معلومة

ما هي الشاشة الوظيفية؟

ما هي الشاشة الوظيفية؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

كنت أراجع هذه الورقة ، لكني لم أفهم المصطلح.
ما معنى الشاشة الوظيفية؟

(أنا لست طالبًا في علم الأحياء ، ولا أفهم كثيرًا ، وسيكون الشرح البسيط البسيط كافياً)


من ملخص المقال المرتبط (جوتمان ، 2002):

استخدمنا شاشة وراثية في الجسم الحي لتحديد 13 مؤثرًا [...]. على الرغم من مشاركة القليل من التماثل الكلي ، إلا أن المناطق الأمينية الطرفية لهذه المؤثرات كانت لها تراكيب من الأحماض الأمينية متشابهة بشكل لافت للنظر.

ومن الجسد:

اعتمدت الشاشة على إشارة إفراز النوع الثالث والمحفز الداخلي لجين القفزة وبالتالي كانت محددة للغاية.

ومن ثم ، يبحث المؤلفون ويتعرفون على البروتينات بإشارة إفرازية تحت تنظيم محفز القفزات. أ شاشة وظيفية في هذه الورقة يشير إلى تحليل عينات البروتين للكشف عن وجود بروتينات ذات وظيفة معينة.


تكتشف شاشات Multiplex enCas12a التخزين المؤقت الوظيفي بين Paralogs المقنعة بطريقة أخرى في شاشات خروج المغلوب أحادية المنشأ من Cas9

حدد الفحص بالضربة القاضية للمكتبة المجمعة CRISPR / Cas9 عبر مئات خطوط الخلايا الجينات التي يؤدي تعطيلها إلى عيوب في اللياقة البدنية ، وهي خطوة حاسمة في تحديد أهداف السرطان المرشحة. ومع ذلك ، فإن عدد الجينات الأساسية المكتشفة من شاشات الضربة القاضية أحادية المنشأ منخفض مقارنة بعدد الجينات المعبر عنها بشكل أساسي في الخلية.

نتائج

من خلال التحليل المنهجي لبيانات الشاشة في خطوط الخلايا السرطانية التي تم إنشاؤها بواسطة خريطة التبعية للسرطان ، نلاحظ أن نصف جميع الجينات المعبر عنها بشكل أساسي لا يتم اكتشافها أبدًا في أي شاشة CRISPR وأن هذه العناصر غير الضرورية يتم إثرائها بشكل كبير بالنسبة للمشابهين. لقد بحثنا في التخزين المؤقت الوظيفي بين ما يقرب من 400 من أزواج paralog المرشحة باستخدام فحص خروج المغلوب CRISPR / enCas12a ثنائي الجينات في ثلاثة خطوط خلوية. نلاحظ 24 زوجًا من نظائر Paralog الاصطناعية المميتة التي نجت من الكشف عن طريق شاشات خروج المغلوب أحادية المنشأ عند عتبات صارمة. يوجد تسعة عشر من 24 (79٪) تفاعلًا مميتًا اصطناعيًا في ما لا يقل عن اثنين من أصل ثلاثة خطوط خلوية و 14 من 24 (58٪) موجودة في جميع خطوط الخلايا الثلاثة التي تم اختبارها ، بما في ذلك الوحدات الفرعية البديلة لمجمعات البروتين المستقرة بالإضافة إلى الزائدة عن الحاجة وظيفيًا الانزيمات.

الاستنتاجات

معًا ، تشير هذه الملاحظات بقوة إلى أن المظاهر الزائدة عن الحاجة وظيفيًا تمثل مجموعة مستهدفة من التبعيات الجينية التي يتم تمثيلها بشكل ناقص بشكل منهجي بين الجينات الأساسية للخلية في شاشات فقدان الوظيفة المستندة إلى كريسبر أحادية المنشأ.


شاشة وظيفية تحدد hDRIL1 باعتباره أحد مكونات الأورام التي تنقذ الشيخوخة التي يسببها RAS

تستجيب الخلايا الليفية الأولية لـ H-RAS V12 المنشط من خلال الخضوع لاعتقال سابق لأوانه ، والذي يشبه الشيخوخة التكرارية 1. تتطلب هذه "الآلية الآمنة من الفشل" ص 19 ARF , ص 53 و ال الورم الأرومي الشبكي (ر) الأسرة: عند تمزقها ، RAS V12 - تفشل الخلايا المعبرة في الخضوع للشيخوخة وتستمر في التكاثر 1،2،3،4،5،6،7. وبالمثل ، فإن التعبير المشترك عن الجينات المسرطنة مثل c-MYC أو E1A ينقذ الشيخوخة الناجمة عن RAS V12. لتحديد الجينات الجديدة التي تسمح بالهروب من الشيخوخة الناجمة عن RAS V12 ، قمنا بتصميم شاشة مكتبة DNA تكميلية غير متحيزة للفيروسات القهقرية. نقوم بالإبلاغ عن تحديد دريل 1، تقويم الإنسان للماوس لامع و ذبابة الفاكهة الميتة المسابقة منظمات النسخ. يجعل DRIL1 الخلايا الليفية الأولية للمورين غير مستجيبة للإشارات المضادة للتكاثر الناتجة عن RAS V12 بواسطة p19 ARF / p53 / p21 CIP1 ، وكذلك بواسطة p16 INK4a. وبهذه الطريقة ، لا ينقذ DRIL1 الشيخوخة الناتجة عن RAS V12 فحسب ، بل يتسبب أيضًا في أن تصبح هذه الأرومات الليفية شديدة التسبب في الأورام. علاوة على ذلك ، يخلد DRIL1 الخلايا الليفية للفأر ، في وجود مستويات عالية من p16 INK4a. الخلود عن طريق دريل 1، الذي يربط منتجها عامل النسخ الذي يتحكم فيه pRB E2F1 (المرجع 8) ، يرتبط باستقراء نشاط E2F1. في المقابل ، يستحث DRIL1 هدف E2F1 سيكلين E1، الإفراط في التعبير عنها كافٍ لتحفيز الهروب من الشيخوخة. وهكذا ، يعطل DRIL1 الحماية الخلوية ضد الانتشار الناجم عن RAS V12 في اتجاه مجرى مسار p19 ARF / p53.


