معلومة

كيف يتم عزل جزء معين لتضخيم PCR؟

كيف يتم عزل جزء معين لتضخيم PCR؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

للحصول على معلومات أساسية ، أنا مهتم بدراسة التطبيقات الهندسية لبروتين معين ، وهو غير متوفر تجاريًا. هدفي النهائي هو التعبير عن الجين الخاص بالبروتين في الخلايا البكتيرية ، على الأرجح بكتيريا الإشريكية القولونية ، إذا كان ذلك إجراءً ممكنًا. أنا على دراية بعملية تكوين الحمض النووي المؤتلف ، وعلى الرغم من أن مختبرنا غير متخصص في علم الأحياء ، فإننا سنعمل مع مختبر آخر في قسم الطب الحيوي لدينا والذي يمكنه توفير المعدات اللازمة وبعض النصائح.

آخر مرة قمت فيها بعمل مختبر حيث عبرنا عن جين جديد في خلايا الإشريكية القولونية كان فصل التكنولوجيا الحيوية في المدرسة الثانوية ، على الرغم من أن الكثير من الإعداد قد تم من أجلنا. أتذكر أن خطوتنا الأولى كانت تضخيم جزء الحمض النووي المطلوب من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل ، لكن ما لا أعرفه هو كيف تم عزل الجزء في البداية. أعلم أن البادئات تساعد بشكل أساسي في تحديد مواضع البداية والنهاية لاستنساخ الحمض النووي ، ولكن إذا كنت ستستخدم كروموسومًا كاملاً يحتوي على الجين المطلوب ، فمن المحتمل أن يكون هناك العديد من المواقع المحتملة التي يمكن أن تعلقها البادئات إلى جانب المنطقة المرغوبة. إذا كان تسلسل الحمض النووي للبروتين الذي أريده معروفًا بالفعل ، فكيف سأحصل على جزء يحتوي على الجين الذي أريده؟

بالإضافة إلى ذلك ، ما مدى صعوبة هذه العملية؟ نظرًا لأن الهدف النهائي هو في الواقع دراسة البروتين ، لا أريد أن تتحول هذه الخطوة إلى أطروحة كاملة من تلقاء نفسها. بالنسبة لبعض البروتينات المحددة ، تبدو العملية موثقة جيدًا ويمكن إجراؤها باستخدام مواد شائعة نسبيًا وباتباع تعليمات بسيطة ، ولكن إلى أي مدى يجب أن أتوقع أن يتباعد الإجراء لمحاولة ذلك مع الجين الذي لم يتم إجراؤه تحديدًا من قبل؟


هناك عدد من أدوات الاختبار التمهيدي التي ستقارن تسلسلات التمهيدي مقابل الجينوم لضمان الخصوصية ، أو تساعدك على تصميم بادئات محددة لتضخيم منطقة معينة. مكان واحد للبدء هو NCBI Primer BLAST ؛ تشرح الصفحة المرتبطة كيفية استخدامها لتوليد بادئات لتضخيم جين معين.

يمكن أن يكون إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل على الحمض النووي الجينومي أمرًا صعبًا بعض الشيء ، حيث يتعين عليك التعامل مع الكثير من العوامل المربكة مثل إمكانية الوصول إلى الحمض النووي والتلوث ومثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل التي تمر عبر إجراءات التنقية. بالإضافة إلى ذلك ، غالبًا ما تحتوي الجينات على إنترونات ضخمة ، لذلك سينتهي بك الأمر إلى عمل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على قالب طويل جدًا (وهو أمر صعب جدًا أو مستحيل ، اعتمادًا على حجم الجين) وستنتهي مع الكل تسلسل الجينات مع introns وهو ليس ما تحتاجه للتعبير عنه على أنه جين متحور.

بدلاً من ذلك ، أوصي بشراء نسخة cDNA من الجين الذي يهمك وتضخيمه من ذلك. يتكون cDNA من تسلسل mRNA المقسم ، لذلك سيكون طوله أكثر قابلية للإدارة وسيحول دون حدوث مشاكل في الربط البديل.

إذا انتقلت إلى صفحة NCBI للحصول على الجين ، في الشريط الجانبي الأيمن ضمن "المعلومات ذات الصلة" ، سترى رابطًا لطلب استنساخ cDNA. سيعطيك هذا بعض الخيارات لشراء بلازميد منقى يحتوي على هذا الجين مقابل 60 دولارًا - 90 دولارًا. سيكون العمل مع هذا البلازميد أسهل بكثير من العمل مع الحمض النووي الجيني وسيوفر لك بالتأكيد الوقت والمال ، خاصة إذا كنت لا تزال عديم الخبرة في الاستنساخ الجزيئي.


بالطبع ، لم يعد عام 2003 بعد الآن وهناك حجة جيدة أن الفكرة الكاملة للقيام بالاستنساخ الجزيئي بنفسك هي مضيعة للوقت والمال. إذا كانت ميزانيتك تسمح بذلك ، فإن أسهل وأسرع طريقة هي أن تدفع لشركة ما لتخليق الجين الخاص بك نيابةً عنك. تقدم Genewiz ، على سبيل المثال ، عرضًا دقيقًا مقابل 0.28 دولارًا أمريكيًا / نقطة أساس ، ولكن ربما يمكنك الحصول على صفقة أفضل إذا كنت تتسوق.

تتمثل ميزة التوليف في أنه يمكنك الحصول على التسلسل الدقيق الذي تريد استنساخه في المتجه الصحيح تمامًا بشكل مثالي في المرة الأولى. إذا لم تكن لديك خبرة في ذلك ، فستستغرق محاولة استنساخ الجين بنفسك وقتًا أطول وستكلفك أموالًا أكثر مما تعتقد. من الأفضل أن يتم توليفها فقط حتى تتمكن من الانتقال إلى تجربتك الحقيقية.


