند غسلها بالكحول ، تميل البكتيريا ذات الجدران الخلوية السميكة التي تحتوي على الببتيدوغليكان إلى الاحتفاظ بهذه الجزيئات وتبقى بنفسجية اللون ، وبالتالي يطلق عليها البكتيريا موجبة الجرام. من ناحية أخرى ، يتم غسل الصبغة بعيدًا عن البكتيريا ذات الجدران الخلوية الرقيقة ، وتعتبر سالبة الجرام. هذا الأخير لا يصبح عديم اللون ، ولكن اللون الوردي عندما يصطدم بالسافرانين.


1. Biosolutions: Western Blot Animation

"اللطخة الغربية (بالتناوب ، اللطخة المناعية) هي طريقة للكشف عن بروتينات معينة في عينة معينة من الأنسجة المتجانسة أو المستخلص. يستخدم الرحلان الكهربي للهلام لفصل البروتينات الأصلية أو المشوهة بطول البولي ببتيد (ظروف تغيير الطبيعة) أو عن طريق التركيب ثلاثي الأبعاد للبروتين (ظروف أصلية / غير مفسدة للطبيعة). يتم بعد ذلك نقل البروتينات إلى غشاء (عادة النيتروسليلوز أو PVDF) ، حيث يتم فحصها (اكتشافها) باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بالبروتين المستهدف. يوجد الآن العديد من شركات الكواشف المتخصصة في توفير الأجسام المضادة (الأجسام المضادة أحادية النسيلة ومتعددة النسيلة) ضد عدة آلاف من البروتينات المختلفة. يمكن أن تكون الأجسام المضادة التجارية باهظة الثمن ، على الرغم من أنه يمكن إعادة استخدام الجسم المضاد غير المرتبط بين التجارب. تُستخدم هذه الطريقة في مجالات البيولوجيا الجزيئية والكيمياء الحيوية وعلم الوراثة المناعية وتخصصات البيولوجيا الجزيئية الأخرى. تشمل التقنيات الأخرى ذات الصلة استخدام الأجسام المضادة للكشف عن البروتينات في الأنسجة والخلايا عن طريق التلوين المناعي ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). نشأت الطريقة من مختبر جورج ستارك في ستانفورد. أطلق دبليو نيل بورنيت اسم اللطخة الغربية على هذه التقنية وهو عبارة عن تلاعب بالاسم Southern blot ، وهي تقنية لاكتشاف الحمض النووي تم تطويرها سابقًا بواسطة Edwin Southern. يُطلق على اكتشاف الحمض النووي الريبي اسم النشاف الشمالي ". (Biosolutions - video) النص: اعرض المستند التالي لقراءة وصف حول الخطوات المتضمنة في لطخة ويسترن من Biosolutions.
وصف الإجراء: لطخة ويسترن

2. WH Freeman Animation: Western Blotting (Immunoblotting)

يمكنك عرض البرامج التعليمية المتحركة في إصدار شريحة تلو شريحة أثناء التنقل خلال أو في إصدار مسروق يتنقل من أجلك.


مركز تشخيص صحة الحيوان

تُستخدم هذه التقنية لتلطيخ شريحة مثل مسحة البراز لمراقبة البكتيريا الدقيقة الموجودة بناءً على تفاعل صبغة الجرام.

  • "إصلاح الحرارة" الشريحة بالعينة عن طريق تمريرها فوق مصدر حرارة ، مثل اللهب ، عدة مرات باستخدام دبوس ملابس أو ملقط. يجب أن يتم تمرير الشريحة بسرعة كبيرة عبر اللهب وعدم تسخينها بشكل مفرط. ضع الشريحة على صينية التلوين.
  • اغمر المسحة الثابتة بمحلول بنفسجي بلوري (# 1) واتركه لمدة دقيقة واحدة.
  • اشطف البنفسج الكريستالي بالماء المقطر أو ماء الصنبور.
  • اغمر الشريحة بمحلول اليود (# 2). اسمح للبقاء لمدة دقيقة واحدة.
  • اشطف محلول اليود بالماء المقطر أو ماء الصنبور.
  • قم بإمساك الشريحة بإمالة بدبوس ملابس ، واغمر الشريحة بمزيل اللون (# 3) لمدة تتراوح من ثانية إلى خمس ثوانٍ.
  • اشطف مزيل اللون بالماء المقطر أو ماء الصنبور.
  • اغمر الشريحة بالسافرانين (رقم 4). اسمح بالبقاء لمدة 30 ثانية.
  • اشطف الزعفران بالماء المقطر أو ماء الصنبور.
  • جفف الشريحة على ورق ماص أو ورق ماص وضعه في وضع رأسي.

افحص الشريحة مجهريًا بحثًا عن كائنات بكتيرية تحت هدف 100X. لاحظ عدة حقول على الشريحة للكائنات البكتيرية. وصف تفاعل الجرام لأي كائنات حية يتم رؤيتها. البكتيريا موجبة الجرام تلطخ البنفسجي العميق إلى الأزرق والبكتيريا سالبة الجرام تلون اللون الوردي إلى الأحمر. إذا كانت شريحتك كلها بلون واحد (إما وردي أو أزرق) ، فربما تكون الشريحة قد انتهت أو لم يتم إزالة لونها. ما لم تكن بقعة غرام لثقافة نقية ، يجب أن تكون هناك مادة تلطيخ كلا اللونين في مكان ما على الشريحة.


2.4 تلطيخ العينات المجهرية

في حالتها الطبيعية ، تفتقر معظم الخلايا والكائنات الحية الدقيقة التي نلاحظها تحت المجهر إلى اللون والتباين. هذا يجعل من الصعب ، إن لم يكن من المستحيل ، اكتشاف الهياكل الخلوية المهمة وخصائصها المميزة دون معالجة العينات بشكل مصطنع. لقد أشرنا بالفعل إلى تقنيات معينة تتضمن البقع والأصباغ الفلورية ، وفي هذا القسم سنناقش تقنيات محددة لتحضير العينات بمزيد من التفصيل. في الواقع ، تم تطوير العديد من الطرق لتحديد الميكروبات المحددة ، أو الهياكل الخلوية ، أو تسلسل الحمض النووي ، أو مؤشرات الإصابة في عينات الأنسجة ، تحت المجهر. هنا ، سنركز على التقنيات الأكثر صلة سريريًا.

تحضير عينات للميكروسكوب الخفيف

في الإعدادات السريرية ، تعتبر المجاهر الضوئية هي المجاهر الأكثر استخدامًا. هناك نوعان أساسيان من التحضير يستخدمان لعرض العينات باستخدام مجهر ضوئي: الحوامل الرطبة والعينات الثابتة.

أبسط نوع من التحضير هو الحامل الرطب ، حيث توضع العينة على الشريحة في قطرة سائل. بعض العينات ، مثل قطرة من البول ، موجودة بالفعل في شكل سائل ويمكن إيداعها على الشريحة باستخدام قطارة. يمكن وضع العينات الصلبة ، مثل كشط الجلد ، على الشريحة قبل إضافة قطرة من السائل لتحضير الحامل الرطب. في بعض الأحيان يكون السائل المستخدم عبارة عن ماء ، ولكن غالبًا ما تتم إضافة البقع لتعزيز التباين. بمجرد إضافة السائل إلى الشريحة ، يتم وضع ساترة في الأعلى وتكون العينة جاهزة للفحص تحت المجهر.

الطريقة الثانية لتحضير العينات للفحص المجهري الضوئي هي التثبيت. يشير "تثبيت" العينة إلى عملية ربط الخلايا بالشريحة. غالبًا ما يتحقق التثبيت إما عن طريق التسخين (تثبيت الحرارة) أو المعالجة الكيميائية للعينة. بالإضافة إلى إرفاق العينة بالشريحة ، فإن التثبيت يقتل أيضًا الكائنات الحية الدقيقة في العينة ، ويوقف حركتها والتمثيل الغذائي مع الحفاظ على سلامة مكوناتها الخلوية للمراقبة.

