معلومة

عرض Phagemid

عرض Phagemid


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

إذا كنت أستخدم عاثية عاثية لعرض الملتهمة وأحاول تجنب تأثيرات الطغيان باستخدام العاثية المساعدة ، فما هي أفضل طريقة للحفاظ على حجم مكتبة كبير مع الاحتفاظ بكل شيء أحاديًا؟ أنا أسأل من حيث الحفاظ على نسبة عدوى مناسبة و / أو حيل العاثيات والأدوات للحفاظ على قياس العناصر المتكافئة.


لقد وجدت مقال في الطبيعة:

الملتهمة المساعدة لتحسين عرض الجسم المضاد أحادي السلسلة في عرض الملتهمة

بروتوكول تجريبي

تم تنفيذ إجراءات الاستنساخ القياسية وتحديد وحدات تكوين المستعمرات ووحدات تشكيل اللويحات والتطعيم المناعي بعد PAGE وفقًا لـ Sambrook et al.

بناء خط خلية التعبئة والتغليف.

DH5alpha / pIII [M13KO7DeltapIII]. تم إدخال الجين M13 pIII المندمج مع المروج P / A1 / 04/03 (المرجع 17) في موقع الاستنساخ المتعدد لبلازميد lambdaattP pLDR9 (المرجع 18). تم قطع أصل التكرار وجين مقاومة الكاناميسين وتم تدين الحمض النووي غير المتماثل lambdaattP-pIII المتبقي. تم تحويل الإشريكية القولونية DH5alpha المحتوية على البلازميد pLDR8 (المرجع 18) باستخدام الحمض النووي غير المتكرر lambdaattP-pIII وطليها على ألواح أجار تحتوي على 25 ميكروغرام / مل أمبيسيلين. بعد الحضانة بين عشية وضحاها عند 42 درجة مئوية ، تم تحديد المستعمرات التي تم الحصول عليها مطلية بالنسخ المتماثلة وتم التعرف على استنساخ مقاوم للأمبيسيلين ، أطلق عليه اسم E. coli DH5alpha / pIII. تم تحويلها لاحقًا باستخدام M13KO7DeltapIII ، مما أدى إلى ظهور خط خلية التعبئة E. coli DH5alpha / pIII [M13KO7DeltapIII].

إنتاج العاثية.

للحصول على الملتهمة المساعدة M13KO7DeltapIII ، تم نقل M13KO7DeltapIII DNA إلى الإشريكية القولونية K802 المحتوية على pNDI (المرجع 15). للحصول على hyperphage ، تم نقل M13KO7DeltapIII DNA إلى الإشريكية القولونية DH5alpha / pIII. تم إنتاج Phage عن طريق الزراعة في وجود 0.5 ملي مولار من الأيزوبروبيل بيتا- D- ثيوجالاكتوزيد (IPTG) عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة مع الرج عند 200 دورة في الدقيقة. تم إصابة Escherichia coli Top10F 'أو E. coli Xl1blue التي تحمل pSEXphOx (Yol) phagemid أو مكتبة scFv في pSEX81 ، على التوالي ، بمستحضر ملقم مساعد عند OD 600 من 0.1 عند تعدد إصابة 20 كما هو موصوف.

تقدير Phage بواسطة ELISA.

تم طلاء سلسلة التخفيف من الملتهمة في 100 ملي مولار NaHCO3 ، ودرجة الحموضة 8.6 في ألواح MaxiSorb ELISA (Life Technologies ، Karsruhe ، ألمانيا) لمدة 16 ساعة عند 4 درجات مئوية. تم إجراء الحجب باستخدام مسحوق حليب منزوع الدسم بنسبة 2 ٪ في PBS (137 ملي كلوريد الصوديوم ، 3 ملي كلوريد الصوديوم ، 8 ملي مولار Na2HPO4 ، 1 ملي KH2PO4 ، الرقم الهيدروجيني 7.3) لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة. تم اكتشاف Phage باستخدام الجسم المضاد للفأر أحادي النسيلة B62-FE2 (Progen ، هايدلبرغ ، ألمانيا) الذي ربط على وجه التحديد حاتمة على بروتين الغلاف الرئيسي pVIII من فج M13. تم استخدام فج M13KO7 من وحدات تشكيل المستعمرات المعروفة للتوحيد القياسي.

لطخة مناعية.

تم تطبيق ما يقرب من 1010 ملتهمة لكل حارة على هلام بولي أكريلاميد بنسبة 10 ٪. تم الحجب باستخدام مسحوق حليب منزوع الدسم بنسبة 2٪ في PBS لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة. تم إجراء التلقيح المناعي باستخدام الفأر mAb anti-g3p (MoBiTec ، Göttingen ، ألمانيا) للتعرف على بروتين طبقة pIII لـ M13KO7 ، الذي تم تصويره باستخدام ركيزة tetramethylbenzidene (TMB) 3،3 '، 5،5' (بروميغا ، ماديسون ، ويسكونسن).

عاثية ELISA ملزمة للمستضد.

تم طلاء سلسلة التخفيف من مستضد BSA-phOx في 100 ملي مولار NaHCO3 ، درجة الحموضة 8.6 ، في ألواح MaxiSorb ELISA (تقنيات الحياة) لمدة 16 ساعة عند 4 درجات مئوية. بعد منع الارتباط غير المحدد مع 2 ٪ من مسحوق الحليب منزوع الدسم في PBS لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة ، تم تطبيق 2 مرات 109 ملتهمة أحادية السلسلة مخففة في مسحوق حليب منزوع الدسم بنسبة 2 ٪ في PBS على كل بئر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل ست مرات بـ 400 مول PBS لكل بئر ، تم اكتشاف الملتهمة المقيدة باستخدام mAb B62-FE2 كما هو موضح أعلاه.

بالغسل.

تم إنشاء مكتبة شظية بشرية scFv في pSEX81 مع تعقيد أقصى محسوب 2 مرات 107 من مستحضرات الخلايا الليمفاوية المحيطية كما هو موصوف. تم طلاء سم الكزاز الذي تم الحصول عليه من Virotech (روسلسهايم ، ألمانيا) بستة آبار ELISA (تقنيات الحياة) بتركيز 0.1 مج / مل في 100 ملي مولار NaHCO3 ، درجة الحموضة 8.6 ، لمدة 16 ساعة عند 4 درجات مئوية. تم حظر الآبار بحليب منزوع الدسم بنسبة 2 ٪ في PBS لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة ، وبعد ذلك تم تطبيق 1011 فجوة من المكتبة على كل بئر وحضنت عند 4 درجات مئوية طوال الليل. بعد خمس غسلات باستخدام PBS / 0.1٪ Tween وخمسة مع PBS ، تمت تصفية الملتهمة المقيدة بـ 1 كوب / مل من التربسين (تقنيات الحياة) في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تم استخدام الملتهمة المخففة لعدوى 20 مل من الإشريكية القولونية XL1blue عند OD 600 من 0.4. نمت البكتيريا المصابة على ألواح أجار Luria-Bertani المحتوية على الجلوكوز والأمبيسلين ، خدش من الصفائح ، واستخدمت لإنتاج فجوة الأجسام المضادة للجولة التالية من الغسل كما هو موصوف سابقًا.


حدث أول مثال موصوف لـ Phage Display في عام 1985 ، عندما قام جورج ب. سميث بدمج الببتيد مع الجين الثالث من العاثية الخيطية. قدم براءة اختراع توضح بالتفصيل عملية إنشاء مكتبات عرض فج في نفس العام. في النهاية ، أدى التطوير الإضافي لتقنية عرض Phage بقيادة مجموعات مختلفة من مختبر MRC للبيولوجيا الجزيئية ، وكذلك من معهد أبحاث Scripps ، إلى إمكانية عرض البروتينات لغرض هندسة البروتينات العلاجية. تم تحسين هذه التقنية بشكل مستمر لفحص وتضخيم مجموعات ضخمة من البروتينات مما يدل على ارتباط النمط الظاهري بالنمط الجيني بشكل أفضل.

يبلغ قطر العاثية الخيطية حوالي 6.5 نانومتر ، ويعتمد طولها على حجم جينومها. إنه يأتي من عائلة ضخمة من الفيروسات البكتيرية التي تصيب أيضًا أشكالًا أخرى من البكتيريا. يحتوي على جينوم صغير مع منطقة بين الجينات تحتوي على التسلسلات اللازمة لتكرار وتغليف الحمض النووي.