ولكن إذا كنت ستستخدم كروموسومًا كاملاً يحتوي على الجين المطلوب ، فمن المحتمل أن يكون هناك العديد من المواقع المحتملة التي يمكن أن تلتصق بها البادئات بجانب المنطقة المرغوبة.

لا ، الهدف من البادئات هو أنها يجب أن تكون طويلة بما يكفي للارتباط بموضع واحد محدد (أو على الأقل ، يوجد مكان واحد فقط حيث يرتبط البادرين بالقرب من بعضهما البعض وفي الاتجاه الصحيح لحدوث تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR))


الملخص

يتم وصف نهج عام بسيط وقابل للتكرار لعزل الجينات المعبر عنها تفاضليًا. ينتج عن هضم cDNAs مع نوكلياز داخلي مقيد من الفئة الثانية شظايا مع كل مجموعة من القواعد الممكنة في النهايات المتماسكة. في ظل ظروف صارمة ، يؤدي الارتباط المحدد للمحولات ذات الأجزاء المتراكمة التكميلية تمامًا إلى تقسيم أجزاء (كدنا) إلى مجموعات سكانية فرعية غير متداخلة. يتم تضخيم شظايا تقييد (كدنا) الداخلية بشكل كبير بواسطة محول PCR التمهيدي وتصور بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام البولي أكريلاميد غير المتحول. تم إثبات قوة هذه التقنية باستخدام نموذج الفئران لتضخم البطين الأيسر الناجم عن الضغط (LVH). عرضت مجموعة من 29 جزءًا ، مشتقة من عينة (6٪) من مجموعات تجمع المحولات الممكنة ، تعبيرًا تفاضليًا واضحًا. تم تأكيد التعبير التفاضلي لـ 19 (66٪) من خلال تحليل اللطخة الشمالية. حدد تحليل التسلسل كلا الجينين المعروف أنهما منتظمان في LVH ، والجينات الجديدة. تم إثبات دقة ربط المحول من خلال عزل أجزاء الجينات المعروفة عن طريق مجموعات المحولات المناسبة. أظهر ارتفاع مجموعات الرنا المرسال بكميات معروفة من الرنا المرسال الاصطناعي حساسية حالية مكافئة لاكتشاف النصوص المعبر عنها عند مستوى 1 في 10000 جزيء.


بوليميرات الحمض النووي

تعد بوليميرات الحمض النووي من المكونات الهامة في تفاعل البوليميراز المتسلسل ، حيث تقوم بتركيب الخيوط التكميلية الجديدة من قوالب الحمض النووي أحادية السلسلة. تمتلك جميع بوليمرات الحمض النووي نشاط 5 → 3 بوليميريز ، وهو دمج النيوكليوتيدات لتمديد البادئات في نهاياتها 3 في اتجاه 5 إلى 3 (الشكل 2).

في الأيام الأولى من PCR ، كان جزء Klenow من بوليميريز الحمض النووي I من بكتريا قولونية تم استخدامه لتوليد خيوط ابنة جديدة [3]. ومع ذلك، هذا بكتريا قولونية الإنزيم حساس للحرارة ويمكن تدميره بسهولة في درجات حرارة تغيير الطبيعة العالية التي تسبق خطوات التلدين والتمديد. وبالتالي ، يحتاج الإنزيم إلى التجديد في خطوة التلدين لكل دورة خلال العملية.

أثبت اكتشاف بوليميرات الحمض النووي القابل للحرارة أنه تقدم مهم ، حيث فتح فرصًا هائلة لتحسين طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل من خلال تمكين استقرار التفاعلات على المدى الطويل. واحدة من أكثر بوليمرات الحمض النووي المعروفة بالحرارة هي طق بوليميراز الدنا المعزول من الأنواع البكتيرية المحبة للحرارة Thermus aquaticus في عام 1976 [5،6]. في التقرير الأول في عام 1988 [7] ، أظهر الباحثون طق احتفاظ بوليميريز الحمض النووي بالنشاط فوق 75 درجة مئوية ، مما يجعل التدوير المستمر دون إضافة إنزيم طازج يدويًا أمرًا ممكنًا ، وبالتالي تمكين أتمتة سير العمل. علاوة على ذلك ، بالمقارنة مع بكتريا قولونية بوليميراز الحمض النووي ، طق أنتج بوليميراز الدنا أمبليكونات PCR أطول بحساسية وخصوصية وإنتاجية أعلى. لجميع الأسباب المذكورة أعلاه ، طق تم تسمية بوليميريز DNA "جزيء العام" من قبل المجلة علم في عام 1989 [8].

الشكل 2. بوليميراز الحمض النووي يمتد 3 نهاية التمهيدي PCR في اتجاه 5 ′ إلى 3.

بالرغم ان طق قام بوليميريز الحمض النووي بتحسين بروتوكولات PCR بشكل كبير ، ولا يزال الإنزيم يقدم بعض العيوب. طق إن بوليميراز الحمض النووي غير مستقر نسبيًا فوق 90 ​​درجة مئوية أثناء تمسخ خيوط الحمض النووي. هذا يمثل مشكلة خاصة بالنسبة لقوالب الحمض النووي ذات المحتوى العالي من GC و / أو الهياكل الثانوية القوية التي تتطلب درجات حرارة أعلى للفصل. يفتقر الإنزيم أيضًا إلى نشاط التدقيق اللغوي ، طق يمكن أن يخطئ بوليميراز الدنا في دمج النيوكليوتيدات أثناء التضخيم. عندما تكون دقة التسلسل أمرًا بالغ الأهمية ، فإن أمبليكونات PCR التي بها أخطاء ليست مرغوبة للاستنساخ والتسلسل. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الطبيعة المعرضة للخطأ لـ طق يساهم بوليميراز الحمض النووي في عدم قدرته على تضخيم الأجزاء التي تزيد عن 5 كيلو بايت بشكل عام. للتغلب على أوجه القصور هذه ، يتم باستمرار تطوير بوليمرات الحمض النووي ذات الأداء الأفضل لتسخير قوة تفاعل البوليميراز المتسلسل عبر مجموعة متنوعة من التطبيقات البيولوجية (تعرف على المزيد حول خصائص بوليميريز الحمض النووي).