لإصلاح العينة بالحرارة ، يتم نشر طبقة رقيقة من العينة على الشريحة (تسمى مسحة) ، ثم يتم تسخين الشريحة لفترة وجيزة فوق مصدر حرارة (الشكل 2.31). غالبًا ما تكون المثبتات الكيميائية أفضل من تسخين عينات الأنسجة. يمكن للعوامل الكيميائية مثل حمض الأسيتيك ، والإيثانول ، والميثانول ، والفورمالديهايد (الفورمالين) ، والغلوتارالدهيد أن تفسد البروتينات ، وتوقف التفاعلات الكيميائية الحيوية ، وتثبت هياكل الخلايا في عينات الأنسجة (الشكل 2.31).

بالإضافة إلى التثبيت ، يتم تطبيق التلوين دائمًا تقريبًا لتلوين ميزات معينة للعينة قبل فحصها تحت المجهر الضوئي. تحتوي البقع أو الأصباغ على أملاح مكونة من أيون موجب وأيون سالب. اعتمادًا على نوع الصبغة ، قد يكون الأيون الموجب أو السالب هو حامل اللون (الأيون الملون) والأيون الآخر غير الملون يسمى المضاد. إذا كان حامل اللون هو أيون موجب الشحنة ، يتم تصنيف البقعة على أنها صبغة أساسية إذا كان الأيون السالب هو حامل اللون ، فإن البقعة تعتبر صبغة حمضية.

يتم اختيار الأصباغ للتلوين بناءً على الخصائص الكيميائية للصبغة والعينة التي يتم ملاحظتها ، والتي تحدد كيفية تفاعل الصبغة مع العينة. في معظم الحالات ، يُفضل استخدام صبغة إيجابية ، وهي صبغة تمتصها الخلايا أو الكائنات الحية التي يتم ملاحظتها ، مما يضيف لونًا إلى الأشياء ذات الأهمية لجعلها تبرز في الخلفية. ومع ذلك ، هناك سيناريوهات يكون من المفيد فيها استخدام صبغة سلبية ، والتي تمتصها الخلفية ولكن ليس بواسطة الخلايا أو الكائنات الحية في العينة. ينتج عن التلوين السلبي مخطط أو صورة ظلية للكائنات الحية على خلفية ملونة (الشكل 2.32).

نظرًا لأن الخلايا عادةً ما تحتوي على جدران خلوية سالبة الشحنة ، فإن الكروموفورات الموجبة في الأصباغ الأساسية تميل إلى الالتصاق بجدران الخلايا ، مما يجعلها بقعًا إيجابية. وبالتالي ، فإن الأصباغ الأساسية شائعة الاستخدام مثل الفوشين الأساسي ، والبنفسجي الكريستالي ، والأخضر الملكي ، والأزرق الميثيلين ، والصفرانين تعمل عادةً كبقع إيجابية. من ناحية أخرى ، فإن الكروموفورات سالبة الشحنة في الأصباغ الحمضية يتم صدها بواسطة جدران الخلايا سالبة الشحنة ، مما يجعلها بقع سلبية. تشتمل الأصباغ الحمضية الشائعة الاستخدام على حمض الفوشسين ويوزين والورد البنغال. يوفر الشكل 2.40 مزيدًا من التفاصيل.

تتضمن بعض تقنيات التلوين تطبيق صبغة واحدة فقط على العينة ، بينما تتطلب تقنيات أخرى أكثر من صبغة واحدة. في التلوين البسيط ، يتم استخدام صبغة واحدة للتأكيد على هياكل معينة في العينة. ستجعل البقعة البسيطة عمومًا جميع الكائنات الحية في العينة تبدو بنفس اللون ، حتى لو كانت العينة تحتوي على أكثر من نوع واحد من الكائنات الحية. في المقابل ، يميز التلوين التفاضلي الكائنات الحية بناءً على تفاعلها مع البقع المتعددة. بعبارة أخرى ، قد يبدو أن كائنين من الكائنات الحية في عينة ملطخة تفاضليًا لهما ألوان مختلفة. تشمل تقنيات التلوين التفاضلي المستخدمة بشكل شائع في البيئات السريرية تلطيخ الجرام ، وتلطيخ سريع الحموضة ، وتلطيخ الأبواغ ، وتلطيخ الأسواط ، وتلطيخ الكبسولة. يوفر الشكل 2.41 مزيدًا من التفاصيل حول تقنيات التلوين التفاضلي هذه.

تأكد من فهمك

  • اشرح سبب أهمية إصلاح عينة قبل عرضها تحت المجهر الضوئي.
  • ما هي أنواع العينات التي يجب أن تكون ثابتة كيميائياً بدلاً من العينات المثبتة بالحرارة؟
  • لماذا قد تتفاعل الصبغة الحمضية مع عينة معينة بشكل مختلف عن الصبغة الأساسية؟
  • اشرح الفرق بين البقعة الإيجابية والسلبية.
  • اشرح الفرق بين التلوين البسيط والتفاضلي.

جرب هذه النصائح حول يرجع تاريخها

إجراء صبغة غرام هو إجراء تلطيخ تفاضلي يتضمن خطوات متعددة. تم تطويره من قبل عالم الأحياء الدقيقة الدنماركي هانز كريستيان غرام في عام 1884 كطريقة فعالة للتمييز بين البكتيريا ذات الأنواع المختلفة من جدران الخلايا ، وحتى اليوم لا تزال واحدة من تقنيات التلوين الأكثر استخدامًا. خطوات إجراء صبغة جرام مذكورة أدناه وموضحة في الشكل 2.33.

  1. أولاً ، يتم تطبيق صبغة الكريستال البنفسجي ، وهي صبغة أولية ، على مسحة ثابتة الحرارة ، مما يعطي كل الخلايا لونًا أرجوانيًا.
  2. بعد ذلك ، يضاف اليود غرام ، لاذع. المادة اللاذعة هي مادة تستخدم لتثبيت أو تثبيت البقع أو الأصباغ في هذه الحالة ، يعمل اليود الجرام كعامل محاصر يتجمع مع البنفسجي البلوري ، مما يجعل مركب اليود البنفسجي البلوري يتكتل ويظل محتجزًا في طبقات سميكة من الببتيدوغليكان في الخلية الجدران.
  3. بعد ذلك ، يضاف عامل إزالة اللون ، عادة إيثانول أو محلول أسيتون / إيثانول. الخلايا التي تحتوي على طبقات ببتيدوغليكان سميكة في جدرانها الخلوية أقل تأثراً بكثير بعامل إزالة اللون فهي تحتفظ بشكل عام بصبغة البنفسج الكريستالية وتبقى أرجوانية. ومع ذلك ، فإن عامل إزالة اللون يغسل الصبغة بسهولة أكبر من الخلايا ذات طبقات الببتيدوغليكان الرقيقة ، مما يجعلها عديمة اللون مرة أخرى.
  4. أخيرًا ، يتم إضافة صبغة مضادة ثانوية ، عادةً سافرانين. يؤدي هذا إلى تلطيخ الخلايا باللون الوردي ويكون أقل وضوحًا في الخلايا التي لا تزال تحتوي على صبغة الكريستال البنفسجي.

يشار إلى الخلايا المصبوغة باللون البنفسجي الكريستالي على أنها خلايا موجبة الجرام ، بينما الخلايا الحمراء المصبوغة بالسافرانين سالبة الجرام (الشكل 2.34). ومع ذلك ، هناك العديد من الاعتبارات الهامة في تفسير نتائج صبغة جرام. أولاً ، قد تتسبب الخلايا البكتيرية القديمة في تلف جدرانها الخلوية مما يؤدي إلى ظهورها سالبة الجرام حتى لو كانت الأنواع موجبة الجرام. وبالتالي ، فمن الأفضل استخدام الثقافات البكتيرية الطازجة لتلطيخ الجرام. ثانيًا ، يمكن أن تؤثر الأخطاء مثل تركها على مزيل اللون لفترة طويلة جدًا على النتائج. في بعض الحالات ، ستظهر معظم الخلايا موجبة الجرام بينما تظهر بعضها سالبة الجرام (كما في الشكل 2.34). يشير هذا إلى حدوث تلف في الخلايا الفردية أو أن مزيل اللون قد ترك لفترة طويلة جدًا ، ولا يزال يتعين تصنيف الخلايا على أنها موجبة الجرام إذا كانت جميعها من نفس النوع بدلاً من ثقافة مختلطة.