يتكون جسيم الملتهمة من خمسة غلاف بروتينات. يحتوي الجسيم على أنبوب مجوف يضم العديد من نسخ بروتين الغلاف الأساسي. هناك أيضًا تفاعلات ملزمة بين الأجزاء الوسطى الكارهة للماء للوحدات الفرعية المجاورة. أحد طرفي الجسيم غير حاد والآخر حاد. تحتوي النهاية الحادة على الكثير من نسخ أصغر نوعين من البروتينات المترجمة عن طريق الريبوسومات ، بينما تحتوي النهاية الحادة على حوالي 5 نسخ فقط من جينات pIII و pVI ، والتي تعد ضرورية لفصل العاثية عن غشاء الخلية.


محتويات

وصف جورج ب. سميث عرض العاثيات لأول مرة في عام 1985 ، عندما عرض عرض الببتيدات على الملتهمة الخيطية عن طريق إنشاء اندماج بروتين قفيصة الفيروس في مكتبة من متواليات الببتيد. & # 911 & # 93 يعرض هذا الببتيدات على السطح الفيروسي ، حيث يمكن اختيار تلك التي لديها أعلى تقارب للربط. في عام 1988 ، وصف ستيفن بارملي وجورج سميث التحليل البيولوجي لانتقاء التقارب وأظهروا أن جولات الانتقاء المتكررة يمكن أن تثري الحيوانات المستنسخة عند 1 في مليار أو أقل. & # 915 & # 93 في عام 1990 ، وصف جيمي سكوت وجورج سميث إنشاء مكتبات كبيرة من الببتيد العشوائي معروضة على الملتهمة الخيطية. & # 916 & # 93 تم تطوير تقنية عرض Phage وتحسينها بشكل أكبر من قبل مجموعات في مختبر البيولوجيا الجزيئية مع Greg Winter و John McCafferty ، ومعهد أبحاث Scripps مع Lerner and Barbas ومركز أبحاث السرطان الألماني مع Breitling و Dübel لعرض البروتينات مثل الأجسام المضادة لهندسة البروتينات العلاجية. حصل سميث ووينتر على نصف نصيب جائزة نوبل في الكيمياء لعام 2018 لمساهمتهما في تطوير عرض العاثيات. & # 917 & # 93 براءة اختراع لجورج بيتشزينك تدعي الأولوية من عام 1985 تصف أيضًا إنشاء مكتبات الببتيد. & # 918 & # 93


ما هو Phagemid (فاسميد)?

Phagemid ، كما يطلق عليه فاسميد ، هو نوع من المتجهات الهجينة أيضًا. يحتوي Phagemid على أصل خاص للنسخ المتماثل يُطلق عليه أصل F1 للنسخ المتماثل. مقتطفات أصل f1 من النسخ المتماثل من فج 1 f.

يمكن لـ Phagemid تكرار كل من الحمض النووي أحادي الجديلة ومزدوج الجديلة. يمكن أن يحدث النسخ المتماثل إما على شكل بلازميد أثناء خضوعه لتكرار مستقل أو يمكن تعبئته في جزيئات الملتهمة وإصابة المضيف البكتيري في النهاية بكتريا قولونية. عند إصابة بكتريا قولونية الخلايا ، تتطلب فجوة f1 وجود بيلوس. ومن ثم ، فإن الجنس الشعير مهم أثناء في المختبر التعبئة والتغليف من Phagemids.


نقاش

على الرغم من الاهتمام الهائل المركّز على عرض الملتهمة بوساطة pIII و pVIII ، لم تكن هناك تقارير منشورة عن pVII و pIX. كما هو موصوف هنا ، تم توضيح أنه يمكن استخدام pVII و pIX لعرض ببتيد العلم عند دمجه مع الطرف N لبروتيني الغلاف. بعد ذلك ، والأهم من ذلك ، أظهرنا أن المناطق المتغيرة للجسم المضاد مندمجة مع pVII و pIX تشارك في تفاعل ديناميكي لعرض جسم مضاد وظيفي Fv ، وهو نموذج مغاير مغاير.

بروتينات الغلاف pIII و pVI و pVIII و pVII و pIX هي بروتينات غشاء داخلي متكاملة قبل التجميع (24). مع ظهور نتائجنا ، تم استخدام الخمسة جميعًا الآن لعرض البروتينات على سطح الملتهمة. أظهر عمال آخرون أن pVII و pIX كانا موجودين كخمس جزيئات موجودة في نفس نهاية جسيم الملتهمة التي ظهرت أولاً من الخلية وكانت مطلوبة لبدء التجميع من خلال التفاعل مع إشارة التعبئة لجينوم الملتهمة (11). أدى عدم وجود pVII و pIX إلى إنتاج منخفض للغاية من الملتهمة. على الرغم من أنه قد تم اقتراح أن pVII و pIX لا يعملان مع بروتين آخر مدمج في N termini (24) ، أظهر تحقيقنا أن مثل هذه الاندماجات كانت قابلة للحياة. الأسباب المحتملة لنجاحنا كانت أن (أنا) تم دمج تسلسل قيادي يستهدف بروتينات الاندماج في الغشاء الداخلي ويمنع التراكم في السيتوبلازم و (ثانيا) تم استخدام النوع البري pVII و pIX من الملتهمة المساعدة للتنافس مع بروتينات الاندماج pVII و PIX. مع نجاح عملنا ، يجب أن يكون pVII و pIX قابلين للتطبيق بسهولة على بروتوكولات عرض الملتهمة التوافقية التي تستخدم تسلسلات بروتين متنوعة للغاية.

أظهرت العلامات الذهبية المحددة للعاثية Fv التي تم تحديدها من المجهر الإلكتروني بوضوح وجود الذهب في أحد طرفي جسيم الملتهمة. ومن المثير للاهتمام ، أنه تم ملاحظة الملتهمة التي كانت تحتوي على ملصق أو اثنين من العلامات الذهبية. نفترض أن هذا الأخير نتج عن العرض الثنائي لشظايا Fv ، بدلاً من وضع العلامات الذهبية المتعددة لـ PCP-BSA. تم تمييز ما يقرب من 20 ٪ من الملتهمة بالذهب ، وبالتالي ، تم عرض الجسم المضاد الوظيفي Fv. ومع ذلك ، أظهر التحليل الحركي أن نشاط 150 نانومتر 21H3 فج Fv كان مساويًا لنشاط 50 نانومتر 21H3 IgG. البيانات ، مجتمعة ، جنبًا إلى جنب مع افتراض أن الأنشطة المحددة لـ Fv و IgG كانت قابلة للمقارنة ، تشير إلى أن بعض جسيمات الملتهمة عرضت في وقت واحد أكثر من جزء Fv واحد. تم عرض عرض متعدد التكافؤ لشظايا Fv عند الطرف C من pIII سابقًا (23). علاوة على ذلك ، أدى تعديل ظروف النمو إلى تغيير التكافؤات في عرض الجسم المضاد (25) ، وبالتالي ، فإن تحريضنا باستخدام 1 ملي مولار من الأيزوبروبيل ثيوغالاكتوبيرانوسيد قد يزيد من إمكانية تعدد التكافؤ.

شظايا Fv هي مقاييس غير متجانسة مكونة من V.ح و V.إل هي أصغر أجزاء الجسم المضاد التي تحتوي على جميع المعلومات اللازمة لربط مولد الضد المحدد. ومع ذلك ، فإن السلاسل المرتبطة غير التساهمية في جزء Fv المعزول ليست مستقرة بدرجة عالية وتميل إلى الانفصال (26). الطرق المعروفة لتثبيت شظايا Fv هي Fvs أحادية السلسلة (scFvs) (1 ، 27 ، 28) و Fvs (dsFvs) (29-31). ومع ذلك ، لا تزال scFvs غالبًا غير مستقرة (29 ، 32 ، 33) ويمكن أن يكون لها ارتباطات أقل مقارنةً بـ Fabs و IgG الكامل لأن الرابط يتداخل مع الربط أو لا يثبت بشكل كافٍ المغير المتغاير (30 ، 34 ، 35). على الرغم من أن dsFvs بشكل عام أكثر استقرارًا ولا تحتوي على رابط ، إلا أنها تتطلب دمج ثاني كبريتيد في بناء المكتبة. بالإضافة إلى ذلك ، من المحتمل أن تغطي مكتبات dsFv مجموعة فرعية من الأجسام المضادة المتحيزة والتي لا يتداخل فيها ثنائي كبريتيد interchain مع ارتباط مولد الضد (35). يمكن النظر إلى الجسم المضاد Fv المعروض بواسطة pVII و pIX بصيغتنا على أنه Fv (psFv) المثبت بالتهيج يحاكي بنية الجسم المضاد الطبيعي دون عيوب scFvs و dsFvs. تحتفظ Fvs لدينا بالتقارب وهي قوية ، حيث يتم تثبيت كل سلسلة بشكل مستقل على طبقة الملتهمة.