مراجع

Hering، H. & amp Sheng، M. العمود الفقري الشجيري: الهيكل والديناميات والتنظيم. القس الطبيعة. Neurosci. 2, 880–888 (2001).

Nimchinsky ، E. A. ، Sabatini ، B. L. & amp Svoboda ، K. هيكل ووظيفة العمود الفقري الشجيري. Annu. القس فيسيول. 64, 313–353 (2002).

ماتسوزاكي ، إم ، هونكورا ، إن ، إليس ديفيز ، جي سي وأمبير كاساي ، هـ. الأساس الإنشائي لتقوية طويلة الأمد في أشواك شجرية مفردة. طبيعة سجية 429, 761–766 (2004).

Nagerl، U. V، Eberhorn، N.، Cambridge، S.B & amp Bonhoeffer، T. اللدونة المورفولوجية المعتمدة على النشاط ثنائي الاتجاه في الخلايا العصبية الحُصَينية. عصبون 44, 759–767 (2004).

Bagni ، C. & amp Greenough ، W. T. من تهريب mRNP إلى تشوه العمود الفقري: جذور متلازمة X الهشة. القس الطبيعة. Neurosci. 6, 376–387 (2005).

Okamoto ، K. ، Nagai ، T. ، Miyawaki ، A. & amp Hayashi ، Y. ينظم التعديل السريع والمستمر لديناميات الأكتين إعادة التنظيم بعد المشبكي الكامنة وراء اللدونة ثنائية الاتجاه. طبيعة الأعصاب. 7, 1104–1112 (2004).

Yi ، J. J. & amp Ehlers ، M. D. Ubiquitin ودوران البروتين في وظيفة المشبك. عصبون 47, 629–632 (2005).

شي ، إس إتش وآخرون. توصيل سريع للعمود الفقري وإعادة توزيع مستقبلات AMPA بعد تنشيط مستقبلات NMDA المشبكية. علم 284, 1811–1816 (1999).

زهو وآخرون. ينظم الفسفرة الخاصة بالدماغ لـ MeCP2 النسخ Bdnf المعتمد على النشاط والنمو الشجيري ونضج العمود الفقري. عصبون 52, 255–269 (2006).

Bingol، B. & amp Schuman، E.M.Synaptic البروتين تدهور بواسطة نظام بروتيازوم يوبيكويتين. بالعملة. رأي. نيوروبيول. 15, 536–541 (2005).

Steward، O. & amp Schuman، E. M. تخليق البروتين في مواقع التشابك على التشعبات. Annu. القس نيوروسسي. 24, 299–325 (2001).

Martin ، K.C ، Barad ، M. & amp Kandel ، E.R. تخليق البروتين المحلي ودوره في اللدونة الخاصة بالمشابك. بالعملة. رأي. نيوروبيول. 10, 587–592 (2000).

Eberwine، J.، Miyashiro، K.، Kacharmina، J.E & amp Job، C. الترجمة المحلية لفئات mRNAs التي تستهدف التشعبات العصبية. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 98, 7080–7085 (2001).

Ostroff ، L. E. ، Fiala ، J.C ، Allwardt ، B. & amp Harris ، K. M. يعيد توزيع Polyribosomes من مهاوي شجيري إلى أشواك مع مشابك متضخمة أثناء LTP في تطوير شرائح حصين الفئران. عصبون 35, 535–545 (2002).

Wells ، D.G ، Richter ، J.D & amp Fallon ، J.R. الآليات الجزيئية لتخليق البروتين المنظم بالنشاط في حجرة التشابك الشجيري. بالعملة. رأي. نيوروبيول. 10, 132–137 (2000).

Kiebler، M.A & amp Bassell، G.J. Neuronal RNA granules: المحركون والصناع. عصبون 51, 685–690 (2006).

Krichevsky، A. M. & amp Kosik، K. S. حبيبات RNA العصبية: رابط بين توطين RNA والترجمة المعتمدة على التحفيز. عصبون 32, 683–696 (2001).

أشرف ، إس آي ، مكلون ، إيه إل ، سكلارسك ، إس إم ، أمبير كونز ، إس. يتم تنظيم تخليق البروتين المشبكي المرتبط بالذاكرة من خلال مسار RISC في ذبابة الفاكهة. زنزانة 124, 191–205 (2006).

شرات ، جي إم وآخرون. ينظم الرنا الميكروي الخاص بالدماغ نمو العمود الفقري الشجيري. طبيعة سجية 439, 283–289 (2006).

Ambros، V. وظائف الرنا الميكروي الحيواني. طبيعة سجية 431, 350–355 (2004).

Bartel، D. P. MicroRNAs: الجينوميات والتكوين الحيوي والآلية والوظيفة. زنزانة 116, 281–297 (2004).

Filipowicz، W.، Bhattacharyya، S.N & amp Sonenberg، N. آليات التنظيم بعد النسخ بواسطة الرنا الميكروي: هل الإجابات في الأفق؟ القس الطبيعة جينيه. 9, 102–114 (2008).

Kosik ، K. S. نظام microRNA العصبي. القس الطبيعة. Neurosci. 7, 911–920 (2006).

ميسكا ، إي إيه وآخرون. تحليل ميكروأري لتعبير الرنا الميكروي في دماغ الثدييات النامية. جينوم بيول. 5، R68 (2004).

سمبير ، ل.ف وآخرون. يكشف تحديد ملامح التعبير عن الرنا الميكروي للثدييات عن مجموعة فرعية من الرنا المجهري المعبر عنها بالدماغ مع أدوار محتملة في تمايز الخلايا العصبية البشرية والفأرية. جينوم بيول. 5، R13 (2004).

كيم ، ج. وآخرون. تحديد العديد من microRNAs التي تتعاون مع polyribosomes في الخلايا العصبية للثدييات. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 101, 360–365 (2004).

Yeh ، D. C. ، Duncan ، J. A. ، Yamashita ، S. & amp Michel ، T. J. بيول. تشيم. 274, 33148–33154 (1999).

Rao، A. & amp Steward، O. الدليل على أن مكونات البروتين الخاصة بتخصصات الغشاء ما بعد المشبكي يتم تصنيعها محليًا: تحليل البروتينات المركبة داخل المشابك. J. نيوروسسي. 11, 2881–2895 (1991).