إلى جانب تفاعلاتها المختلفة مع الأصباغ وعوامل إزالة اللون ، فإن الاختلافات الكيميائية بين الخلايا إيجابية الجرام والخلايا سالبة الجرام لها آثار أخرى ذات صلة إكلينيكية. على سبيل المثال ، يمكن أن يساعد تلطيخ الجرام الأطباء في تصنيف مسببات الأمراض البكتيرية في عينة إلى فئات مرتبطة بخصائص محددة. تميل البكتيريا سالبة الجرام إلى أن تكون أكثر مقاومة لبعض المضادات الحيوية من البكتيريا موجبة الجرام. سنناقش هذا وغيره من تطبيقات صبغ الجرام بمزيد من التفصيل في فصول لاحقة.

تأكد من فهمك

  • اشرح دور اليود غرام في إجراء صبغة غرام.
  • اشرح دور الكحول في إجراء صبغة غرام.
  • ما لون الخلايا موجبة الجرام والخلايا سالبة الجرام ، على التوالي ، بعد إجراء صبغة جرام؟

التركيز السريري

الجزء 3

إن مشاهدة عينة سيندي تحت مجهر المجال المظلم قد زودت الفني ببعض القرائن المهمة حول هوية الميكروب الذي تسبب في إصابتها بالعدوى. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من المعلومات لإجراء تشخيص قاطع. يقرر الفني عمل صبغة جرام للعينة. تستخدم هذه التقنية بشكل شائع كخطوة مبكرة في تحديد البكتيريا المسببة للأمراض. بعد الانتهاء من إجراء صبغة غرام ، يقوم الفني بعرض الشريحة تحت مجهر المجال الساطع ويرى مجموعات أرجوانية تشبه العنب من الخلايا الكروية (الشكل 2.35).

  • هل هذه البكتيريا موجبة الجرام أم سلبية الغرام؟
  • ماذا يكشف هذا عن جدران زنزاناتهم؟

انتقل إلى مربع التركيز السريري التالي. ارجع إلى مربع التركيز السريري السابق.

البقع الحمضية السريعة

التلوين السريع للحمض هو أسلوب آخر شائع الاستخدام للتلوين التفاضلي يمكن أن يكون أداة تشخيصية مهمة. البقع الصامدة للأحماض قادرة على التمييز بين نوعين من الخلايا موجبة الجرام: تلك التي تحتوي على أحماض فطرية شمعية في جدرانها الخلوية ، وتلك التي لا تحتوي على ذلك. طريقتان مختلفتان للتلوين السريع للحموضة هما تقنية Ziehl-Neelsen وتقنية Kinyoun. كلاهما يستخدم carbolfuchsin باعتباره البقعة الأساسية. تحتفظ الخلايا الشمعية سريعة الحموضة بالكاربولفوشين حتى بعد تطبيق عامل إزالة اللون (محلول حمض كحول). ثم يتم تطبيق صبغة ثانوية ، وهي الميثيلين الأزرق ، والتي تجعل الخلايا غير سريعة الحمض زرقاء.

يتمثل الاختلاف الأساسي بين الطريقتين القائمتين على الكربولفوشين في ما إذا كانت الحرارة تستخدم أثناء عملية التلوين الأولية. تستخدم طريقة Ziehl-Neelsen الحرارة لبث carbolfuchsin في الخلايا سريعة الحموضة ، بينما لا تستخدم طريقة Kinyoun الحرارة. كلتا الطريقتين أدوات تشخيصية مهمة لأن عددًا من الأمراض المحددة تسببها البكتيريا المقاومة للحموضة (AFB). في حالة وجود AFB في عينة الأنسجة ، يمكن رؤية لونها الأحمر أو الوردي بوضوح مقابل الخلفية الزرقاء لخلايا الأنسجة المحيطة (الشكل 2.36).

تأكد من فهمك

اتصالات مايكرو

استخدام المجهر لتشخيص مرض السل

السل الفطري ، البكتيريا المسببة لمرض السل ، يمكن اكتشافها في عينات بناءً على وجود عصيات مقاومة للحموضة. في كثير من الأحيان ، يتم تحضير مسحة من عينة من بلغم المريض ثم يتم صبغها باستخدام تقنية Ziehl-Neelsen (الشكل 2.36). إذا تم تأكيد البكتيريا المقاومة للأحماض ، فإنها تُستزرع عمومًا لتحديد هوية إيجابية. يمكن استخدام الاختلافات في هذا النهج كخطوة أولى في تحديد ما إذا كان مرض السل أو غيرها من البكتيريا المقاومة للأحماض موجودة ، على الرغم من أن عينات من أماكن أخرى في الجسم (مثل البول) قد تحتوي على أنواع أخرى المتفطرة محيط.

نهج بديل لتحديد وجود مرض السل هو تألق مناعي. في هذه التقنية ، ترتبط الأجسام المضادة التي تحمل علامة الفلوروكروم مرض السل، إذا كان موجودا. يمكن استخدام الأصباغ الفلورية الخاصة بالأجسام المضادة لعرض البكتيريا الفطرية باستخدام مجهر مضان.

تلطيخ الكبسولة

تحتوي بعض البكتيريا والخمائر على بنية خارجية واقية تسمى الكبسولة. نظرًا لأن وجود الكبسولة يرتبط ارتباطًا مباشرًا بضراوة الميكروب (قدرته على التسبب في المرض) ، فإن القدرة على تحديد ما إذا كانت الخلايا في العينة تحتوي على كبسولات تعد أداة تشخيصية مهمة. لا تمتص الكبسولات معظم الأصباغ الأساسية ، لذلك تستخدم تقنية التلوين السلبي (تلطيخ حول الخلايا) عادةً لتلطيخ الكبسولة. تلطخ الصبغة الخلفية لكنها لا تخترق الكبسولات التي تظهر مثل الهالات حول حدود الخلية. لا تحتاج العينة إلى أن تكون ثابتة بالحرارة قبل تلطيخ سلبي.

تتمثل إحدى تقنيات التلوين السلبي الشائعة لتحديد الخميرة والبكتيريا المغلفة في إضافة بضع قطرات من الحبر الهندي أو النيجروسين إلى عينة. يمكن أيضًا استخدام بقع المحفظة الأخرى لتلطيخ الخلايا المغلفة بشكل سلبي (الشكل 2.37). بدلاً من ذلك ، يمكن الجمع بين تقنيات التلوين الإيجابية والسلبية لتصور الكبسولات: تلون البقعة الإيجابية جسم الخلية ، وتلون البقعة السلبية الخلفية ولكن ليس الكبسولة ، تاركة هالة حول كل خلية.

تأكد من فهمك

تلطيخ إندوسبور

الإندوسبورات هي هياكل تنتج داخل خلايا بكتيرية معينة تسمح لها بالبقاء على قيد الحياة في الظروف القاسية. لا يمكن استخدام تلطيخ الجرام وحده لتصور الأبواغ ، والتي تظهر واضحة عند عرض الخلايا المصبوغة بالجرام. يستخدم تلطيخ Endospore بقعتين للتمييز بين الإندوسبورات وبقية الخلية. تستخدم طريقة Schaeffer-Fulton (أكثر تقنيات تلطيخ الأبواغ شيوعًا) الحرارة لدفع البقعة الأولية (أخضر الملكيت) إلى داخل البوغ. الغسل بالماء يزيل لون الخلية ، لكن البوغ يحتفظ بالبقعة الخضراء. ثم يتم تلطيخ الزنزانة باللون الوردي باستخدام الزعفران. تكشف الصورة الناتجة عن شكل وموقع الأبواغ ، إذا كانت موجودة. ستظهر الأبواغ الخضراء إما داخل الخلايا النباتية الوردية أو منفصلة عن الخلايا الوردية تمامًا. في حالة عدم وجود أبواغ داخلية ، ستكون الخلايا النباتية الوردية فقط مرئية (الشكل 2.38).