الأهم من ذلك ، سيكون تنسيقنا الجديد مفيدًا بشكل خاص للعرض الاندماجي للمصفوفات غير المتجانسة. علاوة على ذلك ، على الرغم من أن الأسباب لم تتضح بعد ، يبدو أن هذا التنسيق يؤدي إلى إثراء قوي بشكل خاص أثناء بروتوكولات التحريك. يبدو أن pVII و pIX قريبان بدرجة كافية من اندماج البروتينات مع Vح و V.إل من جسم مضاد لتشكيل مغاير وظيفي. نتوقع تمامًا أن النهج يمكن أن يمتد إلى عرض عديد ببتيدات متنوعة لإنشاء أجسام مضادة اصطناعية. إن القدرة على عرض ذخيرة كبيرة من مجالات الربط الخافتة الجديدة غير المقيدة بالبرمجة المحددة لهيكل الجسم المضاد ستزيد من فهمنا لتفاعلات البروتين والبروتين وربما تؤدي إلى اكتشاف أنشطة بيولوجية فريدة.


ناقل عرض الملتهمة مُحسَّن لتوليد مكتبات اندماجية للأجسام المضادة البشرية والاستنساخ الجزيئي لشظايا الأجسام المضادة أحادية النسيلة

تم تحسين ناقل phagemid الجديد ، المسمى pCM ، لاستنساخ وعرض مكتبات أجزاء الجسم المضاد (Fab) على سطح الملتهمة الخيطية. يحتوي هذا المتجه على جزأين طويلتين من "حشو" الحمض النووي لتسهيل التمييز بين الأشكال المقطوعة بشكل صحيح للناقل. علاوة على ذلك ، في pCM ، يحتوي الجزء الموجود في موقع الاستنساخ ثقيل السلسلة على جين تشفير الفوسفاتيز الحمضي ، مما يسمح بالتمييز السهل بين خلايا Escherichia coli التي تحتوي على الشكل غير المعدل من phagemid مقابل تشفير الجزء الثقيل cDNA. في نسخ pCM لسلسلة ثقيلة Fd / gene III وسلسلة خفيفة يتم تشغيلها بواسطة مروج lacZ واحد. يتم توجيه السلسلة الخفيفة إلى محيط البلازما بواسطة ببتيد إشارة ompA ، في حين يتم الاتجار بالبروتين الثقيل السلسلة Fd / بروتين الغلاف III بواسطة ببتيد إشارة pelB. تم استخدام phagemid pCM لإنشاء مكتبة الأجسام المضادة للعاثية الاندماجية البشرية التي سمحت باختيار الجسم المضاد أحادي النسيلة Fab الموجه ضد البروتين النووي (NP) لفيروس الأنفلونزا أ.


المواد والأساليب

السلالات البكتيرية وظروف النمو والعاثية المساعدة

بكتريا قولونية سلالة TG1 (سوب thi-1 Δ (lac-proAB) Δ (mcrB-hsdSM)5 (rK - mK -) [F ' traD36 proAB lacI ف ضΔM15]) لإنشاء ناقلات phagemid pDJ01 ومكتبة عرض الملتهمة. بكتريا قولونية تم تحضين الخلايا في مستخلص الخميرة مرق التربتون (2xYT) و بكتريا قولونية المحولات في 2xYT مع 20 ميكروغرام مل -1 كلورامفينيكول (سم) عند 37 درجة مئوية مع التهوية. وسط صلب لنمو بكتريا قولونية تحتوي المحولات أيضًا على 1.5 ٪ (وزن / حجم) أجار. L. rhamnosus تم الحصول على سلالة HN001 من مركز أبحاث فونتيرا وتم نشرها في مرق Man-Rogosa-Sharpe (MRS) (Oxoid ، Basingstoke ، Hampshire ، إنجلترا) عند 37 درجة مئوية. مخزون الملتهمة المساعدة VCSM13d3 مع حذفها gIII تم الحصول عليها عن طريق عدوى المكمل بكتريا قولونية سلالة K1976 (TG1 تتحول مع بلازميد pJARA112 تحتوي على الطول الكامل gIII تحت سيطرة محفز عدوى الملتهمة psp [49]). الملتهمة المساعدة VCSM13 (gIII + تم نشر ستراتاجين ، سيدار كريك ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكية) على سلالة TG1.

عزل الحمض النووي من الكروموسومات L. rhamnosusHN001

لبناء المكتبة ، تم عزل الحمض النووي الكروموسومي من ثقافة ليلية لـ L. rhamnosus HN001 باستخدام تعديل للطريقة الموصوفة سابقًا [102]. باختصار ، تم تخفيف الثقافة الليلية بنسبة 1: 100 إلى 80 مل مرق MRS وحضنت طوال الليل عند 37 درجة مئوية. تم حصاد الخلايا بالطرد المركزي عند 5500 × جم لمدة 10 دقائق ، ثم أعيد تعليقها في 80 مل من مرق MRS وحضنت لمدة ساعتين إضافيتين عند 37 درجة مئوية. تم غسل الخلايا مرتين في 16 مل 30 ملي Tris-HCl (درجة الحموضة 8.0) ، 50 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي EDTA وتم تعليقها في 2 مل من نفس المخزن المؤقت الذي يحتوي على 25 ٪ (وزن / حجم) سكروز ، 20 مجم مل -1 ليزوزيم ( Sigma-Aldrich و Castle Hill و New South Wells و Austarlia) و 20 ميكروغرام مل -1 موتانوليسين (سيغما). تم تحضين المعلق لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. تم إنجاز مزيد من تحلل الخلايا بإضافة 2 مل 0.25 M EDTA ، 800 ميكرولتر 20 ٪ (وزن / حجم) SDS. بعد إضافة SDS ، تم خلط المعلق بعناية وحضنته عند 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، تمت إضافة RNase A (روش ، بازل ، سويسرا) إلى تركيز نهائي قدره 100 ميكروغرام مل -1 واستمرت الحضانة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تمت إضافة بروتيناز K (Roche) إلى تركيز نهائي قدره 200 ميكروغرام مل -1 وتم تحضين المعلق عند 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. أخيرًا ، بعد استخلاص الفينول والكلوروفورم ، تم ترسيب الحمض النووي بإضافة 1/10 حجم 3 م أسيتات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.2) و 2.5 مجلدات 95 ٪ (حجم / حجم) إيثانول. تم تكوير الحمض النووي بالطرد المركزي ، وغسله بنسبة 70 ٪ (حجم / حجم) من الإيثانول ، وتجفيفه بالهواء وإعادة تعليقه في حجم مناسب يبلغ 10 ملي مولار من Tris-HCl (درجة الحموضة 8.0).

بناء ناقل phagemid الجديد pDJ01

التمهيدي pDJ01F01 (5'-GGكككجاجاجCTGCAGCATGATGAAATTC-3 '، تحتوي على أذنأنا موقع (تحته خط) في نهاية 5) و pDJ01R01 (5'-GGGGAATTC TCTAGA CCCGGG GCATGCATTGTCCTCTTG-3 '، التي تحتوي على ، من نهاية 5 ، سابقة بمعنى البيئةRI (أول تسلسل مسطر) ، Xbaأنا (أول تسلسل جريء) ، SMAأنا (ثاني تسلسل مسطر) و Sphتم استخدام I (التسلسل الغامق الثاني) لمواقع التقييد) والقالب pJARA144 (غير منشور) لإنشاء منتج PCR يحتوي على psp مروج متبوعًا بموقع ربط ريبوزومي وموقع استنساخ متعدد. المنتج مشقوق مع أذنانا و سابقة بمعنى البيئةRI و ligated إلى أذنأنا-سابقة بمعنى البيئةهضم RI phagemid pAK100 [73]. وضع الربط psp المروج وموقع الربط الريبوزومي وموقع الاستنساخ المتعدد مباشرة في اتجاه المنبع من تسلسل يشفر علامة الببتيد C-myc ، متبوعًا بالقمع العنبر (TAG) إيقاف كودون وتسلسل ترميز لمجال carboxy-terminal الخاص بـ pIII (الشكل 1). تم تسمية البلازميد pDJ01.