Meister ، G. ، Landthaler ، M. ، Dorsett ، Y. & amp Tuschl ، T. تثبيط خاص بالتسلسل لإسكات الحمض النووي الريبي الناجم عن microRNA و siRNA. RNA 10, 544–550 (2004).

Zito ، K. ، Knott ، G. ، Shepherd ، G.M ، Shenolikar ، S. & amp Svoboda ، K. تحريض نمو العمود الفقري وتشكيل المشابك عن طريق تنظيم الهيكل الخلوي للعمود الفقري أكتين. عصبون 44, 321–334 (2004).

مانسفيلد ، جي إتش وآخرون. تكشف الجينات المحورة "المستشعر" المستجيبة لـ MicroRNA عن أنماط شبيهة بـ Hox وأنماط أخرى منظمة تنمويًا لتعبير microRNA الفقاري. طبيعة الجينات. 36, 1079–1083 (2004).

فو ، ن وآخرون. ينظم microRNA المستحث بالبروتين عنصر استجابة cAMP الذي ينظم تكوين الخلايا العصبية. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 102, 16426–16431 (2005).

Rehmsmeier، M.، Steffen، P.، Hochsmann، M. & amp Giegerich، R. التنبؤ السريع والفعال للـ microRNA / الازدواج المستهدف. RNA 10, 1507–1517 (2004).

Kruger، J. & amp Rehmsmeier، M. RNAhybrid: التنبؤ بالهدف microRNA سهل وسريع ومرن. الدقة الأحماض النووية. 34، W451 – W454 (2006).

Rodenas-Ruano، A.، Perez-Pinzon، M. A.، Green، E. J.، Henkemeyer، M. & amp Liebl، D. J. ديف. بيول. 292, 34–45 (2006).

إيتورناي ، ر. وآخرون. PHR1 ، بروتين غشائي متكامل للخلايا الحسية للأذن الداخلية ، يتفاعل مباشرة مع الميوسين 1 ج والميوسين السابع أ. J. خلية علوم. 118, 2891–2899 (2005).

Ozaki، N. et al. cAMP-GEFII هو هدف مباشر لـ cAMP في إفراز الخلايا المنظم. خلية الطبيعة بيول. 2, 805–811 (2000).

الحسيني إيل ، د. وآخرون. قوة التشابك ينظمها بالميتات ركوب الدراجات على PSD-95. زنزانة 108, 849–863 (2002).

Linder ، M.E & amp Deschenes ، R.J. Palmitoylation: ضبط استقرار البروتين وحركة المرور. القس الطبيعة مول. خلية بيول. 8, 74–84 (2007).

كانغ ، آر وآخرون. تكشف بروتينات البالميتويل العصبية عن ارتباط بالميتويل المشبكي الديناميكي. طبيعة سجية 456, 904–909 (2008).

يتطلب Bhattacharyya، R. & amp Wedegaertner، P. B. J. بيول. تشيم. 275, 14992–14999 (2000).

كي ، إم جي وآخرون. microRNAs الجسدية التي تم تحديدها عن طريق التقاط الليزر وتعدد الإرسال RT-PCR. RNA 13, 1224–1234 (2007).

Lugli ، G. ، Torvik ، V. I. ، Larson ، J. & amp Smalheiser ، N.R. J. نيوروتشيم. 106, 650–661 (2008).

برنارد ، O. Lim كينازات ، منظمات ديناميات الأكتين. كثافة العمليات J. Biochem. خلية بيول. 39, 1071–1076 (2007).

Kurose و H. Gα12 و Gα13 كوسيط تنظيمي رئيسي في نقل الإشارة. علوم الحياة. 74, 155–161 (2003).

Tada، T. & amp Sheng، M. الآليات الجزيئية لتكوين العمود الفقري التغصني. بالعملة. رأي. نيوروبيول. 16, 95–101 (2006).

Obernosterer ، G. ، Leuschner ، P. J. ، Alenius ، M. & amp Martinez ، J. تنظيم ما بعد النسخ لتعبير microRNA. RNA 12, 1161–1167 (2006).

Schratt ، G.M ، Nigh ، E.A ، Chen ، W.G ، Hu ، L. & amp Greenberg ، M. E. ينظم BDNF ترجمة مجموعة مختارة من mRNAs بواسطة هدف ثديي من مسار يعتمد على rapamycin-phosphatidylinositol 3-kinase أثناء تطور الخلايا العصبية. J. نيوروسسي. 24, 9366–9377 (2004).

باراديس ، إس وآخرون. يحدد النهج القائم على RNAi الجزيئات المطلوبة لتطوير المشبك الجلوتاماتيرجي و GABAergic. عصبون 53, 217–232 (2007).

Obernosterer، G.، Martinez، J. & amp Alenius، M. مقفل قائم على الحمض النووي فى الموقع الكشف عن microRNAs في أقسام أنسجة الماوس. بروتوكولات الطبيعة 2, 1508–1514 (2007).


الملخص

تظل الشبكات الجزيئية المشاركة في تنظيم تكرار فيروس نقص المناعة البشرية والنسخ والكمون محددة بشكل غير كامل. لتوسيع فهمنا لهذه الشبكات ، أجرينا شاشة هجينة أحادية الخميرة عالية الإنتاجية غير منحازة ، والتي حددت 42 عامل نسخ بشري و 85 تفاعلًا إجماليًا بين البروتين والحمض النووي مع تكرار طولي طويل لفيروس HIV-1 و HIV-2. لقد بحثنا في مجموعة فرعية من عوامل النسخ هذه للنشاط النسخي في نماذج العدوى المستندة إلى الخلايا. قام KLF2 و KLF3 بقمع نسخ HIV-1 و HIV-2 في خلايا CD4 + T ، بينما قام PLAGL1 بتنشيط نسخ HIV-2 من خلال تفاعلات مباشرة بين البروتين والحمض النووي. باستخدام النمذجة الحسابية مع البروتينات المتفاعلة ، استفدنا من النتائج من شاشتنا لتحديد المسارات المفترضة التي تحدد شبكات النسخ الجوهرية. بشكل عام ، استخدمنا شاشة وظيفية عالية الإنتاجية ، ونمذجة حسابية ، وفحوصات كيميائية حيوية لتحديد وتأكيد العديد من عوامل النسخ المرشحة والعمليات الكيميائية الحيوية التي تؤثر على النسخ والكمون لفيروس HIV-1 و HIV-2.