تقنيات تلطيخ Endospore مهمة لتحديد عصية و المطثية، نوعان من البكتيريا المنتجة للأبواغ التي تحتوي على أنواع مهمة سريريًا. من بين أمور أخرى، الجمرة الخبيثة (التي تسبب الجمرة الخبيثة) كانت ذات أهمية خاصة بسبب القلق من أن جراثيمها يمكن أن تستخدم كعامل إرهاب بيولوجي. جيم صعب هو نوع مهم بشكل خاص مسؤول عن العدوى المكتسبة من المستشفى والمعروفة باسم "C. فرق. "

تأكد من فهمك

تلطيخ فلاجيللا

الأسواط (المفرد: السوط) هي هياكل خلوية تشبه الذيل تستخدم للتنقل بواسطة بعض البكتيريا والعتائق وحقيقيات النوى. نظرًا لكونها رقيقة جدًا ، لا يمكن عادةً رؤية الأسواط تحت المجهر الضوئي بدون تقنية تلطيخ السوط المتخصصة. يؤدي تلطيخ الأسواط إلى زيادة سماكة الأسواط عن طريق تطبيق مادة مردنت (حمض التانيك بشكل عام ، ولكن في بعض الأحيان شب البوتاسيوم) ، والتي تغلف السوط ثم تلطخ العينة بالباراروسانيلين (الأكثر شيوعًا) أو الفوشسين الأساسي (الشكل 2.39).

على الرغم من أن تلطيخ الأسواط غير شائع في البيئات السريرية ، إلا أن هذه التقنية شائعة الاستخدام من قبل علماء الأحياء الدقيقة ، حيث يمكن أن يكون موقع وعدد الأسواط مفيدًا في تصنيف وتحديد البكتيريا في العينة. عند استخدام هذه التقنية ، من المهم التعامل مع العينة بعناية فائقة ، وهي هياكل دقيقة يمكن أن تتلف بسهولة أو يتم سحبها ، مما يضر بمحاولات تحديد موقع الأسواط وحساب عددها بدقة.

تحضير عينات للميكروسكوب الإلكتروني

يجب أن تحتوي العينات المراد تحليلها باستخدام TEM على أقسام رفيعة جدًا. لكن الخلايا طرية للغاية بحيث لا يمكن قطعها بشكل رقيق ، حتى باستخدام سكاكين الماس. لقطع الخلايا دون تلف ، يجب دمج الخلايا في الراتنج البلاستيكي ثم تجفيفها من خلال سلسلة من النقع في محاليل الإيثانول (50٪ ، 60٪ ، 70٪ ، وهكذا). يحل الإيثانول محل الماء في الخلايا ، ويذوب الراتينج في الإيثانول ويدخل الخلية ، حيث يتصلب. بعد ذلك ، يتم قطع المقاطع الرفيعة باستخدام جهاز متخصص يسمى ultramicrotome (الشكل 2.42). أخيرًا ، يتم تثبيت العينات على الأسلاك النحاسية الدقيقة أو شبكات ألياف الكربون وملطخة - ليس بأصباغ ملونة ، ولكن بمواد مثل أسيتات اليورانيل أو رباعي أكسيد الأوزميوم ، والتي تحتوي على ذرات معادن ثقيلة كثيفة الإلكترون.

عندما يتم تحضير العينات للعرض باستخدام SEM ، يجب أيضًا تجفيفها باستخدام سلسلة من الإيثانول. ومع ذلك ، يجب أن تكون أكثر جفافاً مما هو ضروري لـ TEM. يتم استخدام تجفيف النقطة الحرجة باستخدام ثاني أكسيد الكربون السائل الخامل تحت الضغط لإزاحة الماء من العينة. بعد التجفيف ، يتم طلاء العينات بالمعدن عن طريق التخلص من الذرات من هدف البلاديوم ، مع جزيئات نشطة. يمنع طلاء الرشاش العينات من أن تصبح مشحونة بواسطة شعاع الإلكترون الخاص بـ SEM.

تأكد من فهمك

  • لماذا من المهم تجفيف الخلايا قبل فحصها تحت المجهر الإلكتروني؟
  • قم بتسمية الجهاز المستخدم لإنشاء مقاطع رقيقة من العينات للفحص المجهري الإلكتروني.

اتصالات مايكرو

استخدام المجهر لتشخيص مرض الزهري

العامل المسبب لمرض الزهري هو اللولبية الشاحبة ، وهي خلية حلزونية مرنة (spirochete) يمكن أن تكون رفيعة جدًا (& lt 0.15 ميكرومتر) وتطابق معامل الانكسار للوسط ، مما يجعل من الصعب عرضها باستخدام الفحص المجهري الساطع. بالإضافة إلى ذلك ، لم يتم استزراع هذا النوع بنجاح في المختبر على وسط صناعي لذلك ، يعتمد التشخيص على التحديد الناجح باستخدام تقنيات مجهرية وعلم الأمصال (تحليل سوائل الجسم ، وغالبًا ما يبحث عن الأجسام المضادة لمسببات الأمراض). نظرًا لأن التثبيت والتلطيخ سيقتلان الخلايا ، فإن الفحص المجهري المظلم يستخدم عادة لمراقبة العينات الحية ومشاهدة تحركاتها. ومع ذلك ، يمكن أيضًا استخدام طرق أخرى. على سبيل المثال ، يمكن تكثيف الخلايا بجزيئات الفضة (في أقسام الأنسجة) وملاحظتها باستخدام مجهر ضوئي. من الممكن أيضًا استخدام الفلورة أو المجهر الإلكتروني لعرضها اللولبية (الشكل 2.43).

في البيئات السريرية ، غالبًا ما يستخدم التألق المناعي غير المباشر لتحديد اللولبية. يرتبط الجسم المضاد الأولي غير الملوث مباشرة بسطح العامل الممرض ، والأجسام المضادة الثانوية "الموسومة" بصبغة الفلورسنت تلتصق بالجسم المضاد الأولي. يمكن أن تلتصق أجسام مضادة ثانوية متعددة بكل جسم مضاد أولي ، مما يؤدي إلى تضخيم كمية البقعة المرفقة بكل منها اللولبية الخلية ، مما يسهل اكتشافها (الشكل 2.44).

تحضير وتلوين المجاهر الأخرى

يتم تحضير عينات التألق والفحص المجهري متحد البؤر بشكل مشابه لعينات الفحص المجهري الضوئي ، باستثناء أن الأصباغ عبارة عن صبغات فلوروكرومية. غالبًا ما يتم تخفيف البقع في سائل قبل وضعها على الشريحة. تلتصق بعض الأصباغ بجسم مضاد لتلطيخ بروتينات معينة على أنواع معينة من الخلايا (التألق المناعي) وقد يرتبط بعضها الآخر بجزيئات الحمض النووي في عملية تسمى التهجين في الموقع (FISH) ، مما يتسبب في تلطيخ الخلايا بناءً على ما إذا كان لديها تسلسل DNA محدد .

يشبه تحضير العينة للفوتون المجهري الفحص المجهري الفلوري ، باستثناء استخدام الأصباغ بالأشعة تحت الحمراء. يجب أن تكون عينات STM على سطح نظيف للغاية وسلس ذريًا. غالبًا ما تكون ميكا مطلية بـ Au (111). بخار التولوين هو مثبت شائع.

تأكد من فهمك

  • ما هو الفرق الرئيسي بين تحضير عينة للفحص المجهري الفلوري مقابل الفحص المجهري الضوئي؟

ارتباط بالتعلم

تقدم دراسات الحالة في الفحص المجهري بجامعة كورنيل سلسلة من المشكلات السريرية بناءً على أحداث واقعية. Each case study walks you through a clinical problem using appropriate techniques in microscopy at each step.

التركيز السريري

الدقة

From the results of the Gram stain, the technician now knows that Cindy’s infection is caused by spherical, gram-positive bacteria that form grape-like clusters, which is typical of staphylococcal bacteria. After some additional testing, the technician determines that these bacteria are the medically important species known as المكورات العنقودية الذهبية , a common culprit in wound infections. Because some strains of بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية are resistant to many antibiotics, skin infections may spread to other areas of the body and become serious, sometimes even resulting in amputations or death if the correct antibiotics are not used.

After testing several antibiotics, the lab is able to identify one that is effective against this particular strain of بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية. Cindy’s doctor quickly prescribes the medication and emphasizes the importance of taking the entire course of antibiotics, even if the infection appears to clear up before the last scheduled dose. This reduces the risk that any especially resistant bacteria could survive, causing a second infection or spreading to another person.