بناء phagemid عرض SOF من S. المقيحة

التمهيدي pSOF22F01 (5'-CCGCCGATGCATTGACAAATTGTAAG-3 '، التي تحتوي على Nsiموقع I (مسطر)) و pSOF22R01 (5'-CCGCCGGAATTCCTCGTTATCAAAGTG-3 '، يحتوي على سابقة بمعنى البيئةموقع RI (مسطر)) والقالب والحمض النووي المنقى لاستنساخ λEMBL4 من sof22 من عند S. المقيحة تم استخدام السلالة D734 (النمط المصلي M22 The Rockefeller University Collection) لتوليد منتج PCR يشفر SOF لسلالة M22 ، بما في ذلك تسلسل الإشارة ولكن باستثناء جدار الخلية وتسلسل غشاء المرساة (963 من البقايا). تم استخدام سبعة وعشرين دورة للتضخيم sof22. بدأ بروتوكول التدوير الحراري بخطوة تمسخ أولية لمدة دقيقتين عند 94 درجة مئوية ، تليها 10 دورات من: خطوة تمسخ (94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية) ، وخطوة تلدين (59 درجة مئوية لمدة 30 ثانية) وخطوة تمديد (72 درجة مئوية لمدة 2.5 دقيقة). تم إجراء 17 دورة لاحقة بنفس خطوات التمسخ والتلدين ولكن تمت زيادة طول خطوة الاستطالة بمقدار 2 ثانية في كل دورة. تم تمديد خطوة التمديد في الدورة النهائية إلى سبع دقائق لضمان تصنيع جميع المنتجات بالكامل. تم شق منتج PCR مع Nsiانا و سابقة بمعنى البيئةRI و ligated إلى Nsiأنا-سابقة بمعنى البيئةناقل RI المشقوق pDJ01. تمت تسمية هذا phagemid pSOF22.

فحوصات الإنتاج والوظيفية لجزيئات phagemid التي تعرض SOF

تم إنشاء جزيئات phagemid عن طريق إصابة 100 مل من المزارع المتزايدة بشكل أسي من TG1 (pSOF22) بمخزون الملتهمة المساعدة عند تعدد الإصابة بـ 50 فجوة لكل بكتيريا. تم استخدام العاثيات المساعدة VCSM13 و VCSM13d3 لإنتاج جزيئات phagemid من pSOF22 (تسمى pSOF22 PP / wt و pSOF PP / d3 ، على التوالي) و VCSM13 فقط لإنتاج pDJ01 (التحكم في جسيمات phagemid السالب المسمى pDJ01 PP / wt). لم يتم استخدام الملتهمة المساعدة VCSM13d3 لإنتاج جزيئات phagemid pDJ01 بسبب نقص pIII الوظيفي. تم تحضين الخلايا المصابة لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية مع التهوية. تم تكوير الخلايا المضيفة بواسطة الطرد المركزي وجسيمات phagemid التي تم جمعها في المادة الطافية. تمت تنقية جزيئات phagemid عن طريق الترسيب في 5 ٪ (وزن / حجم) PEG ، 500 ملي كلوريد الصوديوم وتعليقها في محلول ملحي بالفوسفات (PBS 125 ملي كلوريد الصوديوم ، 1.5 ملي مولار KH2ص4، 8 ملم نا2HPO4 و 2.5 ملي بوكل ، ودرجة الحموضة 7.6). تم قياس كمية الجسيمات phagemid بناءً على كمية الحمض النووي phagemid بعد تعطيل الفيروسات عند 70 درجة مئوية في 1 ٪ (وزن / حجم) SDS كما هو موضح سابقًا [33].

تم إجراء اختبار عتامة المصل عن طريق خلط 1 مل من مصل الحصان المعطل بالحرارة مع 10 11 جزيء phagemid يعرض SOF (pSOF22 PP / wt pSOF22 / d3) أو تحكم سلبي (pDJ01 PP / wt) في وجود أزيد الصوديوم. تم تحضين التفاعلات عند 37 درجة مئوية وتمت مراقبة الدورة الزمنية لزيادة الكثافة الضوئية بمرور الوقت عن طريق قياس الكثافة الضوئية بطول موجة 405 نانومتر.

تم إجراء اختبار الارتباط بالفيبرونيكتين بواسطة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA [103]). تم طلاء آبار ميكروتر (Nunc-Immuno MaxySorp ™ ، روسكيلد ، الدنمارك) مع فبرونيكتين البلازما بتركيز نهائي قدره 20 ميكروغرام مل -1 ، 100 ميكرولتر لكل بئر في PBS (الرقم الهيدروجيني 7.2) لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية. تم غسل الآبار مرة واحدة باستخدام 300 ميكرولتر من PBS ، 0.05 ٪ Tween 20 buffer (PBST) ثم تم حظرها باستخدام 1 ٪ (وزن / حجم) من ألبومين مصل البقر (BSA) في برنامج تلفزيوني لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة. تم بعد ذلك غسل الآبار (ثلاث مرات) باستخدام 300 ميكرولتر من محلول PBST. تمت إضافة جزيئات Phagemid (2 × 10 8) في 100 ميكرولتر من PBS إلى الآبار. كانت عناصر التحكم السلبي في المخزن المؤقت هي TE (10 ملي مولار تريس ، 1 ملي مولار ، EDTA ، درجة الحموضة 8.0) ، PBS ، و 0.05٪ (وزن / حجم) BSA في برنامج تلفزيوني ، والتحكم السلبي في الجسيمات phagemid كان pDJ01 PP / wt ، تم إنشاؤه كما هو موصوف أعلاه. تم تحضين الأطباق لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة. تمت إزالة جزيئات phagemid غير المقيدة عن طريق الغسيل بـ PBST (سبع مرات). للكشف عن جزيئات phagemid المرتبطة ، تمت إضافة 100 ميكرولتر من الفأر المضاد للـ pVIII (جسم مضاد أحادي النسيلة لـ M13 و fd و f1 ، Progen Biotechnik ، هايدلبرغ ، ألمانيا) عند 0.1 ميكروغرام مل -1 في 0.1 ٪ (وزن / حجم) تمت إضافة BSA / PBS واحتضانها لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تم بعد ذلك غسل الآبار باستخدام محلول PBST 300 ميكرولتر (خمس مرات) وأضيف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد للفأر المترافق مع HRP عند تخفيف 1: 2000 وحضنت لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة. تم غسل اللوح سبع مرات بمخزن PBST وتم تطويره باستخدام مجموعة الركيزة ImmunoPure TMB (بيرس ، روكفورد ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية). تمت قراءة الامتصاصية عند 450 نانومتر. تم قياس كمية الجسيمات phagemid كما هو موضح أعلاه.

بناء مكتبة الجينوم بأكملها

شيدت المكتبة من المنفصمة ميكانيكيا (إرذاذ) L. rhamnosus HN001 DNA واستنساخه في ناقل phagemid pDJ01. تم تعريض البخاخات الطبية التي يمكن التخلص منها والتي تحتوي على 1.5 مل من الحمض النووي الصبغي المخزن (حوالي 20 ميكروغرام) و 25٪ (حجم / حجم) جلسرين لغاز النيتروجين عند ضغط 10 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 90 ثانية. تباينت الأجزاء التي تم الحصول عليها في الحجم بين 0.3 و 4 كيلو بايت ، مع الأغلبية بين 0.5 و 1.6 كيلو بايت. تم تحقيق النهايات غير الحادة عن طريق العلاج باستخدام بوليميريز T4 DNA (Roche) ، وجزء Klenow من بوليميريز الحمض النووي I (Roche) و OptiKinase ™ (شركة USB ، كليفلاند ، أوهايو ، الولايات المتحدة الأمريكية). للتخلص من الأجزاء التي تقل عن 0.3 كيلو بايت ، تم استخدام راتنج استبعاد حجم Sepharose CL-4B 200 (Sigma). تم هضم ناقل phagemid pDJ01 باستخدام إنزيم التقييد SMAأنا (روش) ونزع الفسفرة مع الروبيان الفوسفاتيز القلوي (روش). تم إجراء التلاعب في الحمض النووي وفقًا للطرق القياسية [104].