شاشة الكروماتين المناعية القائمة على الترسيب لتحديد مواقع الربط الجينومي الوظيفية للمعاملات الخاصة بالتسلسل

تين. 1. تحليل مستويات البروتين p53 و MDM2 و p21 في خلايا MCF-10A و HMEC بعد علاج ADR. يظهر تحليل اللطخة الغربية لبروتين p53 و MDM2 و p21 الذي تم حصاده من MCF-10A و HMEC الأساسي الذي لم يتم علاجه (-) أو معالجته (+) باستخدام ADR (350 نانومتر) لمدة 8 ساعات. تين. 2. نظام اختيار الخميرة. تم استنساخ تسلسل التنشيط المنبع المرشح (UAS) المستعاد من ChIP في ناقل مراسل pBM947 الذي يحتوي على جين HIS3 تحت سيطرة مروج GAL1 الأساسي وعلامة URA1. تم تحويل المكتبة المستندة إلى pBM947 إلى سلالة خميرة ذات التغذية الناقصة تحتوي على ناقل pRS314SN ، والذي يعبر عن نوع p53 البشري الذي يحفز الجالاكتوز وعلامة TRP1. نمت الخمائر التي تحتوي على كلا النواقل على وسائط تحتوي على الجالاكتوز ، والتي تعاني من نقص الهيستدين (SG-Trp-Ura-His) لاختبار قدرة p53 على الارتباط بـ UAS المحتمل في ناقل pBM947 وتنشيط نسخ الجين HIS3. تم إجراء طلاء متماثل لجميع الحيوانات المستنسخة على الوسائط المحتوية على الجلوكوز والتي تعاني من نقص الهيستيدين (SD-Trp-Ura-His) لاستبعاد النسخ الإيجابية الكاذبة. تم اعتبار الحيوانات المستنسخة التي نمت بوجود الجلوكوز إيجابية كاذبة ، وتم تحليل الحيوانات المستنسخة التي نمت على الجالاكتوز ، ويفترض أنها تعتمد على p53 ، بشكل أكبر. يُشار إلى استنساخ يحتوي على جزء من مروج p21 يشمل الموقع 1 كمثال على نتيجة إيجابية. تين. 3. تحليل p53 في الجسم الحي ملزمة لمواقع الربط الإجماعي. تمت معالجة ثلاث مجموعات من خلايا MCF-10A و HMEC و HK بشكل متماثل: تمت معالجة مجموعة واحدة باستخدام ADR (350 نانومتر لمدة 5 ساعات) وفورمالدهايد متشابك (ADR + ، XL +) ، مجموعة أخرى لم يتم علاجها باستخدام ADR وكان الفورمالديهايد متشابكًا (ADR - ، XL +) ، وتم التعامل مع المجموعة النهائية باستخدام ADR وليس الفورمالديهايد المتشابك (ADR + ، XL -). تم اشتقاق الحمض النووي لـ PCRs من التهابات مناعية خاصة بـ p53 و cyclin B1 وتم تضخيمها باستخدام بادئات تحيط بعناصر استجابة p53 في الجينات التي تشفر البروتينات المشار إليها. تم حل تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام هلام البولي أكريلاميد الكهربائي ، وتم تلوين المواد الهلامية ببروميد الإيثيديوم. تم تضمين IPs الخاصة بـ cyclin B1 لتقييم أي شظايا DNA تمت تنقيتها من lysates المتشابكة بشكل غير محدد. المدخلات + ، المدخلات الجينومية - ، التحكم في المياه. تعمل نتائج PCR مع البادئات الموجهة إلى منطقة الترميز في GAPDH كعنصر تحكم في IP DNA غير المحدد بواسطة الأجسام المضادة الخاصة بـ p53. تين. 4. تحليل مقارن للربط p53 بالمواقع في مناطق المروج للجينات المستهدفة المعروفة والمرشحة. في اللوحات اليسرى ، تمت معالجة أربع مجموعات من HMEC على النحو التالي: تمت معالجة مجموعة واحدة باستخدام ADR (350 نانومتر لمدة 5 ساعات) ، والفورمالديهايد المترابط ، والمناعة بجسم مضاد p53 (قضبان صلبة) تم علاج مجموعة أخرى باستخدام ADR ، الفورمالديهايد المتشابك ، والمناعة مع الجسم المضاد Cyclin B1 (القضبان المفتوحة) تم علاج المجموعة الثالثة بـ ADR ، وليس الفورمالديهايد المتشابك ، والمناعة مع الجسم المضاد p53 (القضبان المنقطة) والمجموعة النهائية كانت الفورمالديهايد مرتبطة بشكل متقاطع ولكن لا يعالج بـ ADR ثم يتم ترسيبه مناعياً بجسم مضاد p53 (أشرطة رمادية). تم إجراء PCR في الوقت الحقيقي الكمي ، وتم تطبيع كل عينة إلى نفس الحمض النووي الجيني الذي تم عزله من الخلايا التي تم ربطها ومعالجتها بنفس الطريقة باستثناء عدم تنفيذ خطوة الترسيب المناعي. مواقع الربط الموضحة هي تلك التي تم استردادها من شاشة المكتبة (LS) ، وتلك التي تم الإبلاغ عنها مسبقًا في الأدبيات (RS) ، وتلك التي كانت مواقع ربط محتملة تم العثور عليها بواسطة تحليل الجينات باستخدام خوارزمية p53MH (PS). يظهر تطابق الزوج الأساسي لموقع الربط مع إجماع p53 بين قوسين. النتائج ، التي تظهر كنسب مئوية من إدخال الحمض النووي ، مأخوذة من ثلاث تجارب مستقلة على الأقل ، مع أشرطة الخطأ التي تمثل الانحرافات المعيارية. تعرض اللوحات اليمنى مخططات للتركيب الجينومي وتوطين مواقع ربط p53 المعروفة والمفترضة التي تم تحليلها. يشير تظليل الشريط إلى الحفاظ على الأنواع كما هو محدد. يشار إلى Exons بـ E متبوعًا برقم exon إما في مربع مفتوح أو مربع مظلل (يمثل exon الطرفي). يتم عرض تسلسل مواقع الربط الموجودة في المناطق التي تم تحليلها ، وبين قوسين ، يتم إعطاء مسافات مواقع الربط من بداية exon 1. تين. 5. التنظيم المعتمد على p53 للتعبير الجيني المستهدف المرشح التمثيلي. تمت معالجة الزوج متساوي المنشأ لخلايا HCT116 p53 + / + و p53 - / - باستخدام ADR (350 نانومتر) لمدة 0 و 6 و 12 و 24 ساعة ، تمت معالجة خلايا HIp53 (p53) وخط خلية التحكم في النواقل المقابلة (Ø) باستخدام ponasterone A (10 ميكرومتر) لمدة 24 ساعة ، وأصيبت خلايا HK بفيروس غدي معبر عن GFP أو p53 لمدة 30 ساعة. تمت تنقية إجمالي الحمض النووي الريبي من خلايا HCT116 و mRNA من خلايا HIp53 و HK ونسخها عكسيًا وإجراء PCR الكمي في الوقت الحقيقي. تم تطبيع العينات إلى GAPDH ، وتم تقديم النتائج كتغييرات بالنسبة للعينة 0-h HCT116 p53 + / + (اللوحة اليسرى) ، أو خلايا التحكم في ناقلات HIp53 المعالجة بالبوناستيرون (اللوحة الوسطى) ، أو خلايا HK المصابة مع فيروس غدي معرب عن GFP (اللوحة اليمنى). النتائج هي وسيلة لثلاث تجارب مستقلة (خلايا MCF-10A و HMEC) أو تجارب مكررة (خلايا HK) ، مع أشرطة خطأ تمثل الانحرافات المعيارية. نلاحظ أن ذ تم ضبط المحاور على 7.0 مع استثناءات الألواح اليسرى والوسطى لجين CDKN1A واللوحين الأيسر والأيمن لجين EDN-2.