فيديو: إنزيم PCR سريع

تحقيق تخليق أسرع للحمض النووي بمعدل 4 مرات ، وصلب البادئات عند 60 درجة مئوية ، وتحميل العينات مباشرة على المواد الهلامية بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ، باستخدام Invitrogen Platinum II طق البدء الساخن لبوليميراز الحمض النووي.


استخراج الحمض النووي والحمض النووي الريبي

لدراسة الأحماض النووية أو معالجتها ، يجب أولاً عزل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو استخراجه من الخلايا. يمكن القيام بذلك من خلال تقنيات مختلفة. تتضمن معظم تقنيات استخراج الحمض النووي خطوات لفتح الخلية واستخدام التفاعلات الأنزيمية لتدمير جميع الجزيئات الكبيرة غير المرغوبة (مثل تحلل الجزيئات غير المرغوب فيها والفصل عن عينة الحمض النووي). يتم تكسير الخلايا باستخدام محلول تحلل (محلول غالبًا ما يكون منظفًا) يعني التحلل & ldquoto Split. & rdquo تفكك هذه الإنزيمات جزيئات الدهون في أغشية الخلية والنواة. يتم تعطيل الجزيئات الكبيرة باستخدام إنزيمات مثل البروتياز التي تكسر البروتينات ، والريبونوكليازات (RNAses) التي تكسر الحمض النووي الريبي (RNA). ثم يتم ترسيب الحمض النووي باستخدام الكحول. عادة ما يظهر الحمض النووي الجيني البشري ككتلة بيضاء هلامية. يمكن تخزين العينات في & ndash80 & degC لسنوات.

الشكل ( PageIndex <1> ): استخراج الحمض النووي: يوضح هذا الرسم البياني الطريقة الأساسية المستخدمة لاستخراج الحمض النووي.

يتم إجراء تحليل الحمض النووي الريبي لدراسة أنماط التعبير الجيني في الخلايا. من الطبيعي أن يكون الحمض النووي الريبي غير مستقر للغاية لأن الحمض النووي الريبي موجود بشكل شائع في الطبيعة ويصعب جدًا تعطيله. على غرار الحمض النووي ، يتضمن استخراج الحمض النووي الريبي استخدام العديد من المحاليل والإنزيمات لتعطيل الجزيئات الكبيرة والحفاظ على الحمض النووي الريبي.


تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

PCR هي طريقة داخل المختبر لإنتاج كميات كبيرة من أجزاء DNA محددة بطول محدد وتسلسل من كمية صغيرة من قالب معقد ، في هذه التقنية تنتج كميات ميكروغرام من DNA من picogram كميات من مادة البداية ، DNA الهدف ، الاشعال ، البوليميراز و يتم دمج النيوكليوتيدات في أنبوب اختبار لتكاثر المادة الوراثية.

يتم تضخيم الحمض النووي عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل (الشكل 12.10) في تفاعل إنزيمي يخضع لعدة حضانات عند ثلاث درجات حرارة مختلفة. يحتوي كل PCR على أربعة مكونات مهمة.

قالب الحمض النووي : يمكن اعتبار أي مصدر يحتوي على جزيء DNA مستهدف واحد أو أكثر ليتم تضخيمه كقالب. يمكن أيضًا استخدام RNA لـ PCR عن طريق إنشاء نسخة DNA أولاً باستخدام إنزيم النسخ العكسي للإنزيم.

الاشعال: يتطلب كل تفاعل البوليميراز المتسلسل زوجًا من البادئات قليلة النوكليوتيد ، وهي جزيئات DNA قصيرة أحادية الجديلة يتم الحصول عليها عن طريق التوليف الكيميائي. تم تصميم هذه البادئات لتصلب على خيوط متقابلة من التسلسل المستهدف بحيث يتم تمديدها تجاه بعضها البعض عن طريق إضافة النيوكليوتيدات.

بوليميريز الحمض النووي: الإنزيم الأكثر استخدامًا في تفاعل البوليميراز المتسلسل هو بوليميراز العلامة DNA المعزول من بكتيريا مقاومة للحرارة تسمى Thermus aquaticus. تعيش عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقة إلى دقيقتين ولها نصف عمر لأكثر من ساعتين في نفس درجة الحرارة. يرتبط بوليميراز الحمض النووي بالحمض النووي أحادي الجديلة ويصنع خيطًا جديدًا مكملًا للخيط الأصلي. يتمثل دور هذا الإنزيم في تفاعل البوليميراز المتسلسل في نسخ جزيئات الحمض النووي.

ديوكسينوكليوتيد ثلاثي الفوسفات: يتطلب تفاعل البوليميراز المتسلسل أربعة ديوكسينوكليوتيد ثلاثي الفوسفات ، DNTPS (DATP ، dGTP ، DTTP ، dCTP) التي يستخدمها بوليميراز الحمض النووي كوحدات بناء لتجميع الحمض النووي الجديد.