تم ربط ما يقرب من 10 ميكروغرام من الأجزاء الجينومية بـ 3 ميكروغرام من المتجه pDJ01 باستخدام T4 ligase (Roche). بعد استخلاص الفينول والكلوروفورم ، تم ترسيب الحمض النووي المرتبط بالإيثانول ، وغسله باستخدام 70٪ (حجم / حجم) إيثانول ومذاب في 25 ميكرولتر.2تم تحويل مزيج الربط إلى بكتريا قولونية TG1 عن طريق التثقيب الكهربائي (2.5 كيلو فولت ، 25 درجة فهرنهايت ، 400 درجة مئوية) في فتحات 2 مم. تم نقل الخلايا المحولة إلى 50 مل من 2xYT وحضنت لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية مع التحريض الدوراني. بعد الحضانة تم أخذ قسامة 2 مل لتحديد عدد المحولات عن طريق الطلاء على 2xYT أجار مع 20 ميكروغرام مل -1 كلورامفينيكول. تم تضخيم البكتيريا المتبقية بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع التهوية.

الاختيار المباشر لمكتبة عرض الملتهمة السرطانية

تم استخدام قسامة 1 مل من الثقافة الليلية التي تحتوي على مكتبة الجينوم الكاملة لتلقيح 25 مل من 2xYT-Cm. الثقافة المتنامية باطراد (OD600 ما يقرب من 0.2) مصاب بالعاثة المساعدة VCSM13d3 (تعدد العدوى = 50) لمدة 1 ساعة. تم حصاد الخلايا بعد ذلك بالطرد المركزي عند 3200 × جم لمدة 10 دقائق ، تم إعادة تعليق الحبيبات في 1 مل من 2 × YT ، وخلطها مع 10 مل من أجار ناعم (2xYT مرق مع 0.5 ٪ (وزن / حجم) agarose) وصب على أربعة 2xYT-Cm لوحات. احتوى كل من الأجار الناعم والألواح على أجاروز بدرجة البيولوجيا الجزيئية بدلاً من أجار البكتريولوجية. تم تحضين الصفائح طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، ثم تم استخلاص جزيئات phagemid من الصفائح بإضافة 5 مل من 2xYT على كل لوح متبوعًا بإثارة دورانية بطيئة عند درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعات. تم ترسيب جزيئات phagemid المستخرجة بنسبة 5 ٪ (وزن / حجم) PEG ، 0.5 مولار كلوريد الصوديوم وتعليقها في محلول TN (10 ملي تريس ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، درجة الحموضة 7.6). للتخلص من جزيئات phagemid غير المستقرة (المعيبة) ، تمت معالجة الراسب بالساركوسيل بتركيز نهائي قدره 0.1٪ (وزن / حجم). تمت إزالة ssDNA المنطلق من جزيئات phagemid المعيبة بواسطة DNase I (100 ميكروغرام مل -1) في وجود 5 ملي MgCl2. ثم تم تعطيل DNase I بواسطة EDTA (20 مم). ثم تم استخراج ssDNA من الفيروسات المقاومة للساركوسيل. أولاً ، تم إطلاق ssDNA من جزيئات phagemid عن طريق الحضانة عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في وجود 1.2 ٪ (وزن / حجم) SDS. تم إجراء تنقية إضافية لـ ssDNA باستخدام مجموعة إعداد البلازميد المصغرة (Roche). لتضخيم مكتبة سيكريتوم من أصل البلازميد للنسخ المتماثل ، بكتريا قولونية تم تحويل سلالة TG1 باستخدام ssDNA المنقى.

تحليل تسلسل المحدد L. rhamnosusاستنساخ HN001

بعد التحويل ، تم اختيار 491 نسخة عشوائية للتحليل. تمت تنقية الحمض النووي phagemid من هذه الحيوانات المستنسخة باستخدام 96-easy Mini-prep Kit (V-Gene Biotechnology ، مدينة Hangzhou ، الصين). تم تسلسل الإدخالات باستخدام التمهيدي pDJ01R02 (5'-CCGGAAACGTCACCAATGAA) ومجموعة BigDye ® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems ، Foster City ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم تحليلها على محلل وراثي ABI3730 (النظم الحيوية التطبيقية) في AWC Genome Services (جامعة ماسي). تم تسلسل جميع الإدخالات من النهاية 3 ، نظرًا لأن اهتمامنا كان يركز على ORFs في الاندماج معها gIII. تم إجراء تحليل التسلسل والتسلسل على دفعات من 96 نسخة. بعد تحليل التسلسل لأول 192 استنساخًا ، تم استبعاد الحيوانات المستنسخة التي تم اكتشاف تسلسلها أكثر من خمس مرات من التسلسل الإضافي باستخدام التهجين النقطي. تم تحليل التسلسلات التي تم الحصول عليها باستخدام برنامج Vector NTI (Invitrogen ، Carlsbad ، California ، الولايات المتحدة الأمريكية) و GLIMMER الإصدار 3.02 باستخدام مجموعة تدريب تم إنشاؤها مقابل L. rhamnosus مسودة تسلسل الجينوم HN001 ، مصفوفة وزن الموضع تمثل مواقع ربط الريبوسوم لجينات HN001 وطريقة تكرارية ، كما هو موصوف في وثائق البرنامج ، للتنبؤ بـ ORFs [105]. إذا لم يتم الوصول إلى 5 'نهاية ORF ، تم تنفيذ تفاعل تسلسلي باستخدام التمهيدي التكميلي المتجه للأمام pDJF03 (5'-ATGTTGCTGTTGATTCTTCA-3').

تم استخدام SignalP 3.0 [106] و TMHMM 2.0 [107] للتنبؤ بتسلسل الإشارة وحلزون الغشاء ، على التوالي ، باستخدام الإعدادات الافتراضية (للبكتيريا موجبة الجرام) وقيم القطع [14 ، 50]. حلزونات الغشاء الأمينية ذات الموقع النهائي والتي أظهرت في تحليل SignalP 3.0 أن درجة موقع انقسام ببتيداز الإشارة (درجة C) أقل من 0.52 تعتبر بمثابة مراسي غشاء أمينية. تم تأكيد وجود حلزون عبر الغشاء باستخدام برنامج التنبؤ TMHMM [108]. تم توقع تسلسل إشارة البروتين الدهني بواسطة خادم LipPred [109] باستخدام الإعدادات الافتراضية وقيم القطع [53]. تم استخدام TATFIND 1.4 للتنبؤ بتسلسل إشارة Tat [110].

تم فحص جميع تسلسلات الإدراج المترجمة باستخدام BlastP [111] على موقع NCBI [112] مع الإعدادات الافتراضية لتحديد أوجه التشابه مع البروتينات البكتيرية الأخرى. تم استخدام قيمة e أقل من e -10 كقطع للتشابه الملحوظ. علاوة على ذلك ، تم تحديد المجالات المحفوظة في تسلسل استعلامنا بواسطة محرك أداة استرجاع بنية المجال المحفوظة (CDART) في سياق البحث عن المجالات المعروفة المشتقة إما من مجموعات مجموعات متعامدة من البروتينات (COG) [113] ، أو Pfam [114] ] قواعد بيانات.


فاجميد

فاجميد
بلازميد يحتوي على جزء من جينوم الملتهمة. عند الإصابة المشتركة للمضيف بالعاثية المساعدة ، يمكن تعبئة البلازميد في جزيئات الملتهمة. نوع شائع الاستخدام من phagemid يتم تعبئتها على أنها ssDNA في جسيمات فج M13.

فاجميد: نوع من البلازميد يحمل ضمن تسلسله أصل تكاثر البكتيريا. عندما تصاب البكتيريا المضيفة بالعاثية "المساعدة" ، فإن phagemid يتم نسخه مع الحمض النووي للعاثية وتعبئته في كبسولات فج.
.

[12] يتم إدخال جزء الحمض النووي المراد تحوره في أ phagemid مثل M13mp18 / 19 ثم يتم تحويلها إلى سلالة E. coli ناقصة في إنزيمين ، dUTPase (dut) و uracil deglycosidase (ung).

ناقل الاستنساخ - بناء الحمض النووي الاصطناعي المصمم عن قصد والذي يستخدمه علماء الأحياء الجزيئية لتضخيم قطع مختارة من الحمض النووي التي يتم إدخالها في أمثلة الإنشاء بما في ذلك البلازميد ، والعاثية ،

& لامدا فج - ليسوجين
T4 Phage (169 إلى 170 كيلو بايت ، بطول 200 نانومتر)
T7 فج
R17 فج
M13 فج -


ناقلات Phagemid

تقدم مختبرات تصميم الأجسام المضادة الشريكة لدينا مجموعة واسعة من نواقل الملتهمة و phagemid للتغلب على التحدي المتمثل في عرض الملتهمة. اختيار المجلدات هو عملية معقدة تعتمد على متغيرات متعددة وظروف تجريبية ، مما يجعل الوقت والموارد العوامل الرئيسية المحددة لنجاح bopannings.