محتويات

لا تحدد المواصفات الوظيفية الأعمال الداخلية للنظام المقترح ولا تتضمن مواصفات كيفية تنفيذ وظيفة النظام. بدلاً من ذلك ، فإنه يركز على العوامل الخارجية المختلفة (الأشخاص الذين يستخدمون البرنامج ، أو الأجهزة الطرفية للكمبيوتر ، أو أجهزة الكمبيوتر الأخرى ، على سبيل المثال) قد "يلاحظون" عند التفاعل مع النظام.

قد ينص أحد المتطلبات الوظيفية في المواصفات الوظيفية على ما يلي:

عندما ينقر المستخدم فوق الزر "موافق" ، يتم إغلاق مربع الحوار ويعود التركيز إلى النافذة الرئيسية بالحالة التي كان عليها قبل عرض مربع الحوار هذا.

يصف هذا المطلب التفاعل بين وكيل خارجي (المستخدم) ونظام البرنامج. عندما يقوم المستخدم بتوفير مدخلات للنظام عن طريق النقر فوق الزر "موافق" ، يستجيب البرنامج (أو يجب أن يستجيب) عن طريق إغلاق نافذة الحوار التي تحتوي على الزر "موافق".

تحرير الغرض

هناك العديد من الأغراض للمواصفات الوظيفية. أحد الأغراض الأساسية لمشاريع الفريق هو تحقيق شكل من أشكال إجماع الفريق على ما يجب أن يحققه البرنامج قبل بذل المزيد من الجهد الذي يستغرق وقتًا طويلاً في كتابة التعليمات البرمجية المصدر وحالات الاختبار ، تليها فترة من التصحيح. عادة ، يتم التوصل إلى مثل هذا الإجماع بعد مراجعة واحدة أو أكثر من قبل أصحاب المصلحة في المشروع قيد البحث بعد التفاوض على طريقة فعالة من حيث التكلفة لتحقيق المتطلبات التي يحتاج البرنامج للوفاء بها.

  1. للسماح للمطورين بمعرفة ما يجب إنشاؤه.
  2. للسماح للمختبرين بمعرفة الاختبارات المطلوب إجراؤها.
  3. للسماح لأصحاب المصلحة بمعرفة ما يحصلون عليه.

تحرير العملية

في دورة حياة هندسة البرمجيات الصناعية المطلوبة (نموذج الشلال) ، تصف المواصفات الوظيفية ماذا او ما يجب تنفيذها. التالي ، وثيقة هندسة النظم تصف كيف سيتم تحقيق الوظائف باستخدام بيئة برمجية مختارة. في تطوير الأنظمة النموذجية غير الصناعية ، تتم كتابة المواصفات الوظيفية عادةً بعد أو كجزء من تحليل المتطلبات.

عندما يوافق الفريق على أنه تم التوصل إلى توافق في الآراء بشأن المواصفات الوظيفية ، يتم عادةً الإعلان عن المواصفات الوظيفية "كاملة" أو "موقَّعة". بعد ذلك ، يقوم فريق تطوير واختبار البرمجيات عادةً بكتابة الكود المصدري وحالات الاختبار باستخدام المواصفات الوظيفية كمرجع. أثناء إجراء الاختبار ، تتم مقارنة سلوك البرنامج بالسلوك المتوقع كما هو محدد في المواصفات الوظيفية.

طرق تحرير

تتضمن إحدى الطرق الشائعة لكتابة مستند المواصفات الوظيفية رسم أو عرض إطارات سلكية بسيطة أو لقطات شاشة لواجهة مستخدم دقيقة ومصممة بيانياً. بعد اكتمال ذلك ، واعتماد أمثلة الشاشة من قبل جميع أصحاب المصلحة ، يمكن ترقيم العناصر الرسومية وإضافة التعليمات المكتوبة لكل رقم على مثال الشاشة. على سبيل المثال ، يمكن أن تحتوي شاشة تسجيل الدخول على حقل اسم المستخدم المسمى "1" وحقل كلمة المرور المسمى "2" ، وبعد ذلك يمكن الإعلان عن كل رقم كتابيًا ، لاستخدامه من قبل مهندسي البرمجيات ولاحقًا لأغراض الاختبار التجريبي للتأكد من أن الوظيفة كما هي مقصود. تكمن فائدة هذه الطريقة في إمكانية إرفاق تفاصيل إضافية لا حصر لها بأمثلة الشاشة.