يتضمن تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) ثلاث مراحل وهي كالتالي (الشكل 12.11):

  1. ذوبان الحمض النووي (95 درجة مئوية) لتحويل الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل إلى DNA واحد تقطعت بهم السبل (تمسخ).
  2. تعزيز البادئات (عند 50 65 درجة مئوية) لتلتصق بأي من طرفي الشريط المستهدف (تلدين البادئات).
  3. تمديد البلمرة DNA البادئة لتشكيل DNA جديد مزدوج تقطعت بهم السبل عبر المقطع عن طريق إضافة متسلسلة من deoxynucleotides (التمديد التمهيدي). عندما ترتفع درجة الحرارة مرة أخرى ، تنفصل الخيوط الجديدة وتبدأ العملية مرة أخرى. يظهر ملف درجة الحرارة لدورة PCR النموذجية في الشكل 12.12.

تم تصميم بادئات قليل النوكليوتيد لتهجين منطقة الحمض النووي التي تحيط بتسلسل الجين المستهدف المطلوب. يتم بعد ذلك تمديد البادئات عبر التسلسل المستهدف باستخدام بوليميريز الحمض النووي المشتق من Thermus aquaticus (Taq) في وجود ديوكسينوكليوتيد ثلاثي الفوسفات الحر. تشكل هذه الخطوات الثلاث دورة واحدة من التفاعل. تتكرر هذه الخطوات عن طريق معالجة درجة الحرارة ، باستخدام آلة PCR ، تستغرق الدورة حوالي 3 إلى 5 دقائق وبعد 30 دورة (حوالي 3 ساعات) ، يمكن مضاعفة نسخة واحدة من الحمض النووي إلى 1000000 نسخة.

تفاعل البلمرة المتسلسل RNA هو تعديل لتقنية PCR التي تسمح بالتضخيم بدءًا من قالب RNA. أدت الأبحاث الحديثة في مجال تفاعل البلمرة المتسلسل إلى تطوير تقنيات تساهم في فعالية الطريقة. PCR هي تقنية متعددة الاستخدامات. الاختلافات الهامة في PCR هي كما يلي:

معكوس PCR: يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم تسلسلات الحمض النووي البعيدة عن البادئة وليس تلك التي يحيط بها التمهيدي. يمكن استنساخ التسلسلات المراد تضخيمها في متجه ويمكن استخدام تسلسل الحدود للمتجه كطريقة تمهيدي بحيث تستمر البلمرة في الاتجاه المعاكس.

مثبت PCR: في هذه الطريقة ، يتم استخدام أساس واحد فقط. يتم نسخ خصلة واحدة أولاً ثم يتم إرفاق ذيل بولي G في نهاية الشريط المركب حديثًا. يسمح هذا باستخدام البوليمر المتجانس التكميلي ، بولي- C ، ليتم استخدامه كأساس لنسخ خيوط الحمض النووي المفردة التي تم إنشاؤها بواسطة PCR. إنه يؤدي إلى ازدواج الحمض النووي الكامل الذي يمكن تضخيمه بشكل طبيعي.

RT-PCR: يتضمن PCR بوساطة النسخ العكسي تطبيقًا واحدًا يجمع بين عملية تخليق CDNA (عن طريق النسخ العكسي) وتضخيم PCR. يمكن أيضًا تطبيقه على CDNA المزدوج الذي تقطعت به السبل أيضًا والذي يتم تصنيعه من mRNA باستخدام إنزيم النسخ العكسي. إنزيم rTذ يستخدم قوالب الحمض النووي الريبي من تخليق (كدنا) وبالتالي يسمح بإنزيم واحد RT-PCR فيروسي عكسي من فيروس فئران الطيور (AMV RTase).

PCR غير متماثل: يتم استخدامه لتوليد نسخ أحادية السلسلة من تسلسل الحمض النووي والتي يمكن استخدامها مباشرة لتسلسل الحمض النووي. يتم ضبط البادئين (نسبة 100: 1) في خليط التفاعل بحيث يتم استنفاد أحدهما حوالي 10 دورات أو أكثر. بعد هذه الدورات يتم نسخ خيط واحد فقط من قطعة الحمض النووي وهذه النسخ هي مواد البداية المثالية لتسلسل الحمض النووي. يُعرف هذا الاختلاف باسم PCR غير المتماثل.

AP-PCR: PCR التعسفي (AP-PCR) هو نوع من الحمض النووي المضخم العشوائي متعدد الأشكال (RAPD) حيث يتم استخدام بادئات فردية من 10 إلى 50 قاعدة لتضخيم الحمض النووي الجيني في تفاعل البوليميراز المتسلسل. تهرب من دفع الرهان و مكليلاند (1990) طور التعسفي معبي & # 8211 PCR ونفذ بصمات أصابع الجينوم مع الاشعال التعسفي.

تفاعل البلمرة المتسلسل مفيد في مجالات متنوعة من البيولوجيا الجزيئية والأدوية والتكنولوجيا الحيوية.