ارجع إلى مربع التركيز السريري السابق.

Eye on Ethics

Microscopy and Antibiotic Resistance

As the use of antibiotics has proliferated in medicine, as well as agriculture, microbes have evolved to become more resistant. Strains of bacteria such as methicillin-resistant بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية ( MRSA ), which has developed a high level of resistance to many antibiotics, are an increasingly worrying problem, so much so that research is underway to develop new and more diversified antibiotics.

Fluorescence microscopy can be useful in testing the effectiveness of new antibiotics against resistant strains like MRSA. In a test of one new antibiotic derived from a marine bacterium, MC21-A (bromophene), researchers used the fluorescent dye SYTOX Green to stain samples of MRSA. SYTOX Green is often used to distinguish dead cells from living cells, with fluorescence microscopy. Live cells will not absorb the dye, but cells killed by an antibiotic will absorb the dye, since the antibiotic has damaged the bacterial cell membrane. In this particular case, MRSA bacteria that had been exposed to MC21-A did, indeed, appear green under the fluorescence microscope, leading researchers to conclude that it is an effective antibiotic against MRSA.

Of course, some argue that developing new antibiotics will only lead to even more antibiotic-resistant microbes, so-called superbugs that could spawn epidemics before new treatments can be developed. For this reason, many health professionals are beginning to exercise more discretion in prescribing antibiotics. Whereas antibiotics were once routinely prescribed for common illnesses without a definite diagnosis, doctors and hospitals are much more likely to conduct additional testing to determine whether an antibiotic is necessary and appropriate before prescribing.

A sick patient might reasonably object to this stingy approach to prescribing antibiotics. To the patient who simply wants to feel better as quickly as possible, the potential benefits of taking an antibiotic may seem to outweigh any immediate health risks that might occur if the antibiotic is ineffective. But at what point do the risks of widespread antibiotic use supersede the desire to use them in individual cases?


Audits and Consulting:

At Environmental Leverage ® Inc., we have a team of experienced individuals who come into your plant with a fresh pair of eyes. The system is checked from influent to effluent. System optimization, equipment efficiency and operational excellence are key components explored. Key Benefits Equipment efficiency Total Cost of Operation reductions Reliability and safety

An onsite audit is conducted to examine system parameters, process controls, and current monitor and control procedures. A physical walk-through is conducted, process flow diagrams are examined, previous design criteria are examined and current standard operating procedures are evaluated along with data logs.


Microscopy and Staining: Gram, Capsule, and Endospore Staining

Source: Rhiannon M. LeVeque 1 , Natalia Martin 1 , Andrew J. Van Alst 1 , and Victor J. DiRita 1
1 Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University, East Lansing, Michigan, United States of America

Bacteria are diverse microorganisms found nearly everywhere on Earth. Many properties help distinguish them from each other, including but not limited to Gram-staining type, shape and arrangement, production of capsule, and formation of spores. To observe these properties, one can use light microscopy however, some bacterial characteristics (for example size, lack of coloration, and refractive properties) make it hard to distinguish bacteria solely with a light microscope (1, 2). Staining bacteria is necessary when distinguishing bacterial types with light microscopy. The two main types of light microscopes are simple and compound. The main difference between them is the number of lenses used to magnify the object. Simple microscopes (for example a magnifying glass) have only one lens to magnify an object, while compound microscopes have several lenses to enhance magnification (شكل 1). Compound microscopes have an objective lens close to the object which collects light to create an image of the object. This is then magnified by the eyepiece (ocular lens) which enlarges the image. Combining the objective lens and eyepiece allows for higher magnification than using a single lens alone. Typically, compound microscopes have multiple objective lenses of varying powers to allow for different magnification (1, 2). Here, we will discuss visualizing bacteria with Gram stains, Capsule stains, and Endospore stains.


Figure 1: A typical compound microscope. The most important parts of the microscope are labeled.

The Gram stain, developed in 1884 by the Danish bacteriologist Hans Christian Gram (1), differentiates bacteria based on the composition of the cell wall (1, 2, 3, 4). Briefly, a bacterial smear is placed on a microscope slide and then heat-fixed to adhere the cells to the slide and make them more readily accepting of stains (1). The heat-fixed sample is stained with Crystal Violet, turning the cells purple. The slide is flushed with an Iodine solution, which fixes the Crystal Violet to the cell wall, followed by a decolorizer (an alcohol) to wash away any non-fixed Crystal Violet. In the final step, a counterstain, Safranin, is added to color cells red (الشكل 2). Gram-positive bacteria stain purple due to the thick peptidoglycan layer which is not easily penetrated by the decolorizer Gram-negative bacteria, with their thinner peptidoglycan layer and higher lipid content, destain with the decolorizer and are counterstained red when Safranin is added (الشكل 3). Gram staining is used to differentiate cells into two types (Gram-positive and Gram-negative) and is also useful to distinguish cell shape (spheres or cocci, rods, curved rods, and spirals) and arrangement (single cells, pairs, chains, groups, and clusters) (1, 3).


Figure 2: Schematic of the Gram Staining Protocol. The left column shows how Gram-negative bacteria react at each step of the protocol. The right column shows how Gram-positive bacteria react. Also, shown are two typical bacterial cell shapes: the bacilli (or rods) and the cocci (or spheres).


Figure 3: Gram Staining Results. A Gram stain of a mixture of المكورات العنقودية الذهبية (Gram-positive purple cocci) and الإشريكية القولونية (Gram-negative red rods).

Some bacteria produce an extracellular viscous outer layer called a capsule (3, 5). Capsules are protective structures with various functions, including but not limited to adherence to surfaces and other bacteria, protection from desiccation, and protection from phagocytosis. Capsules are typically composed of polysaccharides containing more than 95% water, but some may contain polyalcohols and polyamines (5). Due to their mostly non-ionic composition and tendency to repel stains, simple staining methods do not work with capsule instead, capsule staining uses a negative staining technique which stains the cells and the background, leaving the capsule as a clear halo around the cells (1, 3) (الشكل 4). Capsule staining involves smearing a bacterial sample into an acidic stain on a microscope slide. Unlike Gram staining, the bacterial smear is not heat-fixed during a Capsule Stain. Heat-fixing can disrupt or dehydrate the capsule, leading to false negatives (5). Furthermore, heat-fixing can shrink cells resulting in a clearing around the cell which can be mistaken as a capsule, leading to false positives (3). The acidic stain colors the slide background while follow up with a basic stain, Crystal Violet, colors the bacterial cells themselves, leaving the capsule unstained and appearing as a clear halo between the cells and the slide background (الشكل 5). Traditionally, India ink has been used as the acidic stain because these particles cannot penetrate the capsule. Therefore, neither the capsule nor the cell is stained by India ink instead, the background is stained. Congo Red, Nigrosin, or Eosin can be used in place of India ink. Capsule staining can help doctors diagnose bacterial infections when looking at cultures from patient samples and guide appropriate patient treatment. Common diseases caused by encapsulated bacteria include pneumonia, meningitis, and salmonellosis.


Figure 4: Schematic of the Capsule Staining Protocol. The top panel shows the slide smear prior to any stain application. The middle panel shows how the slide and bacteria look after the primary stain, Congo Red. The final panel shows how the slide and bacteria look after the counterstain, Crystal Violet.


Figure 5: Capsule Staining Results. Capsule staining of encapsulated راكدة بومانية (denoted with black arrows) and non-encapsulated الإشريكية القولونية (denoted with white arrows). Notice the background is dark and A. baumannii cells are stained purple. The capsule around A. baumannii cells is evident as a halo, while بكتريا قولونية has no halo.