شكر وتقدير

نشكر Hans Teunissen و Elzo de Wit على مساعدتهم في تجربة 3C وجميع أعضاء مختبر العجمي لمساعدتهم الفنية ومناقشاتهم. نحن ممتنون لمرفق NKI Genomics Core للتسلسل العميق لعيناتنا.

التمويل

تم دعم هذا العمل من قبل ERC-AdG enhReg (322493 إلى RA) ، ERC-ITN RNA TRAIN (607720 إلى RA) ، مجلس المنح الدراسية الصيني (CSC) (إلى LL) ، برنامج العلوم الحدودية البشرية LT000640 / 2013 (إلى APU) ، والمنظمة الهولندية للأبحاث NWO-TOP 91216002 (إلى RA). يتم دعم RE من قبل جمعية السرطان الإسرائيلية (ICA) ، بمساعدة سخية من أصدقاء ICA الهولنديين ، وصندوق زمالة أبحاث Marguerite Stolz. تم دعم ZM جزئيًا من قبل زمالة Gad و Nava و Shye Shtacher. RE هي زميلة تدريس في مركز Edmond J. Safra للمعلوماتية الحيوية في جامعة تل أبيب.

توافر البيانات والمواد

تتوفر بيانات RNA-seq من رقم الدخول GEO DB GSE112458 [50]. تتوفر بيانات GRO-seq من رقم الانضمام إلى قاعدة بيانات GEO GSE109290 [51].


مراجع

Anderson، P. & amp Kedersha، N. RNA حبيبات. J. خلية بيول. 172, 803–808 (2006).

Anderson، P. & amp Kedersha، N. Stress granules: Tao of RNA. اتجاهات. بيوتشيم. علوم. 33, 141–150 (2008).

Kedersha ، N. & amp Anderson ، P. حبيبات الإجهاد الثدييات وتجهيز الهيئات. طرق الانزيم. 431, 61–81 (2007).

باركر ، آر. وأمبير شيث ، هيئات U. P والتحكم في ترجمة mRNA وتدهورها. مول. زنزانة 25, 635–646 (2007).

أجسام Eulalio ، A. ، Behm-Ansmant ، I. & amp Izaurralde ، E. P: عند مفترق طرق مسارات ما بعد النسخ. القس الطبيعة مول. خلية بيول. 8, 9–22 (2007).

كديرشا ، ن. وآخرون. الدليل على أن المركب الثلاثي (eIF2-GTP-tRNA (i) (Met)) - معقدات ما قبل النفاذية الناقصة هي مكونات أساسية لحبيبات الإجهاد في الثدييات. مول. بيول. زنزانة 13, 195–210 (2002).

Kimball، S.R، Horetsky، R. L.، Ron، D.، Jefferson، L. S. & amp Harding، H. P. تمثل حبيبات الإجهاد الثديية مواقع تراكم مجمعات بدء الترجمة المتوقفة. أكون. J. Physiol. خلية فيسيول. 284، C273-C284 (2003).

Kwon، S.، Zhang، Y. & amp Matthias، P. يعتبر نزع الأسيتيل HDAC6 مكونًا مهمًا جديدًا لحبيبات الإجهاد المتضمنة في استجابة الإجهاد. تطوير الجينات. 21, 3381–3394 (2007).

Eulalio، A.، Behm-Ansmant، I.، Schweizer، D. & amp Izaurralde، E. تكوين الجسم P هو نتيجة وليس السبب لإسكات الجينات بوساطة الحمض النووي الريبي. مول. زنزانة. بيول. 27, 3970–3981 (2007).

Sheth، U. & amp Parker، R. يحدث تقطيع وتعفن الحمض النووي الريبي المرسال في أجسام المعالجة السيتوبلازمية. علم 300, 805–808 (2003).

Lykke-Andersen، J. & amp Wagner، E. تجنيد وتفعيل إنزيمات اضمحلال الرنا المرسال عن طريق اثنين من مجالات تنشيط الاضمحلال بوساطة ARE في البروتينات TTP و BRF-1. تطوير الجينات. 19, 351–361 (2005).

Franks و T. M. تطوير الجينات. 21, 719–735 (2007).

كديرشا ، ن. وآخرون. تعتبر حبيبات الإجهاد وأجسام المعالجة مواقع محببة ديناميكيًا لإعادة تشكيل mRNP. J. خلية بيول. 169, 871–884 (2005).

Kedersha، N.، Tisdale، S.، Hickman، T. & amp Anderson، P. طرق الانزيم. (في الصحافة).

Cougot، N.، Babajko، S. & amp Seraphin، B. البؤر السيتوبلازمية هي مواقع تحلل الرنا المرسال في الخلايا البشرية. J. خلية بيول. 165, 31–40 (2004).

كديرشا ، ن. وآخرون. النقل الديناميكي لـ TIA-1 يصاحب توظيف mRNA في حبيبات الإجهاد في الثدييات. J. خلية بيول. 151, 1257–1268 (2000).

Hou ، J.C & amp Pessin ، J.E Ins (endocytosis) و outs (exocytosis) من تهريب GLUT4. بالعملة. رأي. خلية بيول. 19, 466–473 (2007).

Love، D.C & amp Hanover، J.A مسار تأشير الهيكسوزامين: فك شفرة "O-GlcNAc code". علوم. STKE 2005، re13 (2005).

مارشال ، إس. دور الأنسولين وهرمونات الخلايا الشحمية ومسارات استشعار المغذيات في تنظيم استقلاب الوقود واستتباب الطاقة: منظور غذائي لمرض السكري والسمنة والسرطان. علوم. STKE 2006، re7 (2006).

Slawson، C.، Housley، M. P. & amp Hart، G.W. O-GlcNAc cycling: كيف يغير تعديل ما بعد الترجمة لسكر واحد الطريقة التي نفكر بها حول شبكات الإشارات. J. الخلية. بيوتشيم. 97, 71–83 (2006).

Zachara ، N. E. & amp Hart ، G.W. إشارات الخلية ، الدور الأساسي لـ O-GlcNAc! بيوكيم. بيوفيز. اكتا 1761, 599–617 (2006).

زاكارا ، إن إي وآخرون. تعديل O-GlcNAc الديناميكي للبروتينات nucleocytoplasmic استجابة للإجهاد. استجابة البقاء على قيد الحياة لخلايا الثدييات. J. بيول. تشيم. 279, 30133–30142 (2004).