نحن نقدم حاليًا خيارات متنوعة للعرض على الجانب N-terminal لبروتين الجين III كامل الطول مع الببتيد زعيم PelB إما باستخدام نظام phagemid أو نواقل الملتهمة.


تنتج نواقل الملتهمة (انظر الرابط أدناه) عرضًا متعدد التكافؤ وهي الأنسب للببتيدات و scFv.

تعتبر phagemids هي الأنسب لعرض الأجسام المضادة مثل شظايا scFv و Fab ولكن يمكن استخدامها أيضًا لعرض الببتيدات بتكافؤ منخفض.

pADL ™ -100 أقصى عرض Phagemid Vector:


التطبيقات:
• عرض Phage على الجانب N- طرفي من بروتين الجين III من العاثية الخيطية
• عرض متعدد الببتيد
• مكتبات عرض الببتيد Phage


pADL ™ -20c / 22c / 23c سلسلة ناقلات Phagemid عالية العرض:


التطبيقات:
• عرض Phage على الجانب N- طرفي من بروتين الجين III من العاثية الخيطية
• عرض scFv و Fab
• تعبير scFv أو Fab مجاني

pADL ™ -10 ناقل Phagemid منخفض العرض:


التطبيقات:
• عرض Phage على الجانب N- طرفي من بروتين الجين III من العاثية الخيطية
• عرض scFv روابط ذات علاقة


عرض Phagemid - علم الأحياء

مراجعة شاملة لتقنية عرض الملتهمة لإنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المؤتلفة.

لقد ساهمت الأجسام المضادة وحيدة النسيلة بشكل كبير في مختلف المجالات ، مثل البيولوجيا الجزيئية ، والبحوث الصيدلانية والطبية ، كما ساعدت أيضًا في علاج أمراض مثل السرطان والأمراض المعدية [1-3]. ظهرت الأجسام المضادة المؤتلفة (rAbs) كوسيلة قيمة وعملية للبحث ، وتشخيص الأمراض المختلفة ، وكواحدة من أسرع فئات البروتينات العلاجية نموًا. تم استخدام مجموعة متنوعة من الأنظمة للإنتاج السريع والواسع النطاق للأجسام المضادة المؤتلفة لتلبية الطلب المتزايد على الأجسام المضادة. The benefit of huge amount and consistent quality of the in vitro antibody production methods have interested researchers to make improvements and try various production systems, viz. Gram-negative and Gram-positive bacteria, yeast (for example Adimab platform [4] ) and filamentous fungi, insect / mammalian cell lines, or more recently in transgenic plants and animals [5-7] for economic and large-scale production of rAbs. The other advantages offered by the rAbs include improvements in intrinsic properties such as immunogenicity, affinity, specificity, and stability of antibodies by a variety of mutagenesis techniques [8-10]. Libraries of antibody gene fragments can be cloned into expression vectors and displayed as a single-chain variable fragment or Fab-fragment antibodies on the surface of filamentous bacteriophage [11]. This technique, known as phage display, has helped enormously to study molecular biology mechanisms involving protein-protein [12] or protein-nonprotein interactions [13]. There are many excellent and comprehensive reviews on this topic, and one of the most recent ones is by the Bio-Rad group [14]. Phage display with pre-selected antibodies has also been exploited to enable barcoding of antibodies and thus highly multiplexed and quantitative cell-surface protein profiling [15]. Phage display can also be used to identify other types of protein affinity reagents such as Ras-binding domains [16].

The technique was initially demonstrated by George P. Smith in 1985 [17]. McCafferty and colleagues, in 1990, confirmed its use for the production of recombinant antibodies with desired specificities [18]. Since then, many research groups have contributed towards essential improvements and modifications of the technique for its potential applications in basic and applied biological sciences. Phage display technology allows the isolation of human antibodies against almost any antigen through the clonal selection of antibody fragments in a prokaryotic system, thus facilitating both immunotherapy and in vivo diagnosis. The range of antibodies from antibody libraries is limited by the initial calculated complexity of the antibody fragment gene library. Because the antigen-binding fragment is a heterodimer, the library complexity is increased by the random combination of heavy- and light-chain sub-libraries.

As previously mentioned, phage display technology refers to the use of phages for display of random peptides, foreign proteins or protein domains, as fusion proteins, on their surface [19]. Phages are viruses which infect bacterial cells. Mostly, the vectors used in recombinant DNA technology, are bacteriophages which infect Escherichia coli, the standard recombinant DNA host. An essential feature of such recombinant DNA vectors is that they can contain stretches of foreign DNA, which gets expressed in the host cell when the vector replicates. A phagemid vector, termed so for its phage origin genome, provides such features and enables expression of the foreign DNA, purposely introduced in the vector in such a way that it is expressed in conjunction with a phage protein, as a fusion protein, for display on the phage surface [19]. A variety of bacteriophages, viz. Ff filamentous phage, Lambda and T7 [20, 21] have been utilized in phage display with the most common being the Ff phage family (e.g., M13, fd-phage). These have been preferred, amounting to their potential as excellent cloning vehicles and simplicity for correct assembly of longer phage particles [21]. The PIII or PVIII surface proteins of the phage are used for display of recombinant peptides. Several options aid in avoiding the limitations of the conventional display system [22]. M13 filamentous phage-based libraries like Ph.D.TM-7, Ph.D.TM-12, Ph.D.TMC7C from New England Biolabs, or spherical T7 phage, T7Select® from Merck are available.

The most productive phage in nature is the filamentous phage which infects Escherichia coli. It generates titers of up to 10 13 per ml of bacterial culture. These bacteriophages infect a range of Gram-negative bacteria using the bacterial pili as a receptor. The best characterized of these phages (M13, fl, and fd) are collectively referred to as the Ff phage. These infect E.coli containing the F conjugative plasmid. The first phage display libraries of peptides and antibodies were published in 1990-1991 [23-26], after which the technique underwent numerous improvements for its varied applications.

The vectors designed by combining portions of plasmid and phage genome, for cloning and expression of fusion proteins are known as phagemid vectors. These vectors enclose an M13 phage origin of replication and packaging signal along with an origin of replication and the expression system of the plasmid. Usually, the expression plasmids are composed of multiple cloning sites, an antibiotic resistance marker, epitope tags such as a hexahistidine tag or a c-myc tag [27], and a lacZ promoter [28]. The phagemids habitually contain a gene sequence which codes for coat protein which will be fused to the foreign DNA that is to be expressed [23, 29], and a stop codon (usually amber), to permit host specific expression of the pIII fusion protein or a soluble fusion partner [30]. Phagemids can uphold themselves as plasmids, allowing the expression of the desired protein in the bacterial cell, but they do not have the other genes necessary for phage assembly. Therefore, infection of the phagemid-transformed host cells, with a helper phage becomes essential for the production of viable phage particles. The helper phage is the bacteriophage itself, which is engineered to provide the proteins essential for phage assembly. The phage-foreign fusion proteins can be displayed as either N-terminal fusions with pIII, pVII, pVIII, or pIX, for large proteins [31, 32] or C-terminal fusions with pIII, pVI, or pVIII proteins of the phage [33, 34]. The phage particles can be used in binding selections, and the binding clones can be multiplied through infection of E. coli host.

A drawback of the phagemid system is the reduction in the number of recombinant fusion proteins displayed on each phage particle due to competition between the wild-type coat protein and a fusion coat protein for integration into the phage particle [11]. Because of this problem, a modified helper phage, known as the hyperphage, was designed [35] which reportedly enhanced the yields of recombinant phages displaying the recombinant antibodies by more than two orders of magnitude. Hyperphages have a wild-type pIII phenotype and are therefore able to infect F+ E. coli cells with high efficiency however, they lack a functional pIII gene which renders these particles non-functional and thus require the phagemid-encoded pIII–antibody fusion for complete phage assembly (Figure 1). The outcome is a significant rise in the proportion of recombinant antibody displaying phages. It was reported that the antigen-binding activity also got affected by the use of the hyperphage. As a result, the hyperphage was found to be valuable in cases of selecting antibodies against rare epitopes.