PCR هي طريقة خالية من الخلايا وسريعة وحساسة لاستنساخ شظايا الحمض النووي. تم تطوير تفاعل قياسي ومجموعة واسعة من الأساليب القائمة على PCR لفحص تعدد الأشكال والطفرات. PCR القياسي هو إجراء في المختبر لتضخيم تسلسل الحمض النووي المستهدف المحدد ، حتى من كميات صغيرة جدًا من المواد أو المواد ذات الأصل القديم. يتطلب التضخيم الانتقائي بعض المعلومات المسبقة حول تسلسل الحمض النووي الذي يحيط بالحمض النووي المستهدف. بناءً على هذه المعلومات ، تم تصميم اثنين من البادئات قليلة النوكليوتيد يبلغ طولها حوالي 15-25 زوجًا قاعديًا. البادئات مكملة للتسلسلات خارج النهايات 3 & # 8242 من الموقع المستهدف وترتبط بها على وجه التحديد. تفاعل البوليميراز المتسلسل هو تفاعل متسلسل لأن خيوط الدنا المركبة حديثًا تعمل كقوالب لتخليق الحمض النووي الإضافي لنحو 25-35 دورة لاحقة. نظريًا ، تضاعف كل دورة كمية الحمض النووي التي يتم تضخيمها. في النهاية ، يوجد ما لا يقل عن 10 ^ 5 نسخ من التسلسل المستهدف المحدد. يمكن تصور ذلك على أنه نطاق مميز بحجم معين بعد الرحلان الكهربائي للهلام. تستغرق كل دورة ، تتضمن ثلاثة تفاعلات يتم التحكم فيها بدقة بالوقت والتحكم في درجة الحرارة في أجهزة تدوير حرارية آلية ، حوالي 1-5 دقائق. الخطوات الثلاث في كل دورة هي (1) تمسخ الحمض النووي المزدوج الشريطة ، عند حوالي 93-95 درجة مئوية للحمض النووي البشري ، (2) التلدين التمهيدي عند حوالي 50-70 درجة مئوية اعتمادًا على درجة حرارة الانصهار المتوقعة للحمض النووي المزدوج ، و (3) تخليق الحمض النووي باستخدام بوليميراز الحمض النووي المستقر للحرارة (من الكائنات الحية الدقيقة التي تعيش في الينابيع الساخنة ، مثل Thermophilus aquaticus و Taq polymerase) ، عادةً عند حوالي 70-75 درجة مئوية. في كل دورة لاحقة ، يعمل القالب (الموضح باللون الأزرق) والحمض النووي المركب حديثًا خلال الدورة السابقة (كما هو موضح باللون الأحمر) كقوالب لجولة أخرى من التوليف. ينتج عن الدورة الأولى الحمض النووي المركب حديثًا بأطوال مختلفة (كما هو موضح بسهم) عند النهايتين 3 & # 8242 لأن التوليف يستمر إلى ما بعد التسلسلات المستهدفة. يحدث الشيء نفسه خلال الدورات اللاحقة ، لكن السلاسل المتغيرة تتفوق بسرعة على الحمض النووي الجديد ذي الطول الثابت عند كلا الطرفين لأن التوليف لا يمكن أن يتجاوز نهاية التمهيدي في قالب DNA المقابل.

يمكن استخدام تسلسل حمض أميني معروف جزئيًا لبولي ببتيد للحصول على معلومات التسلسل المطلوبة لـ PCR. من mRNA الخاص به يمكن للمرء أن يشتق cDNA ، وتحديد تسلسل المعنى والشريط المضاد للتأثير لتحضير بادئات قليلة النوكليوتيد المناسبة (1). عندما تتوفر RNAs مختلفة بكميات صغيرة ، يتم استخدام طرق سريعة تعتمد على PCR لتضخيم (كدنا) من exons مختلفة من الجين. يتم الحصول على (كدنا) عن طريق النسخ العكسي من mRNA ، والذي يتم إزالته بعد ذلك عن طريق التحلل المائي القلوي (2). بعد تصنيع خيط DNA جديد مكمل ، يمكن تضخيم الحمض النووي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (3). يمكن استخدام PCR (RT-PCR) للنسخة العكسية عندما يتم فصل تسلسل exon المعروف على نطاق واسع داخل الجين. مع التضخيم السريع لنهايات (كدنا) (RACE-PCR) ، 5؟ و 3؟ يمكن عزل تسلسل النهاية من [كدنا].

تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)


مثيلة

يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للتحقيق في مثيلة خاصة بالموقع. في طريقة تسمى PCR الخاصة بالميثلة(MSP)، تم تصميم اثنين من أزواج التمهيدي للتمييز بين حالة مثيلة موضع الاهتمام [7،8].

في MSP ، يتم معالجة عينات الحمض النووي أولاً باستخدام بيسلفيت لتحويل السيتوزين غير الميثيل (C) إلى اليوراسيل (U). يبقى السيتوزين الميثيل (m5 C) غير متأثر بمعالجة بيسلفيت. للكشف عن المواقع الميثيلية ، تم تصميم زوج واحد من البادئات مع الجوانين (G) للاقتران مع m5 C في التسلسل المستهدف لاكتشاف المواقع غير الميثيلية ، تم تصميم زوج آخر من البادئات مع الأدينين (A) للاقتران مع U في ثنائي سلفيت - الجزيئات المحولة (ثم تزاوج مع الثايمين (T) في دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل اللاحقة). يستخدم تضخيم PCR الإيجابي الناتج عن الارتباط التمهيدي لتحديد حالة المثيلة للموضع (الشكل 7). (تعرف أيضًا على تحليل المثيلة بواسطة إنزيمات التقييد.)

الشكل 7. PCR الخاصة بالميثيلة. في الخطوة الأولى ، يتم معالجة عينات الحمض النووي باستخدام بيسلفيت لتحويل السيتوزين غير الميثيل إلى اليوراسيل. تم تصميم مجموعتين من بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل (مثيلة وغير مثيلة) للتمييز بين حالة المثيلة للموضع بناءً على تضخيم الحمض النووي المعالج بالبيسلفيت. يوجد DNA غير ميثيل كخيوط مفردة بعد معالجة بيسلفيت بسبب عدم تطابق G-U ، ويظهر هنا خيط واحد فقط من الحمض النووي للتبسيط.