جونز ، إس.بي وآخرون. حماية القلب عن طريق ارتباط N-acetylglucosamine بالبروتينات الخلوية. الدوران 117, 1172–1182 (2008).

زاكارا ، إن.إي ، الطبيعة الحلوة للوقاية من أمراض القلب. أكون. J. Physiol. سيرك القلب. فيسيول. 293، H1324-H1326 (2007).

Zachara، N. E. & amp Hart، G.W.O-GlcNAc مستشعر الحالة الخلوية: دور الارتباط بالجليكوزيل الخلوي في تعديل الوظيفة الخلوية استجابة للتغذية والإجهاد. بيوكيم. بيوفيز. اكتا 1673, 13–28 (2004).

Cheung، W. D. & amp Hart، G.W. AMP-activated protein kinase and p38 MAPK بتنشيط O-GlcNAcylation للبروتينات العصبية أثناء الحرمان من الجلوكوز. J. بيول. تشيم. 283, 13009–13020 (2008).

تايلور ، آر بي وآخرون. يحفز الحرمان من الجلوكوز تعديل O-GlcNAc للبروتينات من خلال التنظيم الأعلى لـ N-acetylglucosaminyltransferase المرتبط بـ O. J. بيول. تشيم. 283, 6050–6057 (2008).

موريس ، إن جيه وآخرون. سورتلين هو البروتين الرئيسي 110 كيلو دالتون في حويصلات GLUT4 من الخلايا الشحمية. J. بيول. تشيم. 273, 3582–3587 (1998).

نيلسن ، إم إس وآخرون. ينقل ذيل Sortilin السيتوبلازمي نقل Golgi-endosome ويربط مجال VHS لبروتين الفرز GGA2. EMBO J. 20, 2180–2190 (2001).

ويلز ، إل وآخرون. رسم خرائط مواقع تعديل O-GlcNAc باستخدام علامات التقارب لتعديلات ما بعد الترجمة سيرين وثريونين. مول. بروتينات الخلية 1, 791–804 (2002).

Dai ، M. S. & amp Lu ، H. تثبيط انتشار p53 بوساطة MDM2 وتدهوره بواسطة بروتين الريبوسوم L5. J. بيول. تشيم. 279, 44475–44482 (2004).

Mazroui، R.، Di Marco، S.، Kaufman، R.J & amp Gallouzi، I.E. يؤدي تثبيط نظام اليوبيكويتين - البروتوزوم إلى تكوين حبيبات الإجهاد. مول. بيول. زنزانة 18, 2603–2618 (2007).

جيلكس ، ن. وآخرون. يتم التوسط في تجميع حبيبات الإجهاد عن طريق تجميع يشبه البريون لـ TIA-1. مول. بيول. زنزانة 15, 5383–5398 (2004).

Brengues ، M. & amp Parker ، R. تراكم مرنا متعدد الأدينيلات ، Pab1p ، eIF4E ، و eIF4G مع أجسام P في خميرة الخميرة. مول. بيول. زنزانة 18, 2592–2602 (2007).

Hoyle ، N. P. ، Castelli ، L.M ، Campbell ، S.G ، Holmes ، L.E & amp Ashe ، M. P. J. خلية بيول. 179, 65–74 (2007).

يتطلب تدهور Stoecklin ، G. ، Mayo ، T. & amp Anderson ، P. ARE-mRNA مسار تسوس 5′-3. ممثل EMBO. 7, 72–77 (2006).


تشريح الجزيء: ما الذي يجعل الريمسفير فريدًا؟

دعت منظمة الصحة العالمية في أواخر يناير / كانون الثاني خبراء لمناقشة العلاجات التجريبية للمرضى المصابين بفيروس كورونا المستجد دون اسم ولا لقاح ولا علاج. ذكرت اللجنة أنه من بين الخيارات العلاجية المختلفة ، كان الريمديسفير يعتبر المرشح الواعد. & rdquo

في غضون أسابيع ، كانت التجربة السريرية للمركب جارية في الصين. من المتوقع ظهور النتائج في أبريل في غضون ذلك ، أصبح تفشي فيروس SARS-nCoV-2 ، الفيروس المسبب لـ COVID-19 ، وباء عالميًا.

Remdesivir هو نظير نيوكليوزيد ، وهو أحد أقدم فئات الأدوية المضادة للفيروسات. إنه يعمل عن طريق منع بوليميريز الحمض النووي الريبي الذي تحتاجه فيروسات كورونا وفيروسات الحمض النووي الريبي ذات الصلة لتكرار جينوماتها والتكاثر في الجسم المضيف.

تم تصنيع الجزيء في الأصل كجزء من شاشة لمثبطات بوليميريز الحمض النووي الريبي لفيروس التهاب الكبد الوبائي سي. قرر مخترعوها في شركة جلعاد للعلوم المضي قدمًا بمركب نظير نيوكليوزيد مختلف لعلاج التهاب الكبد سي. ولكن يتم حفظ بوليميرات الحمض النووي الريبي المعتمد على الحمض النووي الريبي بين العديد من الفيروسات. أظهرت التجارب في المختبر وفي زراعة الخلايا وفي النماذج الحيوانية أن الريمديسفير له نشاط واسع النطاق ضد فيروسات الحمض النووي الريبي ، بما في ذلك الفيروسات الخيطية (مثل التي تسبب الإيبولا) وفيروسات كورونا.

يشبه Remdesivir أدينوزين قاعدة الحمض النووي الريبي ، كما هو موضح هنا كأحادي الفوسفات.

يحتوي المركب و ATP على بعض الاختلافات المهمة ، لكن بعض الميزات متشابهة جدًا. تحدث ASBMB Today إلى الكيميائي الطبي Katherine Seley & ndashRadtke في جامعة ماريلاند ، مقاطعة بالتيمور ، وعالم الفيروسات البنيوية كريج كاميرون في جامعة نورث كارولينا ، تشابل هيل حول ما يجعل الجزيء مثيرًا للاهتمام. انقر على الميزة المميزة باللون الأزرق لقراءة ملاحظاتهم.