Apart from this, specific mutations were also introduced in the coat proteins for the development of a hybrid phage display system [27], in which, two copies of the gene encoding coat protein exist: one with the scFv fusion and the other coding the natural non-fusion protein. Finally, the amount of recombinant proteins displayed is determined by more than a few factors, viz., type of coat protein chosen for fusion (pIII or pVIII), display system chosen for expression (phage or phagemid), and the choice of helper phage in case a phagemid system is used.

Some of the most widely used and commercially available phage display vector systems include, pSEX81 [36, 37], pCANTAB 5E [38-40], pCOMB3 [41] or its derivates, for example, pComb3XSS (Addgene 63890) [42, 43].

The phagemid vector, pSEX81, has been engineered for expression of functional single-chain Fv antibody-pIII fusion proteins on the surface of M13 bacteriophages. The phagemid was constructed explicitly for cloning of immunoglobulin heavy and light chain gene fragments isolated from human or mouse antibody libraries. The cassette vector, pSEX81, was designed for the convenient insertion of heavy and light chain variable domain coding regions and the production of a functional single chain of M13 bacteriophages. The corresponding DNA fragments of human or mouse origin can be amplified by PCR using the degenerate IgG/IgM, or IgG primer sets respectively, available from the same company. The amplified gene fragments encoding variable heavy or light domain are cloned in-frame between a signal peptide sequence of bacterial pectate lyase (pelB) for secretion of the fusion protein into periplasmic space and pIII gene of M13 bacteriophage.

The VH and VL genes are joined by a DNA fragment coding for a flexible 18 amino acid residue linker containing first six amino acids of CH1 constant region domain and the hydrophilic pig brain alpha tubulin peptide sequence "EEGEFSEAR". Vector backbone further provides a strong promoter, the T7 terminator, ColE1 origin of replication, intergenic region of phage F1 and an ampicillin resistance marker for selection. In pSEX81 the recognition sites of restriction endonucleases Nco I and Hind III allow insertion of VH gene fragments. For the insertion of a VL gene fragment, sites of restriction endonucleases Mlu I and Not I are present.

The systems for phage display can be categorized along the lines of the arrangement of the phage genes coding for coat proteins [44, 45]. A ‘type 3’ vector, consists of a single phage chromosome (genome) containing a single gene III for expression of foreign DNA and a single type of pIII protein molecule. In theory, the foreign peptide encoded by the insert gets displayed on all the five pIII molecules on a virion (though practically the host proteolytic enzymes remove the foreign peptide from some or even most of the pIII copies, especially if the foreign peptide is large). Likewise, the ‘type 8’ and ‘type 6’ vectors display foreign peptides on every copy of pVIII and pVI, respectively [46-48]. In a ‘type 88’ vector, the phage genome bears two VIII genes, which encodes for two different types of pVIII molecules, a recombinant one, bearing the foreign DNA and the wild-type one. This system allows the display of larger proteins on the phage surface. In the same way, the ‘type 33’ vector bears two genes III. A ‘type 8+8’ system is different in the manner that the two VIII genes are on separate genomes. The wild-type being on a phage (helper phage), while the recombinant one on the phagemid [28, 49]. The ‘type 3+3’ and the ‘type 6+6’ systems are reminiscent of ‘type 8+8’ systems.

Production of large quantities of antibodies becomes challenging due to the high complexity of the immunoglobulin molecules. The immunoglobulin G is a heterotetramer, consisting of two different polypeptide chains joined by the inter-chain disulfide bonds. The antibody light chain and heavy chain consist of several domains known as “immunoglobulin folds”, each of which requires intra-domains disulfide bond for stabilization. An oxidizing environment along with the complex apparatus is much needed for efficient and correct conformation of a large number of disulfide bonds together with folding and assembly of four chains to one IgG molecule. The in vitro hosts for the production or selection of antibodies, generally have less optimal conditions for expression of a correct and complete immunoglobulin molecule. Thus, many researchers opted for other smaller sized formats of antibodies, which retained the antigen-specificity and also provided significant advantages.

By far, the ‘Fv’ fragment is the smallest antigen-binding fragment of immunoglobulin retaining complete antigen binding site and consists of only the variable fragments of an antibody structure. A single-chain variable fragment (scFv) is a fusion protein of the variable regions of the heavy (VH) and light chains (VL) of immunoglobulins (Figure 2), connected with a short linker peptide often to about 25 amino acids, which helps to improve the stability of the short antibody. The flexibility and solubility of the linker are due to the glycine and serine or threonine amino acid residues, respectively. The linker can either connect the N-terminus of the VH with the C-terminus of the VL or vice versa. This protein retains the specificity of the original immunoglobulin, despite the removal of the constant regions and the introduction of the linker. These molecules were created to facilitate phage display, where it is highly convenient to express the antigen-binding domain as a single peptide. As an alternative, scFv can be constructed directly from a sub-cloned heavy and light chains derived from a hybridoma. Since the scFvs are only half the size of a Fab fragment and still retain the original specificity of the parent immunoglobulin, they have significant applications in techniques, such as flow cytometry, immune-histochemistry, and as antigen-binding domains of artificial T cell receptors, etc. Unlike monoclonal antibodies, which are often produced in mammalian cell cultures, scFvs are more often produced in bacteria cell cultures such as E. coli, allowing an easy and faster production of antibodies in massive amounts.

The fragment antigen-binding (Fab fragment) is the antigen-binding region on an antibody, which is composed of a constant and a variable domain. The domains form the paratope — the antigen-binding site — at the amino-terminal portion of the monomer. The two variable domains facilitate binding with specific antigens. For example, Tao Y et al selected for Fabs against Wnt receptors from a phage-displayed synthetic library F [50]. Slezak T et al developed a modular antibody platform based on the phage display of Fab fragments [51].

A diabody comprises two scFvs which are connected with linker peptides, too short for the two variable regions to fold together (about five amino acids), forcing dimerization of the scFvs. Diabodies have a much higher affinity to their target, due to much lower dissociation constants.

Another recombinant antibody format, called as scFv-zipper, consists of two scFv antibodies, with same or different antigen specificities, linked with leucine zippers.

Thus, the phage-displayed recombinant antibodies (rAbs), which provide a direct link between the genotype and phenotype of the antibody to be displayed [52], have been displayed as functional binding molecules in different formats of antibody fragments [18, 30]. At present, the most widely used and applicable formats are scFv and Fab fragments, particularly expressed in eukaryotes.

Various types of libraries have been utilized for selection of specific antibodies: (1) antigen- or pathogen-specific library sourced from immunized animals, for example, leukocytes from an immunized llama [42, 53], (2) a single-pot or universal library without any specificity, (3) mutant libraries generated from mutated DNA sequences of a monoclonal hybridoma line or single phage clone [54, 55]. The single-pot universal libraries are extremely assorted and allow the selection of antibody fragments with binding affinities to a wide range of antigens [21] due to the size of their repertoire [56].

Polymerase chain reaction (PCR) has enormously simplified the cloning of variable region genes. The cDNA synthesized from mRNA isolated from B-lymphocyte population is used as a template for PCR- based amplification of VL and VH immunoglobulin genes. The mRNA can also be isolated from hybridoma cell lines, single clones obtained from the primary library. PCR amplification requires oligonucleotide primers complementary to the antibody gene sequences. Degenerate primer sets have been used to amplify almost all the possible sequences for the variable light or variable heavy chain genes for the generation of a library. Many of the primer sets have been reported with various target sequences for primer annealing [57-60].

A set of downstream primers analogous to sequences encoding parts of CH1 and CL chains have been used for amplification of the variable genes from antibodies of different subclasses. Assembly of the two variable domains into a single gene can be made possible by a DNA linker either in the VH-linker-VL format or the VL-linker-VH type [61, 62]. It has been noted that the expression level of scFv in N-termini-VL domain-linker-VH domain C-termini orientation was relatively high in comparison to the other format. Hence, to obtain high yields of the antibodies, insertion of the gene sequence coding for them should be in the desired frame in the phagemid vector. The most significant advantage offered by phagemid vectors is their small size (3–5 kb) and high efficiency for transformation in bacterial cells. In general, the recombinant phagemid is introduced into competent E. coli, followed by infection of the bacterial host cells with a helper phage (M13VCS or K07) to yield a recombinant phage that displays antibody fragments as fusions to one of the phage coat proteins.

Solemani Zadeh et al published a detailed protocol for efficient construction and screening of synthetic domain phage variable libraries (with 50-fold improvement of elution efficiency) [63]. Ferrara F et al combined phage and yeast display to identify monoclonal antibodies with desired binding properties [64].