In adverse conditions (for example nutrient limitation, extreme temperatures, or dehydration), some bacteria produce endospores, metabolically inactive structures that are resistant to physical and chemical damage (1, 2, 8, 9). Endospores allow the bacterium to survive harsh conditions by protecting the genetic material of the cells once conditions are favorable for growth, spores germinate, and bacterial growth continues. Endospores are difficult to stain with standard staining techniques because they are impermeable to dyes typically used for staining (1, 9). The technique routinely used to stain endospores is the Schaeffer-Fulton Method (Figure 6), which uses the primary stain Malachite Green, a water soluble stain that binds relatively weakly to cellular material, and heat, to allow the stain to break through the cortex of the spore (Figure 7). These steps color the growing cells (termed vegetative cells in the context of endospore biology), as well as endospores and any free spores (those no longer within the former cell envelope). Vegetative cells are washed with water to remove Malachite Green endospores retain the stain due to heating the Malachite Green within the spore. Finally, the vegetative cells are counterstained with Safranin to visualize (Figure 8). Staining for endospores helps differentiate bacteria into spore formers and non-spore formers, as well as determines whether spores are present in a sample which, if present, could lead to bacterial contamination upon germination.


Figure 6: Schematic of the Endospore Staining Protocol. The left column shows how spore forming bacteria react at each step of the protocol. The right column shows how non-spore forming bacteria react.


Figure 7: Diagram of Endospore Structure. Bacterial cell containing an endospore with the various spore structures labeled.


Figure 8: Endospore Staining Results. A typical staining of endospores of العصوية الرقيقة. The vegetative cells (denoted with the white arrows) are stained red, while the endospores (denoted with the black arrows) are stained green.

إجراء

1. Gram Staining

  1. Set-up
    1. Wear gloves and a non-flammable lab coat, as dyes will stain hands and clothing.
    2. A Bunsen burner is used to heat fix the bacteria. Use care when working with flame tie back long hair.
    3. Commercially available Gram stain reagents will be used.
    4. Clean microscope slides with laboratory wipes.
    1. Pipet 10 µL phosphate buffered saline or culture broth on slide.
    2. Smear a bacterial colony into the liquid to produce a thin even layer.
      ملحوظة: Do not use cultures older than 24 hours, as bacteria too old could have changes in their cell wall which will affect the Gram stain results (1, 4).
    3. Completely air-dry slide.
    4. Once dried, heat fix bacteria by passing slide through the flame (bacteria side up) 4-5 times.
      ملحوظة: Do not hold the slide in the flame too long or you can distort the bacterial cells (1).
    5. Working over the sink, hold the slide level and apply Gram's Crystal Violet to completely cover the heat-fixed bacteria, allow to stand 45 seconds.
    6. Rinse excess Crystal Violet by holding the slide at an angle and squirting a gentle, indirect stream of water onto the slide and letting it run down over the stained bacteria. Do not squirt water directly onto the bacteria.
    7. Holding slide level again, apply Gram's Iodine Solution to completely cover the stained bacteria, allow to stand 45 seconds.
    8. Rinse excess Iodine as in step 1.2.6 above.
    9. While holding the slide at an angle, add a few drops of Decolorizer onto the slide, letting it trickle down over the stained bacteria just until the runoff is clear typically, about 5 seconds. Immediately rinse with water as in step 1.2.6 above.
      ملحوظة: This is a critical step in the protocol. Allowing Decolorizer to trickle too long or not long enough will result in false Gram-staining (4).
    10. Holding the slide level again, apply Gram's Safranin to completely cover the bacteria, allow to stand 45 seconds.
    11. Rinse excess Safranin as in step 1.2.6 above.
    12. Blot, do not rub, excess water from slide using paper towels.
    13. Examine slide on the microscope using oil-immersion with a 100X objective.
    1. Gram-positive bacteria will stain purple.
    2. Gram-negative bacteria will stain red.
    3. Shape (cocci, bacilli, curved rods, spirals) of bacteria will be visible.
    4. Arrangement of bacterial cells (single cells, paired cells, chains of cells, clusters, groupings) will be visible.

    2. Capsule Staining

    1. Set-up
      1. Wear gloves and a lab coat as dyes stain hands and clothing.
      2. To prepare 1% Crystal Violet solution, mix 0.25 gram Crystal Violet with 25 mL distilled water until dissolved.
      3. To prepare 1% Congo Red solution, mix 0.25 gram Congo Red with 25 mL distilled water until dissolved.
      4. Clean slides with laboratory wipes.
      1. Place 10 µL Congo Red on slide.
      2. Using a pipet tip, smear a bacterial colony into the dye to produce a thin even layer.
      3. Completely air-dry slide with dye/cell mixture, 5-7 minutes.
        ملحوظة: Do not heat fix as heating can dehydrate or distort the capsule.
      4. Flood the smear with 1% Crystal Violet for 1 minute.
      5. Rinse excess stain by holding the slide at an angle and squirting a gentle, indirect stream of water onto the slide and letting it run down over the stained bacteria. Do not squirt water directly onto the bacteria.
      6. Hold the slide at a 45-degree angle until completely air-dried.
      7. Examine smear on the microscope under oil-immersion with a 100X objective.
      1. Bacterial cells will stain purple.
      2. Background of the slide will stain dark.
      3. Capsules will be a clear halo around cells against a dark background.

      3. Endospore Staining (Schaeffer-Fulton method)

      1. Set-up
        1. Wear gloves and non-flammable lab coat to protect hands and clothing from dyes and flame.
        2. A Bunsen burner is used to heat fix the bacteria. Use care when working with flame tie back long hair.
        3. To prepare 0.5% Malachite Green solution, mix 0.125 grams Malachite Green with 25 mL distilled water until dissolved.
        4. Use commercially available Gram's Safranin reagent solution.
        5. Clean slides with laboratory wipes.
        1. Pipet 10 µl phosphate buffered saline (PBS) or culture broth onto slide.
        2. Using aseptic technique, smear a bacterial colony into the liquid to produce a thin even layer.
          ملحوظة: Endospores generally do not form in young cells, therefore the culture is recommended to be between 18 and 36 hours old (9).
        3. Completely air-dry slide.
        4. Heat fix by passing slide (bacteria side up) through flame 4-5 times.
        5. To help contain the dye, place a piece of lens paper (cut to fit the bacterial smear) over the heat fixed smear.
        6. Saturate lens paper with Malachite Green solution.
        7. Place slide on top of beaker of boiling water on a hot plate, and steam slide for 5 minutes, keeping lens paper moist by adding more dye a drop at a time as needed.
          ملحوظة: Avoid overheating and drying out the dye solution.
        8. Remove slide from beaker, remove and discard lens paper, allow slide to cool 2 minutes.
        9. Holding slide at an angle, rinse thoroughly by squirting a gentle, indirect stream of water onto slide, allowing it to drain down over smear.
        10. Holding slide level, flood smear with Safranin, allow to stand 1 minute.
        11. Rinse excess Safranin as in step 3.2.9 above.
        12. Allow to air-dry.
        13. Examine slide on microscope under oil-immersion with a 100X objective.
        1. Spores will stain green.
        2. Vegetative cells will stain red.
        3. Some vegetative cells will contain spores the cells will stain red, while the endospores will stain green.

        Bacteria are microscopic living organisms that have many distinguishing characteristics such as shape, arrangement of cells, whether or not they produce capsules, and if they form spores. These features can all be visualized by staining and aid in the identification and classification of different bacterial species.

        To examine the first two characteristics of cell shape and arrangement, we can use a simple technique called Gram staining. Here, crystal violet is applied to bacteria, which have been heat-fixed onto a slide. A decolorizer is then applied and any bacteria with a thick peptidoglycan layer will stain purple, as this layer is not easily penetrated by the decolorizer. These bacteria are referred to as Gram positive.

        Gram negative bacteria have a thinner peptidoglycan layer and will de-stain the decolorizer, losing the purple color. However, they will stain reddish-pink when a safranin counter stain is added, which binds to a lipopolysaccharide layer on their outside. Once stained, the cells can be observed for morphology, size, and arrangement, such as in chains or clusters, which further aids in classification and identification.

        Another useful technique in the microbiologist's toolkit is the capsule stain, used to visualize external capsules that surround some types of bacterial cells. Due to the capsules non-ionic composition and tendency to repel stains, simple staining methods won't work. Instead, a negative staining technique is used, which first stains the background with an acidic colorant, such as Congo red, before the bacterial cells are stained with crystal violet. This leaves any capsule present as a clear halo around the cells.