3 و rsquo مجموعة هيدروكسي

الفئات المختلفة من نظائر النيوكليوزيد / النوكليوتيدات لها تأثيرات مختلفة على البوليميرات. يقع Remdesivir في فئة تسمى إنهاء سلسلة nonobligate ، لأنه ، من الناحية النظرية ، يجب أن يكون من الممكن إضافة المزيد من النيوكليوتيدات إلى حبلا من RNA بعد إضافة remdesivir بسبب وجود مجموعة الهيدروكسيل في الكربون 3 في السكر.

وقال عالم الفيروسات كريج كاميرون ، الأستاذ في جامعة نورث كارولينا في تشابل هيل الذي يدرس التفاعلات بين نظائر النوكليوزيدات والبوليميراز الفيروسي ، إن مجموعة الهيدروكسي هذه هي المطلوب لاستمرار تخليق الحمض النووي ، سواء كان الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي.

تشير الأبحاث الحديثة إلى أنه عند مزجه مع بوليمرات RNA من فيروسات كورونا أو فيروسات فلافيفير في المختبر ، لا ينهي remdesivir تخليق RNA جديد على الفور. بدلاً من ذلك ، قال كاميرون ، & ldquo يستغرق الأمر بضع دورات من إضافة النوكليوتيدات قبل أن تتمكن من رؤية تأثير الإنهاء. & rdquo

قد تساعد هذه النيوكليوتيدات الإضافية في حماية ريمديزفير من إنزيمات تصحيح الفيروسات التاجية المعروفة بإزالة نظائر النوكليوتيدات غير الطبيعية.

قاعدة الاقتران مع اليوراسيل

في الأدينوزين في الحمض النووي الريبي مزدوج الشريطة ، يشارك هذا الوجه من الجزيء في الاقتران الأساسي مع اليوراسيل. يعمل النيتروجينان كمانحين ومقبولين للبروتون ، على التوالي للروابط الهيدروجينية للذرات في قاعدة اليوراسيل.

يعتقد الكيميائيون أن الريمديزفير ، من خلال تقديم وجه ملزم مشابه جدًا ، يتم دمجه في خيط الحمض النووي الريبي المتنامي بواسطة البوليميراز الفيروسي.

الرابطة النوكليوزيدية C

يسمى الرابط بين الريبوز والقاعدة برابطة الجليكوسيد. عادة ، يربط 1 & rsquo الكربون في حلقة الريبوز بالنيتروجين في القاعدة. ولكن في remdesivir (وبعض النظائر النوكليوتيدية الأخرى) يرتبط السكر والنيوكليوبيز برابطة بين كربونين.

& ldquo إنه يوفر بالتأكيد قدرًا أكبر من الاستقرار (ضد) نوكليازات وغيرها من الإنزيمات التي يمكن أن تشق القاعدة النووية من السكر ، كما قالت كاثرين سيلي رادتك ، عالمة الكيمياء الطبية في جامعة ماريلاند ، مقاطعة بالتيمور ، والتي تعمل على تصميم وتركيب نوكليوزيد مضاد للفيروسات. نظائرها. باستخدام C-nucleoside ، يتعين على ldquoyou & rsquod كسر رابطة الكربون والكربون ، بينما في النيوكليوزيد العادي ، يمكنك كسر رابطة نصفي أميني ، وهو في الواقع غير مستقر إلى حد ما. لذا فإن وجود رابطة الكربون والكربون هو ميزة عظيمة. & rdquo

1 و rsquo cyano group

اسأل مجموعة من الكيميائيين ما الذي يقفز عليهم حول remdesivir ، وسيبدأ معظمهم بهذه الميزة الدرامية. الاستبدال في هذا الكربون غير معتاد ، وربما يكون ممكنًا فقط بسبب قوة الرابطة النوكليوزيدية C.

وفقًا لمقال نُشر في مجلة الكيمياء الطبية ، تمت إضافة مجموعة cyano في البداية لأن جزيء السلائف ، وهو مثبط فعال للغاية لبوليميراز الحمض النووي الريبي الفيروسي ، قد منع أيضًا بوليميريز الحمض النووي الريبي الميتوكوندريا في الفئران. لصنع جزيء بدون تلك الآثار الجانبية السامة ، جرب الكيميائيون في جلعاد سلسلة من البدائل في الكربون 1 & rsquo. كان المركب مع مجموعة cyano يعمل بشكل أفضل: لا يزال يمنع التهاب الكبد C polymerase ، ولكنه لم يعد مدمجًا بواسطة polymerases الخلية المضيفة.

& ldquo يمكنك & rsquot توقع النشاط. قال سيلي رادتك ، عليك أن تجعلها تختبرها. & ldquo ولكن حتى التغييرات الصغيرة يمكن أن يكون لها عواقب مذهلة. & rdquo

فوسفات

& ldquo ترى كل ذلك flotsam و jetsam ينطلقان في 5 & rsquo hydroxyl؟ & rdquo قالت كاثرين سيلي رادتك. بين الكيميائيين الطبيين ، يُعرف هذا النوع من مجموعات الحماية بشكل عرضي باسم & ldquoa McGuigan protide. & rdquo صممه الكيميائي الطبي كريس ماكجيجان في التسعينيات ، ويستخدم هذا النوع من مجموعات الحماية وتنوعاتها على نطاق واسع لإيصال نظائر النوكليوتيدات إلى الخلايا.

وقال سيلي رادتك إنه نظام رائع لأنه يحقق شيئين. & ldquo لا. 1 ، مشكلة مع النيوكليوسيدات هي أنها & rsquore القطبية وفوسفاتها أكثر قطبية. & rdquo يؤدي إخفاء مجموعات الفوسفات شديدة السلبية بالإسترات أو الأميدات إلى تقليل القطبية الكلية و rsquos ، مما يسمح لها بعبور غشاء البلازما إلى الخلايا.

Second, in order to be recognized by polymerases, the analog needs to resemble a normal nucleotide triphosphate&mdashwhich means it needs to be phosphorylated.

&ldquoThe first phosphorylation, either by cellular or viral kinases, is oftentimes very difficult,&rdquo Seley-Radtke said. &ldquoA lot of those kinases are very, very picky in terms of recognition.&rdquo By arriving in the cell with its first phosphate already in tow, remdesivir and related nucleotide analogs skip that rate-limiting step. After the protecting groups are cleaved, the nucleotide analog is a reasonable substrate for later nucletodie kinases.