Phage display based in vitro affinity selection of antibodies resembles the clonal selection of antibodies in vivo [65]. The target antigen is immobilized on surfaces based on the choice of the researcher, and the library is applied onto it, enabling affinity-based selection of highly reactive antibodies. The non-specific phage particles get eliminated during washing steps, and those which remain bound to the immobilized antigen, are eluted by addition of appropriate elution reagents. The antigen-specific phages can then be amplified in a proper strain of E. coli for their downstream applications or the next selection cycle facilitating further enrichment. This affinity selection process is known as bio-panning, and the final round of it can be determined by assessment of no more additional rise in the yield of eluted phages [65].

Bio-panning includes recurring rounds of phage binding to the target, washing to remove non-binding phage and elution steps to get binding phage and re-amplification of the phage pool enriched for specific binding phage. Any other methods which help in separation of specific from non-binding clones can be employed as selection methods. Most commonly in vitro selection method, such as bio-panning on immobilized antigen coated onto paramagnetic beads [66], plastic tubes or Petri dishes [54], columns with an antigen-activated matrix [18], or specifically coated BIAcore sensor chips [56], selection using biotinylated antigen [55] or direct selection on fixed prokaryotic cells respectively mammalian cells [67] have been reported.

A large fraction of non-specific phages get washed, and the phage clones bearing antibodies with specific binding properties to the matrix are eluted by using appropriate elution reagents. The fact that the M13 phage is stable at extremes of temperature and pH has been utilized successfully in experimenting with the choice of elution reagents. Acidic solutions, like HCl, glycine buffers [56, 68], basic solutions, like triethylamine [54], or even reducing agents have been used. In other cases, a competition elution by an excess concentration of antigen [24] or antibodies to the antigen has also been reported. Another gentle strategy has been the use of enzymes for cleavage of a protease site engineered between the antibody and pIII protein of the phage [21].

An in vivo selection involves the introduction of phage particles directly into animals of choice followed by the collection of target tissues. Such a method has helped in the research studies on cellular receptors and identification of peptides or antibodies with specificity for them [69, 70]. For a further selection of monoclonal antibodies, the phage clones obtained after final round are propagated individually and characterized for desired binding specificities [21].

Alfaleh et al, for example, used cell-based biopanning to isolate anti-CD117 antibodies, which were evaluated by flow cytometry and immunohistochemistry [71]. Kim et al panned a Fab phage display library against the spike protein of Middle East respiratory syndrome-coronavirus and generated highly specific Fab fragments and monoclonal antibodies, with the potential as diagnostic agents [72]. D Wrapp et al developed a VHH phage library against the S proteins of MERS-CoV and SARS-CoV-1 viruses using the pMECS vector [73].

The antibodies generated through recombinant methods hold superiority than the hybridoma produced [74], as the former can be improved for its qualities and modified as per the desired applications. Affinity maturation of rAbs has been reported [24, 75]. High-affinity antibodies against a broad spectrum of antigens have been derived from various immunized animals, such as llamas [53, 76], mice [77], chickens [78], rabbits [79], and also from sheep [80] and nonhuman primates [75].

Very high volumetric yields have been reported for cytoplasmic expression of rAbs in E. coli. Production of smaller antibody fragments has been reported up to grams per liter amounts in bacteria [81]. Expression of a functional rAb in E. coli was first reported by Skerra and Plückthun in 1988 [82], where both V chains were translocated into the periplasmic space of the bacterial cells. The oxidizing environment in the compartment allowed correct conformation of the functional Fv fragment by the formation of appropriate disulfide bonds. The approach was also utilized for the expression of first time functional Fab fragments in E. coli [83]. The expression of recombinant antibodies in reducing cytoplasm more often than not results in non-functional aggregates [84].

On the other hand, expression of functional antibody fragments in cytoplasm most of the times requires complete denaturation and refolding [85]. However, successful production of functional scFvs in the cytoplasm of E. coli, not requiring refolding has also been reported [86-88]. The type of host strain and the specificity of the antibodies are known to affect the expression of functional rAbs in E. coli. A good number of rAbs have been produced in the periplasm of E. coli using N-terminal leader sequences targeting the periplasmic Sec pathway [89-91]. Following the expression of the rAbs, the molecules are isolated from the periplasmic fraction [92, 93], or culture supernatants [94, 95]. The expression, periplasmic transport, accurate folding and assembly of two different polypeptide chains is highly necessary for the expression of rAbs in the Fab format. The bi-cistronic vectors with the first cistron encoding the light chain and the second cistron encoding the Fd fragment (consisting of VH and CH1) were found to be optimal for such requirements [92]. Production of a full size glycosylated IgG in E. coli has also been reported [96], only after the fine-tuning of the translation strength of both IgG chains, by the introduction of silent mutations into the translation initiation region of the leader sequence which facilitated optimal periplasmic transport [96].

  • Origin, diversity, and parallel selection: A variety of sources can be used for generation of large diversity antibody libraries. High diversity allows the selection of antibodies against multiple targets simultaneously, thereby saving considerable time, efforts and costs associated with monoclonal antibody (mAb) generation.
  • Ease of development: The time required for construction of libraries, the selection of mAbs with desired specificities, and optimization of assays based on mAbs are much less than the conventional fusion methods.
  • Specificity/ affinity: Direct relation of the genotype to the phenotype of the developed antibody.
  • Formats: Different variants can be generated depending upon the downstream applications of mAbs.
  • Scope of improvement: Molecular methods allow the scope of perfection for the mAbs either before or after development. Affinity maturation strengthens the binding efficacy of antibodies to the target antigen, providing mAbs a higher affinity, and specificity towards the target. The recombinant mAbs can be conjugated to reporter enzymes for direct detection.
  • Stability: The phage display libraries are very stable, even for an indefinite period, and can be revived after long-term storage, by infection of bacterial cells.
  • Concentration: The large diversity libraries often contain displayed antibodies at low molarities.
  • Library complexity: The number of antibody display clones is less than the recombinants, which may at times interfere with the selection of mAbs directed towards rare targets.
  • Selection bias: Biological selection is reported to be biased against cysteine residues in odd numbers, positive charged or specific residues at fixed positions. Further, the selection is limited to the interaction of target antigen and the antibody.
  • Biological efficacy: The application of monoclonal antibodies is limited for use as therapeutics in organisms different than their origin.

Hence, high yield expression of rAbs in E. coli can be achieved only after addressing various issues like host toxicity, vector mutation, and plasmid loss. Such decisive constraints can be addressed by the promoter system, plasmid copy number, etc. [97]. One modification is the growth of bacterial cells between the temperature range 20 to 30°C rather than at 37°C to steer clear of the overloading of E. coli’s secretory pathway. Nevertheless, very high yields of antibody fragments in E. coli can be facilitated by high cell density fermentation in bioreactors. Cell-wall-less L-forms of the Gram-negative bacterium Proteus mirabilis have also been experimented for the production of miniAbs and scFvs [98, 99], to obtain high yields of functional scFvs [99].

The expression of recombinant antibody fragments (scFv, Fab) has been reported in numerous microorganisms, especially in selected strains of E. coli. The choice for E. coli host strains such as BL21 and their derivatives amounts to the fact that the antibodies can be produced economically in bulk amounts. The soluble antibody fragments can be expressed in the culture supernatant, bacterial periplasm, and/or inside the bacterial cytoplasm [100-102]. Though the secretion of the rAbs in the periplasm and the media provide a less overall yield, the oxidative environment outside the cell cytoplasm confers proper formation of disulfide bonds required for natural folding of antibody domains.

Antibodies expressed into the periplasmic space are extracted by osmotic shock. RAbs expressed in considerable amounts in the cell cytoplasm frequently results in extensive aggregation and formation of inclusion bodies, which can be purified from the other cellular components. The aggregated antibody mass can be made soluble by adding strong denaturants for instance urea or guanidium hydrochloride including some oxido-reduction system. The native antibody fragments are recovered by refolding upon removal of the denaturants. Guidelines for antibody refolding have been extensively reviewed [103].

Apart from E. coli host cells, the rAbs have been expressed in mammalian systems [104, 105], insect cells [106, 107], yeasts like Saccharomyces cerevisiae [108], Schizosaccharomyces pombe [109], Hansenula polymorpha [110], and also in Pichia pastoris [111] and in bacterial host strains such as Bacillus brevis [112]. Generally, the choice of expression hosts (bacteria, yeast, plants, insect or mammalian cells) must be reliable as per the final application of the antibody molecule.


شاهد الفيديو: Phage Display Technology - Creative Biolabs Updated Version (قد 2022).