        The final major staining technique covered here can help determine if the bacteria being studied forms spores. In adverse conditions, some bacteria produce endospores, dormant, tough, non-reproductive structures, whose primary function is to ensure the survival of bacteria through periods of environmental stress, like extreme temperatures or dehydration. However, not all bacterial species make endospores, and they are difficult to stain with standard techniques because they are impermeable to many dyes. The Schaeffer-Fulton method uses malachite green stain, which is applied to the bacteria fixed to a slide. The slide is then washed with water before being counter stained with safranin. Vegetative cells will appear pinkish-red, while any endospores present will appear green. In this video, you will learn how to perform these common bacterial staining techniques and then examine the staining samples using light microscopy.

        To begin the procedure, tie back long hair and put on the appropriate personal protective equipment, including a lab coat and gloves.

        Then, clean a fresh microscope slide with a laboratory wipe. Next, pipette 10 microliters of 1X phosphate buffered saline onto the first slide. Then, use a sterile pipette tip to select a single bacterial colony from the LB agar plate. Smear the bacterial colony in the liquid to produce a thin, even layer. Set the slide on the bench top, and allow it to fully air dry.

        Once dried, light a Bunsen burner to heat fix the bacteria. Using tongs, pass the slide through the burner flame several times, with the bacteria side up, taking care not to hold the slide in the flame too long, which may distort the cells.

        Now, working over the sink, hold the slide level and apply several drops of Gram's crystal violet to completely cover the bacterial smear and then, place the slide onto the bench to stand for 45 seconds. Next, hold the slide at an angle, and gently squirt a stream of water onto the top of the slide, taking care not to squirt the bacterial smear directly. Now, holding the slide level again, apply Gram's iodine solution to completely cover the stained bacteria and then, allow it to stand for another 45 seconds. Next, carefully rinse the iodine from the slide, as shown previously. While holding the slide at an angle, add a few drops of Gram's decolorizer to the slide, allowing it to run down over the stained bacteria, just until the run-off is clear, for approximately 5 seconds. Immediately, rinse with water as shown previously. This will limit over-decolorizing the smear. Next, holding the slide level again, apply Gram's safranin counter-stain to completely cover the stained bacteria. After 45 seconds, gently rinse the safranin from the slide with water, as shown previously, and then, blot dry with paper towels.

        Finally, add a drop of immersion oil directly to the slide, and then, examine the slide using a light microscope with a 100X oil objective lens.

        To begin this staining protocol, first put on the correct personal protective equipment, and then, ensure that the glass slides that will be used are clean.

        Next, prepare the solutions. To make 1% crystal violet solution, mix 0.25 grams of crystal violet powder with 25 milliliters of distilled water, and vortex until dissolved. Then, prepare 1% Congo red solution by mixing 0.25 grams of Congo red powder with 25 milliliters of distilled water and vortex until dissolved. Now, pipette 10 microliters of the Congo red solution onto the slide. Using a clean, sterile pipette tip, select a single bacterial colony from the LB agar plate. Then, smear the bacterial colony into the dye to produce a thin, even layer. Completely air dry the bacterial slide for 5-7 minutes. Once the slide is dry, flood the smear with enough 1% crystal violet to cover the smear and let it sit for 1 minute. Now, hold the slide at an angle and gently squirt a stream of water onto the top of the slide, taking care not to squirt the bacteria directly. Continue holding the slide at a 45 degree angle until completely air dried. Finally, add a drop of immersion oil directly to the slide, and then, examine the slide using a light microscope with a 100X oil objective.

        To perform endospore staining, first, prepare a 0.5% malachite green solution by mixing 0. 125 grams of malachite green powder with 25 milliliters of distilled water, and then vortex the solution until dissolved. Next, pipette 10 microliters of 1X PBS onto the center of the slide. Then, use a sterile pipette tip to select a single bacterial colony from the LB agar plate. Smear the bacteria into the liquid to produce a thin, even layer. Now, set the slide on the bench top, and allow it to fully air dry. Once dried, light a Bunsen burner to heat fix the bacteria. Pass the slide through the blue burner flame several times, with the bacteria side facing up. Then, once the slide has cooled, place a piece of precut lens paper over the heat fixed smear. Next, turn on a hotplate to the highest setting, and bring a beaker of water to a boil.

        Saturate the lens paper with the malachite green solution and, using tongs, place the slide on top of the beaker of boiling water to steam for 5 minutes. Keep the lens paper moist by adding more dye, one drop at a time, as needed. Next, again using tongs, pick up the slide from the beaker and remove and discard the lens paper. Allow the slide to cool for 2 minutes. Working over the sink, hold the slide at an angle, and gently squirt a stream of water onto the top of the slide. Now, hold the slide level and apply safranin to completely cover the slide. Then, allow it to stand for 1 minute. Next, hold the slide at an angle and rinse as previously shown. Allow the slide to air dry on the bench top. Finally, add a drop of immersion oil directly to the slide, and then, examine the slide with a light microscope, with a 100X oil objective.

        In the Gram staining protocol, two different colored stains can result. Dark purple staining indicates that the bacteria are Gram-positive, and that they have retained the crystal violet stain. In contrast, reddish-pink staining is a characteristic of Gram-negative bacteria, which instead will be colored by the safranin counter stain. Additionally, different shapes and arrangements of bacteria can be visualized after Gram staining. For example, it is possible to differentiate Cocci, or round bacteria, from rod-shaped Bacillus, or identify bacteria which forms strands, compared to those which typically aggregate as clumps, or occur singly.

        In a capsule stained microscope image, the bacterial cells will typically be stained purple, and the background of the slide should be darkly stained. Against this dark background, the capsules of the bacteria, if present, will appear as a clear halo around the cells.

        Lastly, in endospore staining, Vegetative cells will be stained red by the safranin counter stain. If endospores are present in the sample, these will retain the malachite green stain, and appear bluish-green in color.

        Applications and Summary

        Bacteria have distinguishing characteristics that can aid in their identification. Some of these characteristics can be observed by staining and light microscopy. Three staining techniques useful for observing these characteristics are Gram staining, Capsule staining, and Endospore staining. Each technique identifies different characteristics of bacteria and can be used to help physicians recommend treatments for patients, identify potential contaminants in samples or food products, and verify sample sterility.

        مراجع

        1. Black, J. G. Microbiology Principles and Explorations, 4 th edition. Prentice-Hall, Inc., Upper Saddle River, New Jersey. (1999)
        2. Madigan, M. T. and J. M. Martinko. بيولوجيا بروك للكائنات الدقيقة, 11 th edition. Pearson Prentice Hall, Upper Saddle River, New Jersey. (2006).
        3. Leboffe, M. J., and B. E. Pierce. A Photographic Atlas for the Microbiology Laboratory، الطبعة الثانية. Morton Publishing Company, Englewood, Colorado. (1996).
        4. Smith, A. C. and M. A. Hussey. Gram stain protocols. Laboratory Protocols. American Society for Microbiology, Washington, DC. Available from: http://www.asmscience.org/content/education/protocol/protocol.2886. (2005).
        5. Hughes, R. B. and A. C. Smith. Capsule Stain Protocols Laboratory Protocols. American Society for Microbiology, Washington, DC. Available from: http://www.asmscience.org/content/education/protocol/protocol.3041. (2007).
        6. Anthony, E. E. Jr. A note on capsule staining. علم73(1890):319-320 (1931).
        7. Finegold, S. M., W. J. Martin, and E. G. Scott. Bailey and Scott's Diagnostic Microbiology, 5 th edition. The C. V. Mosby Company, St. Louis, Missouri. (1978).
        8. Gerhardt, P., R. G. E. Murray, W. A. Wood, and N. R. Krieg. Methods for general and molecular bacteriology. ASM Press, Washington, DC. (1994).
        9. Hussey, M. A. and A. Zayaitz. Endospore Stain Protocol. Laboratory Protocols. American Society for Microbiology, Washington, DC. Available from: http://www.asmscience.org/content/education/protocol/protocol.3112. (2007).

        كشف الدرجات

        Bacteria are microscopic living organisms that have many distinguishing characteristics such as shape, arrangement of cells, whether or not they produce capsules, and if they form spores. These features can all be visualized by staining and aid in the identification and classification of different bacterial species.