نظرًا لأن MSP يعتمد بشكل كبير على خصوصية التمهيدي تجاه التسلسل المحول من ثنائي كبريتيت ، يلعب تصميم التمهيدي دورًا مهمًا في النجاح التجريبي. أولاً ، يجب أن تحتوي مواقع الربط التمهيدي على بقايا حساسة للميثيل بحيث يمكن اكتشاف التسلسلات الميثيلية مقابل التسلسلات غير الميثيل. ثانيًا ، تكون البادئات غير المثيلة عادةً غنية بـ AT وبالتالي تحتاج إلى أن تكون طويلة (على سبيل المثال ، gt30 nt) مع Tم ≥60 درجة مئوية لتمكين التلدين المحدد. بالإضافة إلى ذلك ، غالبًا ما تفضل متواليات AT العالية تكوين ثنائي التمهيدي ، وتهجين غير متطابق ، وانزلاق بوليميريز الحمض النووي ، وتحيز التضخيم. لذلك ، يجب أن يكون بوليميريز الحمض النووي المحدد قادرًا على تضخيم القوالب بمجموعة واسعة من محتوى AT / GC. ثالثًا ، يجب اختبار خصوصية التمهيدي تجريبيًا باستخدام DNA الضابطة لحالات مثيلة معروفة وغير معروفة لتقييم النتائج الإيجابية الخاطئة. للمساعدة في التمييز بين حالات المثيلة من خلال عدم تطابق زوج القاعدة ، يُنصح بتصميم بادئات مثيلة وغير مثيلة مع زوج من G-A أو T-C في نهاياتها 3 (الشكل 7).

بالإضافة إلى تضخيم التسلسلات الغنية بـ AT ، يجب أن يكون بوليميريز الحمض النووي قادرًا على القراءة من خلال بقايا U في الحمض النووي بعد معالجة بيسلفيت. معظم بوليمرات الحمض النووي عالية الدقة ليست مناسبة لـ MSP (ما لم يتم تعديلها بشكل خاص) نظرًا لوجود جيب ربط اليوراسيل من أصولهم القديمة. وبالمثل ، فإن وجود U في تسلسل القالب لا يسمح بمعالجة UDG للوقاية من التلوث المرحل لـ PCR.

بدلاً من نقطة النهاية PCR ، يمكن استخدام PCR في الوقت الفعلي مع MSP لمزيد من التحليل الكمي للميثيل. باستخدام PCR في الوقت الفعلي ، يعد تحليل منحنى الذوبان لأمبليكون PCR طريقة بديلة قائمة على PCR لاكتشاف حالة المثيلة في موضع الاهتمام.


عزل الجينات واستنساخ الحمض النووي | التكنولوجيا الحيوية

في هذه المقالة سوف نناقش حول عزل الجينات واستنساخ الحمض النووي.

تكوين مجموعات جديدة من المادة الوراثية عن طريق إدخال الحمض النووي المنتج خارج الخلية في فيروس أو بلازميد بكتيري أو أي نظام ناقل آخر للسماح بدمجها في كائن حي مضيف يكون فيه قادرًا على التكاثر المستمر والتعبير يسمى الهندسة الوراثية.

يشار إلى التقنيات المعنية أيضًا باسم الاستنساخ الجيني ، أو التلاعب الجيني في المختبر أو التكنولوجيا المؤتلفة. يحدث نقل المادة الجينية بين الأفراد في الطبيعة عن طريق الاقتران والتنبيغ والتحول.

مهما كان الهدف طويل المدى لمشروع البيولوجيا الجزيئية ، فإن الهدف الأولي عادة هو عزل جين واحد أو جزء آخر محدد من الحمض النووي من الكائن الحي قيد الدراسة. هذه هي الخطوة الأولية الأساسية لتسلسل الحمض النووي ، لفحص ملف تعريف التعبير للجين ، أو لتنقية البروتين المشفر بواسطة الجين.

يمكن تحقيق هذا الهدف الأولي بإحدى طريقتين:

أنا. عن طريق استنساخ الحمض النووي ، والذي يتضمن إدخال جزيء الدنا المرغوب في ناقل الاستنساخ متبوعًا بتكرار ناقل الاستنساخ في مزرعة بكتيريا الإشريكية القولونية؟

ثانيا. عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل ، والذي يتضمن التضخيم الأنزيمي لجزء الحمض النووي المطلوب؟

& # 8216Gene Cloning & # 8217 هي طريقة لعزل منطقة معينة من الحمض النووي وإنتاج ملايين النسخ المتطابقة من الحمض النووي (الجين) داخل ثقافة الخلايا الميكروبية.

الخطوات الأساسية في تجربة استنساخ الجينات هي:

أنا. عزل وتنقية الحمض النووي

ثانيا. قطع الحمض النووي في المواقع المطلوبة بنفس إنزيمات التقييد.

ثالثا. ربط (ربط) قطعة الحمض النووي المطلوبة إلى ناقل

رابعا. غرس المتجه في الخلية المضيفة عن طريق التحول

v. اختيار المحولات

السادس. تتكاثر جزيئات الحمض النووي المؤتلف داخل الخلايا المضيفة.

السابع. عندما تنقسم الخلية المضيفة ، يتم تمرير نسخ من جزيئات الحمض النووي المؤتلف إلى النسل.

ثامنا. ينتج عن النسخ المتماثل المستمر للخلايا المضيفة استنساخ ، يتكون كل منها من خلايا متطابقة تحتوي جميعها على نسخ من جزيء DNA مؤلف واحد.

ينتج عن هذه السلسلة من التلاعبات مكتبة استنساخ ، تضم العديد من الحيوانات المستنسخة المختلفة ، كل منها يحمل جزءًا مختلفًا من الحمض النووي الأصلي. وبالتالي فإن الخطوة التالية هي تحديد الاستنساخ الذي يحتوي على الجين محل الاهتمام PCR في الخطوط العريضة - يعتبر PCR نهجًا مختلفًا تمامًا لعزل قطعة DNA.