        To examine the first two characteristics of cell shape and arrangement, we can use a simple technique called Gram staining. Here, crystal violet is applied to bacteria, which have been heat-fixed onto a slide. A decolorizer is then applied and any bacteria with a thick peptidoglycan layer will stain purple, as this layer is not easily penetrated by the decolorizer. These bacteria are referred to as Gram positive.

        Gram negative bacteria have a thinner peptidoglycan layer and will de-stain the decolorizer, losing the purple color. However, they will stain reddish-pink when a safranin counter stain is added, which binds to a lipopolysaccharide layer on their outside. Once stained, the cells can be observed for morphology, size, and arrangement, such as in chains or clusters, which further aids in classification and identification.

        Another useful technique in the microbiologist's toolkit is the capsule stain, used to visualize external capsules that surround some types of bacterial cells. Due to the capsules non-ionic composition and tendency to repel stains, simple staining methods won't work. Instead, a negative staining technique is used, which first stains the background with an acidic colorant, such as Congo red, before the bacterial cells are stained with crystal violet. This leaves any capsule present as a clear halo around the cells.

        The final major staining technique covered here can help determine if the bacteria being studied forms spores. In adverse conditions, some bacteria produce endospores, dormant, tough, non-reproductive structures, whose primary function is to ensure the survival of bacteria through periods of environmental stress, like extreme temperatures or dehydration. However, not all bacterial species make endospores, and they are difficult to stain with standard techniques because they are impermeable to many dyes. The Schaeffer-Fulton method uses malachite green stain, which is applied to the bacteria fixed to a slide. The slide is then washed with water before being counter stained with safranin. Vegetative cells will appear pinkish-red, while any endospores present will appear green. In this video, you will learn how to perform these common bacterial staining techniques and then examine the staining samples using light microscopy.

        To begin the procedure, tie back long hair and put on the appropriate personal protective equipment, including a lab coat and gloves.

        Then, clean a fresh microscope slide with a laboratory wipe. Next, pipette 10 microliters of 1X phosphate buffered saline onto the first slide. Then, use a sterile pipette tip to select a single bacterial colony from the LB agar plate. Smear the bacterial colony in the liquid to produce a thin, even layer. Set the slide on the bench top, and allow it to fully air dry.

        Once dried, light a Bunsen burner to heat fix the bacteria. Using tongs, pass the slide through the burner flame several times, with the bacteria side up, taking care not to hold the slide in the flame too long, which may distort the cells.

        Now, working over the sink, hold the slide level and apply several drops of Gram's crystal violet to completely cover the bacterial smear and then, place the slide onto the bench to stand for 45 seconds. Next, hold the slide at an angle, and gently squirt a stream of water onto the top of the slide, taking care not to squirt the bacterial smear directly. Now, holding the slide level again, apply Gram's iodine solution to completely cover the stained bacteria and then, allow it to stand for another 45 seconds. Next, carefully rinse the iodine from the slide, as shown previously. While holding the slide at an angle, add a few drops of Gram's decolorizer to the slide, allowing it to run down over the stained bacteria, just until the run-off is clear, for approximately 5 seconds. Immediately, rinse with water as shown previously. This will limit over-decolorizing the smear. Next, holding the slide level again, apply Gram's safranin counter-stain to completely cover the stained bacteria. After 45 seconds, gently rinse the safranin from the slide with water, as shown previously, and then, blot dry with paper towels.

        Finally, add a drop of immersion oil directly to the slide, and then, examine the slide using a light microscope with a 100X oil objective lens.

        To begin this staining protocol, first put on the correct personal protective equipment, and then, ensure that the glass slides that will be used are clean.

        Next, prepare the solutions. To make 1% crystal violet solution, mix 0.25 grams of crystal violet powder with 25 milliliters of distilled water, and vortex until dissolved. Then, prepare 1% Congo red solution by mixing 0.25 grams of Congo red powder with 25 milliliters of distilled water and vortex until dissolved. Now, pipette 10 microliters of the Congo red solution onto the slide. Using a clean, sterile pipette tip, select a single bacterial colony from the LB agar plate. Then, smear the bacterial colony into the dye to produce a thin, even layer. Completely air dry the bacterial slide for 5-7 minutes. Once the slide is dry, flood the smear with enough 1% crystal violet to cover the smear and let it sit for 1 minute. Now, hold the slide at an angle and gently squirt a stream of water onto the top of the slide, taking care not to squirt the bacteria directly. Continue holding the slide at a 45 degree angle until completely air dried. Finally, add a drop of immersion oil directly to the slide, and then, examine the slide using a light microscope with a 100X oil objective.

        To perform endospore staining, first, prepare a 0.5% malachite green solution by mixing 0. 125 grams of malachite green powder with 25 milliliters of distilled water, and then vortex the solution until dissolved. Next, pipette 10 microliters of 1X PBS onto the center of the slide. Then, use a sterile pipette tip to select a single bacterial colony from the LB agar plate. Smear the bacteria into the liquid to produce a thin, even layer. Now, set the slide on the bench top, and allow it to fully air dry. Once dried, light a Bunsen burner to heat fix the bacteria. Pass the slide through the blue burner flame several times, with the bacteria side facing up. Then, once the slide has cooled, place a piece of precut lens paper over the heat fixed smear. Next, turn on a hotplate to the highest setting, and bring a beaker of water to a boil.

        Saturate the lens paper with the malachite green solution and, using tongs, place the slide on top of the beaker of boiling water to steam for 5 minutes. Keep the lens paper moist by adding more dye, one drop at a time, as needed. Next, again using tongs, pick up the slide from the beaker and remove and discard the lens paper. Allow the slide to cool for 2 minutes. Working over the sink, hold the slide at an angle, and gently squirt a stream of water onto the top of the slide. Now, hold the slide level and apply safranin to completely cover the slide. Then, allow it to stand for 1 minute. Next, hold the slide at an angle and rinse as previously shown. Allow the slide to air dry on the bench top. Finally, add a drop of immersion oil directly to the slide, and then, examine the slide with a light microscope, with a 100X oil objective.

        In the Gram staining protocol, two different colored stains can result. Dark purple staining indicates that the bacteria are Gram-positive, and that they have retained the crystal violet stain. In contrast, reddish-pink staining is a characteristic of Gram-negative bacteria, which instead will be colored by the safranin counter stain. Additionally, different shapes and arrangements of bacteria can be visualized after Gram staining. For example, it is possible to differentiate Cocci, or round bacteria, from rod-shaped Bacillus, or identify bacteria which forms strands, compared to those which typically aggregate as clumps, or occur singly.

        In a capsule stained microscope image, the bacterial cells will typically be stained purple, and the background of the slide should be darkly stained. Against this dark background, the capsules of the bacteria, if present, will appear as a clear halo around the cells.

        Lastly, in endospore staining, Vegetative cells will be stained red by the safranin counter stain. If endospores are present in the sample, these will retain the malachite green stain, and appear bluish-green in color.


        Colloidal Iron

        The colloidal iron technique is based upon the attraction of positively charged iron ions (ferric cations) for the negatively charged carboxylate and sulfate group endings in acidic mucins. The bound ferric ions are detected or visualized by subsequent treatment with potassium ferrocyanide to form bright blue deposits of ferric ferrocyanide or Prussian blue. While the colloidal iron technique is an extremely sensitive method for the detection of acid mucins, it is not as frequently used as other techniques such as Alcian blue. However, like Alcian blue the colloidal iron technique may be used in combination with the periodic acid also known as the Schiff technique.


        شاهد الفيديو: صبغة جرام وجدار البكتيريا Gram staining (قد 2022).


تعليقات:

  1. Aloeus

    أهنئ ، فكرة رائعة وهي على النحو الواجب

  2. Bestandan

    إنه بالتأكيد على حق

  3. Pueblo

    لن يعمل.

  4. Lindeberg

    يا لها من فكرة شيقة ..

  5. Dabi

    أعتقد أنك مخطئ. أنا متأكد. يمكنني الدفاع عن موقفي. أرسل لي بريدًا إلكترونيًا في PM ، سنتحدث.

  6. Latif

    بيننا يتحدث ، في رأيي ، واضح. لا أرغب في تطوير هذا الموضوع.



اكتب رسالة