بدلاً من سلسلة طويلة من التلاعب بالخلايا الحية ، فإن تفاعل البوليميراز المتسلسل عبارة عن تفاعل أنبوب اختبار يتم تنفيذه ببساطة عن طريق خلط الكواشف المناسبة معًا واحتضانها في دورة حرارية ، وهي قطعة من المعدات التي تتيح تغيير درجة حرارة الحضانة على مدى الوقت بطريقة مبرمجة مسبقًا.

الخطوات الأساسية في تجربة تفاعل البوليميراز المتسلسل هي كما يلي ، يتم تحضير الحمض النووي من الكائن الحي الذي تتم دراسته وتحريفه عن طريق التسخين إلى 94 درجة مئوية. يضاف زوج من قليل النوكليوتيدات إلى الحمض النووي ، حيث تمكنها تسلسلات هذه الأوليغنوكليوتيدات من تصلب أي من جانبي الجين أو قطعة أخرى من الحمض النووي التي سيتم عزلها ، ويتم تبريد الخليط إلى 50-60 درجة مئوية بحيث تلتصق هذه الأوليغنوكليوتيدات مواقعهم المستهدفة.

يضاف بوليميراز DNA القابل للحرارة مع إمداد ديوكسي ريبونوكليوتيدات ويتم تسخين الخليط إلى درجة الحرارة المثلى لتخليق الحمض النووي. تتكرر دورة التمسخ - التلدين - التمديد من 25 إلى 30 مرة ، مع مضاعفة عدد جزيئات الدنا المركبة حديثًا خلال كل دورة. ينتج عن هذا التضخيم الأسي تخليق عدد كبير من نسخ تسلسل الحمض النووي المحاط بزوج من قليل النيوكليوتيدات.

التقنيات الأساسية اللازمة للاستنساخ و PCR هي:

4. فصل DNA و RNA بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام

5. تنقية جزيئات الحمض النووي من المواد الهلامية الكهربائية

6. بناء جزيئات الحمض النووي المؤتلف

7. إدخال الجزيئات المؤتلفة في الخلايا المضيفة واختيار المؤتلف

تعد القدرة على زراعة ثقافات نقية من البكتيريا بما في ذلك الثقافات المصابة بالعاثيات واحدة من أهم المهارات العملية التي يمكنك القيام بها كعالم ميكروبيولوجي. وذلك لأن معظم تجارب استنساخ الجينات تستخدم بكتيريا E. coli ككائن حي مضيف. حتى لو كان الهدف على المدى الطويل هو استنساخ جين في كائن حي غير الإشريكية القولونية ، فسيتم تنفيذ التلاعب الأولي في الإشريكية القولونية بسبب السهولة التي يمكن بها التعامل مع هذه البكتيريا.

بالنسبة للكثيرين ، فإن أول بيولوجيا جزيئية حقيقية يتم تجربتها هي تنقية الحمض النووي من الكائن الحي قيد الدراسة.

يعد تحضير الحمض النووي الريبي النقي والسليم أمرًا صعبًا نسبيًا بسبب الانتشار الواسع للأنزيمات الملوثة التي تعمل على تحلل جزيئات الحمض النووي الريبي. يمكن تعطيل RNases الموجودة في الخلايا التي يتم استخراج الحمض النووي الريبي منها أثناء إجراء التنقية بواسطة مثبط RNase مناسب ، ولكن يمكن تقديم مشاكل كبيرة بواسطة الأواني الزجاجية والمحاليل الملوثة بـ RNases المستمدة من إفرازات الجلد. هذه الإنزيمات شديدة المقاومة للعلاجات الفيزيائية ، حتى أن بعضها يتحمل التعقيم ويمكن أن يكون التحكم فيها مشكلة. يمكن أيضًا استخدام RNA بدلاً من DNA كمواد أولية لـ PCR.

فصل الحمض النووي والحمض النووي الريبي بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي:

يتم فصل جزيئات الحمض النووي الريبي (DNA) والحمض النووي الريبي (RNA) بأحجام مختلفة عن طريق الرحلان الكهربائي في [اغروس) أو ، في حالات نادرة ، هلام بولي أكريلاميد. يتم تشغيل المواد الهلامية Agarose بشكل روتيني لتقدير أحجام جزيئات DNA و RNA ، مما يتيح تقييم نجاح تقنية تحضيرية أو معالجة إنزيمية. الاغاروز الكهربائي للهلام هو أيضا أولية لتحليل جزيئات الحمض النووي من خلال تقنيات مثل التهجين الجنوبي.

تنقية جزيئات الحمض النووي من المواد الهلامية الكهربائية:

يوجد في بعض مجالات البيولوجيا الجزيئية عدد من الإجراءات البديلة لتحقيق نفس الهدف.

1. إن تنقية جزيئات الدنا من المواد الهلامية هي إحدى هذه الحالات. في كثير من الأحيان ، سيوفر هلام agarose أو polyacrylamide نطاقًا يمكن التعرف عليه بثقة على أنه يحتوي على جزء من الحمض النووي موضع الاهتمام.

2. قد تكون الخطوة التالية هي استئصال الشريط وتنقية جزيئات الحمض النووي قبل بناء جزيئات الحمض النووي المؤتلف وإجراء مزيد من الدراسة.

بناء جزيئات الحمض النووي المؤتلف:

تتمثل الخطوة الحقيقية الأولى في تجربة استنساخ الجينات في بناء جزيئات مؤتلفة عن طريق إدخال شظايا الحمض النووي في جزيئات ناقلات.

إدخال الجزيئات المؤتلفة في الخلايا المضيفة واختيار المؤتلف:

بمجرد تكوين جزيئات الحمض النووي المؤتلف يجب إدخالها في خلايا الإشريكية القولونية. هذا هو أسلوب مستقيم للأمام ومعيار لأنواع مختلفة من المتجهات.

يجب أن يكون واضحًا الآن أن اختيار متجه الاستنساخ هو أمر مهم. يجب أن تحدد طبيعة الإجراء المستخدم لإدخال الجزيئات المؤتلفة في الخلايا المضيفة ويجب أن تحدد الطريقة التي يتم بها اختيار المواد المؤتلفة.

من المهم اختيار ناقل مناسب لحجم شظايا الحمض النووي التي ترغب في استنساخها ، حيث أن بعض النواقل مصممة لشظايا صغيرة نسبيًا (5 كيلو بايت وأقل) بينما يتطلب البعض الآخر شظايا أكبر من حجم معين.


تطبيق

يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل في مجموعة واسعة من التطبيقات في العلوم والصناعة والطب والزراعة والحفظ. في الصحة والطب ، يتم استخدامه لتعزيز فهمنا للسرطان والأمراض الوراثية البشرية ، مثل التليف الكيسي ومرض باركنسون. يعتبر تفاعل البوليميراز المتسلسل مهمًا أيضًا في التحديد الجيني للأمراض الفطرية والبكتيرية والفيروسية. يتم استخدامه ، على سبيل المثال ، للكشف عن السيلان والكلاميديا ​​في عينات البول. يساعد تفاعل البوليميراز المتسلسل أيضًا في تحديد علاقات الأمومة والأبوة وعلاقات الدم الأخرى ويستخدمه علماء الطب الشرعي لتحديد الأفراد بناءً على ملفهم الجيني. توفر هذه التقنية أيضًا للعلماء وسيلة للبحث عن جينات مماثلة منتشرة في جميع الأنواع أو المجموعات السكانية المختلفة لتحديد المسافة التطورية للأنواع ذات الصلة ولتضخيم الحمض النووي القديم المعزول من عينات الحيوانات المنقرضة. يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل أمرًا حيويًا أيضًا لأعمال الحفظ ، مما يساعد على منع زواج الأقارب للحيوانات الأسيرة وتحديد أصل العاج الذي تم الحصول عليه بشكل غير قانوني. تستخدم هذه التقنية أيضًا في الزراعة لتحديد أنواع النباتات والآفات والأمراض.

أحد القيود مع PCR هو أنه يتطلب معدات وبنية تحتية يصعب تغييرها مع المستخدم. يتم التغلب على بعض هذه المشكلات من خلال تقنية LAMP التي يسهل تنفيذها في الميدان لأنها تحتاج إلى أجهزة أقل تعقيدًا وأقل تكلفة. كما أن له ميزة أنه يمكنه تضخيم الحمض النووي من العينات المعالجة جزئيًا و / أو غير المعالجة وهو سريع للغاية.

يعد LAMP الآن طريقة تشخيص جزيئي مستخدمة على نطاق واسع ويقف في طليعة ثورة التشخيص في نقطة الرعاية. نظرًا لبساطته وتكلفته المنخفضة واستهلاكه المنخفض للطاقة وسهولة تعلمه وقوته ، فقد أثبت برنامج (LAMP) أنه وسيلة تشخيص وكشف مفيدة للكشف عن الأمراض المعدية في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل. منذ عام 2005 بدأ استخدامه في برامج فحص الملاريا والسل ومرض النوم. كما تم استخدام هذه الطريقة مؤخرًا للكشف عن فيروس الإيبولا. تجري التجارب الآن لمعرفة ما إذا كان برنامج (LAMP) يمكن أن يوفر أداة للكشف السريع عن التهاب السحايا ، والذي يعوق علاجه السريع حاليًا صعوبة تحديد المرض قبل أن تغمر العدوى الجسم.


استنتاج

في هذا البحث ، تم تصميم محول مزدوج الخيط مع مواقع تقييد متعددة. تم التحقيق في هذه الاستراتيجية من قبل PCR مريحة لتحديد الهدف. أدى إنجاز مشي الجينوم باستخدام هذه الطريقة إلى تقليل وقت وتكلفة الدراسة من خلال تصميم بادئات محددة ومهايئ بسيط. لتأكيد التسلسل المستهدف بين العديد من المنتجات الممكنة ، تم إجراء PCR واحد (PCR ثالث) بدلاً من استنساخ أو إعادة تصميم بادئات محددة. للحصول على DNA أطول من المرافقة ، يمكن استخدام إنزيمات تقييدية أخرى أو بوليميراز DNA عالي الدقة. بشكل عام ، يمكن استخدام تسلسل المحول الاصطناعي والأمام التمهيدي المصمم بناءً على المحول لتحديد المنطقة غير المعروفة لأي جين. يحتاج مستخدمو الطريقة فقط إلى تصميم أساس عكسي باستخدام تسلسل معروف للجين المستهدف. بالإضافة إلى ذلك ، يساعد تطبيق الطريقة الحالية الباحثين على استبدال مواقع إنزيمات التقييد المرغوبة بدلاً من مواقع تقييد المحولات المتعددة الحالية.


شاهد الفيديو: لن تشتري البروتين بعد اليوم ضخم عضلاتك ببروتين طبيعي منزلي يقوي العضلات النائمة لديك وتجعلها ضخمة (قد 2022).


تعليقات:

  1. Lambert

    فكرة جيدة جدا

  2. Cesaro

    لن يعمل هكذا.

  3. Malatilar

    الآن هذا شيء مثل ذلك!

  4. Claegtun

    أعتقد أنه خطأ. دعونا نحاول مناقشة هذا.

  5. Hadon

    وحتى مع ذلك

  6. Eluwilussit

    اريد نفسي ...

  7. Titus

    نعم أفهمك.



اكتب رسالة